Tài liệu Phương pháp giải trình tự gen

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM ••❧ ĐỀ TÀI BÁO CÁO: LỚP: DHSH07LT SVTH: Nhóm 15 GVHD: Th.s Trần Hồng Bảo Quyên 1. Nguyễn Thanh Diệu 2. Trần Thị Tha La 3. Nguyễn Thị Cẩm Nương 4. Nguyễn Thị Phương 5. Dương Chí Sơn 6. Đinh Thị Yến Thi 7. Trần Văn Thiết 8. Trần Trung Thịnh NỘI DUNG 1. Khái niệm giải trình tự gen và ý nghĩa của GTTG 2. Phương pháp giải trình tự gen: 2.1 Phương pháp Maxam – Gilbert 2.2 Phương pháp Sanger 2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động 3. So sánh phương pháp Maxam–Gilbert và Sanger 4. Ứng dụng 1.1.Khái Niệm: Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotid trong phân tử DNA. 1.2 Ý nghĩa Giúp xác định vị trí của gen trên NST, cho phép kết luận về bản chất của gen. Có ý nghĩa trong việc tìm hiểu những chức năng cấu trúc của gen cũng như các dòng gen. 2.1 Phương pháp Maxam - Gibert Nguyên lý: Thủy giải đặc trưng phân tử DNA cần xác định trình tự bằng phương pháp hóa học. Các bước thực hiện Bước 1: - Đánh dấu phóng xạ P32 ở đầu 5’ của mạch khuôn. 5’OH 3’ 5’OH 3’ P32, ATP, enzyme P3 2 90oC - Biến tính bằng nhiệt độ. - Điện di tách lấy một mạch DNA làm mạch khuôn, dùng mạch khuôn này cho các xử lý tiếp theo. DNA đánh dấu P32 Điện di phân tách các mạch đơn P32 Tách lấy mạch đơn 2.1 Phương pháp Maxam - Gibert Bước 2: Thực hiện các phản ứng hóa học đặc hiệu Có thể sử dụng 4 ống nghiệm để thực hiện các phản ứng hóa học đặc hiệu khác nhau, tạo các đoạn DNA cắt dài ngắn khác nhau. Ống 1 Hóa chất xử lý Vị trí cắt 1 Dimethyl sunrfat pH 8 G 2 Piperidine formate pH2 A và G 3 Hydrazine C và T 4 Hydrazine + Nacl 1,5M C 2.1 Phương pháp Maxam - Gibert 2.1 Phương pháp Maxam - Gibert Bước 3: Lấy sản phẩm xử lý trong mỗi ống nghiệm đem chạy điện di, hiện hình phóng xạ và xác định kết quả. Ví dụ: Xử lý Dimethylsunfat ở ống phản ứng 1, phản ứng cắt tại G. 2.1 Phương pháp Maxam - Gibert 32P ATCG 32P ATCGCCAG 32P ATCGCCAGTTG 32P ATCGCCAGTTGTACCAG Sau khi xử lý bằng DMSO4 Trình tự gen ban đầu 32P ATC 32P ATCGCCA 32P ATCGCCAGTT 32P ATCGCCAGTTGTACCA 2.1 Phương pháp Maxam - Gibert Bước 4: Tập hợp kết quả thu được ở tất cả các ống nghiệm, thu được các đoạn polynucleotid dài ngắn hơn kém nhau 1 nucleotid, từ đó xác định được trình tự của DNA mạch khuôn. 2.2 Phương pháp Sanger Nguyên lý: Dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ hoạt động của enzyme DNA Polymerase. Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotid (ddNTP) và các deoxynucleotid thông thường. 2.2 Phương pháp Sanger Việc tổng hợp mạch bổ sung sẽ bị dừng lại do ddNTP không có khả năng hình thành liên kết phosphodieste . 2.2 Phương pháp Sanger Vật liệu: - Primer( 20 nucleotides) - DNA polymerase - DNA template - dNTP và ddNTP - Vật liệu đánh dấu - Hệ thống điện di Các bước tiến hành Bước 1: Biến tính DNA khuôn Điện di trên gel polyacrylamid để thu các mạch đơn DNA, dùng DNA này để tiến hành các bước xử lý tiếp theo. 2.1 Phương pháp Sanger Bước 2: Chuẩn bị cho phản ứng tổng hợp DNA Lấy 4 ống Eppendorf, cho các thành phần cần thiết vào mỗi ống : mạch khuôn, mồi có đánh dấu phóng xạ P32, enzyme DNA polymerase, dNTP, dung dịch đệm thích hợp và thêm vào mỗi ống tương ứng một loại ddNTP nhất định. 2.2 Phương pháp Sanger 2.2 Phương pháp Sanger Bước 3 : Thực hiện các phản ứng tổng hợp DNA Bước 4: Điện di kết quả, so sánh kết quả các chuỗi mạch đơn DNA được tổng hợp để xác định trình tự của mạch khuôn. 2.2 Phương pháp Sanger ddTTP 2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động Nguyên lý: Hoàn toàn được thiết kế trên nguyên tắc sử dụng ddNTP do Sanger và cộng sự phát minh. Mồi và dNTP được đánh dấu huỳnh quang. Mỗi loại dNTP được đánh dấu huỳnh quang khác nhau, biểu thị các màu sắc khác nhau. Máy thực hiện tổng hợp các mạch đơn DNA mới trên cả 2 mạch khuôn DNA, sử dụng phần mềm trên máy tính để xử lý kết quả. 2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động Bước 1: Chuẩn bị (DNA khuôn, các dNTP và ddNTP có gắn màu quỳnh quang, enzyme, mồi…) Bước 2: Nhân DNA bằng PCR Bước 3: Nạp sản phẩm PCR vào máy giải trình tự gen và chạy máy giải trình tự gen. Bước 4: Phân tích kết quả từ các dữ liệu do máy tính cung cấp