Tài liệu Phát triển quy trình mpcr phát hiện mbv ( monodon baculovirus), wssv (white spot syndrome virus) và gen beta-actin trên tôm sú (penaeus monodon)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN VIẾT TOÀN PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH mPCR PHÁT HIỆN MBV ( Monodon baculovirus), WSSV (White spot syndrome virus) VÀ GEN BETA-ACTIN TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGHÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN VIẾT TOÀN PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH mPCR PHÁT HIỆN MBV ( Monodon baculovirus), WSSV (White spot syndrome virus) VÀ GEN BETA-ACTIN TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGHÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN BÙI THỊ BÍCH HẰNG 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com LỜI CẢM TẠ Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với cô Bùi Thị Bích Hằng đã tận tâm hướng dẫn, chỉ bảo, cung cấp tài liệu cũng như những kinh nghiệm giúp tôi hoàn thành được đề tài. Tôi xin chân thành cám ơn toàn thể quý thầy cô, anh chị Bộ môn Sinh Học và Bệnh Thủy Sản – Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt đề tài luận văn tốt nghiệp. Chân thành cám ơn các bạn lớp Bệnh học thủy sản K31 đã động viên và ủng hộ tôi thực hiện được đề tài này. i PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TÓM TẮT Đề tài được thực hiện nhằm phát triển và ứng dụng quy trình mPCR phát hiện đồng thời MBV và WSSV trên tôm sú (Penaeus monodon). Sau khi thực hiện quy trình mPCR của (Karlo et al., 2006) với mẫu dương tính với MBV cho kết quả ở vị trí 361bp. Sau đó tiếp tục phát triển quy trình mPCR phát hiện đồng thời MBV và gen β-actin cho kết quả hiện hai vạch ở vị trí 361bp (MBV) và 216 (β-actin). Trên cơ sở kết quả đạt được, thực hiện quy trình mPCR phát hiện MBV và WSSV kết quả cho thấy hiện vạch 1441bp (WSSV) ở bước 1, hiện đồng thời hai vạch 941bp (WSSV) và 361bp (MBV) ở bước 2. Thực hiện tiếp quy trình phát hiện MBV, WSSV và gen β-actin nhưng kết quả ở hai bước chỉ hiện vạch của WSSV (1441bp, 941bp). ii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................i TÓM TẮT ................................................................................................................ ii MỤC LỤC................................................................................................................iii DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................... v DANH SÁCH HÌNH ............................................................................................... vii CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU ....................................................................................... 1 CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................... 2 2.1 Tình hình chung về tôm ........................................................................... 3 2.1.1. Tình hình nuôi tôm trên thới giới ............................................... 3 2.1.2. Tình hình ở Việt Nam ................................................................ 4 2.2. Tổng quang về tình hình dịch bệnh trên tôm............................................ 5 2.2.1. Trên thới giới............................................................................. 5 2.2.2. Ở Việt Nam ............................................................................... 7 2.3. Bệnh Monodon Baculovirus (MBV) ...................................................... 8 2.3.1 Tác nhân gây bệnh ..................................................................... 8 2.3.2 Vật chủ cảm nhiễm ..................................................................... 8 2.3.3 Dấu hiệu bệnh lý ........................................................................ 8 2.3.4 Kiểu lan truyền ........................................................................... 9 2.3.5 Phương pháp chuẩn đoán ............................................................ 9 2.3.6 Các biện pháp kiểm soát bệnh ................................................... 10 2.4. Bệnh đốm trắng WSSV .......................................................................... 11 2.4.1 Tác nhân gây bệnh .................................................................... 11 2.4.2 Vật chủ cảm nhiễm .................................................................... 11 2.4.3 Dấu hiệu bệnh lý ....................................................................... 12 2.4.4 Kiểu lan truyền .......................................................................... 12 2.4.5 Phương pháp chuẩn đoán ........................................................... 13 2.4.6 Các biện pháp kiểm soát bệnh ................................................... 14 2.5.Sơ lược về gen β-actin ............................................................................ 14 2.6. Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) .......................................... 14 2.6.1 Một số nhân tố chính ảnh hưởng đến phản ứng PCR ................. 16 2.6.2 Ứng dụng của phương pháp PCR Thủy sản ............................... 17 CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................... 19 3.1. Thời gian và địa điễm nghiên cứu .......................................................... 19 3.2. Dụng cụ và hóa chất .............................................................................. 19 3.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 20 3.3.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................. 20 3.3.2. Ly trích DNA ........................................................................... 20 iii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 3.3.3. Đo hàm lượng DNA ................................................................ 21 3.3.4. Quy trình PCR phát hiện MBV (Karlo et al.,2006) ................... 21 3.3.5. Phương pháp mPCR phát hiện MBV và gen β – actin............... 22 3.3.6. Phương pháp mPCR phát hiện MBV và WSSV ........................ 23 3.3.7. Phương pháp mPCR phát hiện MBV, WSSV và gen β – actin .............................................................................................................. 25 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 26 4.1. Thực hiện quy trình PCR phát hiện MBV (Karlo et al.,2006) ...... 27 4.2. Thực hiện quy trình mPCR phát hiện MBV và gen β – actin ...... 29 4.3. Thực hiện quy trình mPCR phát hiện MBV và WSSV ................ 31 4.4. Thực hiện quy trình mPCR phát hiệnMBV,WSSVvà β–actin ...... 34 4.5.Ứng dụng quy trình mPCR phát hiện MBV và β –actin ................ 36 4.6.Ứng dụng quy trình mPCR phát hiện MBV và WSSV .................. 39 CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .............................................................. 40 5.1. Kết luận ....................................................................................... 40 5.2.Đề xuất ........................................................................................ 41 iv PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Sản lượng tôm nuôi trên thế giới qua một số năm (nghìn tấn) (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003) ............................................................................. 3 Bảng 2.2: Tình hình nuôi tôm sú ở VN qua một số năm (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003) ..................................................................................................... 5 Bảng 3.3 Trình tự mồi sử dụng trong qui trình PCR phát hiện MBV (Belcher and Young, 1998) , β-actin (Oanh, 2007), WSSV (OIE, 2006) ................... 20 Bảng 3.4. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình PCR phát hiện MBV ........................................................................... 21 Bảng 3.5. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV và β – actin...................................................... 22 Bảng 3.6. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 1) ............................................ 23 Bảng 3.7. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 2) ............................................. 24 Bảng 3.8. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 1) ......................... 25 Bảng 3.9. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 2) ......................... 25 Bảng 4.10. Hàm lượng ADN của mẫu tôm sú .............................................. 27 Bảng 4.11. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình PCR phát hiện MBV ........................................................................... 28 Bảng 4.12. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV và β – actin...................................................... 30 Bảng 4.13. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 1)............................................. 31 Bảng 4.14. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 2).............................................. 31 Bảng 4.15. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 2) đã được điều chỉnh. ............. 33 Bảng 4.16. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 1) . ........................ 35 v PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Bảng 4 .17. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 2) . ........................ 35 vi PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1. Sản lượng tôm sú thế giới năm 2001 (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003) ...................................................................................................................... 4 Hình 2.2. Sản lượng tôm nuôi tính theo khu vực ( Nguồn tổng cục thống kê, 2008) ............................................................................................................ 5 Hình 2.3: Tôm sú nhiễm bệnh MBV chậm lớn, màu xanh xẫm (Bùi Quang Tề, 2004) . ........................................................................................................... 9 Hình 2.4: Tiêu bản ép mô gan tụy của hậu ấu trùng tôm P. monodon bị nhiễm MBV nhuôm malachite green (700X). (Bondad-Reantaso, M.G et al., 2001)…….........................................................................................................10 Hình 2.5 Gan tụy tôm sú bị nhiễm MBV, nhuộm H&E (Bùi Quang Tề, 2004) .................................................................................................................... 10 Hình 2.6. Tôm sú bị bệnh đốm trắng WSSV, có các đốm trắng dưới vỏ (Bùi Quang Tề, 2004) ......................................................................................... 12 Hình 2.7. Tôm sú bị nhiễm đốm trắng, nhân tế bào biểu bị dạ dày trương to có thể vùi màu hồng, mẫu nhuộm H&E (Bùi Quang Tề, 2004)......................... 13 Hình 4.8. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV ......................... 27 Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV. ........................ 29 Hình 4.10. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và β – actin ... 30 Hình 4.11. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và WSSV....... 32 Hình 4.12. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và WSSV sao khi chuẩn hóa .................................................................................................... 34 Hình 4.13. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin ............................................................................................................ 36 Hình 4.14. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và β – actin ... 37 Hình 4.15. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và β – actin .. 38 Hình 4.16. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và WSSV....... 39 vii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG I GIỚI THIỆU Việt Nam có diện tích mặt nước lớn, kể cả nước ngọt, lợ và mặn, đây là một lợi thế cho việc phát triển nuôi trồng thủy sản và cũng là một trong những lý do dẫn tới sự thành công của ngành trong thời gian qua. Việt Nam đã trở thành nước nuôi trồng thủy sản lớn thứ 3 và là một trong 10 nước xuất khẩu thủy sản lớn nhất thế giới. Theo bộ thủy sản 2006, sản lượng thủy sản nuôi trồng của Việt Nam đạt 1,67 triệu tấn với giá trị xuất khẩu đạt 1,7 tỷ USD, tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản toàn ngành đạt 3,35 tỷ USD. Đồng bằng Sông Cửu Long có diện tích tự nhiên khoảng 39.747 km2, chiếm 12% diện tích cả nước. Trên thực tế, nuôi trồng thủy sản (NTTS) ở ĐBSCL đã trở thành một nghề truyền thống và không ngừng thay đổi. Theo tính toán, tổng diện tích có khả năng NTTS ở ĐBSCL hơn 1.200.000 ha, bằng gần 60% của cả nước. Trong đó, diện tích có khả năng NTTS vùng triều khoảng 750.300 ha, chiếm trên 26% tổng diện tích đất tự nhiên của 8 tỉnh ven biển của vùng và chiếm 74% tổng diện tích có khả năng NTTS trên vùng triều toàn quốc. Năm 2006, sản lượng NTTS vùng ĐBSCL đạt khoảng 1.200.000 tấn, bằng trên 70% sản lượng NTTS toàn quốc. Trong đó Tôm sú (Penaeus monodon) là đối tượng thuỷ sản có giá trị thương phẩm cao là đối tượng nuôi quan trọng ở Việt Nam cũng như một số nước đang phát triển ở Châu Á như Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Philippines, Việt Nam... và Nam Mỹ (Ecuador). Nghề nuôi tôm không chỉ góp phần lớn làm tăng kim ngạch xuất khẩu thủy sản cho các nước nêu trên mà còn có tác động tích cực đến quá trình phát triển kinh tế xã hội, cải thiện đời sống cho người nuôi thủy sản. Tuy nhiên, khi nghề nuôi tôm được thâm canh hóa nhất là nuôi với mật độ cao thì phải đương đầu với tình trạng dịch bệnh bùng nổ ngày càng thường xuyên và nghiêm trọng do sự suy thoái về môi trường và sự lây lan mầm bệnh. Đặt biệt là bệnh do virus trên tôm sú như: bệnh đốm trắng (white spot syndrome virus – WSSV), bệnh MBV (monodon baculovirus), bệnh đầu vàng (yellow head virus – YHV),…đã và đang gây thiệt hại nặng nề cho người nuôi. Do đó, việc phát hiện phát hiện sớm bệnh để giảm thiệt hại cho người nuôi, đồng thời nâng cao chất lượng và sản lượng tôm nuôi là vấn đề quan tâm hàng đầu của ngành thủy sản và của người nuôi tôm. Có nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh như: phương pháp chẩn đoán truyền thống bằng cách quan sát dấu hiệu bệnh hay phương pháp mô bệnh học nhưng nó lại không cho phép phát hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh. Nhiều phương pháp phân tử như lai in situ, western blot, PCR, RT-PCR được phát -1- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com triển nhằm khắc phục những nhược điểm trên. Phương pháp PCR hiện đang được sử dụng rất rộng rải và hiệu quả trong việc xét nghiệm tôm giống. Trong đó phương pháp được xem là hiệu quả nhất là phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) nên nó được cải tiến không ngừng để có thể phát hiện sớm, phát hiện đồng thời và chính xác tác nhân gây bệnh. Từ đó, đề tài: “ Phát triển qui trình mPCR (multiplex Polymerase Chain Reaction) phát hiện đồng thời MBV (M onodon baculovirus), WSSV (White spot syndrome virus) và gen beta – actin của tôm sú (Penaeus monodon)” được thực hiện. Mục tiêu của đề tài Phát triển và ứng dụng quy trình mPCR phát hiện đồng thời MBV, WSSV trên tôm sú (Penaeus monodon) và kiểm soát kết quả âm tính giả. Nội dung đề tài Thực hiện quy trình PCR phát hiện MBV (Karlo et al., 2006) Thực hiện quy trình mPCR phát hiện MBV và nội chuẩn β – actin Thực hiện quy trình mPCR phát hiện WSSV, MBV và nội chuẩn β – actin -2- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Tình chung về tôm 2.1.1. Tình hình nuôi tôm trên thới giới Tổng sản lượng tôm của thế giới là 1,6 triệu tấn năm 2003 và có giá trị tương đương 9000 triệu đôla. Khoảng 75% là từ các nước châu Á, như Trung Quốc, Thái Lan, Ấn Độ..., 25% còn lại là từ nước Nam Mỹ. Trung Quốc hiện là nhà xuất khẩu lớn nhất. (FAO, 2004) Các loài tôm được nuôi nhiều nhất là tôm sú (P. monodon), tôm thẻ Trung quốc (P. chinensis) và tôm chân trắng (P. vannamei). Riêng 3 loài tôm này chiếm trên 86% sản lượng tôm nuôi của thế giới. Nếu tính về sản lượng thì tôm sú chỉ xếp thứ 20 trong số các loài thuỷ sản nuôi nhưng về giá trị thì chúng đứng đầu với 4.046 tỷ USD trong năm 2000. (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003) Bảng 2.1: Sản lượng tôm nuôi trên thế giới qua một số năm (nghìn tấn) (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003) Năm 1995 1996 1997 1998 1999 Trung Quốc Thái Lan Việt Nam Indonesia Ấn Độ Ecuador Philippine 78 126 146 205 210 278 53 121 97 96 90 259 58 125 95 98 76 233 105 126 65 119 40 115 148 81 130 66 34 230 128 118 114 108 40 2000 250 105 110 Tôm sú đã được nuôi ở rất nhiều quốc gia trên thế giới, tính đến nay có hơn 65 nước và vùng lãnh thổ đang tiến hành nuôi, tập trung ở hai khu vực chính là Châu Á Thái Bình Dương chiếm 72% và Mỹ La Tinh chiếm 28% tổng sản lượng tôm nuôi. (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003) -3- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 300 276 Sản lượng (tấn) 250 200 150 103.603 100 97.1 50 40.698 50 26.352 2.459 lo an ài Ð M al ai xi a Th ái L an Ph ili pp in 0 Quốc gia Hình 2.1: Sản lượng tôm sú thế giới năm 2001 (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003) 2.1.2. Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam Bờ biển Việt Nam trãi dài 3.260 km suốt từ Bắc vào Nam là tiềm năng to lớn cho nuôi trồng thủy sản nước mặn và nước lợ. Diện tích nuôi tôm gia tăng nhanh chóng từ 250.000ha năm 2000 lên đến 959.000 ha năm 2005 (Tạp chí thủy sản, 2006). Tính đến hết năm 2005 cả nước có 4.281 trại giống sản xuất được 28,8 tỷ con tôm giống tăng 151,64% so với năm 2000. Theo số liệu hiện có, Việt Nam là nước có diện tích nuôi tôm vào loại lớn trên thế giới, vượt xa Indonesia, nước có diện tích nuôi tôm lớn nhất vào năm 1996, khoảng 360.000 ha. Phần lớn diện tích nuôi tôm ở Việt Nam tập trung ở ĐBSCL, rải rác dọc các cửa sông, kênh, rạch ven biển miền Trung và ở đồng bằng sông Hồng, sông Thái Bình ở miền Bắc (http://www.vietlinh.com.vn/html/tintue) -4- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 1000000 Đồng bằng sông Hồng Sản Lượng (tấn) 100000 Đông Bắc 10000 Tây Bắc 1000 Bắc Trung Bộ 100 Duyên hải Nam Trung Bộ Tây Nguyên 10 1 19 95 19 96 19 97 19 98 19 99 20 00 20 01 20 02 20 03 20 04 20 05 20 06 20 07 Đông Nam Bộ Năm Đồng bằng sông Cửu Long Hình 2.2: Sản lượng tôm nuôi tính theo khu vực. (Nguồn: tổng cục thống kê, 2008 ) Các loài tôm nuôi chính ở Việt Nam gồm tôm sú (P. monodon), tôm he (P. merguiensis), tôm nương (P. orientalis), tôm đất/rảo (metapenaeus ensis), trong đó tôm sú là loài nuôi chủ đạo, đóng góp sản lượng cao nhất. Việt Nam tồn tại 3 hình thức nuôi tôm là quãng canh (cải tiến), bán thâm canh và nuôi thâm canh. Bảng 2.2: Tình hình nuôi tôm sú ở VN qua một số năm (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003) Năm Diện Tích (ha) 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 260.000 200.000 195.000 265.000 295.000 326.407 446.208 478.785 Sản lượng ( 1000 tấn) 53 58 105 115 128 105 159 193 Năng Suất(kg/ha/năm) 200 290 538 433 433 487 356 403 2.2. Tổng quan về tình hình dịch bệnh trên tôm 2.2.1. Tình hình bệnh tôm trên thế giới Tác nhân gây bệnh virus hiện nay được xem là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng nhất làm thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi tôm thế giới. Việc chữa trị bệnh không có hiệu quả vì hiện nay chưa có một loại thuốc hay loại -5- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com hóa chất nào có thể chữa bệnh virus. Một số bệnh do virus gây ra làm bùng nổ dịch bệnh ở các trại nuôi tôm trên thế giới như: bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh Monodon Type baculovirus (MBV), bệnh đầu vàng (YHV), ...Năm 1989 lần đầu tiên ở Thái Lan tìm thấy một số lượng lớn thể ẩn polyhedral của MBV trong cơ quan gan tụy của postlarvae ở tôm sú (đây là loài tôm nuôi chủ yếu ở Thái Lan và các nước châu Á). Loài virus này được công bố là loài gây bệnh trên tôm nuôi công nghiệp ở Đài Loan năm 1987 - 1988. MBV cũng được xem là tác nhân gây bệnh làm ảnh hưởng đến năng suất thu hoạch ở Úc. MBV hiện diện phổ biến ở các Châu lục, gây bệnh cho tôm nuôi và tôm tự nhiên. Virus gây tỷ lệ chết cao cho ấu trùng và đối với tôm trưởng thành sự nhiễm ít nghiêm trọng hơn. Tuy nhiên khả năng gây bệnh của MBV còn tùy thuộc vào độc lực của từng chủng virus ở từng vùng địa lý khác nhau (Lightner và Redman, 1981) Bệnh đốm trắng (WSSV) là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi hiện nay. Bệnh xảy ra khắp nơi trên thế giới và ảnh hưởng phần lớn đến nghề nuôi tôm công nghiệp. Bệnh đốm trắng gây tỉ lệ chết cao và gây thiệt hại rất lớn cho nghề nuôi tôm công nghiệp ở Trung Quốc, Nhật Bản, Indonesia và Ấn Độ. Trong khoảng thời gian 1994 – 1995, bệnh đốm trắng đã gây chết hầu hết tôm nuôi dọc theo bờ biển phía Đông Ấn Độ và phía Tây Ấn Độ (Thông tin KH & CNTS, số 4/2004). Bênh cạnh đó nghề nuôi tôm ở Ecuador hầu như bị phá sản do dịch bệnh đốm trắng, sản lượng tôm nuôi giảm sút nghiêm trọng, từ tháng 4/1999 đến 4/2000 thiệt hại do bệnh đốm trắng đã lên đến 600 triệu USD. Cũng như Ecuador, bệnh đốm trắng đã gây thiệt hại 80% sản lượng nuôi tôm của Peru, tổng lượng tôm xuất khẩu từ 57 triệu USD năm 1997 và 71 triệu USD năm 1998 đến năm 1999 chỉ còn 32,66 triệu USD. Ngoài ra, nghề nuôi tôm ở Ấn Độ cũng bị thiệt hại đến 95% do dịch bệnh đốm trắng gây ra. Sự thiệt hại do bệnh đốm trắng gây ra rất nghiêm trọng, nhiều trại tôm bị thiệt hại đến 60% hoặc mất trắng (Thông tin KH & CNTS, số 10/2001). Ở Thái Lan bệnh WSSV làm giảm sản lượng tôm nuôi từ 225.000 tấn năm1995 xuống 160.000 tấn năm 1996 làm thiệt hại trên dưới 500 triệu USD. Ở các nước châu Á bệnh gây thiệt hại khoảng 3 tỷ USD mỗi năm (Nguyễn Văn Hảo, 2003) Theo Chanratchakool et all. (1999). YHV là virus gây thảm khốc và làm suy giảm nền kinh tế châu Á. Bệnh được phát hiện đầu tiên ở Thái Lan vào năm 1990. Làm thất thoát hơn 30,6 triệu USD năm 1992 và 650 triệu USD vào năm 1994. -6- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 2.2.2.Tình hình bệnh tôm ở Việt Nam Ở Việt Nam ngay từ những năm đầu thập niên 90, cùng với sự phát triển của nghề nuôi tôm công nghiệp thì dịch bệnh bắt đầu xuất hiện. Từ năm 1993 – 1995 dịch bệnh tôm đã báo động trên toàn quốc, làm thiệt hại hàng ngàn tỷ đồng. Trong năm 1994 tổng diện tích nuôi tôm có dịch bệnh là 84.558 ha với sản lượng thiệt hại ước tính là 5.225 tấn (Bộ thủy sản, 1995). Theo Nguyễn Văn Hảo (2003) đợt dịch bệnh thứ nhất năm 2001 xảy ra vào tháng 2 và tháng 3 rộng khắp trên tôm nuôi ở các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Tiềng Giang, riêng ở Bạc Liêu thiệt hại khoảng 10.212 ha. Dịch bệnh đợt hai xảy ra vào tháng 7 cùng năm cũng làm tỉnh thiệt hại 47.333 ha Theo điều tra của Nguyễn Văn Hậu năm 2006 thì tôm giống tới tay người nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long có tới 23% tôm giống bị nhiễm WSSV và 43,8% nhiễm MBV. Tính đến 9/2003, cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha. Các tỉnh, thành ven biển từ Đà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97% diện tích có tôm bị chết trong cả nước, Cà Mau bị hơn 232 ha. (Theo báo lao động, 2003) Ở Bạc Liêu, thiệt hại do dịch bệnh ở các mô hình nuôi tôm quãng canh cải tiến kết hợp với đối tượng khác, quãng canh cải tiến chuyên tôm, bán thâm canh và thâm canh lần lượt chiếm 9,6%, 28,8% và 53,1% (Sở thủy sản Bạc Liêu, 2006). Theo báo cáo của sở thủy sản Bình Định và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản I, 6/2006 toàn tỉnh Bình Định có diện tích nuôi tôm là 3666,3 ha. Tổng thiệt hại do bệnh đốm trắng làm tôm chết trên toàn tỉnh là 306 ha (165 ha mất trắng) (http://www.ria1.org/modules/news/article.php?storyid=150) Theo báo cáo của ngành thủy sản Bến Tre, 2006 toàn tỉnh đã thả nuôi trên 3.600 ha tôm sú thâm canh, bán thâm canh, đạt 57% diện tích. Diện tích nuôi thâm canh, bán thâm canh thả nuôi bị thiệt hại do dịch bệnh là 436 ha, chiếm 12,07% diện tích thả nuôi, trong đó thiệt hại nặng nhất là huyện Bình Đại 367,75 ha. Nếu so với năm 2005, tình hình dịch bệnh xảy ra nghiêm trọng hơn. (http://www.vietlinh.com.vn/dbase/VLTTShowContent.asp?ID=3108) Theo số liệu thống kê của Sở NN-PTNT Kiên Giang 5/2008, đã có 43.058 ha trong tổng số 80.563 ha tôm nuôi của tỉnh bị thiệt hại do dịch bệnh. Tập trung chủ yếu ở các huyện vùng U Minh Thượng và Gò Quao, trong đó riêng hai huyện An Minh và Vĩnh Thuận đã có trên 35.000 ha tôm bị chết . -7- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Không riêng gì Kiên Giang mà các tỉnh khác như Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Trà Vinh, Long An nhiều nông dân cũng đang phải đối mặt với tình trạng tôm chết hàng loạt một cách bất thường như vậy. Hiện tỉnh Cà Mau cũng đã có trên 38.800 ha tôm sú nuôi bị chết với các triệu chứng như: đốm đỏ, đầu vàng, đốm trắng (http://www.thiennhien.net/news/160/ARTICLE/5611/200805-21.html) 2.3. Bệnh Monodon Baculovirus (MBV) Bệnh MBV được phát hiện đầu tiên bởi Lightner và Redman (1981) trên tôm sú (Penaeus monodon) tại Đài Loan. Năm 1989 ở Thái Lan tìm thấy một số lượng lớn thể ẩn polyhedral của MBV trong cơ quan gan tụy của postlarvae ở tôm sú (đây là loài tôm nuôi chủ yếu ở Thái Lan và các nước châu Á). MBV hiện diện phổ biến ở các Châu lục, gây bệnh cho tôm nuôi và tôm tự nhiên. Virus gây tỷ lệ chết cao cho ấu trùng và ít nghiêm trọng hơn đối với tôm trưởng thành. Tuy nhiên khả năng gây bệnh của MBV còn tùy thuộc vào độc lực của từng chủng virus ở từng vùng địa lý khác nhau. (Bùi Quang Tề và ctv, 2004) 2.3.1 Tác nhân gây bệnh. Tác nhân gây bệnh MBV (Monodon Baculovirus) là virus type A Baculovirus monodon, cấu trúc nhân là ADN, có lớp vỏ bao, dạng hình que. Theo Mari (1993) thì chủng MBV của tôm sú từ Ấn Độ Thái Bình Dương có kích thước nhân 42 ± 3 x 246 ± 15 nm, kích thước vỏ bao 75 ± 4 x 324 ± 33 nm. Virus cảm nhiễm trên nhân gan tụy và nhân của biểu mô ruột giữa. Sự lây nhiễm bệnh MBV còn xảy ra trong cơ quan bạch huyết. (Bondad-Reantaso, M.G et al., 2001) 2.3.2. Vật chủ cảm nhiễm MBV có thể nhiễm ở nhiều loài tôm he khác nhau: Penaeus monodon, P. merguiensis, P. semisulcatus, P. kerathurus, P. plebejus, P. indicus, P. penicillatus, P. esculentus, P. Vannamei. Trong đó, tôm sú (P. monodon) thường bị nhiễm nặng và phổ biến nhất. (K.K. Vijayan et al., 1995) 2.3.3. Dấu hiệu bệnh lý Đối với tôm Postlarvae khi nhiễm nhẹ không có dấu hiệu rõ ràng, khi nhiễm nặng thể hiện một số dấu hiệu như: yếu, bơi lội lờ đờ, cơ thể đổi màu xanh lơ hay xanh đen, chuyển giai đoạn chậm không đều. Tỷ lệ chết tích lũy đến 90% nếu môi trường không ổn định. (Bùi Quang Tề và ctv, 2004) Cũng theo Bùi Quang Tề và ctv, (2004) tôm thịt khi bị nhiễm MBV thường có màu đen tối, kém ăn còi cọc, chậm lớn, chu kỳ lột xác kéo dài, nên trên -8- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com mang và bề mặt cơ thể bị cảm nhiễm rất nhiều các tác nhân cơ hội như vi khuẩn dạng sợi, động vật đơn bào (Protozoa), tảo đơn hay đa bào và các tác nhân khác. Có thể sau 3-4 tháng nuôi, tôm vẫn có kích thước rất nhỏ thường gọi là ”tôm kim”. Hình 2.3: Tôm sú nhiễm bệnh MBV chậm lớn, màu xanh xẫm (Bùi Quang Tề, 2004) 2.3.4. Kiểu lan truyền MBV lây truyền qua đường miệng do virus có trong phân của tôm bị nhiễm bệnh, hoặc do tôm ăn thịt tôm đã chết hoặc vừa chết. Tôm trưởng thành bị nhiễm bệnh cũng có khả năng truyền sang con của chúng thông qua làm bẩn khối trứng đã đẻ ra do phân. (Bondad-Reantaso, M.G et al., 2001) 2.3.5. Phương pháp chẩn đoán Theo tài liệu FAO về hướng dẫn chẩn đoán bệnh trên động vật thủy sản Châu Á thì có các phương pháp chẩn đoán sau: dựa vào dấu hiệu bên ngoài, tôm bị nhiễm MBV cấp tính có biểu hiện yếu, bơi lội lờ đờ kém ăn, cơ thể đổi sang màu xanh lơ hay xanh đen, tôm còi cọc chậm lớn. Tuy nhiên các dấu hiệu này cũng không đặc trưng cho bệnh MBV. Có thể áp dụng phương pháp kiểm tra nhanh các mô gan tụy ép tươi không nhuộm hay có nhuộm bằng malachite green, dưới kính hiển vi có độ phóng đại lớn hơn hoặc bằng 40X. Thông qua sự tồn tại của các thể ẩn hình cầu bắt màu xanh đậm mà xác định MBV trên tôm. -9- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Hình 2.4: Tiêu bản ép mô gan tụy của hậu ấu trùng tôm P. monodon bị nhiễm MBV nhuôm malachite green (700X). (Bondad-Reantaso, M.G et al., 2001) Có thể dùng phương pháp mô học, để phát hiện các thể ẩn hình cầu bắt màu hồng của thuốc nhuộm Eosin, nằm trong nhân phình to của tế bào gan tụy, trên các lát cắt mô gan tụy với thuốc nhuộm H&E, ở độ phóng đại đại lớn hơn hoặc bằng 40X Hình 2.5: Gan tụy tôm sú bị nhiễm MBV, nhuộm H&E (Bùi Quang Tề, 2004) Có thể dùng các phương pháp hiện đại để chẩn đoán và nghiên cứu virus này như dùng kỹ thuật PCR để nhận biết ADN đặt trưng của MBV, dùng phương pháp kính hiển vi điện tử (TEM) phát hiện các thể MBV trong trong nhân tế bào biểu mô gan tụy... - 10 - PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 2.3.6. Các biện pháp kiểm soát bệnh Theo Bondad-Reantaso, M.G et al. (2001), mật độ nuôi cao, hóa chất và các stress do môi trường đã làm tăng tính độc của bệnh MBV ở các loài tôm dễ bị nhiễm bệnh trong điều kiện nuôi Việc phòng tránh nhiễm bệnh bằng cách chọn tôm bố mẹ không bị nhiễm MBV bằng phương pháp kiểm tra phân, tẩy uế bề mặt của ấu trùng nauplius hoặc các trứng đã thụ tinh bằng formalin, iodophore, và lọc sạch nước biển Có thể tiệt trùng các dịch bệnh MBV ở một số cơ sở nuôi trồng thủy sản bằng cách cho tiêu hủy đàn tôm đã bị nhiễm bệnh, khử trùng dụng cụ nuôi, tránh virus tái nhiễm (từ các phương tiện nuôi khác ở bên cạnh, tôm tự nhiên,vv...) 2.4. Bệnh đốm trắng WSSV Năm 1993, WSSV lần đầu tiên được tìm thấy ở Đài Loan. Từ đó virus này phân bố rộng và gây thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi tôm ở vùng này. Bệnh đốm trắng (WSSV) vẫn là một trong các bệnh virus nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi hiện nay (Chou et al, 1995 trích dẫn bởi Nguyễn Văn Hảo, 2003) 2.4.1. Tác nhân gây bệnh Trước năm 2002, có 3 chủng Baculovirus gây bệnh đốm trắng hoặc còn gọi là virus Trung Quốc. Tuỳ từng nước nghiên cứu chúng có tên gọi và kích thước như sau: (Bùi Quang Tề, 2004) Tên virus Virus Trung Quốc (HHNBV) Virus tôm Nhật 1(RVPJ-1) Virus tôm Nhật 2 (RV-PJ-2) Virus bệnh đốm trắng Thái Lan (SEMBV) Virus bệnh đốm trắng (WSBV) Kích thước virus 120 x 360 nm 84 x 226 nm 83 x 275 nm 121 x 276 nm Kích thước nhân 70-150x350-380nm 58-67x330-350nm 54 x 216 nm 89 x 201 nm Hội nghị virus học quốc tế lần thứ 12 (Paris, 2002) các tác giả: Just M. Vlak, Jean-Robert Bonami, Tim W. Flegel, Guang-Hsiung Kou, Donald V. Lightner, Chu-Fang Lo, Philip C. Loh và Peter J. Walker đã phân loại virus gây hội chứng đốm trắng là một giống mới Whispovirus thuộc họ mới Nimaviridae. Virus có dạng hình trứng, kích thước 120 x 275nm, có một đuôi phụ ở một đầu, kích thước 70 x 300nm. Virus có ít nhất 5 lớp protein, trọng lượng phân tử từ 15- 28 kilodalton. Vỏ bao có hai lớp protein VP28 và VP19; nucleocapsid có 3 lớp VP26, VP24, VP15. Nhân cấu trúc ADN. (Bùi Quang Tề, 2004) - 11 - PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com