Tài liệu Phát hiện và xác định klebsiella pneumoniae mang gen blakpc kháng carbapenem

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ DIỆU THU PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH Klebsiella pneumoniae MANG GEN BLAKPC KHÁNG CARBAPENEM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - năm 2011 LỜI CÁM ƠN Tôi xin dành những lời cám ơn chân thành nhất gửi đến tất cả những người đã luôn bên cạnh tôi, giúp tôi có được thành công ngày hôm nay. Lời đầu tiên, xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS.BS Phạm Hùng Vân, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn khoa học, truyền đạt cho tôi những kiến thức bổ ích và kinh nghiệm quý báu. Thầy luôn động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa luận. Cũng những lời tri ân này, xin gửi tới các thầy cô trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên – những người đã trang bị cho tôi nền tảng kiến thức vững chắc để tôi tự tin bước vào con đường nghiên cứu. Tôi có được may mắn vì đề này nằm trong luận án tiến sĩ của Th.S Trần Nhật Phương nên tôi nhận được rất nhiều sự hỗ trợ từ Anh. Cám ơn Anh đã cung cấp cho tôi các chủng để tiến hành thí nghiệm cũng như đã theo sát từng bước đi của tôi, cho tôi những góp ý rất chân thành, giúp đề tài này đuợc hoàn thiện trong thời gian sớm nhất. Xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị, bạn bè ở công ty Nam Khoa đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo một môi trường làm việc thân thiện giúp tôi có động lực làm việc tốt hơn. Cảm ơn rất nhiều những người bạn đã luôn sát cánh, dõi theo tôi, những người đã cùng tôi chia sẻ buồn vui trong những năm tháng đi học, những người mà nếu thiếu họ chắc tôi khó lòng hoàn thành luận văn này một cách trọn vẹn. Và cuối cùng, từ tận đáy lòng, con biết ơn bố mẹ đã dành cho con cả cuộc đời này. Gia đình luôn là điểm tựa vững chắc cho con những lúc khó khăn nhất, giúp con có thêm động lực, niềm tin vào những gì mình làm, giúp con nên người trưởng thành như ngày hôm nay. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 7 năm 2011 Vũ Diệu Thu Trang i MỤC LỤC MỤC LỤC ............................................................................................................. i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................ v DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. vi DANH MỤC BẢNG ..........................................................................................viii ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1 1. TỒNG QUAN ................................................................................................... 3 1.1 Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae .................................................................. 3 1.1.1 Đặc điểm phân loại ................................................................................ 3 1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa và phân bố................................................ 4 1.1.3 Các nhân tố gây bệnh............................................................................. 7 1.1.4 Đặc điểm gây bệnh và tình hình đề kháng kháng sinh............................ 8 1.2 Carbapenem và cơ chế kháng carbapenem.................................................... 9 1.2.1 Carbapenem........................................................................................... 9 1.2.2 Cơ chế kháng carbapenem .................................................................. 11 1.2.3 Carbapenemase................................................................................... 12 1.3 Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) ............................................ 15 1.3.1 Klebsiella pneumonia carbapenemase (KPC)....................................... 15 1.3.2 Phát hiện và điều trị nhiễm khuẩn kháng carbapenem ......................... 17 1.3.3 Tình hình dịch tễ học .......................................................................... 19 1.4 Một số nghiên cứu đã thực hiện .................................................................. 23 1.4.1 Trên thế giới ....................................................................................... 23 MỤC LỤC Trang ii 1.4.2 Trong nước.......................................................................................... 25 2. VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP......................................................................... 27 2.1 Vật liệu....................................................................................................... 27 2.1.1 Các chủng thí nghiệm .......................................................................... 27 2.1.2 Thiết bị................................................................................................ 27 2.1.3 Hóa chất .............................................................................................. 28 2.2 Phương pháp............................................................................................... 28 2.2.1 Phương pháp nhuộm gram ................................................................... 29 2.2.2 Phương pháp định danh sinh hóa ......................................................... 29 2.2.2.1 Nguyên tắc các phản ứng sinh hóa định danh nhóm trực khuẩn Gram âm .............................................................................................. 30 2.2.2.2 Cách tiến hành ......................................................................... 33 2.2.3 Phương pháp giải trình tự gen 16S RNA.............................................. 36 2.2.3.1 Tách chiết DNA vi khuẩn ......................................................... 37 2.2.3.2 Phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen 16S rRNA ..................... 37 2.2.3.3 Tinh sạch sản phẩm PCR .......................................................... 38 2.2.3.4 Xác định nồng độ DNA sau tinh sạch ....................................... 40 2.2.3.5 PCR giải trình tự....................................................................... 40 2.2.3.6 Tủa và tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự............................. 41 2.2.3.7 Điện di mao quản DNA ........................................................... 42 2.2.3.8 Xử lý kết quả giải trình tự ......................................................... 42 2.2.4 Phương pháp phát hiện vi khuẩn có kiểu hình tiết ESBL...................... 42 2.2.4.1 Phương pháp đĩa đôi ................................................................. 42 MỤC LỤC Trang iii 2.2.4.2 Phương pháp đĩa kết hợp .......................................................... 43 2.2.5 Phương pháp phát hiện vi khuẩn có khả năng sinh carbapenmase ........ 44 2.2.5.1 Phương pháp khuyếch tán kháng sinh ....................................... 45 2.2.5.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC................ 45 2.2.5.3 Thử nghiệm Hodge cải biên ...................................................... 45 2.2.5 Phương pháp xác định vi khuẩn mang gen blaKPC ............................... 47 2.2.5.1 Phương pháp PCR .................................................................... 47 2.2.5.2 Điện di gel agarose ................................................................... 48 2.2.5.3 Phương pháp giải trình tự gen ................................................... 49 2.2.5.4 Xác định kiểu gen blaKPC........................................................ 50 2.3 Qui trình thí nghiệm ................................................................................... 51 3. KẾT QUẢ BIỆN LUẬN ................................................................................ 53 3.1 Kết quả định danh vi khuẩn ........................................................................ 53 3.1.1 Kết quả định danh sinh hóa ................................................................. 53 3.1.2 Kết quả giải trình tự 16S rRNA ........................................................... 56 3.2 Kiểm tra kiểu hình tiết ESBL...................................................................... 57 3.3. Kiểm tra kiểu hình kháng carbapenem ...................................................... 59 3.3.1 Biện luận tính kháng dựa vào đường kính vòng vô khuẩn................... 59 3.3.2 Biện luận tính kháng dựa vào MIC ..................................................... 61 3.3.3 Kết quả thử nghiệm Hodge cải biên .................................................... 64 3.4. Xác định gen blaKPC ............................................................................... 68 3.4.1. Kết quả PCR ...................................................................................... 68 MỤC LỤC Trang iv 3.4.2 Kết quả giải trình tự............................................................................. 71 3.4.3 Xác định kiểu gen blaKPC................................................................... 76 3.5 Tổng kết kết quả thu được .......................................................................... 79 3.5.1 Đánh giá tính kháng của các chủng thí nghiệm .................................... 79 3.5.2 Đánh giá thử nghiệm Hodge cải biên ................................................... 81 4. KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ ................................................................................... 83 4.1 Kết luận ...................................................................................................... 83 4.2 Đề nghị....................................................................................................... 84 TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................. 85 Tài liệu tiếng Việt............................................................................................. 85 Tài liệu tiếng Anh............................................................................................. 86 Tài liệu Internet ................................................................................................ 93 PHỤ LỤC Phu lục 1: Kết quả định danh bằng IDS 14 ® GNR Phu lục 2: Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA Phu lục 3: Hình ảnh kháng sinh đồ của 21 chủng thí nghiệm Phu lục 4: Kết quả giải trình tự gen blaKPC của các chủng thí nghiệm MỤC LỤC Trang v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ASTS Antibiotics Sensitivity Testing Surveillance CLSI Clinical and Laboratory Standards Insitute dNTP deoxyribonucleotide triphosphate ESBL Expanded Spectrum Beta-lactamase FDA Food and Drug Administration ICARE Intensive Care Antimicrobial Resisstance Epidemiology K. pneumoniae Klebsiella pneumoniae KIA Kligler Iron Agar KPC Klebsiella pneumonia Carbapenemase MC agar Mac Conkey agar MH Mueller Hinton MHA Mueller Hinton Agar MIC Minium Inhibitory Concentration NCBI National Center for Borotechnology Information ONPG o-nitrophenyl-D-galactopyranoside PBP penicillin-binding protein PCR Polymerase Chain Reaction TBE Tris/Borate/EDTA DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Trang viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số thử nghiệm sinh hóa của các loài chi Klebsiella............................ 5 Bảng 1.2 Nguồn phân lập Klebsiella ...................................................................... 6 Bảng 1.3 Phân lớp các kháng sinh beta-lactam .......................................................10 Bảng 1.4 Các men beta-lactamase chọn lọc ở vi khuẩn gram âm ............................12 Bảng 1.5 Phân bố của gen blaKPC theo thời gian và vùng địa lý ............................21 Bảng 2.1 Hướng dẫn đọc kết quả các phản ứng sinh hóa trong bộ IDS14 GNR® ....35 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA ............................38 Bảng 2.3 Hướng dẫn biện luận tính kháng của nhóm Enterobacteriacea theo CLSI 2011 .......................................................................................................................44 Bảng 2.4 Trình tự mồi sử dụng khuyếch đại gen blaKPC .......................................47 Bảng 2.5 Chương trình luân nhiệt Tm55 và Tm60 .................................................48 Bảng 2.6 Tên và nồng độ kháng sinh trong kháng sinh đồ ..................................52 Bảng 3.1 Kết quả định danh bằng bộ hóa chất IDS14 GNR® ................................54 Bảng 3.2 Nồng độ, kích thước sản phẩm PCR gen 16S rRNA sau tinh sạch ...........56 Bảng 3.3 Kết quả xác định các chủng tiết ESBL ....................................................58 Bảng 3.4 Kết quả biện luận tính kháng carbapenem dựa vào đường kính vòng vô khuẩn quanh đĩa carbapenem ..................................................................................60 Bảng 3.5 So sánh kết quả biện luận tính kháng carbapenem dựa vào MIC và dựa vào đường kính vòng vô khuẩn ...............................................................................63 Bảng 3.6 Bảng tổng kết kết quả thu được ...............................................................67 Bảng 3.7 Nồng độ và kích thước sản phẩm PCR gen KPC sau tinh sạch ................72 Bảng 3.8 Đánh giá kết quả thử nghiệm Hodge cải biên (MHT) ..............................81 DANH MỤC BẢNG Trang vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình kính hiển vi quét của khuẩn lạc K. pneumoniae ............................. 4 Hình 1.2 Cấu trúc của penicillin và carbapenem ................................................... 9 Hình 1.3 Vị trí của gen blaKPC ở K. pneumoniae và một số loài khác ................ 16 Hình 1.4 Sự khác biệt giữa KPC-1, KPC-2 và KPC-3 .......................................... 17 Hình 1.5 Phân bố dịch tễ gen blaKPC (năm 2009) ............................................... 23 Hình 2.1 Hướng dẫn định danh vi khuẩn gram âm dễ mọc nhờ bộ IDS14 GNR® 36 Hình 2.2 Thử nghiệm Hodge cải biên trên môi trường MHA ............................... 46 Hình 2.3 Sơ đồ đặt các đĩa kháng sinh ................................................................. 52 Hình 3.1 Kết quả nuôi cấy và quan sát trên kính hiển vi điện tử ........................... 53 Hình 3.2 Hình ảnh điện di chip gen 16S rRNA .................................................... 56 Hình 3.3 Kết quả kháng sinh đồ chủng 17 ............................................................ 59 Hình 3.4 Kết quả xác định MIC meropenem bằng phương pháp vi pha loãng trong môi trường lỏng của chủng 04, 05, 13, 18, 20. ...................................................... 62 Hình 3.5 Kết quả thử nghiệm Hodge cải biên (MHT)........................................... 65 Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuyếch đại gen KPCu và KPC của chủng chứng âm và chứng dương.................................................................................... 68 Hình 3.7 Kết quả điện di gen KPC và KPCu của 21 chủng thí nghiệm ................ 70 Hình 3.8 Kết quả điện đi chip sản phẩm PCR gen blaKPC tinh sạch .................... 72 Hình 3.9 Kết quả giải trình tự gen blaKPC của chủng K. pneumoniae ATCC ® 1705 với cặp mồi blaKPC-F ................................................................................. 74 Hình 3.10 Kết quả giải trình tự gen blaKPC của chủng K. pneumoniae ATCC ® 1705 với cặp mồi blaKPC-R ................................................................................. 74 DANH MỤC HÌNH Trang vii Hình 3.11 Kết quả tra cứu trình tự tương đồng với chủng K. pneumoniae ATCC ® 1705 dùng trong thí nghiệm bằng công cụ BLAST của NCBI .............................. 75 Hình 3.12 Tìm vị trí cắt giới hạn trong trình tự gen blaKPC bằng phần mềm Primer premier 5.0 .......................................................................................................... 77 DANH MỤC HÌNH Trang 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong cuộc chiến tranh giữa con người và vi khuẩn, kháng sinh là những trợ thủ đắc lực cho con người. Thuốc kháng sinh không ngừng được cải biến về chất lượng và phổ tác dụng nhằm tăng cường hiệu quả điều trị. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh rộng rãi đã dẫn tới sự gia tăng các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc với nhiều cơ chế khác nhau, đáng chú ý là cơ chế sản xuất men ESBL (extended spectrum beta-lactamase) có khả năng thủy phân các thế hệ kháng sinh cephalosporin và hầu hết các loại beta-lactam. Đối với các trường hợp này, kháng sinh carbapenem được xem là phương án cuối cùng. Vũ khí carbapenem hiện nay đang có nguy cơ trở nên vô hiệu do sự xuất hiện của các vi khuẩn có khả năng tiết men carbapenemase, đáng lo ngại nhất là men KPC (Klebsiella pneumoniae Carbapenemase) phát hiện chủ yếu ở Klebsiella pneumoniae. Klebsiella pneumoniae được biết đến là tác nhân phổ biến các trường hợp viêm phổi bệnh viện và nhiều bệnh nhiễm trùng nguy hiểm khác. Chủng này có khả năng tích lũy và lan truyền tính kháng rất cao. Gần đây, vi khuẩn Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem đã và đang bùng phát trên một số quốc gia trên thế giới và gây ra những đợt dịch lớn điển hình như ở New York[17, 18, 20, 69], Isarel [46]. Đây thực sự là thách thức đối các nhà điều trị và gánh nặng cho cộng đồng bởi vì việc trị liệu rất hạn chế, những vi khuẩn mang gen này được xem là “bất trị”. Hơn nữa, gen blaKPC nằm trên plasmid nên khả năng lan truyền tính kháng rất nhanh và còn có thể cộng hợp với các họ gen kháng khác trên plamid làm cho những chủng mang gen này có tính kháng mạnh hơn. Tổ chức Y tế thế giới đã lên tiếng cảnh báo về sự lây lan của các vi khuẩn Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC để các nước có biện pháp kiểm soát sự lây nhiễm và tránh lạm dụng, sử dụng thuốc kháng sinh sai mục đích. Tuy nhiên, ở Việt Nam, cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào về mô hình lan truyền của siêu vi khuẩn này. ĐẶT VẤN ĐỀ Trang 2 Đề tài “Phát hiện và xác định Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem” được thực hiện nhằm phát hiện được một số chủng Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC ở một số bệnh viện ở Việt Nam. Qua đó giúp cho các nhà lâm sàng Việt Nam kịp thời có biện pháp cách ly, ngăn chặn sự lây lan cũng như có cái nhìn thận trọng hơn về sự lan truyền của đối tượng này. Nội dung thực hiện đề tài bao gồm các phần: + Định danh lại các chủng nghi ngờ là Klebsiella pneumoniae có tính đa kháng thu được từ một số bệnh viện tại Việt Nam. + Xác định kiểu hình tiết ESBL và carbapenemase. + Phát hiện gen blaKPC bằng phương pháp PCR. + Xác định kiểu gen blaKPC trên các chủng Klebsiella pneumoniae bằng phương pháp giải trình tự. ĐẶT VẤN ĐỀ Trang 3 1. TỒNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae 1.1.1 Đặc điểm phân loại Năm 1884, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (18531938) đã phát triển kĩ thuật nhuộm Gram để phân biệt Klebsiella pneumoniae và Streptococcus pneumoniae. Klebsiella được đặt theo tên nhà vi khuẩn học người Đức thế kỉ 19, Edwin Klebs (1834-1913) [24]. Dựa vào độ tương đồng di truyền, chi Klebsiella được chia làm 8 loài: Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella planticola, Klebsiella terrigena, Klebsiella mobilis (Enterobacter aerogenes), Klebsiella ornithinolytica và Klebsiella variicola. Klebsiella pneumoniae lại được chia làm 3 loài phụ là Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae và Klebsiella rhinoscleromatis. Sự phân chia này dựa theo sự khác nhau trong quá trình phát sinh bệnh chứ không phải dựa vào khoảng cách di truyền [24]. Trong chi Klebsiella, Klebsiella pneumoniae là thành viên quan trọng nhất về bệnh học và đã trở thành một trong những tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện nghiêm trọng trong những năm gần đây [52]. Đặc điểm phân loại của Klebsiella pneumoniae: Giới: Bacteria Ngành : Proteobacteria Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Klebsiella Loài: Klebsiella pneumoniae TỔNG QUAN Trang 4 1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa và phân bố Klebsiella pneumoniae là trực khuẩn Gram âm, không di động, có vỏ polysacharide đặc trưng. Lớp áo này giúp vi khuẩn tránh được hàng rào phòng vệ của tế bào chủ [52]. Hình 1.1 Hình kính hiển vi quét của khuẩn lạc K. pneumoniae [76] K. pneumoniae sống kị khí tùy ý, có khả năng lên men lactose. K. pneumoniae có quan hệ gần nhất với Klebsiella oxytoca, chúng phân biệt nhau nhờ phản ứng indole, K. pneumoniae có indole âm và có khả năng tăng trưởng với cả melezitose và 3-hydroxybutyrate [52]. Một số phản ứng sinh hóa của các loài trong chi Klebsiella được thống kê trong bảng 1.1. Vi khuẩn này có mặt khắp nơi trong tự nhiên như ở đất, nước, nước thải, các sản phẩm thực vật, những thức ăn có hàm lượng đường và acid cao. Một số loài trong chi Klebsilla còn được phân lập từ bề mặt rễ của một số loài thực vật với vai trò cố định nitơ. Klebsiella spp. có phổ kí chủ động vật rộng, bao gồm cả côn trùng và nhiều nhóm động vật khác. Ở người có thể tìm thấy chúng ở da, cổ họng, đường ruột, dạ dày, nước tiểu hay vết thương vô trùng [24, 52]. Nguồn phân lập phổ biến của các loài trong chi Klebsiella được mô tả trong bảng 1.2. TỔNG QUAN Trang 5 Bảng 1.1 Một số thử nghiệm sinh hóa của các loài chi Klebsiella [3] KIA/TSI Loài OXI NO2 PAD URE IND MOB CIT VP MR LDC MLO ONPG GLU LAC GAS H 2S K. pneumoniae - + + + + - - + - - + + - + + + K .oxytoca - + + + + - - + + - + + - + + + K .ornithinolytica - + + + + - - + + - + +/- + + + + K. planticola - + + + + - - + - - + + + + + + K. ozanae - + + +/- +/- - - - - - +/- - + +/- - + K. rhinoscleromatis - + + - - - - - - - - - + - + - K. terrigena - + + + + - - - - - +/- + +/- + + + Ghi chú: (-) thử nghiệm âm tính; (+) thử nghiệm dương tính; (+/-) trên 70% là dương tính. (OXI) thử nghiệm oxidase; (GLU) khả năng lên men glucose; (LAC) khả năng lên men lactose; (GAS) khả năng sinh hơi; (H2S) khả năng sinh H2S; (PAD) thử nghiệm phenylalanine deaminase, (URE) thử nghiệm urease; (IND) thử nghiệm indol; (MOB) tính di động; (CIT) khả năng biến dưỡng citrat; (VP) thử nghiệm Voges – Proskauer; (MR) thử nghiệm methyl red; (LDC) thử nghiệm decarboxylase; (MLO) khả năng biến dưỡng malonate; (ONPG) thử nghiệm ONPG. TỔNG QUAN Trang 6 Bảng 1.2 Nguồn phân lập Klebsiella [3] [4] Nguồn phân lập Loài Phân lập được từ các bệnh phẩm trên người như Klebsiella pneumoniae viêm phổi, apxe phổi, viêm phổi, viêm màng não, nhiễm trùng tiểu, nhiễm trùng huyết. Klebsiella oxytoca Phân lập được từ các bệnh phẩm trên người và gây nhiều nhiễm trùng khác nhau. Là tác nhân gây viêm mũi teo và nhiễm trùng mủ Klebsiella ozanae ở màng nhầy của mũi. Ngoài ra vi khuẩn này còn có thể phân lập được từ các nhiễm trùng: máu, nước tiểu, mô mềm. Klebsiella planticola Phân lập được từ máu, đàm, nước tiểu, vết thương Phân lập được từ nước và thực vật. Ở người, vi Klebsiella ornithinolytica khuẩn này thường được phân lập ở đường hô hấp trên, nước tiểu, dịch não tùy và máu. Phân lập được từ màng nhầy đường hô hấp, mũi Klebsiella rhinoscleromatis hầu, xoang mũi. Nguồn phân lập chính là đất và nước, có thể phân Klebsiella terrigena lập được từ phân người khỏe mạnh, đường hô hấp nhưng không gây bệnh cho người. TỔNG QUAN Trang 7 1.1.3 Các nhân tố gây bệnh Các thành viên trong chi Klebsiella đều biểu hiện 2 loại kháng nguyên bề mặt: kháng nguyên O có bản chất lipopolysaccharide và kháng nguyên vỏ K có bản chất polysaccharide. Có khoảng hơn 80 kháng nguyên K và 9 kháng nguyên O. Cả hai kháng nguyên này là cơ sở cho sự phân nhóm huyết thanh và đều góp phần vào quá trình phát sinh bệnh. Dựa vào tính biến động trong cấu trúc của những kháng nguyên này, người ta lại phân loại thành nhiều kiểu huyết thanh khác nhau. Độc tính của tất cả các loại huyết thanh dường như là như nhau [52]. Cũng như các loài khác trong họ vi khuẩn đường ruột, Klebsiella bám dính lên bề mặt tế bào chủ nhờ hệ thống lông pili được cấu tạo bởi những đơn vị protein hình cầu có khối lượng phân tử khoảng 15-26kDa. Những lông pili này có khả năng đông tụ hồng cầu của nhiều loài động vật khác nhau [52]. Để vượt qua hàng rào phòng vệ của tế bào chủ, ngoài việc thoát khỏi sự thực bào do hoạt động của các bạch cầu đa nhân, vi khuẩn phải còn phải tìm cách thoát khỏi ảnh hưởng của các chất diệt khuẩn trong huyết thanh. Hoạt tính diệt khuẩn chủ yếu qua trung gian các protein bổ thể. Bổ thể được hoạt hóa khi có hay không có kháng thể đặc hiệu nhưng đều dẫn tới hoạt hóa protein C3, hình thành opsonin C3b và sản phẩm cuối cùng là protein C5b-C9. Protein này tạo ra các kênh xuyên màng ở màng ngoài tế bào vi khuẩn làm cho Na+ được bơm vào trong, thay đổi ấp suất thẩm thấu bên trong tế bào vi khuẩn. Cho tới nay, cơ chế giúp vi khuẩn kháng huyết thanh vẫn chưa rõ. Đối với Klebsiella, giả thuyết được đưa ra là do lớp vỏ polysaccharide bao bọc và che lớp lipopolysaccharide nằm ở dưới hoặc do chuỗi bên của kháng nguyên O xuyên qua lớp vỏ tạo thành cấu trúc bề mặt không hoạt hóa bổ thể [52]. Để tăng trưởng được trong mô tế bào chủ, vi khuẩn phải được cung cấp đủ sắt. Đây là nhân tố thiết yếu cho sự tăng trưởng của vi khuẩn, có chức năng xúc tác các phản ứng oxi hóa khử trong quá trình truyền điện tử. Tuy nhiên, do nguồn sắt tự TỔNG QUAN Trang 8 do trong tế bào chủ rất thấp nên nhiều vi khuẩn đảm bảo đủ lượng sắt cho tăng trưởng bằng cách tiết ra những chất kìm phân tử lượng nhỏ, có ái lực cao với sắt được gọi là các siderophore. Ở Klebsiella người ta nhận thấy đã có sự sản xuất hai loại siderophore là enterobactin và aerobactin [24, 52]. 1.1.4 Đặc điểm gây bệnh và tình hình đề kháng kháng sinh Klebsiella là tác nhân đứng thứ 2 sau E.coli gây nhiễm khuẩn bệnh viện và cộng đồng. Chúng có thể gây bệnh viêm phổi, apxe phổi, viêm màng phổi và những nhiễm trùng ngoài phổi như viêm ruột, viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn đường tiết niệu. Yếu tố nguy cơ để nhiễm các chủng này ở bệnh viện là do bệnh nhân thời gian nằm viện kéo dài, hệ miễn dịch suy yếu, nằm chung giường với người nhiễm bệnh hay thực hiện những thủ thuật xâm lấn như đặt ống thông tiểu, đặt nội khí quản,…Tuy nhiên, nhiễm khuẩn bệnh viện do Klebsiella tăng cao chủ yếu do việc sử dụng kháng sinh làm gia tăng những chủng kháng thuốc [24, 52]. Tính đề kháng kháng sinh của các thành viên trong gia đình Klebsiella rất cao. Tất cả đã đề kháng với ampicillin do sự có mặt của gen mã hóa sản xuất betalactamase đặc hiệu cho penicillin. Thông thường, các enzyme beta-lactamase vốn có này còn nhạy cảm với các chất ức chế beta-lactamase như acid clavulanic, tuy nhiên từ năm 1982 tại Đức đã xuất hiện K. pneumoniae có tính đa kháng do tiết được men beta-lactamase phổ rộng hay còn gọi là ESBL (extended spectrum betalactamase). Các enzyme này được truyền qua trung gian plasmid nên có tính chất lây lan trên diện rộng, tính nhạy cảm giảm hẳn với các thuốc ức chế betalactamase, và nguy hiểm hơn lại có tính đa kháng thông qua trung gian plasmid với các họ kháng sinh khác như với aminoglycoside. Đối với các chủng tiết ESBL, việc lựa chọn kháng sinh điều trị rất khó khăn do chúng kháng được với nhiều loại kháng sinh. Carbapenem (imipenem, ertapenem, meropenem) được coi là kháng sinh có tác dụng nhất. Tuy nhiên, “siêu vi khuẩn” K. pneumoniae có khả năng kháng carbapenem với một số cơ chế khác nhau đang bùng phát và trở thành mối nguy cho sức khỏe cộng đồng [52]. TỔNG QUAN Trang 9 1.2 Carbapenem và cơ chế kháng carbapenem 1.2.1 Carbapenem Carbapenem là một phân lớp của kháng sinh beta-lactam, có phổ kháng khuẩn rộng nhất so với các phân lớp khác của beta-lactam như penicillin, các thế hệ cephalosporin. Carbapenem có nguồn gốc là một dẫn xuất của thienamycin, một hợp chất tự nhiên do Streptomyces cattlaya tiết ra [15, 60]. Carbapenem với cấu trúc hơi giống penicillin, gồm 1 vòng beta-lactam hình vuông nối kết với 1 vòng 5 cạnh, nhưng khác với penicillin ở chỗ nguyên tố lưu huỳnh thay bằng gốc methylen và có thêm 1 dấu nối đôi . Cấu trúc đặc biệt của carbapenem tạo ra 3 đặc tính giúp carbapenem có phổ tác dụng rộng: (1) những phân tử này rất nhỏ và có khả năng sử dụng những lỗ hổng rất nhỏ của màng ngoài vi khuẩn Gram âm để tiếp xúc với PBP (penicillin-binding protein); (2) cấu trúc của carbapenem làm cho kháng sinh này khó bị beta-lactamase của nhiều loại vi khuẩn cắt đứt vòng beta-lactam; (3) carbapenem có ái lực với nhiều PBP khác nhau của nhiều loại vi khuẩn. Penicilline [75] Carbapenem [74] Hình 1.2 Cấu trúc của penicillin và carbapenem TỔNG QUAN Trang 10 Bảng 1.3 Phân lớp các kháng sinh beta-lactam [2] Lớp kháng sinh Penicilin Lớp phụ Tên kháng sinh Penicillin Penicillin Aminopenicillin Amoxillin, ampicillin Ureidopenicillin Azlocillin, mezlocillin, piperacillin. Carboxylpenicillin Carbenicillin, ticarcillin Penicillinase- bền penicillin Cloxacillin, dicloxacillin, methincillin, nafcillin, oxacillin Amidinopenicillin Mecillinam Ampicillin/sulbactam β-lactam/hợp chất ức chế β-lactam Amoxicillin/clavulanate Ticarcillin/clavulanate Piperacillin/Tazobactam Cephalosporin I Cefazolin, cephalothin, cephapirin, cephradine Cephalosporin II Cefamandole, cefocicid, ceftaroline, cefuroxime (sodium) Cephalosporin III Cefoperazone, cefotaxime, ceftazidime, ceftizoxime, ceftiaxone Cephalosporin IV Cefepime Cephamycin Cefmetazole, cefotetan, cefoxitin Cephalosporin Cefator, cefadroxil, cefdinir, cefditoren, cefetamet, cefixime, cefpodoxime (axetil), cefprozil, ceftibuten, cefuroxime, cephalexin, cepharadine Carbacephem Locacarbef Cephem (chích) Cefem (uống) Monobactam Penems Aztreonam Carbapenem Imipenem, meropenem, doripenem, ertapenem, cefmetazole Penem Faropenem TỔNG QUAN