Tài liệu Phát hiện người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước làm tổ bệnh hemophilia a bằng kỹ thuật microsatellite dna

  • Số trang: 179 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 19 |
  • Lượt tải: 0
hoangtuavartar

Tham gia: 05/08/2015

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BÙI THỊ MINH PHƢỢNG PHÁT HIỆN NGƢỜI LÀNH MANG GEN BỆNH VÀ CHẨN ĐOÁN TRƢỚC LÀM TỔ BỆNH HEMOPHILIA A BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE DNA LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BÙI THỊ MINH PHƢỢNG PHÁT HIỆN NGƢỜI LÀNH MANG GEN BỆNH VÀ CHẨN ĐOÁN TRƢỚC LÀM TỔ BỆNH HEMOPHILIA A BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE DNA Chuyên ngành: Hóa sinh M số: 62720112 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Tạ Thành Văn 2. PGS.TS. Trần Vân Khánh HÀ NỘI - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi là Bùi Thị Minh Phƣợng, nghiên cứu sinh khóa 34, Trƣờng Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh, xin cam đoan: 1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của Thầy GS.TS. Tạ Thành Văn và Cô PGS.TS. Trần Vân Khánh. 2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đ đƣợc công bố tại Việt Nam. 3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đ đƣợc xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trƣớc pháp luật về những cam kết này./. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 NGƢỜI VIẾT CAM ĐOAN Bùi Thị Minh Phƣợng DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BMD Becker Muscular Dystrophy BVSKTE Bảo vệ sức khoẻ trẻ em CK Creatine Kinase DMD Duchenne Muscular Dystrophy DNA Deoxyribo Nucleic Acid FISH Fluorescent In Situ Hybridization ICSI Intracytoplasmic Sperm Injection IVF In Vitro Fertilization KB Kilo Base MLPA Multiplex Ligation Probe Amplification NST X Nhiễm sắc thể X NST Y Nhiễm sắc thể Y PCR Polymerase Chain Reaction PGD Preimplantation Genetic Diagnosis RNA Ribo Nucleic Acid RT – RCR Reverse Transcription PCR STR Short Tandem Repeat MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................ 4 1.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG BỆNH HEMOPHILIA A .................................... 4 1.1.1. Định nghĩa ......................................................................................... 4 1.1.2. Lịch sử nghiên cứu ............................................................................ 4 1.1.3. Dịch tễ bệnh học ................................................................................ 4 1.1.4. Đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán bệnh hemophilia A ...................... 5 1.2. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ CƠ SỞ PHÂN TỬ HEMOPHILIA A ... 8 1.2.1. Cơ chế di truyền bệnh hemophilia A................................................. 8 1.2.2. Cơ sở phân tử học bệnh hemophilia A .............................................. 9 1.3. NGƢỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A ..................... 14 1.3.1. Đặc điểm chung ngƣời mang gen bệnh ........................................... 14 1.3.2. Cơ chế di truyền của ngƣời mang gen bệnh hemophilia A ............. 14 1.3.3. Triệu chứng của ngƣời mang gen .................................................... 16 1.3.4. Các phƣơng pháp phát hiện ngƣời lành mang gen bệnh ................. 17 1.4. PHƢƠNG PHÁP THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM VÀ QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TRƢỚC LÀM TỔ .......................................... 23 1.4.1. Phƣơng pháp thụ tinh trong ống nghiệm ......................................... 23 1.4.2. Quy trình chẩn đoán gen trƣớc làm tổ ............................................. 25 1.4.3. Các phƣơng pháp và kỹ thuật sinh học phân tử mới nhất áp dụng trong việc chẩn đoán trƣớc làm tổ ...................................................... 30 1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI VỀ CHẨN ĐOÁN TRƢỚC LÀM TỔ ................................................. 38 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam ....................... 38 1.5.2. Tình hình nghiên cứu chẩn đoán trƣớc làm tổ bệnh hemophilia A 42 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 46 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .............................................................. 46 2.2. DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU ..... 47 2.2.1. Dụng cụ và trang thiết bị ................................................................. 47 2.2.2. Hoá chất ........................................................................................... 48 2.2.3. Trình tự mồi cho phản ứng .............................................................. 51 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................... 52 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu ......................................................................... 52 2.3.2. Địa điểm nghiên cứu ....................................................................... 54 2.3.3. Quy trình và các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu ...................... 54 2.3.4. Quy trình xác định ngƣời lành mang gen bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA ............................................................... 57 2.3.5. Quy trình chẩn đoán trƣớc làm tổ ................................................... 60 2.4. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU TRONG Y HỌC ...................................... 63 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................... 64 3.1. KẾT QUẢ PHÁT HIỆN NGƢỜI LÀNH MANG GEN F8 BỊ ĐỘT BIẾN BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE DNA ...................... 64 3.1.1. Kết quả xác định marker dị hợp tử gen F8 trên bệnh nhân và ngƣời lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật microsatellite DNA ..................... 64 3.1.2. Kết quả phát hiện ngƣời lành mang gen bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA .................................................................... 68 3.2. KẾT QUẢ CHẨN ĐOÁN TRƢỚC LÀM TỔ BỆNH HEMOPHILIA BẰNG KỸ THUẬT MICROSATTELITE DNA ................................. 90 3.2.1. Kết quả kích thích buồng trứng và thực hiện ICSI ......................... 90 3.2.2. Kết quả chẩn đoán tiền làm tổ của các gia đình hemophilia A ....... 92 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN .......................................................................... 108 KẾT LUẬN .................................................................................................. 138 KHUYẾN NGHỊ.......................................................................................... 139 CÁC DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần hóa chất sử dụng cho điện di mao quản ................. 63 Bảng 3.1. So sánh kết quả phát hiện ngƣời lành mang gen bệnh bằng 2 phƣơng pháp ............................................................................... 87 Bảng 3.2. Tỷ lệ phát hiện ngƣời lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật microsatellite-DNA..................................................................... 88 Bảng 3.3. Kết quả đánh giá về tỷ lệ phôi phát triển sau khi thụ tinh .......... 90 Bảng 3.4. Kết quả đánh giá sự phát triển của các phôi thu đƣợc ngày 3 .... 91 Bảng 3.5. Kết quả sinh thiết phôi chẩn đoán gen và đánh giá sự phát triển phôi sau sinh thiết 3 ngày ........................................................... 92 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh chảy máu khớp gối ở bệnh nhân hemophilia A ............ 5 Hình 1.2. Hình ảnh chảy máu trong cơ ở bệnh nhân hemophilia A ............. 6 Hình 1.3. Kiểu gen và kiểu hình của bố mẹ và thế hệ sau ........................... 8 Hình 1.4. Vai trò của yếu tố VIII trong quá trình đông máu huyết tƣơng . 10 Hình 1.5. Vị trí của gen mã hóa yếu tố VIII trên NST X ........................... 10 Hình 1.6. Cấu trúc gen và protein FVIII .................................................... 11 Hình 1.7. Protein yếu tố VIII với các vùng chức năng............................... 12 Hình 1.8. Sơ đồ di truyền của ngƣời mẹ mang gen kết hôn với bố bình thƣờng.. 15 Hình 1.9. Sơ đồ di truyền của ngƣời mẹ bình thƣờng kết hôn với bố bị bệnh .. 15 Hình 1.10. Sơ đồ phả hệ của ngƣời mẹ mang gen kết hôn với bố bình thƣờng 18 Hình 1.11. Sơ đồ di truyền của ngƣời mẹ mang gen kết hôn với bố bị bệnh.... 19 Hình 1.12. Quy trình thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm .......................... 25 Hình 1.13. Sinh thiết phôi bào giai đoạn blastomere cho chẩn đoán PGD ..... 28 Hình 1.14. Ứng dụng của kỹ thuật FISH trong chẩn đoán xác định giới tính và số lƣợng nhiễm sắc thể .......................................................... 32 Hình 1.15. Kết quả multiplex PCR sử dụng cặp mồi amel, SYR, FXS1108, DXS 9798, trên phôi bào sinh thiết chẩn đoán bệnh hemophilia A........... 37 Hình 1.16. Sơ đồ phả hệ của một gia đình mang gen đột biến đảo đoạn intron 22 gây bệnh hemophilia A ............................................... 43 Hình 1.17. Hình ảnh các marker dị hợp tử xác định đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A ..................................................................... 44 Hình 1.18. Kết quả multiplex PCR sử dụng cặp mồi amel, SYR, FXS1108, DXS 9798, trên phôi bào sinh thiết ............................................ 45 Hình 2.1. Kết quả STR lựa chọn marker dị hợp tử .................................... 59 Hình 2.2. Kỹ thuật Microsatellite DNA trong chẩn đoán đột biến gen gây bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể giới tính X................. 59 Hình 2.3. Kết quả STR xác định giới tính .................................................. 62 Hình 3.1. Kết quả đồng hợp tử và đồng hợp tử của STR ........................... 64 Hình 3.2. Kết quả khuếch đại các marker DXS9901, FXS1108, F8int22 và DXS9897 .................................................................................... 65 Hình 3.3. Tần suất alen của marker FXS 1108 .......................................... 66 Hình 3.4. Tần suất alen của marker DXS9897 ........................................... 66 Hình 3.5. Tần suất alen của marker F8int22 .............................................. 67 Hình 3.6. Tần suất alen của marker DXS9901 ........................................... 67 Hình 3.7. Sơ đồ phả hệ gia đình HA 61 ..................................................... 68 Hình 3.8. Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình m số HA61 ................. 69 Hình 3.9. Hình ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS1108, DXS9897 và F8int22 của gia đình HA61 .................................... 70 Hình 3.10. Sơ đồ phả hệ gia đình HA37 sau khi phân tích bằng hai phƣơng pháp .. 72 Hình 3.11. Ảnh giải trình tự gen của gia đình m số HA37......................... 73 Hình 3.12. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS9901 và DXS9897 của gia đình m số HA37 .......................................... 74 Hình 3.13. Sơ đồ phả hệ gia đình HA50 sau khi phân tích bằng hai phƣơng pháp ............................................................................... 75 Hình 3.14. Hình ảnh giải trình tự gen gia đình HA50 .................................. 76 Hình 3.15. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS9901, DXS9897 và FXS1108, của gia đình bệnh nhân hemophilia A mã số HA50 ................................................................................ 77 Hình 3.16. Sơ đồ phả hệ gia đình HA16 ...................................................... 79 Hình 3.17. Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình m số HA16 ................. 80 Hình 3.18. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS9901 và DXS9897 của gia đình HA16 ..................................................... 81 Hình 3.19. Sơ đồ phả hệ gia đình HA30 sau khi phân tích .......................... 83 Hình 3.20. Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số HA3084 Hình 3.21. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS9901 và FXS1108, của gia đình bệnh nhân hemophilia A mã số HA30 ... 85 Hình 3.22. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi, F8in22, DXS9897 và DXS9901 của gia đình m số HA09 .................... 89 Hình 3.23. Kết quả khuếch đại các marker FXS1108, F8int22, và DXS9897.. 94 Hình 3.24. Kết quả multiplex PCR khuếch đại 3 marker dị hợp tử FXS1108, DXS9897 và F8int22 và 2 marker giới tính Amel và SRY trên mẫu bệnh nhân HA61 ................................................................. 95 Hình 3.25. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS 1108, F8int22, DXS 9897 xác định phôi nam bình thƣờng của gia đình HA61 ........ 96 Hình 3.26. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS 1108, F8int22, DXS 9897 xác định phôi nam bệnh lý gia đình HA61 97 Hình 3.27. Sơ đồ phả hệ phôi gia đình HA61 .............................................. 98 Hình 3.28. Kết quả khuếch đại các marker FXS1108 và DXS9897 ........... 99 Hình 3.29. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS1108 và DXS9897 của ngƣời mẹ so sánh với bệnh nhân HA28............ 100 Hình 3.30. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS 1108, DXS 9897 xác định phôi nam bình thƣờng gia đình HA28 ..... 102 Hình 3.31. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS 1108, DXS 9897 xác định phôi nam bệnh lý gia đình HA28............. 103 Hình 3.32. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS 1108, DXS 9897 xác định phôi nữ mang gen gia đình HA28 ........... 104 Hình 3.33. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS 1108, DXS 9897 xác định phôi nữ không mang gen gia đình HA28 105 Hình 3.34. Sơ đồ phả hệ gia đình HA28 .................................................... 106 Hình 3.35. Tỷ lệ phôi bất thƣờng và không bất thƣờng về gen ................. 107 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với sự phát triển của nền kinh tế xã hội, tỷ lệ vô sinh ngày càng gia tăng và là nỗi lo cho nhiều cặp vợ chồng. Ra đời vào những năm 1970 của thế kỷ trƣớc, có thể nói phƣơng pháp thụ tinh trong ống nghiệm “in vitro fertilization - IVF” đ trở thành cứu cánh cho nhiều cặp vợ chồng vô sinh mong muốn có đứa con [1]. Vào năm 2010 bác sỹ Robert G.Edwards đ vinh dự trao giải thƣởng Nobel về sinh lý và Y khoa cho những cống hiến to lớn và hiệu quả mà phƣơng pháp này mang lại [2]. Phƣơng pháp này đ mang lại niềm vui, niềm hạnh phúc cho bao cặp vợ chồng khắp nơi trên thế giới, tuy nhiên không phải cặp vợ chồng nào cũng may mắn sinh đƣợc những đứa con mong muốn bằng phƣơng pháp này. Tỷ lệ thành công của phƣơng pháp này chỉ đạt hơn 35% tùy theo từng quốc gia [3]. Có rất nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến sự thành công của phƣơng pháp này nhƣ: tuổi bố mẹ, tình trạng sức khỏe, tinh thần tâm lý, chất lƣợng tinh trùng và trứng… và đặc biệt chất lƣợng phôi sau khi thụ tinh. Các phôi có thể bất thƣờng nhiễm sắc thể (NST) thƣờng hay NST giới tính đều làm giảm khả năng mang thai sau khi cấy phôi vào buồng tử cung, có thể gây sảy thai hoặc sinh ra những đứa con không khỏe mạnh [4], [5], [6],[7]. Để làm giảm tỷ lệ sinh ra những đứa con không khỏe mạnh và làm tăng tỷ lệ thành công của phƣơng pháp thụ tinh trong ống nghiệm, thời gian gần đây các nhà khoa học đ áp dụng quy trình sàng lọc phôi “Pre-Implantion Genetic Diagnosis, PGD” còn gọi là “chẩn đoán di truyền trƣớc làm tổ” nhằm có đƣợc những phôi tốt nhất cho quá trình chuyển phôi [8],[9],[10]. Cùng với sự phát triển của kỹ thuật chọc hút phôi và ứng dụng những tiến bộ mới nhất của sinh học phân tử vào chẩn đoán, cho đến nay có rất nhiều bệnh lý di truyền và hầu hết các bất thƣờng trên NST, cả các đột biến gen quan trọng gây ung thƣ đều có thể đƣợc sàng lọc bằng kỹ thuật PGD [11], 2 [12],[13],[14-15]. Trong số đó, bệnh hemophilia A (bệnh ƣa chảy máu) là loại bệnh có tỷ lệ mắc cao, bệnh cảnh lâm sàng nặng nề và thƣờng gây ra những sang chấn lớn về tâm lý cho gia đình và cho ngƣời bệnh. Vì vậy vấn đề đặt ra là chúng ta phải làm sao giúp cho các cặp vợ chồng mang gen bệnh hemophilia A sinh đƣợc những đứa con hoàn toàn khỏe mạnh. Hemophilia A là bệnh di truyền do thiếu hụt hoặc bất thƣờng chức năng của các yếu tố đông máu VIII [16],[17]. Hemophilia A là bệnh di truyền alen lặn trên NST X không có alen trên NST Y, nên ngƣời mẹ mang gen bệnh sẽ di truyền cho con trai và biểu hiện bệnh trên lâm sàng [18]. Theo thống kê của tổ chức hemophilia A thế giới, hiện nay có khoảng 250.000 bệnh nhân mắc bệnh hemophilia A và chỉ có khoảng 50.000 đƣợc điều trị đặc hiệu [19]. Tại Việt Nam, ƣớc tính có khoảng 6000 ngƣời bị bệnh hemophilia A và khoảng 30.000 ngƣời mang gen bệnh hemophilia A [20]. Biểu hiện lâm sàng chủ yếu là chảy máu ở bất kỳ nơi nào trên cơ thể, và chảy máu kéo dài: chảy máu khớp, chảy máu trong cơ, chảy máu não, chảy máu trong cổ và ngực… Mức độ biểu hiện trên lâm sàng liên quan trực tiếp nồng độ yếu tố VIII trong huyết tƣơng. Việc tầm soát trƣớc sinh bệnh hemophilia A là việc làm hết sức quan trọng giúp cho việc sinh ra những đứa trẻ hoàn toàn khỏe mạnh. Việc xác định đột biến gen gây bệnh, sàng lọc ngƣời lành mang gen bệnh và chẩn đoán trƣớc sinh bệnh hemophilia A đ đƣợc nghiên cứu khá nhiều ở Việt Nam.Việc quản lý bệnh nhân và ngƣời mang gen của bệnh lý này là tiền đề vững chắc để triển khai thành công quy trình chẩn đoán trƣớc làm tổ trong sàng lọc phôi. Phƣơng pháp này sẽ giúp giảm biến chứng và di chứng cho ngƣời mẹ khi mang thai bệnh lý, giảm chấm dứt thai kỳ do phát hiện bệnh ở thai nhi khi chẩn đoán tiền sản, mang lại niềm vui hạnh phúc cho các cặp vợ chồng mang gen bệnh, đồng thời giảm tỷ lệ mắc bệnh ở cộng đồng. Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử phát hiện các đột biến gây bệnh hemophilia A, kỹ thuật 3 microsatellite DNA là kỹ thuật sử dụng các primer gắn huỳnh quang để khuếch đại vùng trình tự lặp lại ngắn (short tandem repeat-STR) và phân tích kích thƣớc của chúng thông qua điện di mao quản trên máy giải trình tự gen để xác định các alen đột biến. Kỹ thuật này có nhiều ƣu điểm là dễ dàng phát hiện alen đột biến mà không cần xác định các đột biến trực tiếp, vì vậy sẽ giảm đƣợc chi phí cho gia đình bệnh nhân. Hiện nay kỹ thuật này còn khá mới mẻ ở Việt Nam ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh lý di truyền. Xuất phát từ thực tế đó đề tài: “Phát hiện ngƣời lành mang gen bệnh và chẩn đoán trƣớc làm tổ bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA” đƣợc đƣa vào nghiên cứu với mục tiêu: 1. Xác định người lành mang gen bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA. 2. Chẩn đoán trước làm tổ cho những người mẹ mang gen bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA. 4 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG BỆNH HEMOPHILIA A 1.1.1. Định nghĩa Bệnh hemophilia A là một bệnh di truyền do thiếu hụt hoặc bất thƣờng chức năng của các yếu tố đông máu trong huyết tƣơng - thiếu hụt yếu tố VIII gây bệnh hemophilia A, thiếu hụt yếu tố IX gây bệnh hemophilia B, thiếu hụt yếu tố XI gây bệnh hemophilia C. Bệnh hemophilia A là bệnh rối loạn đông máu di truyền hay gặp nhất [21-22]. 1.1.2. Lịch sử nghiên cứu Sự di truyền của bệnh máu khó đông liên kết với giới tính đƣợc phát hiện từ những năm 80 của thế kỷ 19. Vào thời điểm này, các nhà khoa học nhận thấy chỉ có nam giới mắc bệnh và không có khả năng truyền bệnh cho con trai nhƣng truyền gen bệnh cho con gái và ngƣời con gái này có thể truyền gen bệnh cho con trai mình. Bệnh hemophilia A còn đƣợc biết đến nhƣ căn bệnh của Hoàng Gia vì nữ hoàng Anh Victoria 1838-1901 mang gen bệnh này và truyền nó cho nhiều thế hệ sau. 1.1.3. Dịch tễ bệnh học Theo thống kê của tổ chức hemophilia thế giới (WFH), hiện nay có khoảng 500.000 bệnh nhân mắc bệnh hemophilia và chỉ có khoảng 1/3 đƣợc chẩn đoán [23]. Tỷ lệ mắc bệnh hemophilia A gần giống nhau ở các vùng địa lý, các nƣớc, các chủng tộc, tần suất mắc bệnh chung khoảng 30-100/1.000.000 dân.Tần suất mắc bệnh hemophilia A là 1/4000  1/5.000 trẻ trai [24]. Tại Việt Nam, theo những thống kê không đầy đủ hiện tại có khoảng 6000 bệnh nhân hemophilia. Số liệu điều tra những năm 1994  1996 về tình hình bệnh hemophilia ở miền Bắc Việt Nam cho thấy tỷ lệ bệnh hemophilia là 5 25  60/1.000.000 dân. Tại mít tinh hƣởng ứng ngày hemophilia thế giới (174-2016), hội rối loạn đông máu Việt Nam và Viện Huyết học - Truyền máu Trung ƣơng đ công bố có 6000 ngƣời bị bệnh chảy máu di truyền [25]. 1.1.4. Đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán bệnh hemophilia A 1.1.4.1. Đặc điểm chảy máu trong bệnh hemophilia A Bệnh đặc trƣng bởi thời gian đông máu kéo dài và tăng nguy cơ chảy máu. Biểu hiện lâm sàng chủ yếu là xuất huyết. Xuất huyết có thể tự nhiên hoặc sau chấn thƣơng nhẹ. Đặc điểm xuất huyết là các đám bầm máu dƣới da, tụ máu trong cơ, chảy máu ở các khớp. Chảy máu khớp thƣờng gặp nhất ở bệnh nhân hemophilia A. Đây là loại chảy máu nguy hiểm vì khi tái phát nhiều lần gây ra viêm khớp, biến dạng khớp [26]. Chảy máu khớp có thể xuất hiện tự nhiên hoặc sau chấn thƣơng. Nếu điều trị muộn sau 4 giờ thì cảm giác đau có thể tăng lên, khớp sẽ sƣng và việc điều trị bị kéo dài tới vài ngày. Trẻ lớn có thể nhận biết đƣợc chảy máu khớp trƣớc khi đau và sƣng xảy ra với cảm giác gai châm hoặc kiến bò trong khớp. Điều trị sớm sẽ dự phòng đƣợc tình trạng đau mạn tính và biến dạng khớp. Hình 1.1. Hình ảnh chảy máu khớp gối ở bệnh nhân hemophilia A (Nguồn: http://hemoviet.org.vn) Chảy máu trong cơ bao gồm 10-25% các trƣờng hợp xuất huyết nặng trong hemoglobin. Huyết khối cơ đƣợc coi là nguyên nhân chính gây ra tình trạng khuyết tật trong chứng chảy máu. Chảy máu trong cơ cũng thƣờng gặp 6 và xuất hiện tự nhiên hoặc sau chấn thƣơng. Những cơ hay bị chảy máu là: cơ cẳng chân, cơ đùi, cơ cánh tay. Chảy máu cơ gây ra sƣng đau trong vài ngày. Một dấu hiệu quan trọng và kín đáo trong chảy máu cơ là cảm giác đau, nóng, ngứa ran hoặc tê bì. Nếu không đƣợc điều trị sớm cơ sẽ bị phá huỷ và có thể gây liệt [23]. Hình 1.2. Hình ảnh chảy máu trong cơ ở bệnh nhân hemophilia A (Nguồn: http://hemoviet.org.vn) Ngoài ra bệnh nhân có thể bị chảy máu não, chảy máu ở các vị trí khác nhƣng hiếm gặp xuất huyết dƣới da. Chảy máu từ vết cắt sâu hoặc xƣớc da có thể kéo dài và hồi phục sau vài ngày mà không cần điều trị. Chảy máu miệng, lợi và mũi cũng hay gặp. Có thể xuất huyết tiêu hoá và đái máu. 1.1.4.2. Các xét nghiệm cận lâm sàng để chẩn đoán bệnh Những thay đổi về huyết học ở bệnh nhân hemophilia A: - Thời gian máu chảy kéo dài, thời gian đông máu kéo dài có thể hơn 1 giờ; chất lƣợng cục máu đông kém; thời gian Howell kéo dài… + Hoạt tính yếu tố VIII huyết tƣơng giảm hoặc không có. + Yếu tố Von - Willebrand trong máu bình thƣờng. + Số lƣợng tiểu cầu trong máu bình thƣờng. 7 1.1.4.3. Chẩn đoán bệnh  Chẩn đoán xác định [21] - Dựa vào lâm sàng: Có vết bầm tím, tụ máu, chảy máu. - Dựa vào tiền sử gia đình - Dựa vào xét nghiệm máu: + Số lƣợng tiểu cầu bình thƣờng, PT (Prothrombin Time: thời gian prothrombin) bình thƣờng, fibrinogen bình thƣờng, APTT (Activated Partial Thromboplastin Time: thời gian thromboplastin một phần hoạt hóa) kéo dài > 1,5 giá trị bình thƣờng. + Hoạt tính yếu tố VIII huyết tƣơng giảm dƣới 40%. + Yếu tố Von Willebrand bình thƣờng + Các xét nghiệm khác: Mixtest xác định kháng thể kháng yếu tố VIII.  Chẩn đoán mức độ bệnh Nồng độ yếu tố VIII Mức độ (%) (hoạt tính Biểu hiện chảy máu (UI/ml)) Nặng (Chiếm 70%) Chảy máu tự nhiên không liên <1% (<0,01) quan đến chấn thƣơng, thƣờng chảy máu ở khớp và cơ. Chảy máu tự nhiên hoặc liên Trung bình (Chiếm 15%) 1-5% (0,01-0,05) quan đến chấn thƣơng nhỏ. Chảy máu nặng sau chấn thƣơng, phẫu thuật. Nhẹ (Chiếm 15%) > 5-40% (0,04-0,4) Chảy máu sau chấn thƣơng lớn hoặc phẫu thuật. 8 1.2. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ CƠ SỞ PHÂN TỬ HEMOPHILIA A 1.2.1. Cơ chế di truyền bệnh hemophilia A Đây là một bệnh di truyền liên kết với giới tính: Ở nam chỉ có một NST giới tính X nên nếu NST giới tính X mang gen bệnh thì lƣợng yếu tố VIII tạo ra không đủ và ngƣời đó bị bệnh hemophilia A [27]. Đối với nữ giới nhờ có hai NST giới tính X nên nếu một NST giới tính X mang gen bệnh thì gen bình thƣờng trên NST còn lại vẫn tổng hợp yếu tố VIII bình thƣờng. Ngƣời phụ nữ không bị bệnh nhƣng mang một gen bị bệnh sẽ truyền cho con trai và ngƣời con trai sẽ bị bệnh, nếu truyền cho con gái thì ngƣời con gái sẽ trở thành ngƣời mang gen bệnh. Hình 1.3. Kiểu gen và kiểu hình của bố mẹ và thế hệ sau 1/ Bố bị bệnh, mẹ bình thƣờng: 100% con gái là ngƣời mang gen bệnh (XHXh) và 100% con trai bình thƣờng (XHY). 2/ Mẹ mang gen bệnh, bố bình thƣờng: trong một gia đình có bố bình thƣờng (XHY), mẹ mang gen bệnh (XHXh) (ngƣời truyền bệnh) thì 50% số con gái sẽ là ngƣời mang gen bệnh (XHXh), 50% con gái bình thƣờng (XX), 50% con trai bị bệnh (XhY) và 50% con trai bình thƣờng (XHY). 3/ Bố bị bệnh, mẹ mang gen bệnh: 50% con gái bị bệnh (X hXh) đồng hợp tử, 50% con gái mang gen bệnh (XHXh), 50% con trai bị bệnh và 50% 9 con trai bình thƣờng (XHY). Nhƣ vậy nữ mắc bệnh khi mang đồng hợp tử gen bệnh (cả 2 thể nhiễm sắc X bị thƣơng tổn: XhXh), nữ mang gen bệnh khi mang dị hợp tử gen bệnh (một thể nhiễm sắc X bị thƣơng tổn: XHXh). 4/ Do đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử từ ngƣời bố hoặc từ ngƣời mẹ: thƣờng chiếm khoảng 1/3 các trƣờng hợp hemophilia A. Tỉ lệ đột biến gây bệnh hemophilia xẩy ra là 3 x 106 trên gen và trên một giao tử trong một thế hệ [31]. Tỷ lệ đột biến mới xảy ra ở tế bào mầm sinh dục của nam cao hơn 5 lần so với ở tế bào mầm sinh dục của nữ. Gần đây, ngƣời ta đ chứng minh rằng tần suất đột biến theo giới tùy thuộc vào loại đột biến. Đột biến đảo đoạn intron 22 ở tế bào mầm sinh dục nam nhiều hơn 15 lần so với ở tế bào mầm sinh dục nữ. Hiện tƣợng này giải thích cho sự vắng mặt nhiễm sắc thể thứ hai tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình đảo đoạn trong giai đoạn phân bào giảm nhiễm ở nam. 1.2.2. Cơ sở phân tử học bệnh hemophilia A Từ năm 1984, nghiên cứu của Vehar và cộng sự đ cho thấy những hiểu biết đầy đủ về cấu trúc phân tử gen F8 tổng hợp protein FVIII, mở đƣờng cho các nghiên cứu về cơ chế phân tử bệnh hemophilia A và các dạng đột biến gen F8 gây bệnh. Trong con đƣờng đông máu nội sinh, yếu tố VIII đóng vai trò là đồng yếu tố với yếu tố IX hoạt hóa (IXa) với sự có mặt của Ca2+ và phospholipid tiểu cầu hoạt hóa yếu tố X thành Xa, từ đó tác động nên sự hình thành thrombin từ prothrombin, giúp cho quá trình tạo và cố định fibrin từ fibrinogen, hoàn thiện quá trình tạo cục máu đông cùng với tiểu cầu và yếu tố thành mạch. Việc thiếu hụt hoặc bất thƣờng chức năng yếu tố VIII làm ngừng trệ dòng thác đông máu theo con đƣờng nội sinh, dẫn đến tình trạng chảy máu kéo dài, không cầm ở bệnh nhân hemophilia A. 10 Yếu tố mô Fibrinogen Yếu tố bề mặt Fibrin ổn đinh fibrin Hình 1.4. Vai trò của yếu tố VIII trong quá trình đông máu huyết tương 1.2.2.1. Vị trí và cấu trúc của gen mã hóa yếu tố VIII Gen quy định tổng hợp yếu tố VIII nằm ở vị trí Xq28 trên NST giới tính X, là một trong những gen lớn nhất của ngƣời, có kích thƣớc 186 Kb gồm 26 exon, trong đó 24 exon có kích thƣớc từ 62bp đến 262bp và 2 exon lớn nhất là exon 14 (3106 bp) và exon 26 (1958 bp), m hóa 9 Kb mRNA. Ngƣời đột biến gen F8 gây thiếu hoặc không tổng hợp đƣợc yếu tố VIII, làm rối loạn quá trình đông máu biểu hiện thành triệu chứng lâm sàng của bệnh hemophilia A [28]. Nhiễm sắc thể X Hình 1.5. Vị trí của gen mã hóa yếu tố VIII trên NST X (Nguồn: www.hemophilia.com)
- Xem thêm -