Tài liệu Quy trình định tính vibrio cholerae

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM 1 Tp.Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2016 2 BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM DANH SÁCH THÀNH VIÊN VÀ NHIỆM VỤ 3 MỤC LỤC I. Đặc điểm vi khuẩn Vibrio cholerae........................................................................4 1. Tổng quan về Vibrio cholerae.............................................................................4 2. Phạm vi áp dụng.................................................................................................5 II. Thử nghiệm sinh hóa trong qui trình định tính Vibrio cholerae...........................5 1. Nguyên tắc..........................................................................................................5 2. Môi trường và hóa chất......................................................................................5 3. Quy trình phân tích...........................................................................................11 4. Các bước tiến hành...........................................................................................11 5. Kết quả..............................................................................................................18 4 I. Đặc điểm vi khuẩn Vibrio cholerae 1. Tổng quan về Vibrio cholerae Là vi khuẩn Gram âm, hình que hai đầu không đều nhau tạo thành hình dấu phẩy, không sinh bào tử, di động nhờ 1 lông roi. Sống kị khí tùy ý, có khả năng lên men glucose nhưng không sinh hơi không sinh H 2S. Vibrio cholerae có phản ứng oxidase(+), ADH(-), LDC(+), lên men được sucrose, có thể tăng trưởng được trong môi trường chứa 0-3% NaCl, không phát triển được trong môi trường chứa 6, 8, 10% muối. T0op=370C, pHop=8.6, sống kị khí tùy ý, có khả năng phát triển tốt trên môi trường kiềm. Vibrio cholerae bị tiêu diệt ở nhiệt độ là 560C trong 30 phút. Vibrio cholerae sinh độc tố ruột và nội độc tố trong đường tiêu hóa, kích thích nghiêm trọng màng nhày tạo ra dịch dạ dày, gây tiêu chảy nặng, mất nước, choáng, thậm chí gây tử vong với tỉ lệ lên tới 25-50%. Biện pháp điều trị tốt nhất là bổ sung nước và chất điện giải thay thế. Vibrio cholerae là vi khuẩn gây ra bệnh dịch tả (Bệnh tả là bệnh truyền nhiễm cấp tính do phẩy khuẩn tả (Vibrio cholerae) gây ra, lây truyền bằng đường tiêu hoá. Bệnh có biểu hiện lâm sàng là đi ngoài lỏng và nôn nhiều lần, nhanh chóng dẫn đến mất nước - điện giải, suy tim mạch và tử vong nếu không được điều trị kịp thời. Hình ảnh về vi khuẩn Vibrio cholerae 5 2. Phạm vi áp dụng Phương pháp này được tham chiếu theo TCVN 7905 - 1: 2008 ( ISO 218721:2007) Dùng để phát hiện Vibrio cholerae trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. II. Thử nghiệm sinh hóa trong qui trình định tính Vibrio Cholerae 1. Nguyên tắc Phát hiện Vibrio cholerae trong thực phẩm được thực hiện bằng cách cân một lượng mẫu xác định và nuôi ủ trong môi trường lỏng chọn lọc. Những khuẩn lạc giống Vibrio cholerae sẽ được thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa. 2. Môi trường và hóa chất Môi trường và hoá chất APW ( Alkaline Phosphat Water) TCBS (Thiosulphate citrate bile salt sucrose) Mục đích Tăng sinh chọn lọc: phục hồi sức sống của các vi sinh vật bị tổn thương và nhằm gia tăng tăng mật độ tương đối của vi sinh vật cần phát hiện, ức chế sự phát triển của các vi sinh vật không mong muốn. Phânlập: Môi trường thạch Thiosulfate CitrateBile Salts Sucrose là môi trường chọn lọc dùng để phân lập các loài Vibrio từ mẫu xét nghiệm phân có lẫn với vi khuẩn khác. Các loài Vibrio được phân biệt bằng đặc điểm do khuẩn lạc sinh ra trên môi trường. Các kiểu khuẩn lạc khác nhau được sinh ra từ các loài Vibrio khác nhau, thể hiện qua sự lên men của sucrose. Khi dùng thạch TCBS, chúng ta nên dùng chất nuôi cấy đặc, những loài Vibrio dễ chết đột ngột và môi trường này có để ngăn chặn được điều đó. Mẫu xét nghiệm tươi là tốt nhất, vì vi sinh vật này nhạy cảm với điều kiện khô, ánh sáng và pH 6 NA/TSA TSI/KIA Đĩa giấy Oxidase Dung dịch NaCl KOH 3% Arginine dehydrolase Ornithine decarboxylase Lysine decarboxylase TW (Tryptone Water) ONPG Kowac’s HCl và NaOH (KOH) 10% acid. Phục hồi Khẳng định sơ bộ: -Môi trường thạch KIA (Kligler Iron Agar) được sử dụng để nuôi cấy trực tiếp cho trực khuẩn gram âm lên men đường glucose, đây là đặc điểm cơ bản trong phân loại bước đầu của các trực khuẩn gram âm. Môi trường này cũng đồng thời thử tính lên men đường lactose, sinh hơi trong quá trình lên men carbohydrat và sinh H2S. Tất cả những đặc điểm đó đã được sử dụng cho các trực khuẩn gram âm thuộc họ vi khuẩn đường ruột. - Đĩa giấy Oxidase dùng để thử nghiệm Oxidase: Xác định sự hiện diện của enzyme oxidase ở V.cholerae -Dung dịch NaCl dùng để thử nghiệm tính chịu mặn của V.cholerae Thử String test để khẳng định sơ bộ Thử nghiệm sinh hoá để khẳng định Thuốc thử Indol Chỉnh pH Thành phần môi trường  APW ( Ancalin Peptone Water) Thành phần Khối lượng Peptone 10g 7 Natri clorua (NaCl) 10g Nước cất 1 lít  TCBS ( Thiosunfat- Citrat- Bile- muốối- Sacaroza): mối trường phân lập Thành phần Khối lượng Pepton 10g Cao nấm men 5g Natri xitrat 10g Natri thiosunfat (Na2S2O3) 10g Mật bò 5g Sacaroza 20g Natri clorua 10g Sắt (III) xitrat (FeC6H5O7) 1g Natri cholate 3g Xanh brom thymol 0.04g Xanh thymol 0.04g Thạch 15g Nước cất vô trùng 1lít  NA/TSA Thành phần Khối lượng Dịch chiết thịt 5,0 g Pepton 3,0 g Natri clorua (NaCl) 10,0 g 8 Thạch Từ 8 g đến 18 g Nước 1000 ml  TSI Thành phần Khối lượng Pepton 20,0 g Dịch chiết thịt 3,0 g Dịch chiết nấm men 3,0 g Natri clorua (NaCl) 10,0 g Lactoza 10,0 g Sacaroza 10,0 g Glucoza 1,0 g Sắt (III) xitrat 0,3 g Đỏ phenol 0,024 g Thạch Từ 8 g đến 18 g Nước 1 000 ml  ODC Thành phần Khối lượng L-Ornithin monohydroclorua 5,0 g 9 Dịch chiết nấm men 3,0 g Glucoza 1,0 g Bromocresol tía 0,015 g Natri clorua (NaCl) 10,0 g Nước 1 000 ml  LDC Thành phần Khối lượng L-lysin monohydroclorua 5,0 g Dịch chiết nấm men 3,0 g Glucoza 1,0 g Bromocresol tía 0,015 g Natri clorua (NaCl) 10,0 g Nước 1 000 ml  ADH Thành phần Khối lượng L-Arginin monohydro clorua 5,0 g Dịch chiết nấm men 3,0 g Glucoza 1,0 g Bromocresol tía 0,015 g Natri clorua (NaCl) 10,0 g 10 Nước 1 000 ml 3. Quy trình phân tích 4. Các bước tiến hành BƯỚC 1: Tăng sinh Cân 25g hay 25ml mẫu cho vào túi dập mẫu vô trùng, thêm 225ml APW, dập mẫu 60 giây, ủ ở 37oC trong 6 giờ và 16-24 giờ. 11  Tăng sinh lần 1: Trong môi trường lỏng chọn lọc. Cấy phần mẫu thử vào môi trường tăng sinh ở nhiệt độ môi trường. Ủ huyền phù ban đầu ở 37 oC trong 6h ± 1h đối với các sản phẩm đông lạnh sâu hoặc ở 41.5 oC trong 6h ± 1h đối với các sản phẩm tươi, khô hoặc sản phẩm ướp muối.  Tăng sinh lần 2: Trong môi trường lỏng chọn lọc. Chuyển 1ml dịch cấy thu được trong tân sinh lần 1 lấy từ bề mặt cho vào ống. Ủ ở 37 ± 0.5 oC trong 24 giờ. → nhằm phục hồi sức sống vi sinh vật bị tổn thương, nhằm gia tăng mật độ tương đối của vi sinh vật cần thiết, ức chế sự phát triển vi sinh vật không mong muốn. Vibrio cholerae có thể có mặt một lượng nhỏ thường đi kèm với một lượng lớn đáng kể với các loài vi sinh vật khác thuộc họ Vibrionacea hoặc các họ khác do đó cần phải có hai bước tăng sinh chọn lọc liên tiếp để phát hiện các vi sinh vật này. BƯỚC 2: Phân lập Từ môi trường tăng sinh, cấy ria lên môi trường thạch TCBS, ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Trên môi trường thach TCBS khuẩn lạc V. cholerae tròn, lớn có màu vàng. → khuẩn lạc có màu vàng do lên men được sucrose sinh ra khí CO 2, khi đó môi trường có tính acid ( chất chỉ thị bromthymol blue). BƯỚC 3: Phục hồi trên môi trường dinh dưỡng NA/TSA Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ từ đĩa trên môi trường phân lập TCBS. Nếu trên một đĩa có ít hơn 5 khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc nghi ngờ, thì lấy tất cả các khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ đó cấy ria lên NA/TSA có bổ sung 1.5% NaCl. Ủ ở 37±1oC trong 24 giờ. BƯỚC 4: Khẳng định sinh hóa và kháng huyết thanh Từ các khuẩn lạc đã chọn cấy ria lên NA/TSA, dùng que cấy cấy vào các môi trường thử nghiệm sau: Các phép thử nhận dạng giả định Phép thử Phản ứng tiêu biểu của 12 Vibrio cholerae Tính di động + Oxidase +  Thử nghiệm tính di động: Nguyên tắc: Xác định khả năng di động của Vibrio cholerae. Dùng que cấy thẳng lấy vi sinh vật sang ống nghiệm thạch bán lỏng NA, đâm thẳng từ trên xuống dưới ngay giữa ống môi trường, ử 37 oC trong 24 giờ. Phản ứng dương tính khi Vibrio cholerae lan ra khỏi đường cấy, xa hay gần tùy theo khả năng di động của vi khuẩn mạnh hay yếu. Phản ứng âm tính khi Vibrio cholerae chỉ mọc trên đường cấy.  Thử nghiệm oxidase: Nguyên tắc: Xác định sự hiện diện của hệ enzyme oxidase ở Vibrio cholerae. Đặt giấy lọc lên 1 nắp đĩa petri, nhỏ khoảng 2-3 giọt thuốc thử oxidase. Dùng que cấy bạch kim (platin) hoặc que cấy nhựa dùng 1 lần hoặc que cấy gỗ vô trùng lấy một khuẩn lạc từ môi trường TSA ria lên vị trí đã nhỏ thuốc thử oxidase. V.cholerae làm vết ria có màu tím thẩm hoặc xanh thẩm sau 30 giây đến 1 phút. 13 Các phép thử nghiệm khẳng định Phép thử Phản ứng tiêu biểu ADH - ODC + LDC + ONPG + TSI Vàng/vàng, không sinh H2S và khí Indol + Thử nghiệm khả năng chịu mặn - 0% NaCl + - 2% + - 6% - - 8% - - 10% -  Thử nghiệm decarboxylase  ADH: enzyme arginine dehydrolase  ODC: enzyme ornithine decarboxylase  LDC: enzyme lysine decarboxylase 14 Cấy vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống canh thang ornithine, lysine, arginine và ống đối chứng acid amin. Mỗi ống được phủ 1-2 ml dầu khoáng vô trùng. Ủ các ống ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Phản ứng dương tính khi môi trường trở nên đục và có màu tím. Phản ứng âm tính khi toàn bộ ống canh thang có màu vàng ổn định trong 4 ngày (tương ứng màu của ống đối chứng). Vibrio cholerae cho phản ứng lysine hoặc ornithine (+) phản ứng arginine âm tính.  Thử nghiêm ONPG: Xác định sự hiện diện của enzyme-β-galactosidase ở vi sinh vật. Các vi khuẩn chỉ lên men lactose khi tổng hợp trong tế bào của 2 enzyme là galactosidase có vai trò xúc tác sự thủy phân lactose permease có vai trò vận chuyển lactose vào bên trong tế bào Lấy vi khuẩn đã phát triển trên môi trường TSI hoặc từ môi trường không chọn lọc khác chứa 1% lactose vào ống nghiệm chứa 0.25ml nước muối sinh lý hòa tan. Thêm 1 giọt toluen vào ống rồi lắc đều, để yên trong 5 phút. Thêm 0.25ml ONPG, ủ ống nghiệm ở nhiệt độ 37 oC. V.cholerae cho phản ONPG dương tính khi môi trường chuyển sang vàng, âm tính khi môi trường không chuyển màu  Thử nghiệm trên môi trường TSI/ KIA Nguyên tắc: nhằm xác định vi sinh vật sử dụng nguồn carbonhydrate nào, có sinh hơi hay không, có sinh H2S hay không. Cấy chuyển các khuẩn lạc từ môi trường TSA vào các ống nghiêm TSI hoặc KIA. Nới lỏng các nắp ống đẻ tạo điều kiện hiếu khí. Nuôi ủ ở 37oC trong 18-24 giờ. Trên môi trường TSI, Vibrio cholerae làm phần thạch nghiêng và thạch đứng của môi trường chuyển sang màu vàng 15 không sinh hơi không sinh H 2S. Trên môi trường KIA, phần thạch nghiêng có màu đỏ và thạch đứng có màu vàng không sinh hơi và không sinh khí H 2S, Vibrio cholerae lên men đường glucose nhưng không lên men đường lactose. Thời gian ủ không quá 24 giờ, vì cấy bề mặt nghiêng thì màu đỏ Vibrio cholerae chuyển sang màu vàng sau 24 giờ.  Thử nghiệm indol: Cấy khuẩn nghi ngờ vào ống chứa 5ml môi trường muối trypton-tryptophan. Ủ ở 37oC trong 24 giờ ± 3 giờ. Sau khi ủ thêm 1 ml thuốc thử Kowac’s. Việc hình thành vòng màu đỏ phản ứng dương tính (hình thành indol). Vòng màu vàng chanh chứng tỏ phản ứng âm tính.  Thử nghiệm kháng huyết thanh: Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh lên lam kính sạch và 1 giọt nước muối sinh lý lên 1 vị trí khác nhau chuyển vi khuẩn từ TSA lên 2 giọt dung dịch trên rồi phân tán đều 16 vi khuẩn. Kết luận dương tính khi có hiện tượng ngưng kết ở giọt có kháng huyết thanh và không có hiện tượng ngưng kết ở giọt nước muối. Tóm tắt thử nghiệm kháng huyết thanh Vibrio cholerae theo Bảng 4.1 và Bảng 4.2 Bảng 4.1. Phân biệt Vibrio cholerae O1 và Vibrio cholerae non - O1 Kháng nguyên Chủng có kết quả sinh hoá tương tự Vibrio cholerae Chủng có kết quả sinh hoá tương tự Vibrio cholerae Chủng có kết quả sinh hoá tương tự Vibrio cholerae Kháng huyết Dung dịch muối Kết luận thanh đa giá O1 sinh lý + Vibrio cholerae O1 - - Vibrio cholerae non-O1 + + Chủng không đặc hiệu với kháng nguyên O nhóm 1 Bảng 4.2. Phân biệt các kiểu huyết thanh chủng Vibrio cholerae O1 Kháng nguyên Vibrio cholerae O1 Vibrio cholerae O1 Vibrio cholerae O1 Vibrio cholerae O1 Kháng huyết thanh Inaba + Kháng huyết thanh Ogawa - Dung dịch muối sinh lý Kết luận - Chủng Inaba - + - Chủng Ogawa + + - - - - Chủng Hikojima Chủng không đặc hiệu 5. Kết quả Phát hiện hay không phát hiện Virbio cholerae trong 25g mẫu rắn hoặc 25ml mẫu lỏng 17