Tài liệu Phát hiện một loại đột biến gen ty thể ở người việt nam bằng kỹ thuật pcr-rflp

Phát hiện một loại đột biến gen ty thể ở người Việt Nam bằng kỹ thuật PCR-RFLP Phạm Minh Huệ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Khoa Sinh học Luận văn ThS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30 Người hướng dẫn: PGS.TS Phan Tuấn Nghĩa Năm bảo vệ: 2011 Abstract: Tập trung nghiên cứu về đột biến mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA trong vùng không mã hóa (vùng V) nằm giữa gene mã cho cytochrome c oxidase subunit II (COII) và gen mã hóa cho phân tử RNA vận chuyển Lysine (tRNALys). Ngoài ra, tìm hiểu về đột biến điểm A3243G và A8344G được chứng minh là chiếm khoảng 80% số ca mang hội chứng tương ứng là MELAS và MERRF, qua đó đánh giá khả năng liên quan giữa sự mấ t đoa ̣n 9 bp và khả năng bi ̣các đô ̣t biế n phổ biến này. Keywords: Sinh học thực nghiệm; Đột biến gen; Người Việt Nam; Kỹ thuật PCR-RFLP; Gen ty thể Content Ty thể là một cơ quan tử của tế bào nhân thực có vai trò tạo năng lượng dưới dạng ATP cho các hoạt động sống của tế bào. Ty thể có hệ gen riêng với DNA dạng mạch vòng, kích thước 16,5 kb, chứa 37 gen mã hóa cho 13 protein, 22 RNA vận chuyển và 2 RNA ribosome của ty thể. Các gen trong ty thể di truyền từ mẹ sang con. Các protein do gen ty thể mã hóa tham gia vào quá trình trao đổi chất trong ty thể cũng như chuỗi vận chuyể n điê ̣n tử trên màng trong của ty thể . Ty thể là nơi xẩ y ra quá trình oxy hóa phosphoryl hóa và nhiề u quá trình hóa sinh khác. Các quá trình này tạo ra các dạng oxy phản ứng (reactive oxygen species) và là nguyên nhân gây nên nhiề u tổ n thương trong cấ u trúc DNA của ty thể. Tỷ lệ đột biến cao, có kiểu thừa kế khác nhau và số bản sao lớn trên mỗi tế bào là những đặc trưng chính của DNA ty thể (mtDNA). Nghiên cứu các đột biến trong mtDNA là một trong những cách cho phép chúng ta hiểu được quá trình tiến hóa con người, cụ thể là về nguồn gốc, quan hệ họ hàng, khả năng giao phối với họ khác, sự di cư và nhập cư tới những vùng mới của thế giới. Một loạt các loại hội chứng và bệnh tật, trong đó có quá trình già hóa ung thư, hiện tượng chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) có nguyên nhân liên quan đến đột biến trong hệ gen ty thể. Các đột biến trong hệ gen ty thể, cho dù là một đột biến điểm nucleotide, đứt đoạn hay đảo đoạn, thường xảy ra ở các loại mô bào cần năng lượng như cơ, tim, thận, tuyến nội tiết và đều ảnh hưởng lớn đến chức năng của chúng đối với cơ thể. Năm 1988, đột biến đầu tiên gây bệnh trên hệ gen ty thể người được biết đến và ngày nay hơn 270 đột biến gây bệnh trên hệ gen ty thể người đã được phát hiện. Các đột biến trong mtDNA ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp ATP của tế bào và từ đó ảnh hưởng đến hầu như tất cả các hệ thống cơ quan. Tuy nhiên, các tế bào và các cơ quan bị ảnh hưởng nhiều nhất là những bộ phận có mức tiêu thụ năng lượng cao như não bộ, cơ xương và tim. Nhiều đột biến mtDNA xuất hiện là nguyên nhân chủ yếu gây mất chức năng cơ, thần kinh. Không phải tất cả các phần của genome ty thể phát triển ở cùng một mức độ đột biến, phần thay đổi thường xuyên nhất của mtDNA là phần không mã hóa, phần nằm trong vùng điều khiển gọi là D-loop (chứa hai vùng siêu biến HVR1 và HVR2 chiếm khoảng 7% genome ty thể). Một trong những phần không mã hóa được coi là chỉ thị sinh học đặc trưng cho nguồn gốc các tộc người là phần trình tự lặp lại 9 bp nằm trong vùng V giữa gen mã hóa cho cytochrome c oxidase (COII) và tARNLys. Tuy nhiên, đây cũng là vùng đặc trưng cho những đột biến mất đoạn ở các bệnh nhân bị hội chứng bệnh ty thể. Ở Việt Nam, những nghiên cứu về genome ty thể chưa được quan tâm nhiều. Việc nghiên cứu đột biến trong hệ gen ty thể có ý nghĩa lớn, góp phần làm sáng tỏ nguyên nhân của nhiều bệnh di truyền và chuyển hóa cũng như đánh giá mối quan hệ tiến hóa, di truyền trong quần thể. Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phát hiện một loại đột biến gen ty thể ở người Việt Nam bằng kỹ thuật PCR-RFLP”, trong đó chúng tôi tập trung nghiên cứu về đột biến mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA trong vùng không mã hóa (vùng V) nằm giữa gene mã cho cytochrome c oxidase subunit II (COII) và gen mã hóa cho phân tử RNA vận chuyển Lysine (tRNALys). Ngoài ra, chúng tôi cũng đồng thời nghiên cứu đột biến điểm A3243G và A8344G được chứng minh là chiếm khoảng 80% số ca mang hội chứng tương ứng là MELAS và MERRF, qua đó đánh giá khả năng liên quan giữa sự mấ t đoa ̣ n 9 bp và khả năng bi ̣ các đô ̣t biế n phổ biến này . Đối tượng nghiên cứu: 72 mẫu máu của bệnh nhân nghi bị bệnh ty thể được Bệnh viện Nhi Trung ương cung cấp và được sử dụng cho nghiên cứu phát hiện các loại đột biến mất đoạn, đột biến điểm trên mtDNA. Ngoài ra, 14 mẫu gia đình bệnh nhân cũng được thu thập cho nghiên cứu liên quan. Các mẫu máu sau khi lấy vô trùng được bảo quản trong ngân hàng mẫu ở -20oC cho đến khi sử dụng. Hóa chất: gồm các cặp mồi để sàng lọc các loại đột biến điểm trên mtDNA và cặp mồi pUC19Fw và pUC19Rv (bảng 1) được mua từ hãng Invitrogen và Fermentas, thang chuẩn DNA, dNTP và các enzyme được mua từ hãng Fermentas; bộ kit tách chiết DNA được mua từ hãng Qiagen, kit pGEM-T được mua từ hãng Invitrogen; Taq DNA polymerase của Hãng Enzynomics và Protein cung cấp, hóa chất cho giải trình tự của hãng Beckman Coulter. Các hóa chất còn lại đều đạt độ tinh sạch cho nghiên cứu sinh học phân tử. Hai loại cặp mồi để kiểm tra sự có mặt của 2 loại đột biến điểm A3243G và A8344G trên mtDNA gây nên các hội chứng tương ứng là MELAS và MERRF (bảng 1). Trong đó, cặp mồi MRAGFw và MRAGRv được sử dụng để sàng lọc đồng thời hai loại đột biến là A8344G và đột biến mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA. Bảng 1: Trình tự các cặp mồi dùng trong PCR STT Tên mồi 1 Mt Fw 5’-CAAGAGAAATAAGGCTTACTTC- 3’ Mt Rv 5’-GGAGTAGGAGGTTAGCCATGGG-3’ MRAGFw 5’-GGTATACTACGGTCAATGCTC- 3’ 2 Trình tự mồi MRAGRv 5’ -TTTCACTGTAAAGAGGTGTGGG-3’ Các cặp mồi được thiết kế để bắt cặp đặc hiệu với đoạn DNA cần nhân lên, trong đó có những mồi chứa nucleotide không ghép cặp (mismatch) để tạo thêm hoặc giảm bớt vị trí cắt của các enzyme giới hạn, từ đó tạo nên các băng điện di khác nhau ở mẫu bệnh nhân bị đột biến và không đột biến. Thiết bị máy móc chính gồm: máy điện di ngang và điện di đứng, máy PCR (Eppendorf), máy soi và chụ ảnh gel (BioRad), máy đo mật độ hấp thụ quang học (Nano Drop), máy đọc trình tự CEQ 8000 ( Beckman Coulter) và nhiều thiết bị cần thiết khác. Phương pháp nghiên cứu 1. 2. 3. 4. Tách DNA tổng số từ máu theo kit của Qiagen Tách plasmid theo phương pháp của Sambrook và Russell Định lượng DNA bằng phương pháp đo mật độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại Điện di DNA trên gel agarose 5. Điện di DNA trên gel polyacrylamide 6. Nhân bản đoạn gen bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) 7. Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (PCRRFLP) 8. Nhân dòng sản phẩm PCR vào vector pGEM-T 9. Giải trình tự nucleotide bằng máy tự động theo phương pháp của Sanger 10. Phân tích số liệu bằng phần mềm Genetyx Kết quả nghiên cứu 1. Thu thập mẫu máu bệnh nhân và tách chiết DNA tổng số Một số đặc điểm của mẫu phân tích Mẫu máu từ các bệnh nhi có độ tuổi từ 1 tháng tuổi đến 15 tuổi, những trẻ dưới 5 tuổi (từ 1 tháng tuổi-5 tuổi) được nghiên cứu chiếm tỷ lệ 76%, từ 6-15 tuổi chiếm tỷ lệ 24%. Trong đó, tỷ lệ các trẻ nam là 58%; tỷ lệ trẻ nữ là 42%. Hầu hết các bệnh nhân là người dân tộc Kinh. Theo các dẫn liệu khám bởi bác sĩ ở Bệnh viện Nhi Trung ương thì các bệnh nhân xuất hiện những triệu chứng của bệnh cơ não (encephalomyopathy) như bị rối loạn chuyển hóa, bị động kinh co giật, phát triển tinh thần vận động chậm, một số xuất hiện những tổn thương não… Tách chiết DNA của các mẫu DNA tổng số từ 200 µl mẫu máu của bệnh nhân được tách theo kit của Qiagen, chế phẩm DNA tổng số được điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện di cho thấy các băng DNA đều có một băng rõ nét, với độ di động điện thấp, chứng tỏ DNA tổng số tách được đều nguyên vẹn Chúng tôi cũng đã tiến hành đo mật độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại của chế phẩm DNA tổng số từ 72 mẫu bệnh nhân để đánh giá độ tinh sạch cũng như xác định hàm lượng DNA. Kết quả thu được cho thấy các mẫu DNA đều có tỷ số A260/A280 nằm trong khoảng 1,80−2,0, chứng tỏ chế phẩm ít lẫn protein hay RNA. Như vậy, chúng tôi đã thu được các sản phẩm DNA tổng số đạt yêu cầu để tiến hành các bước thí nghiệm tiếp theo. 2. Phát hiện đột biến A8344G và đột biến mất đoạn 9 bp bằng PCR-RFLP Vì đoạn gen mang đột biến A8344G liên quan đến hội chứng MERRF nằm gần đoạn lặp 9 bp CCCCCTCTA, nên chúng tôi nghiên cứu sự có mặt của hai đột biến này cùng nhau. Nhân bản đoạn gen từ 8155-8366 bằng PCR Chúng tôi đã dùng kỹ thuật PCR với mồi xuôi (8155-8175) bắt cặp hoàn toàn với sợi khuôn và mồi ngược (8366-8345) chứa một điểm không bắt cặp với sợi khuôn có trình tự dưới đây để nhân bản đoạn gen 212 bp (8155-8366) trong hệ gen ty thể. Tên mồi Trình tự MRAG Fw 5’GGT ATA CTA CGG TCA ATG CTC 3’ (nt 8155-8175) MRAG Rv 5’ TTT CAC TGT AAA GAG GTG TGG G3’ (nt 8366-8345) Đoạn DNA mà chúng tôi nhân bản là trình tự thường có thể mang: i) đột biến mất đoạn 9 bp nằm ở một trong hai trình tự lặp lại CCCCCTCTA từ vị trí 8272-8289; ii) đột biến điểm A8344G. Đoạn gen khi không có đột biến mất đoạn cũng như đột biến A8344G sẽ có chiều dài 212 bp và khi không có đột biến A8344G thì chứa 2 điểm cắt của BanII (GAGCCC và GGGCCC). Đoạn gen khi được nhân bản bằng PCR và được cắt bằng enzyme BanII sẽ tạo ra 3 đoạn với kích thước là 99 bp, 41 bp và 72 bp. Nếu có đột biến A8344G, với cách thiết kế mồi vừa nêu thì đoạn DNA nhân bản sẽ có thêm một điểm cắt ở đoạn 72 bp (GAGCCC), và khi đó sản phẩm cắt bằng BanII sẽ gồm 4 đoạn với kích thước là 99 bp, 41 bp, 52 bp và 20 bp. Khi có đột biến mất đoạn 9 bp, thì đoạn gen nhân bản chỉ còn 203 bp và nếu được cắt bằng BanII sẽ cho 4 băng với kích thước là 99 bp, 32 bp, 52 bp và 20 bp. Băng 20 bp khó được nhìn thấy trên gel vì kích thước qúa nhỏ nên có thể chạy ra khỏi gel. Kết quả điện di agarose 2% sản phẩm PCR cho thấy sự xuất hiện của băng DNA với kích thước như mong đợi (203-212 bp) ở các mẫu có DNA tách từ bệnh nhân, trong khi đó mẫu kiểm tra âm (không chứa DNA) không cho băng DNA nhân bản nào. Như vậy, cặp mồi chúng tôi thiết kế là đặc hiệu cao cho việc nhân bản đoạn DNA có kích thước 212 bp Sau khi kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 2%, chúng tôi đã tiến hành cắt trực tiếp các sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn BanII, sau đó điện di sản phẩm trên gel polyacrylamide 15%. Kết quả cho thấy sản phẩm PCR của tất cả 72 mẫu bệnh nhân chúng tôi nghiên cứu đều được enzyme BanII cắt tạo ra 3 băng khác nhau , như vậy đoạn DNA mà chúng tôi nhân bản chỉ có 2 vị trí nhận biết cho enzyme BanII, chứng tỏ tất cả các mẫu kiểm tra đều không có đột biến điểm A8344G. Mặc dù tất cả các mẫu đều bị cắt ra 3 băng, nhưng kích thước các băng có sự khác nhau giữa hai nhóm: nhóm thứ nhất sản phẩm PCR bị cắt ra 3 băng theo đúng như tính toán lý thuyết là 99 bp, 41 bp, 72 bp; nhóm thứ hai ngoài băng 99 bp và 72 bp thì xuất hiện băng có kích thước ngắn hơn băng 41 bp. Chúng tôi nghi ngờ các mẫu ở nhóm thứ hai này xảy ra hiện tượng mất một đoạn nucleotide và sự mất đoạn này nằm ở băng 41bp (từ vị trí 8254→8294), băng này chỉ còn 32 bp theo như tính toán lý thuyết. Tất cả các mẫu nghi ngờ đều không còn băng 41 bp nên đột biến mất đoạn này ở dạng homoplasmy ở tất cả các trường hợp, có nghĩa là đột biến mất đoạn có mặt ở tất cả các bản copy của DNA ty thể. Để khẳng định tính chất di truyền theo dòng mẹ của các gen trên hệ gen ty thể. Chúng tôi đã kiểm tra phổ băng PCR-RFLP của 4 gia đình (ký hiệu I, II, III và IV) có bệnh nhân nghi ngờ mất đoạn. Kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR với mẫu DNA khuôn của bố bệnh nhân của cả 4 gia đình sau khi cắt bằng BanII có 3 băng với kích thước 99 bp, 72 bp và 41 bp giống như mẫu bình thường. Trong khi đó sản phẩm PCR với DNA khuôn của mẹ bệnh nhân ở cả 4 gia đình được cắt bằng BanII đều cho 3 băng DNA có kích thước 99 bp, 72 bp và 32 bp giống như mẫu bệnh nhân nghi ngờ đột biến mất đoạn. Kết quả này chứng tỏ bố bệnh nhân của cả 4 gia đình đều không mang đột biến mất đoạn, còn bệnh nhân và mẹ bệnh nhân của 4 gia đình đều mang đột biến mất đoạn. Để có thêm bằng chứng về di truyền từ mẹ sang con của đột biến mất đoạn 9 bp, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra phổ băng PCR đoạn gen 212 bp của hai gia đình bệnh nhân khác (gia đình V và VI), mỗi gia đình có 2 con. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide 15% cho thấy băng DNA nhân bản ở mẫu các con và mẹ bệnh nhân đều chạy nhanh hơn băng DNA nhân bản ở mẫu bố bệnh nhân. Kết quả này một lần nữa bổ sung tính chất di truyền theo dòng mẹ của đột biến mất đoạn 9 bp. Để khẳng định chắc chắn những kết luận do phương pháp PCR-RFLP thu được trên đây, chúng tôi tiến hành nhân dòng đoạn DNA được nhân bản bằng PCR vào vector pGEM-T và giải trình tự đoạn DNA kích thước 212 bp đối với 6 gia đình (I, II, III, IV, V, VI). Sản phẩm PCR được gắn với vector pGEM-T và được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Các tế bào được nuôi trên đĩa thạch LB có 50-100 µg/ml ampicillin, cơ chất X-gal và chất cảm ứng IPTG. Sau khi được nuôi qua đêm ở 37oC, các khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng xuất hiện. Các khuẩn lạc màu trắng theo lý thuyết là chứa vector tái tổ hợp. Để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen đích (đoạn 212 bp) trong vector tái tổ hợp ở các khuẩn lạc trắng, chúng tôi chọn một khuẩn lạc xanh và một số khuẩn lạc trắng rồi tiến hành PCR sử dụng hai cặp mồi: i) Cặp mồi pUC19Fw và pUC19Rv có trình tự nằm trên vector pGEM-T với khoảng cách giữa hai mồi là 296 bp; ii) Cặp mồi MRAGF và MRAGR đặc hiệu cho đoạn DNA 212 bp chèn vào vector pGEM-T. Kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc xanh với cặp mồi pUC19Fw và pUC19Rv cho băng DNA có kích thước khoảng 0,3 kb mà theo tính toán lý thuyết là 296 bp, còn với cặp mồi MRAGF và MRAGR không cho băng DNA nào. Sản phẩm PCR với các khuẩn lạc trắng khi sử dụng cặp mồi pUC19Fw và pUC19Rv cho băng DNA có kích thước khoảng 0,5 kb mà theo tính toán lý thuyết là 508 bp, còn với cặp mồi MRAGF và MRAGR cho băng DNA có kích thước khoảng 212 bp. Như vậy, chúng tôi đã thu được các khuẩn lạc trắng có vector tái tổ hợp mang đoạn DNA mong muốn. Từ các khuẩn lạc thu được, một số khuẩn lạc trắng được chọn ngẫu nhiên để nuôi trong môi trường LB lỏng, chuẩn bị cho bước tinh sạch plasmid Chúng tôi đã tiến hành giải trình tự đoạn gen đích trong vector tái tổ hợp thu được ở trên và so sánh trình tự vừa đọc được với trình tự gốc chuẩn rCRS (mã số J01415.2 trong Ngân hàng gen). Kết quả so sánh trình tự đoạn gen cho thấy đoạn gen từ vector tái tổ hợp pGEM-T của bố bệnh nhân có độ tương đồng 99,53% so với trình tự chuẩn tương ứng của hệ gen ty thể công bố trên GenBank . Chỉ có một nucleotide (C) vị trí 193 là không khớp với nucleotide (A) ở vị trí 8347 (trên genome ty thể hoàn chỉnh), nguyên nhân của sai khác này là do chúng tôi chủ động thay thế nucleotide T bằng G trong mồi MRAGRv khi thiết kế. Ngoài ra, kết quả cũng cho thấy đoạn gen đích của mẫu bố bệnh nhân chứa đầy đủ 2 trình tự lặp lại 9 bp là CCCCCTCTACCCCCTCTA. Tuy nhiên, trình tự đoạn gen của bệnh nhân và người mẹ chỉ có độ tương đồng 95,3% so với trình tự chuẩn tương ứng của hệ gen ty thể công bố trên GenBank, do mất đi 9 nucleotide CCCCCTCTA so với trình tự chuẩn, ngoài ra có sự sai khác một nucleotide (C thay cho A ở vị trí 184 trong đoạn gen được nhân lên) do cách thiết kế mồi ban đầu của chúng tôiNhư vậy, kết quả giải trình tự đoạn DNA (8155-8366) trên hệ gen ty thể hoàn toàn phù hợp với kết quả phân tích bằng PCR-RFLP. Tuy nhiên, việc xác định trình tự giúp chúng tôi khẳng định chính xác đoạn nulcleotide bị mất. Áp dụng phương pháp đã nêu ở trên (PCR-RFLP kết hợp với việc xác định trình tự, chúng tôi đã phát hiện 23 trường hợp mất đoạn 9 bp trong tổng số 72 mẫu nghiên cứu, chiếm tỷ lệ 31,9~32%. Như vậy tần suất xuất hiện sự mất đoạn 9 bp giữa vùng COII và tRNA Lys ở các bệnh nhân Việt Nam nghi ngờ hội chứng cơ não ty thể là tương đối cao so với những người khỏe mạnh (chiếm tỷ lệ 20%) như được báo cáo trong nghiên cứu trước đây. Kết quả này phần nào cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu về tần suất xuất hiện sự mất đoạn 9 bp trong hệ gen ty thể ở các bệnh nhân người Đài Loan mắc hội chứng MELAS và MERRF là 47% so với người khỏe mạnh là 21%. Các nghiên cứu trước đây cũng đã cho rằng có sự thiếu ổn định của vùng gen COII/tRNALys trong hệ gen ty thể ở các bệnh nhân bị bệnh ty thể và là điểm nóng cho sự mất đoạn, mặc dầu vùng này của ty thể vốn được xem là một vùng không mã hóa cho protein hay enzyme nào. Do đó, có thể nó không phải là một đột biến gây nên bệnh tật. Nhưng tỷ lệ đột biến mất đoạn cao trong những bệnh nhân có biểu hiện rối loạn hoạt động ty thể, khiến chúng tôi nhận định hai khả năng: thứ nhất, ở bệnh nhân bị rối loạn hoạt động ty thể thì quá trình sao chép của gen ty thể bị lỗi và gây ra sự mất đoạn, đặc biệt ở những vùng trình tự lặp lại tương đồng; thứ hai, sự mất đoạn này ở người đã góp phần cho những biểu hiện bệnh đa dạng của bệnh ty thể. 3. Phân tích đột biến A3243A Nhân đoạn gen mang đột biến A3243G Nhằm tìm hiểu sự liên quan giữa đột biến mất đoạn 9 bp với đột biến A3243G của hội chứng MELAS, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc sự có mặt của đột biến này ở 72 bệnh nhân mà chúng tôi chọn điều tra đột biến mất đoạn 9 bp và đột biến A8344G nêu trên. Đột biến thay thế A thành G ở vị trí 3243 làm xuất hiện trình tự nhận biết của enzyme HaeIII (AGCC → GGCC). Chúng tôi đã áp dụng phương pháp PCR-RFLP như được nêu trong nghiên cứu của Trịnh Lê Phương và tập thể. Cặp mồi đặc hiệu trên (MtFw và MtRv – bảng 1) chứa hai vị trí nhận biết của enzyme HaeIII và ở mồi xuôi 3149C được thay bằng 3149T còn ở mồi ngược 3318G được thay bằng 3318A (so với trình tự gốc). Với cách thiết kế như trên, cặp mồi đã loại bỏ hai trình tự nhận biết của HeaIII trong sản phẩm PCR. Vì vậy, chỉ những đoạn DNA chứa đột biến mới có vị trí nhận biết của enzyme HaeIII và bị cắt thành hai đoạn mới, còn đoạn DNA không chứa đột biến thì không có vị trí nhận biết của enzyme HaeIII nên không bị cắt và giữ nguyên kích thước ban đầu. Theo tính toán lý thuyết, PCR với cặp mồi thiết kế chúng tôi nhân bản được đoạn DNA từ vị trí 3134 đến vị trí 3331, kích thước 198 bp. Chúng tôi sử dụng chế phẩm DNA tổng số tách từ mẫu máu của các bệnh nhân cho PCR. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% cho thấy sản phẩm PCR từ các mẫu DNA tổng số tách từ máu của các bệnh nhân đều cho một băng DNA duy nhất có kích thước như tính toán lý thuyết là 198bp. Trong khi đó, sản phẩm PCR của mẫu không có DNA không cho băng DNA nào cả. Phát hiện đột biến A3243G bằng PCR-RFLP Sau khi kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 2%, chúng tôi đã tiến hành cắt trực tiếp các sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn HaeIII, sản phẩm của phản ứng cắt giới hạn được điện di trên gel polyacrylamide 15%. Theo lý thuyết, enzyme HaeIII cắt đoạn DNA kích thước 198 bp chứa đột biến A3243G thành hai đoạn mới có kích thước 111 bp và 87 bp. Còn đoạn DNA không chứa đột biến không bị enzyme HaeIII cắt và giữ nguyên kích thước ban đầu 198 bp. Dựa vào phổ băng DNA thu được chúng ta có thể kết luận đoạn DNA có mang đột biến hay không. Đối chứng dương được cắt từ DNA khuôn bệnh nhân bị đột biến A3243G xác định trong nghiên cứu Trịnh Lê Phương và tập thể sau khi cắt bằng HaeIII đều cho 3 băng DNA là 198 bp, 111 bp và 87 bp. Đột biến này đã được nhóm nghiên cứu giải trình tự và khẳng định phương pháp xác định đột biến A3243G bằng PCR-RFLP là hoàn toàn chính xác Tương tự như vậy, dựa vào đối chứng dương đã biết, từ 72 mẫu bệnh nhân được điều tra, chúng tôi phát hiện ra một trường hợp một bệnh nhân bị đột biến A3243G và bệnh nhân này nằm trong số 23 bệnh nhân mang đột biến mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA đã được điều tra ở trên. Đột biến A thay thế G ở vị trí 3243 nằm trên gen mã hóa cho tRNALeu(UUR) thuộc hội chứng não giật cơ, tăng lactate máu và giả tai biến mạch (MELAS). Bệnh nhân này là một trẻ nam 11 tuổi (Nguyễn Văn Đ., Hải Hậu-Nam Định), có biểu hiện rối loạn chuyển hóa ty thể đặc trưng nhất là hàm lượng acid lactic máu rất cao 9,2 mmol/L so với người bình thường là 1,0 1,78 mmol/L. Dấu hiệu về thần kinh cũng khá rõ nét cho hội chứng MELAS: bệnh nhân có biểu hiện bị động kinh co giật nặng, run tay phải, co giật chân phải, hay bị co giật dẫn đến liệt nửa người và hồi phục chậm, trong cơn co giật vẻ mặt đờ đẫn mất ý thức. Phát triển tinh thần vận động chậm, tay chân nhỏ, người cao và rất gầy (trọng lượng cơ thể là 18 kg, so với bình thường là khoảng 25 kg). Kết quả chụp cộng hưởng từ cho thấy bệnh nhân bị viêm não, hình ảnh tổn thương viêm não thùy thái dương trái và thùy chẩm hai bên. Những tổn thương này là phổ biến trong hội chứng Melas với đột biến A3243G, nhiều nghiên cứu đã cho rằng sự mất chức năng ty thể góp phần cho những phá hủy thần kinh trong hội chứng Melas. Kiểm tra sau khi đo thính lực thấy khả năng nghe kém. Hàm lượng Ca2+ là 0,95 mmol/L giảm so với mức bình thường là 1,1-1,3 mmol/L, có thể do nhiều ty thể bị hỏng làm giảm khả năng tích trữ và lưu giữ lượng ion Ca2+ trong máu bệnh nhân. Bệnh nhân này có thể trạng gầy yếu, mệt mỏi, rất biếng ăn, nuốt khó và thường bị nôn sau ăn. Kết quả kiểm tra các cơ quan khác như hô hấp, tiêu hóa, cơ-xương khớp, thị lực không phát hiện gì đặc biệt. Các chỉ tiêu sinh hóa máu khác đều trong mức bình thường. Kết quả phát hiện các virus EV, EBV, CMV, HSV1 cho kết quả âm tính. Chúng tôi cũng đã kiểm tra sự có mặt của đột biến A3243G trong các thành viên gia đình bệnh nhân Nguyễn Văn Đ. Kết quả điện di sản phẩm PCR-RFLP cho thấy sản phẩm PCR với mẫu DNA khuôn của bố bệnh nhân sau khi cắt bằng HaeIII chỉ cho một băng DNA duy nhất kích thước 198bp giống như sản phẩm PCR trước khi cắt bằng HaeIII. Trong khi đó sản phẩm PCR với mẫu DNA khuôn của bệnh nhân, mẹ và anh trai bệnh nhân thì sau khi cắt bằng HaeIII đều cho 3 băng DNA giống như mẫu đối chứng dương. Dựa vào thang chuẩn DNA, các băng này có kích thước như tính toán lý thuyết là 87 bp, 111 bp và 198 bp. Kết quả này chứng tỏ bố bệnh nhân không mang đột biến A3243G, còn mẹ bệnh nhân, anh trai bệnh nhân và bệnh nhân đều mang đột biến A3243G. Điều này một lần nữa cũng khẳng định mẹ của bệnh nhân đã truyền đột biến A3243G cho con. Sự tồn tại của băng DNA có kích thước ban đầu 198 bp ở các sản phẩm cắt của mẫu bệnh nhân, anh và mẹ bệnh nhân được lý giải bằng hiện tượng heteroplasmy. Cơ thể mang đột biến A3243G chứa đồng thời bản copy có đột biến và bản copy không có đột biến nên sản phẩm PCR có chứa cả đoạn DNA mang đột biến và đoạn DNA không mang đột biến. Do đó, sản phẩm PCR-RFLP của mẫu mẹ, anh trai bệnh nhân và bệnh nhân vẫn có băng 198 bp. Thêm nữa, dựa vào độ sáng của các băng DNA ở sản phẩm cắt của bệnh nhân, anh và mẹ bệnh nhân chúng tôi đưa ra nhận định rằng: tỉ lệ sản phẩm PCR bị cắt bởi enzyme HaeIII ở mẹ bệnh nhân thấp hơn so với hai người con rất nhiều, điều đó cho thấy tỉ lệ ty thể mang đột biến A3243G/ty thể không mang đột biến ở mẹ bệnh nhân thấp hơn hai người con. Nhận định này phần nào giải thích được bệnh nhân có biểu hiện của hội chứng MELAS rõ rệt, còn mẹ bệnh nhân thì không có các biểu hiện bệnh. Như vậy, có thể thấy rằng bệnh nhân Nguyễn Văn Đ. mang đồng thời đột biến mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA và đột biến MELAS A3243G. Mất đoạn 9 bp có thể là một yếu tố nhạy cảm cho những bệnh rối loạn đa yếu tố liên quan đến ty thể. Theo các dẫn liệu Bệnh viện Nhi Trung ương cung cấp, chúng tôi thấy những bệnh nhân mất đoạn 9 bp chúng tôi phát hiện được đều thuộc nhóm có hàm lượng axit lactic trong máu cao so với người bình thường (1,0 1,78 mmol/L), cá biệt có trường hợp cao nhất đạt 20,3 mmol/L. Axit lactic là một hợp chất hữu cơ sinh học, nó được sản sinh từ quá trình đường phân (glycolysis). Hầu hết các cơ quan, tổ chức trong cơ thể duy trì hoạt động nhờ vào quá trình cung cấp năng lượng hiếu khí. Tuy nhiên khi ty thể bị hỏng thì tế bào sử dụng toàn phần hay một phần năng lượng từ nguồn oxy hóa glucose yếm khí và sản sinh axit lactic khuếch tán vào máu. Vì đột biến mất đoạn 9 bp không thuộc vùng gen mã hóa cho một RNA hay protein nào, nên không phải là nguyên nhân trực tiếp gây nên các rối loạn chức năng ty thể. Các rối loạn như tăng axit lactic máu và biểu hiện bất bình thường về thần kinh và vận động (không nêu ở đây) của các bệnh nhân được điều tra rất có thể liên quan đến sự có mặt của đột biến khác trong hệ gen ty thể mà chưa được phát hiện thấy trong nghiên cứu của chúng tôi. Tỷ lệ đột biến mất đoạn 9 bp cao (32%) hơn mức người bình thường trong nghiên cứu của chúng tôi có thể nói lên rằng, có sự liên quan nhất định giữa mất đoạn 9 bp với khả năng bị các đột biến khác trong hệ gen ty thể. References Tài liệu Tiếng Việt 1. Đái Duy Ban, Lê Thanh Hòa, Nguyễn Văn Vũ, Hoàng Minh Châu, Nguyễn Bích Nga, Đái Hằng Nga, Lê Kim Xuyến, Đoàn Thanh Hương, Phạm Công Hoạt, Phan Xuân Đọc, Lê Trung Dũng, Lê Quang Huấn, Nguyễn Thanh Đạm, Nguyễn Bá Đức, Nguyễn Công Hoàng (2003), “Bước đầu nghiên cứu ung thư vú bệnh nhân Việt Nam bằng phương pháp sinh học phân tử sử dụng chỉ thị di truyền hệ gen ty thể vùng D-loop”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ hai, Nghiên cứu cơ bản trong sinh học, nông nghiệp, y học, Huế 25-26/7/2003, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà nội, tr. 825-829. 2. Lê Quang Huấn, Trần Mỹ Linh, Vũ Thị Thư, Phan Minh Tuấn, Lê Trần Bình (2003), “Nghiên cứu giám định phả hệ bằng kỹ thuật DNA”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ hai, Nghiên cứu cơ bản trong sinh học, nông nghiệp, y học, Huế 25-26/7/2003, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà nội, tr. 917-919. 3. Trịnh Lê Phương, Chu Văn Mẫn và Phan Tuấn Nghĩa (2009), “Phân tić h đột biến gen A3243G của hội chứng MELAS bằng phương pháp PCR-RFLP cải tiến”, Tạp chí Di truyền học và ứng dụng, Số 4: 6-9. 4. Quyền Đình Thi, Đào Thị Tuyết, Nghiêm Đình Dũng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải (2006), “Xác định trình tự đoạn DNA từ vị trí 5805 đến vị trí 8414 trong hệ gen ty thể người Việt Nam”, Báo cáo kết quả nghiên cứu đề mục, Đề tài KC-04-25, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội, tr.10-20. 5. Phạm Hùng Vân (2009), PCR và Real-time PCR, các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp, NXB Y học, Hồ Chí Minh. Tài liệu Tiếng Anh 6. Anderson S., Bankier A. T., Barrel B. G., de Bruijn M. H. L., Coulson A. R., Drouin J., Eperson I. C., Nierlich D. P., Roe B. A., Sanger F., Schreier P. H., Smith A. J. H., Staden R., Young I. G. (1981), “Sequence and organization of the human mitochrondrial genome”, Nature, 290, pp. 457−465. 7. Andreu A. L., Bruno C., Dunne T. C., Tanjik K., Shanske S., Sue C. M., Krishna S., Hadjigeorgiou G. M., Shtilbans A., Bonilla E., DiMauro S. (1999), “A nonsense mutation (G15059A) in the cytochrome b gên in a patient with exercise intolerance and myoglobinuria”, Ann. Neurol., 45, pp. 127-130. 8. Ballinger S.W., Schurr T.G., Torroni A., Gan Y. Y., Hodge J. A., Hassan K., Chen K. H. and Wallace D. C. (1992), “Southeast Asian mitochondrial DNA analysis reveals genetic continuity of ancient Mogoloid migrations”, Genetics, 130, pp. 139-152. 9. Barrietos A., Casademont J., Solans A., Moral P., Cardellach F., Urbano-Márquez A., Estivill X. and Nunes V. (1995), “The 9-bp deletion in region V of mitochondrial DNA: evidence of mutation recurrence”, Hum Genet, 96, pp. 225-228. 10. Bouzisi M. F., Schager H., Collombet J. M., Carrier H., Flocard F., Quard S., Mousson B., Godinot C. (1993), “Decreased expression of ubiquinol-cytochrome c reductase subunits in patients exhibiting mitochondrial myopathy with progressive exercise intolerance”, Neuromuscul. Disord., 3, pp. 599-604. 11. Clayton D. A., Vinograd J. (1967), “Circular dimerand catenate forms of mitochondrial DNA in human leukaemic leucocytes”, Nature, 216, pp. 652−657. 12. De Coo I. F., Renier W. O., Ruitenbeek W., TerLaak H. J., Bakker M., Schagger H., Van Oost B. A., Smeets H. J. (1999), “A 4-base pair deletion in the mitochondrial cytochrome b gene associated with parkinsonism/ Melas overlap syndrome”, Ann. Neurol., 45, pp. 130133. 13. DiMauro S., Hirano M., Kaufmann P., Tanji K., Sanno M., Shugu D. C., Bonillia E., DeVivo D. C. (2002), “Clinical features and genetics of myoclonic epilepsy with ragged red fibers”, Adv. Neurol., 89, pp. 217-229. 14. Du W. D., Li W., Chen G., Cao H. M., Tanga H., Tanga X., Jin Q., Sund Z., Zhao H., Zhoua W., Hea S., Lva Y., Zhao J., Zhanga X. (2009), “Detection of known base substitution mutations in human mitochondrial DNA of MERRF and MELAS by biochip technology”, Biosen. Bioelectron., 24, pp. 2371–2376. 15. Handoko H. Y., Lum J. K., Rismalia G., Kartapradja H., Sofro A. S. M. and Marzuki S. ( 2001), “Length Variations in the COII–tRNALys Intergenic Region of Mitochondrial DNA in Indonesian Populations”, Hum. Biol., 73, pp. 205–223. 16. Hertzberg M., Mickleson K. N. P., Serjeantson S. W., Prior J. F., and Trent R. J. (1989), “An Asian-specific 9-bp Deletion of Mitochondrial DNA Is Frequently Found in Polynesians”, .Am. J. Hum. Genet., 44, pp. 504-510. 17. Ida H., Rennert O. M., Iwasawa K., Kobayashi M., Eto Y. (1999), “Clinical and genetic studies of Japanese homozygotes for the Gaucher disease L444P mutation”, Hum. Genet., 105, pp. 120–126. 18. Ivanova R., Astrinidis A., Lepage V., Djoulah S., Wijnen E., Vu-Trieu A., Hors J. and Charron D. (1999), “Mitochondrial DNA polymorphism in the Vietnamese population”, Eur. J. Immunogenet., 26, pp. 417–422. 19. Keightley J. A., Anitori R., Burton M. D., Quan F., Buist N. R., Kennaway N. G. (2000), “Mitochondrial encephalomyopathy and complex III deficiency associated with a stopcodon mutation in the cytochrome b gene”, Am. J. Hum. Genet., 67, pp. 1400-1410. 20. Kolesnikova O. A., Entelis N. S., Mireau H., Fox T. D., Martin R. P., Tarassov I. A. (2000), “Suppression of mutations in mitochondrial DNA by tRNAs imported from the cytoplasm”, Science, 289, pp. 1931 – 1933. 21. Legros F., Chatzoglou E., Frachon P., Ogier De Baulny H., Laforet P., Jardel C., Godinot C., Lombes A. (2001), “Functional characterization of novel mutations in the human cytochrome b gene”, Eur. J. Hum. Genet., 9, pp. 510-518. 22. Liu C. S., Cheng W. L., Chen Y. Y., Ma Y. S., Pang C. Y., and Wei Y. H. (2005), “High Prevalence of the COII/tRNALys Intergenic 9-bp deletion in Mitochondrial DNA of Taiwanese Patients with MELAS or MERRF Syndrome”, Ann. NY. Acad. Sci., 1042, pp. 82-87. 23. Masoro E. J. and Austad S. N. (2006), Handbook of The Biology of Aging, 6th Edition, Academic Press, USA. 24. Miller F. J., Losenfeldt F. L., Zhang C., Linnane A. W. and Nagley P. (2003), “ Precise determination of mitochondrial DNA copy number in human skeletal and cardiac muscle by a PCR-based assay”, Nucleic. Acids. Re., 31, e61. 25. Montero M., Alonso M., Albillos A., Cuchillo-Ibanez I., Olivares R., Villalobos C. (2002), “Effect of inositol 1,4,5-triphosphate receptor stimulation on mitochondrial (Ca2+) and secretion in cromaffin cells”, Biochem. J., 365, pp. 451-459. 26. Musumeci O., Andreu A. L., Shanske S., Bresolin N., Comi G. P., Rothstein R., Schon E. A., and DiMauro S. ( 2000), “Intragenic Inversion of mtDNA: A New Type of Pathogenic Mutation in a Patient with Mitochondrial Myopathy”, Am. J. Hum. Genet., 66, pp. 1900– 1904. 27. Nelson D. L., Cox M. M. (2009), Lehninger Principles of biochemistry, Worth publishers, Inc. 28. Nogueira C., Nunes J., Evangelista T., Fattori F., Tesa A., Pereira C., Santorelli F. M., Vilarinho L. (2007), “A new mtDNA-tRNAGlu mutation (14728T>C) presenting a late-onset mitochondrial encephalomyopathy”, Mitochondrion, 7, pp. 396-398. 29. Oota H., Kitano T., Jin F., Yuasa I., Wang L., Ueda S., Saitou N., Stoking M. (2002), “Extreme mtDNA homoleneity in continental Asia populations”, Am. J. Phys. Anthropol., 118, pp. 146-153. 30. Polyak K., Li Y., Zhu H., Lengauer C., Willson J. K., Markowitz S. D., Trush M. A., Kinzer K. W., Vogelstein B. (1988), “Somatic mutations of the mitochondrial genome in human colorectal tumours”, Nat. Genet., 20, pp. 291-293. 31. Redd A. J., Takezaki N., Sherry S. T., McGarvey S. T., Sofro A. S., Stoneking M. (1995), “ Evolutionary history of the COII/tRNALys intergenic 9 base pair deletion in human mitochondrial DNAs from the Pacific”, Mol. Biol. Evol., 12, pp. 604–615. 32. Sambrook J., Russell D. W. (2001), Molecular Cloning: A laboratory manual, 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory, New York. 33. Schon E. A., Rizzuto R., Moraes C. T., Nakase H., Zeviani M., DiMauro S. (1989), “A direct repeat is a hostpot for large-scale deletion of human mitochondrial DNA”, Science, 244, pp. 346-349. 34. Schuelke M., Krude H., Finckh B., Mayatepek E., Janssen A., Schmelz M., Trefz, Trijbels F., Smeitink J. (2002), “Septo-optic dysplasia associated with a new mitochondrial cytochrome b mutation”, Ann. Neurol., 51, pp. 388-392. 35. Singh R., Ellard S., Hattersley A., and Haries L. W. (2006), “Rapid and sensitive Real-time polymerase chain reation method for detection and quantification of A3243G mitochondrial point mutation”, J. Mol. Diagn., 8, pp. 225-230. 36. Sokolova V. A., Vasilyev V. B., (2002), “A Russian family of Slavic origin carrying mitochondrial DNA with a 9-bp deletion in region V and a long C-stretch in D-loop”, Elsevier Science, pp. 479–483. 37. Strand H., Ingebretsen O. C., Nilssen Ø. (2008), “Real-time detection and quantification of mitochondrial mutations with oligonucleotide primers containing locked nucleic acid”, Clin. Chim. Acta., 390, pp. 126-133. 38. Tanahashi C., Nakayama A., Yoshida M., Ito M., Mori N., Hashizume Y. (2000), “MELAS with the mitochondrial DNA 3243 point mutation: a neuropathological study”, Acta. Neuropathol., 99, pp. 31-38 39. Thomas M. G., Cook C. E., Miller K., Waring M. J. and Hagelberg E. (1998), “Molecular instability in the COII±tRNALys intergenic region of the human mitochondrial genome: multiple origins of the 9-bp deletion and heteroplasmy for expanded repeats”, Phil. Trans. R. Soc. Lond., 353, pp. 955-965. 40. Watkings W. S., Bamshad M., Dixon M. E., Rao B. B., Naidu J. M., Reddy P. G., Prasad B. V. R., Das P. K., Reddy P. C., Gai P. B., Bhanu A., Kusuma Y. S., Lum J. K., Fishcher P., and Jorde W. S. (1999), “Multiple Origins of the mtDNA 9-bp Deletion in Populations of South India”, Am. J. Phys. Anthropol., 109, pp. 147–158. 41. Wibrand F., Ravn K., Schwartz M., Rosenberg T., Horn N., Vissing J. (2001), “Multisystem disorder associated with a missense mutation in the mitochondrial cytochrome b gene”, Ann. Neurol., 50, pp. 540-543. 42. Wrischnik L. A., Higuichi R. G., Stoneking M., Erlich H. A., Arnheim N. and Wilson A. C. (1987), “Length mutations in human mitochondrial DNA: direct sequencing of enzymatically amplified DNA”, Nucleic. Acids. Res., 15, pp. 529-542. 43. Zhuo G., Feng G., Leng J., Yu L., Jiang Y. (2010), “A 9-bp deletion homoplasmy in women with polycystic ovary syndrome revealed by mitochondrial genome – mutation screen”, Biochem. Genet., 48, pp. 157-163. Tài liệu từ trang web 44. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/J01415.2 45. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=gene&part=melas DiMauro S., Hirano M. (2001) “MELAS”, GENE Reviews 46. https://notes.utk.edu/bio/bcmb421.nsf/f5b2cbf2a827c0198525624b00057d30/217c10a4bee dc0298525651300613209?OpenDocument 47. http://genome.wellcome.ac.uk/doc_WTD020876.html Sykes B (2003) “Mitochondrial DNA and human history” 48. http://www.mitomap.org/mitoseq.html “A human mitochondrial genome database”