Tài liệu Phát hiện người mang đột biến gen atp7b trong các thành viên gia đình bệnh nhân wilson.

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM pu VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nguyễn Thị Mai Hương PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG ĐỘT BIẾN GEN ATP7B TRONG CÁC THÀNH VIÊN GIA ĐÌNH BỆNH NHÂN WILSON LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2018 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MAI HƯƠNG PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG ĐỘT BIẾN GEN ATP7B TRONG CÁC THÀNH VIÊN GIA ĐÌNH BỆNH NHÂN WILSON Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 9 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. GS. TS. Tạ Thành Văn Trường Đại học Y Hà Nội 2. GS. TS. Phan Văn Chi Viện Công nghệ sinh học Lời cảm ơn Nghiên cứu được thực hiện dưới sự hỗ trợ, giúp đỡ của rất nhiều người. Tôi xin được trân trọng cảm ơn và luôn luôn ghi nhớ! Lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin gửi đến toàn bộ bệnh nhân Wilson và gia đình họ. Nếu không có sự hợp tác nhiệt tình của họ, tôi đã không thể hoàn thành được nghiên cứu này. Tôi xin trân trọng cảm ơn hai người thầy: GS.TS. Tạ Thành Văn, Trường Đại học Y Hà Nội và GS.TS. Phan Văn Chi, Viện Công nghệ sinh học đã hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi trong thời gian qua. Tôi vô cùng biết ơn PGS.TS. Trần Vân Khánh, Trường đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ và góp ý tận tình cho tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các vị lãnh đạo Bệnh viện Nhi Trung Ương và các anh, chị đồng nghiệp, đặc biệt là TS.BS Nguyễn Phạm Anh Hoa, Trưởng Khoa Gan-Mật đã tạo điều kiện giúp đỡ trong quá trình nghiên cứu Tôi thực sự xúc động và tự hào bởi sự hỗ trợ nhiệt tình, sự động viên, chia sẻ của lãnh đạo và các đồng nghiệp tại Khoa Di truyền và Sinh học phân tử, nơi tôi đang công tác, để tôi hoàn thành nhiệm vụ và nghiên cứu của tôi! Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô và các anh, chị tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu hệ gen đã giúp đỡ tôi trong những chặng đường đã qua. Bố, mẹ đã mang tôi đến với cuộc sống, luôn dõi theo, cổ vũ và hỗ trợ! Tôi xin dành tặng kết quả nhỏ bé này tới bố mẹ tôi! Tôi cũng vô cùng cảm ơn sự chia sẻ, giúp đỡ của các em tôi, của những người bạn dành cho tôi. Họ là động lực để tôi luôn luôn cố gắng không ngừng. Chồng và các con của tôi là những người thân yêu nhất ở bên cạnh tôi, luôn động viên và yêu thương vô bờ bến! Đặc biệt, tôi muốn được chia sẻ niềm vui này với một thiên thần nhỏ trong gia đình tôi, con là lý do để tôi sống tốt hơn mỗi ngày. Vì con, tôi nguyện cố gắng để làm được những điều có ý nghĩa với gia đình, với cuộc sống và đặc biệt là với bệnh nhân của tôi. Nguyễn Thị Mai Hương i Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả phối hợp với một số đồng nghiệp khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Hà Nội, ngày 29 tháng 06 năm 2018 Tác giả Nguyễn Thị Mai Hương ii MỤC LỤC 1.1. 1.2. 1.3. MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................. 3 Lịch sử nghiên cứu bệnh Wilson ............................................................ 3 1.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................ 3 1.1.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ........................................................... 6 Dịch tễ học và phân loại bệnh Wilson .................................................... 8 1.2.1. Dịch tễ học ................................................................................................ 8 1.2.2. Phân loại bệnh ........................................................................................... 9 Cơ sở di truyền phân tử bệnh Wilson .................................................... 9 1.3.1. Vị trí, cấu trúc phân tử gen ATP7B ........................................................... 9 1.3.2. Cấu trúc và chức năng protein ATP7B ..................................................... 9 1.3.3. Đặc điểm đột biến gen ATP7B ................................................................ 11 1.4. Cơ chế bệnh sinh bệnh Wilson ............................................................... 14 1.5. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng, tiêu chuẩn chẩn đoán, điều trị bệnh Wilson ......................................................................................... 18 1.6. 1.7. 1.5.1. Đặc điểm lâm sàng .................................................................................... 18 1.5.2. Đặc điểm cận lâm sàng, tiêu chuẩn chẩn đoán và điều trị 23 bệnh Wilson ............................................................................................... Phát hiện người mang gen ATP7B bị đột biến và chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson ........................................................................... 26 1.6.1. Phát hiện người mang gen ATP7B bị đột biến ................................ 26 1.6.2. Chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson ........................................................... 27 Các kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng trong chẩn đoán xác định bệnh Wilson ..................................................................................... 28 1.7.1. Giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger ................................ 28 1.7.2. Một số phương pháp khác được dùng trong phát hiện đột 29 biến gen ATP7B ......................................................................................... 1.7.3. Phương pháp phân tích đột biến mới......................................................... 31 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.... 33 2.1. 2.2. 2.3 Đối tượng nghiên cứu .............................................................................. 33 2.1.1. Nhóm bệnh nhân và các thành viên trong gia đình ................................ 33 2.1.2. Nhóm chẩn đoán trước sinh ................................................................ 33 2.1.3. Tiêu chuẩn lựa chọn .................................................................................. 33 2.1.4. Tiêu chuẩn loại trừ..................................................................................... 35 Hóa chất và thiết bị .................................................................................. 36 2.2.1. Hóa chất ................................................................................................ 36 2.2.2. Thiết bị và các loại tiêu hao................................................................ 38 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 38 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu ................................................................................... 38 2.3.2. Xây dựng phả hệ và thu thập mẫu ............................................................. 38 2.3.3. Phương pháp sử dụng trong phát hiện đột biến gen ATP7B 42 cho bệnh nhân Wilson và các thành viên trong gia đình ........................... 2.3.4. Phương pháp sử dụng trong chẩn đoán trước sinh cho thai nhi ................ 47 2.4 Đạo đức nghiên cứu ................................................................................. 49 2.5 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................... 49 2.6. Sơ đồ nghiên cứu ...................................................................................... 49 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................. 51 3.1. Kết quả xác định đột biến gen ATP7B cho các thành viên trong gia đình bệnh nhân Wilson ..................................................................... 51 3.2. 3.1.1. Phát hiện đột biến gen ATP7B cho 78 bệnh nhân Wilson ......................... 51 3.1.2. Xác định đột biến gen ATP7B cho các thành viên gia đình 74 bệnh nhên Wilson ...................................................................................... Chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson ....................................................... 88 3.2.1. Kết quả tách DNA tổng số từ dòng tế bào ối và PCR ............................... 88 3.2.2. Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson ............................................... 89 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ .................................................... 93 4.1. 4.2. Phát hiện đột biến gen ATP7B cho các thành viên trong gia đình 96 bệnh nhân Wilson .................................................................................... 4.1.1. Đặc điểm đột biến gen ATP7B của 78 bệnh nhân Wilson ........................ 96 4.1.2. Ý nghĩa của sàng lọc đột biến cho các thành viên gia đình bệnh nhân Wilson ...................................................................................... 109 Ý nghĩa của chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson ................................... 119 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 122 NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ............................................................................... 124 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH ......................................... 125 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................... 131 PHỤ LỤC.................................................................................................. 1 Phụ lục 1. Danh sách bệnh nhân, kết quả tách DNA tổng sổ và phân tích đột biến gen của 78 bệnh nhân và các thành viên trong 55 phả hệ .... 1 Phụ lục 2. Danh sách và kiểu gen của 78 bệnh nhân Wilson .................... 16 Phụ lục 3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR 21 exon của gen ATP7B ....... 21 Phụ lục 4. Trình tự đột biến gen của bệnh nhân có đột biến mới IVS20+4A>G ............................................................................................. 22 Phụ lục 5. Bảng mã di truyền và viết tắt các acid amin ............................. 23 Phụ lục 6. Phả hệ và trình tự đột biến gen của các phả hệ được phát hiện sớm người mắc bệnh Wilson chưa có biểu hiện lâm sàng................. 24 Phụ lục 7. Kết quả sàng lọc đột biến đích cho các thành viên trong gia đình bệnh nhân mã số WBW120501 ......................................................... 30 Phụ lục 8. Kết quả tách DNA của 3 mẫu dịch ối sau nuôi cấy .................. 32 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên đầy đủ Nghĩa tiếng việt ARMS Amplification refractory mutation Hệ thống đột biến chịu nhiệt system nhân bản ATOX1 Antioxidant protein 1 ATP Adenosine triphosphate ATP7A ATPase copper transporting alpha ATP vận chuyển đồng, chuyển đồng, chuỗi alpha ATP7B ATPase copper transporting beta ATP vận chuỗi beta bp base pair Cặp bazơ cDNA complementary DNA DNA bổ sung CTR1 Copper transporter Chất vận chuyển đồng cs Cộng sự Cu Đồng DNA Desoxyribonucleic acid ddNTP Dideoxynucleotide triphosphate dNTP Deoxynucleotide triphosphate EtBr Ethidium bromide h hour kb kilo base kDa kilo Dalton KF Kayser-Fleischer MDD Maximum dependence Phụ thuộc tối đa mô hình Decompositon Model phân hủy Multiplex Ligat on-dependent Kỹ thuật khuếch đại đa mồi Probe Amplification dựa vào phản ứng nối Markov Model Mô hình Markov MLPA MM giờ vi MM/MM Missense mutation/ Missense Đột biến sai nghĩa/Đột biến mutation sai nghĩa mRNA messenger RNA RNA thông tin MRI Magnetic resonance imaging Chụp cộng hưởng từ RNA Ribonucleic acid NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp RFLP Restricted fragment length Đa hình đột dài đoạn cắt giới polymorphism hạn Servere mutation/Servere Đột biến nghiêm trọng/Đột mutation biến nghiêm trọn Servere mutation/Missense Đột biến nghiêm trọng/Đột mutation biên sai nghĩa SNPs Single nucleotide polymorphisms Đa hình nucleotid đơn TGE Thr-Gly-Glu TGEA Thr-Gly-Glu-Ala TM Transmembrane Xuyên màng UTR Untranslated region Vùng không dịch mã WMM Weight Matrix Model Mô hình ma trận trọng lượng SM/SM SM/MM vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Bảng điểm Leipzig 2001 trong chẩn đoán bệnh Wilson ........................ 34 Bảng 2.2 Các cặp mồi dùng trong PCR và giải trình tự gen ATP7B ..................... 37 Bảng 2.3 Thành phần PCR ....................................................................................... 43 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng giải trình tự gen .................................................... 43 Bảng 3.1 Phân bố bệnh nhân theo giới và độ tuổi phát bệnh trung bình ............. 52 Bảng 3.2 Phân bố bệnh nhân theo địa phương ................................................... 52 Bảng 3.3 Kiểu gen của 78 bệnh nhân Wilson .................................................... 53 Bảng 3.4 Tỷ lệ các đột biến gen ATP7B trong nghiên cứu ................................ 55 Bảng 3.5 Các đa hình trên gen ATP7B được phát hiện trong nghiên cứu ........... 64 Bảng 3.6 Tỷ lệ phát hiện đột biến trên các vùng gen ATP7B ............................. 64 Bảng 3.7 Kết quả phân tích đột biến mới bằng chương trình tin sinh ................. 69 Bảng 3.8 Kiểu gen, đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của 7 bệnh nhân Wilson có đột biến mới ................................................................ 70 Bảng 3.9 Kết quả phân tích đột biến vùng cắt, nối của gen ATP7B.................... 72 Bảng 3.10 Kết quả sàng lọc đột biến gen ATP7B cho các thành viên của 55 phả hệ............................................................................................ 74 Bảng 3.11 Tỷ lệ người mang gen bệnh ở bố, mẹ của bệnh nhân Wilson .............. 75 Bảng 3.12 Tỷ lệ người mang gen bệnh ở nhóm anh, chị, em ruột của bệnh nhân Wilson ....................................................................................... 75 Bảng 3.13 Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của 13 trường hợp bị Wilson được phát hiện qua sàng lọc gia đình................................ 76 Bảng 3.14 Đặc điểm cận lâm sàng, kiểu gen và điểm chẩn đoán của 5 trường hợp mắc Wilson chưa có biểu hiện lâm sàng ........................... 83 Bảng 3.15 Tỷ lệ người mang gen bệnh ở nhóm họ hàng của bệnh nhân................. 86 Bảng 3.16 Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson............................................. 89 Bảng 4.1 Đột biến thường gặp trên gen ATP7B trong nghiên cứu và một số nước châu Á .................................................................................. 103 viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Gen ATP7B và protein ATP7B-ATPase tương ứng ở người ................. 10 Hình 1.2 Quá trình chuyển hóa đồng trong gan ..................................................... 17 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................ 50 Hình 3.1 Trình tự gen của bệnh nhân mã số WBW160802 ................................ 57 Hình 3.2 Trình tự gen của bệnh nhân mã số WBW100604 ................................ 58 Hình 3.3 Trình tự gen của bệnh nhân mã số WBW160609 ................................59 Hình 3.4 Trình tự gen của bệnh nhân mã số WBW170704 ................................60 Hình 3.5 Trình tự gen của bệnh nhân mã số WBW160507 ................................61 Hình 3.6 Trình tự gen của bệnh nhân mã số WBW160507 ................................ 62 Hình 3.7 Trình tự gen của bệnh nhân mã số WBW140801 ................................ 63 Hình 3.8 Biểu đồ tỷ lệ phát hiện đột biến trên các vùng gen ATP7 .................... 65 Hình 3.9 Vị trí và tỷ lệ các đột biến gen ATP7B trong nghiên cứu ..................... 66 Hình 3.10 Sơ đồ các bước phát hiện đột biến gen ATP7B cho bệnh nhi mắc bệnh Wilson ...................................................................................... 68 71 Hình 3.11 Kết quả phân tích đột biến F1026Y bằng chương trình SIFT ............... Hình 3.12 Kết quả phân tích đột biến F1026Y bằng chương trình Polyphen-2 và MutationTaster ................................................................ 71 Hình 3.13 Kết quả phân tích đột biến IVS20+4A>G bằng phần mềm 73 BDGP ........................................................................................................ 78 Hình 3.14 Phả hệ của gia đình bệnh nhân WBW160101 và WBW160602 ........... 79 Hình 3.15 Trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số WBW160101 .................... 80 Hình 3.16 Trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số WBW160602 .................... 81 Hình 3.17 Phả hệ của gia đình bệnh nhân mã số WBW160904 ............................. 82 Hình 3.18 Trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số WBW160904 .................. 84 Hình 3.19 Phả hệ của gia đình bệnh nhân mã số WBW100901 ............................. Hình 3.20 Trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số WBW100901 ....................85 86 Hình 3.21 Phả hệ của gia đình bệnh nhân mã số WBW120501 ............................. 87 Hình 3.22 Trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số WBW120501 .................... ix 88 Hình 3.23 Điện di sản phẩm PCR của 3 mẫu chẩn đoán trước sinh ....................... 90 Hình 3.24 Phả hệ gia đình thai phụ mã số AFW151105 ......................................... 91 Hình 3.25 Trình tự gen của gia đình thai phụ mã số AFW151105 ......................... 92 Hình 3.26 Phả hệ gia đình thai phụ mã số AFW150804 ......................................... 93 Hình 3.27 Trình tự gen của gia đình thai phụ mã số AFW150804 ......................... 94 Hình 3.28 Phả hệ gia đình thai phụ mã số AFW160501 ......................................... 95 Hình 3.29 Trình tự gen của gia đình thai phụ mã số AFW160501 ......................... Hình 4.1 Biểu đồ các exon của gen ATP7B có tỷ lệ phát hiện đột biến cao trong nghiên cứu và các nghiên cứu khác ........................................ 106 x 1 1. MỞ ĐẦU Bệnh Wilson là một bệnh di truyền lặn hiếm gặp trên thế giới với tỷ lệ mắc từ 1/5000 đến 1/30000 trẻ đẻ sống do đột biến gen ATP7B. Gen ATP7B mã hóa protein ATPase, có chức năng vận chuyển đồng từ gan để bài tiết ra ngoài thông qua mật. Rối loạn chức năng protein ATPase là nguyên nhân dẫn đến đồng tích lũy phần lớn tại gan và một số cơ quan khác chẳng hạn như não, thận và do đó gây ra các bệnh liên quan đến gan, tâm thần và thần kinh. Wilson là bệnh có biểu hiện lâm sàng vô cùng phong phú và phát bệnh ở nhiều độ tuổi khác nhau. Trên thực tế, bệnh nhân Wilson ở Việt Nam thường được chẩn đoán ở giai đoạn muộn do bệnh nhân không có điều kiện khám, chữa bệnh hoặc do không được thăm khám đúng chuyên khoa vì kiểu hình của bệnh rất đa dạng. Nếu bệnh nhân Wilson không được chẩn đoán và điều trị sớm, đồng dư thừa sẽ tích lũy trong các mô của cơ thể, làm tổn thương nghiêm trọng các cơ quan này và có thể tử vong do suy gan cấp và suy gan tối cấp. Bởi vậy chẩn đoán xác định bệnh Wilson có ý nghĩa quan trọng trong thực hành lâm sàng và tiên lượng bệnh. Bệnh Wilson có thể được chẩn đoán theo thang điểm Leipzig nhưng khi đó bệnh nhân đã có nhiều triệu chứng khiến cho việc điều trị bệnh tốn kém và gặp nhiều khó khăn. Trong khi xét nghiệm di truyền dựa trên phát hiện đột biến gen ATP7B không những là phương pháp duy nhất được sử dụng trong chẩn đoán xác định bệnh ở bất kì giai đoạn nào của bệnh mà còn là xét nghiệm được dùng để chẩn đoán phân biệt bệnh Wilson với nhiều bệnh lý khác liên quan đến gan và thần kinh chưa rõ nguyên nhân. Đặc biệt, người mắc bệnh Wilson chưa có biểu hiện lâm sàng chỉ có thể được phát hiện sớm bằng xét nghiệm di truyền. Khi được chẩn đoán sớm, bệnh nhân sẽ được điều trị sớm, tiết kiệm chi phí chữa bệnh, tránh các biểu hiện và biến chứng nguy hiểm. Một trong những nghĩa quan trọng khác của phân tích đột biến gen ATP7B là vai trò của nó trong phát hiện người mang gen bệnh Wilson. Nếu bệnh nhân Wilson có thể được chẩn đoán theo thang điểm Leipzig thì người mang gen bệnh không thể 2 phát hiện được bởi họ hầu như không có biểu hiện lâm sàng và bất thường trên xét nghiệm sinh hóa. Vì vậy, xét nghiệm di truyền là phương pháp duy nhất để xác định người mang gen bệnh, đặc biệt trong các trường hợp sàng lọc đột biến gen ATP7B cho người hiến tạng trước khi ghép gan cho bệnh nhân Wilson thể suy gan tối cấp bởi người hiến tạng phù hợp phải là người không bị bệnh hoặc không mang gen bệnh Wilson. Hơn thế nữa, phát hiện người mang gen bệnh còn là cơ sở của tư vấn di truyền tiền hôn nhân và chẩn đoán trước sinh nhằm giảm tỷ lệ sinh con mắc bệnh và nâng cao chất lượng cuộc sống của người bệnh và gia đình. Cho đến nay, một số nghiên cứu về đột biến gen ATP7B ở Việt Nam đã được thực hiện trên qui mô nhỏ nên chưa đại diện cho đặc điểm đột biến gen ATP7B ở người Việt Nam, cũng như chưa xác định được tần suất các loại đột biến gen. Việc phát hiện đột biến cho bệnh nhân Wilson cần thực hiện trên toàn bộ gen ATP7B khiến cho chi phí xét nghiệm rất tốn kém và cần nhiều thời gian, có thể ảnh hưởng đến điều trị bệnh. Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài “Phát hiện người mang đột biến gen ATP7B trong các thành viên gia đình bệnh nhân Wilson” được thực hiện nhằm phát hiện đột biến thường gặp và vùng thường xảy ra đột biến của gen ATP7B ở Việt Nam để từ đó xây dựng quy trình phát hiện đột biến cho bệnh nhân Wilson, đồng thời phát hiện sớm người bệnh chưa có biểu hiện lâm sàng và người mang gen bệnh để làm cơ sở tư vấn di truyền, điều trị, tiên lượng bệnh và chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson. Xét nghiệm di truyền đã mở ra một bước tiếp cận mới trong chẩn đoán và điều trị bệnh Wilson nói riêng và các bệnh di truyền nói chung ở Việt Nam. Chẩn đoán và điều trị sớm không chỉ giúp các bệnh nhân Wilson cải thiện chất lượng sống, hòa nhập tốt với cộng đồng, giảm chi phí điều trị mà còn giúp tư vấn di truyền cho người bệnh và gia đình họ. Vì vậy, nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu sau: 1. Phát hiện người mang đột biến gen ATP7B cho các thành viên trong gia đình có tiền sử mắc bệnh Wilson. 2. Bước đầu chẩn đoán trước sinh cho thai phụ có tiền sử sinh con mắc bệnh Wilson. 3 1. CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH WILSON 1.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Bệnh Wilson là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường (NST) thường do đồng lắng đọng ở các mô trong cơ thể, nhiều nhất ở gan và não. Biểu hiện lâm sàng của bệnh chủ yếu liên quan đến bệnh gan, thần kinh, tâm thần (Ferenci và cs, 2012). Năm 1850, Wilson lần đầu tiên được báo cáo là một hội chứng mang đặc điểm lâm sàng có tính chất di truyền hay bệnh thoái gan (Aoki, 2004).Năm 1912, bệnh Wilson được nhà thần kinh học người Anh, Samuel Alexander Kinnier Wilson (1878-1937) mô tả là bệnh “thoái hóa tiến triển hình hạt đậu”, mang tính chất gia đình, có thể tử vong do bệnh thần kinh kèm theo các bệnh về gan mạn tính dẫn tới xơ gan. Nghiên cứu mô tả đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng được thực hiện trên bệnh nhân Wilson đã cho thấy mối liên quan giữa các bất thường trên xét nghiệm sinh hóa và di truyền (Das và cs, 2006). Năm 1993, gen ATP7B gây bệnh Wilson đã được tách dòng thành công. Gen ATP7B là một thành viên của nhóm ATPase vận chuyển cation (Yamaguchi và cs, 1993; Tanzi và cs, 1993). Năm 1994, gen ATP7B đã được mô tả cấu trúc và chức năng một cách đầy đủ (Wu và cs, 1994). Từ đó, gen ATP7B được nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới bằng nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm: PCR (Polymerase Chain Reaction), PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restricted Fragment Length Polymorphism) và giải trình tự gen. Người châu Âu và Địa Trung Hải có lượng đột biến rất phong phú, đột biến thường gặp nhất là H1069Q (Ferenci, 2006; Loudianos và cs, 1999), đột biến thay thế Histidin thứ 1069 trên chuỗi polypeptid thành Glutamin (Phụ lục 5-Bảng mã di truyền và kí hiệu viết tắt của các acid amin). Nghiên cứu phát hiện đột biến từ exon 5 đến exon 21, tác giả Shah đã phát hiện 27 đột biến khác nhau, bao gồm 5 đột biến mất đoạn hoặc thêm đoạn (dẫn 4 đến làm dịch khung đọc mở), 16 đột biến thay thế nucleotid (do bị thay đổi bộ ba), 2 đột biến vô nghĩa (đột biến tạo mã kết thúc sớm) và 2 đột biến vùng cắt, nối (Shah và cs, 1997; Nussbaum và cs, 2007), trong đó đột biến H1069Q là phổ biến nhất. Đây cũng là đột biến có tỷ lệ phát hiện cao nhất (37%) trong số 50 đột biến tìm thấy trong nghiên cứu gồm 136 bệnh nhân mắc Wilson đến từ Italia, Thổ Nhĩ Kì, Tây Ban Nha và đột biến tìm thấy thường ở thể đột biến dị hợp tử kép (Loudianos và cs, 1999) và Hungary (Firneisz và cs, 2002). Nghiên cứu đột biến gen ATP7B được thực hiện ở một số nước khu vực Đông Á chẳng hạn như Trung Quốc (Liu và cs, 2004; Wu và cs, 2000; Wu và cs, 2001; Li và cs, 2011), Hàn Quốc (Yoo và cs, 2002; Gu và cs, 2003; Park và cs, 2007; Lee và cs, 2011), Đài Loan (Wan và cs, 2006; Lin và cs, 2010) và Nhật Bản (Okada và cs, 2000; Kusuda và cs, 2000). Ngoài ra, nghiên cứu đột biến gen ATP7B đã được hự chiện trên người Iran (Maleki và cs, 2013). Một số quốc gia khác chẳng hạn như: Pakistan, Bangladesh, Indonesia, Philippine hiện vẫn chưa có công bố về đột biến gen ATP7B (Ferenci và cs, 2007). Ở khu vực Đông Nam Á, nghiên cứu phát hiện đột biến gen ATP7B rất hiếm gặp hoặc được thực hiện với cỡ mẫu nhỏ. Một nghiên cứu trên người Thái Lan đã phát hiện 2 đột biến, c.1870_1871delGA trên exon 6 và M1359V trên exon 20 (Treepongkaruna và cs, 2010), tuy nhiên đây không phải là đột biến phổ biến ở Châu Á (Ferenci, 2006). Đột biến mới trên gen ATP7B được công bố trong nhiều y văn quốc tế (Kusuda và cs, 2000; Leggio và cs, 2006; Kuppala và cs, 2009; Geng và cs, 2013) và cần tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của chúng đến chức năng của gen ATP7B. Các đột biến này được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau, chẳng hạn như: nghiên cứu in silico (sử dụng các chương trình tin sinh để đánh giá ảnh hưởng của đột biến đến cấu trúc và chức năng của gen), in vivo, in vitro (Squitti và cs, 2014; Dong và cs, 2016) và nghiên cứu mô hình cấu trúc không gian của gen (Huster và cs, 2012) để đánh giá ảnh hưởng của đột biến mới đến cấu trúc, chức năng của protein. Nghiên cứu thực nghiệm in vivo hoặc in vitro trên tế bào nấm men hoặc tế bào động vật có ý vai trò tiên quyết để khẳng định chắc chắn đột biến mới 5 trên gen ATP7B là đột biến gây bệnh hay không gây bệnh (Forbes và Cox, 1998; Squitti và cs, 2014). Một số đột biến là đột biến gây bệnh khi phân tích bằng các chương trình tin sinh, trong khi nghiên cứu thực nghiệm lại có kết quả ngược lại, chẳng hạn kết quả phân tích hàm cPdel cho thấy đột biến M645R, V995A, R1041W, R1041P, A1183T... là những đột biến gây bệnh nhưng nghiên cứu thực nghiệm cho thấy những đột biến trên không ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển đồng. Ngoài ra, đột biến M769V, L776V chưa được phân loại một cách chắn chắn là đột biến gây bệnh hay là một biến dị (variant). Nghiên cứu ở mức độ chức năng của protein nhờ biểu hiện gen trong nấm men đã cho thấy M769V là đột biến gây bệnh và L776V chỉ là một biến dị hiếm gặp hoặc là một đột biến ảnh hưởng đến quá trình định vị nội bào của protein ATP7B, qua đó làm giảm lượng đồng nội bào (Forbes và Cox, 1998). Việc phân tích, đánh giá đột biến mới luôn cần có sự kết hợp của nhiều chương trình tin sinh và quan trọng nhất vẫn là thực hiện các nghiên cứu đột biến mới ở mức độ protein (Forbes và Cox, 1998; Park và cs, 2007). Từ năm 1995, nghiên cứu về chức năng của gen ATP7B đã được thực hiện trên các chủng nấm men (Forbes và Cox, 1998), tế bào CHO-K1 (Cater và cs, 2007; Wan và cs, 2010) để nghiên cứu ảnh hưởng của các đột biến gen ATP7B đến quá trình vận chuyển đồng. Nghiên cứu in vivo và in vitro có thể phân biệt được ảnh hưởng của đột biến gen đến quá trình cuộn gập của protein (protein folding) hoặc chức năng của protein. Theo tác giả Huster, đột biến D1027A ảnh hưởng đến năng suất vận chuyển đồng do phá vỡ quá trình thủy phân mặc dù nó không ảnh hưởng đến việc liên kết đồng (Huster và cs, 2012). Đột biến vùng mã hóa và không dịch mã được nghiên cứu bằng phương pháp cách tách dòng gen và tạo đột biến điểm trực tiếp. Dòng tế bào có đột biến điểm được chuyển vào các tế bào CHO-K1 để đánh giá ảnh hưởng của các đột biến này đến chức năng của gen. Kết quả cho thấy, đột biến sai nghĩa vùng điều khiển gen đã làm giảm hoạt tính của vùng điều khiển gen, từ 13 đến 51%. Nghiên cứu biểu hiện tế bào bị đột biến vùng cắt nối của exon 12 trên tế bào CHOK1 cho thấy thể bị đột biến bị giảm khả năng vận chuyển đồng đến 80% so với thể không bị đột biến (Wan và cs, 2010). 6 Wilson là bệnh lý đặc biệt bởi sự liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình. Kiểu hình của bệnh Wilson không chỉ phụ thuộc vào thể đột biến, mà còn phụ thuộc vào từng loại đột biến cụ thể xảy ra trên các vị trí khác nhau của gen ATP7B (Fan và cs, 2000; Lei và cs, 2004; Bie và cs, 2007; Chang và cs, 2017). Tuy nhiên, phần lớn y văn báo cáo kết quả nghiên cứu một số đột biến thường gặp đến biểu hiện lâm sàng của bệnh. Theo đó, bệnh nhân bị đột biến đồng hợp tử R778L có biểu hiện bệnh từ sớm và lâm sàng nặng của thể bệnh gan (Forbes và Cox, 1998; Kusuda và cs, 2000). Trong khi, đột biến R778Q được tìm thấy trên người Đài Loan gây ra hậu quả ít nghiêm trọng hơn so với đột biến R778L, mặc dù Glutamin có tính chất gần với Arginin hơn là Leucin (Forbes và Cox, 1998). Đột biến dị hợp tử R778L trên gen ATP7B (ví dụ kiểu gen c.2871delC/R778L) không ảnh hưởng nhiều đến kiểu hình của bệnh nhân Wilson (Okada và cs, 2000) nhưng một số nghiên cứu khác đã không thể khẳng định mối liên quan giữa đột biến đồng tử R778L và các triệu chứng lâm sàng của bệnh gan ở bệnh nhân Wilson (Bie và cs, 2007). Bệnh nhân bị đột biến đồng hợp tử R779L thường có vấn đề về ngôn ngữ, cử động lưỡi và bệnh biểu hiện muộn, thường từ 18 tuổi, trong khi bệnh nhân dị hợp tử với đột biến này có thể được chia thành hai nhóm: nhóm có vấn đề về cử động lưỡi và nhóm có vấn đề về nội tạng (Fan và cs, 2000); đồng hợp tử đột biến H1069Q không liên quan đến mức độ biểu hiện của bệnh (Anjali và cs, 1997) nhưng có thể ảnh hưởng đến độ tuổi phát bệnh và thể bệnh thần kinh (Firneisz và cs, 2002; Bie và cs, 2007); bệnh nhân bị đột biến đồng hợp tử G943S, V1106I biểu hiện bệnh muộn và ảnh hưởng đến thần kinh (Forbes và Cox, 1998; Lei và cs, 2004). Bệnh nhân Wilson có kiểu gen đồng hợp tử đột biến A874V thường biểu hiện bệnh liên quan đến thần kinh và phát bệnh muộn (Kusuda và cs, 2000). 1.1.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam Năm 1965, bệnh Wilson trên người Việt Nam được Scheinberg mô tả lần đầu tiên trong y văn báo cáo khái quát về bệnh Wilson, bao gồm các đặc điểm di truyền, đặc điểm lâm sàng và sự phân bố địa lý của bệnh Wilson trên thế giới (Scheinberg 7 và cs, 1965). Năm 2005, tác giả Thái Duy Thành đã phân tích các triệu chứng lâm sàng của bệnh Wilson, một số thay đổi trên hình ảnh học và chỉ số sinh hóa (Thái Duy Thành, 2005). Năm 2006, tác giả Lê Đức Hinh đã mô tả đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân Wilson. Tuy nhiên, nghiên cứu đã không tiến hành phát hiện đột biến gen ATP7B (Lê Đức Hinh và cs, 2006). Năm 2008, tác giả Hoàng Lê Phúc là người đầu tiên tiến hành nghiên cứu đột biến gen ATP7B trên 16 bệnh nhân nhi mắc bệnh Wilson tại Bệnh viện Nhi Đồng 1, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. Nghiên cứu đã báo cáo 8 đột biến, bao gồm: P767Pfs, T850I, G943D, I1148T, E1173K, E1372X, IVS15-2 A>G, và 1 đột biến mới L1015R. Tuy nhiên, đột biến gen ATP7B được sàng lọc từ exon 4 đến exon 21 vì quá trình phân tích gen được thực hiện ở Áo (Hoàng Lê Phúc và cs, 2008). Năm 2010, tác giả Nguyễn Thị Mai Hương đã báo cáo kết quả phát hiện đột biến gen ATP7B trên 10 bệnh nhân nhi mắc Wilson ở Bệnh viện Nhi Trung Ương. Theo đó, S105X có thể là một đột biến thường gặp trong nghiên cứu (Nguyễn Thị Mai Hương và cs, 2010). Ngược lại, nghiên cứu của Đỗ Thanh Hương chỉ phát hiện hai trường hợp bị đột biến dị hợp tử R778L trên gen ATP7B khi tiến hành phát hiện đột biến cho 23 bệnh nhân Wilson (Đỗ Thanh Hương và cs, 2010). Năm 2015, tác giả Phan Tôn Hoàng đã công bố kết quả phân tích đột biến gen ATP7B trên 61 bệnh nhân Wilson, trong đó 51 bệnh nhân bị đột biến gen ATP7B, bao gồm 28 đột biến xảy ra trên 13 exon, 1 vùng intron và 5’UTR. Tác giả đã đưa ra tỷ lệ các vùng đột biến gen và bản đồ đột biến gen ATP7B ở Việt Nam (Phan Tôn Hoàng, 2015). Năm 2015-2016, tác giả Đỗ Thanh Hương và Hoàng Lê Phúc đã công bố kết quả nghiên cứu về mối liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình của bệnh nhân Wilson ở Việt Nam. Theo đó, kiểu hình của bệnh nhân Wilson không chỉ phụ thuộc loại đột biến mà còn phụ thuộc vị tri của đột biến gen ATP7B (Hoàng Lê Phúc, 2015; Đỗ Thanh Hương, 2016). Năm 2017, nghiên cứu của tác giả Phạm Lê Anh Tuấn đã phát hiện 26 đột biến khác nhau trên 54 bệnh nhân Wilson ở miền Bắc, Việt Nam.