Tài liệu Phân tích thành phần stipuleanosid r2 trong các bộ phận của cây sâm vũ diệp

an dP ha rm ======  ====== ac y, V KHOA Y DƯỢC NU ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ed ici ne TRẦN THỊ NGỌC HÀ M PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN STIPULEANOSID R2 TRONG CÁC BỘ PHẬN CỦA CÂY SÂM VŨ DIỆP Sc ho ol of (Panax bipinnatifidus Seem.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Co py rig h t@ NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2019 =======  ====== ac y, V KHOA Y DƯỢC NU ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI dP ha rm Người thực hiện: TRẦN THỊ NGỌC HÀ an PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN STIPULEANOSID R2 ed ici ne TRONG CÁC BỘ PHẬN CỦA CÂY SÂM VŨ DIỆP M (Panax bipinnatifidus Seem.) of KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC t@ Sc ho ol (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa: QH2014.Y Co py rig h Người hướng dẫn: GV.TS. NGUYỄN HỮU TÙNG Hà Nội - 2019 MỤC LỤC NU LỜI CẢM ƠN Danh mục ký hiệu và tên viết tắt ac y, V Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ và đồ thị ĐẶT VẤN ĐỀ dP ha rm CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN..................................................................................... 2 1.1. Tổng quan về Sâm Vũ Diệp........................................................................... 2 1.1.1. Tên khoa học......................................................................................... 2 an 1.1.2. Đặc điểm thực vật................................................................................. 2 1.1.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái..............................................................2 ed ici ne 1.1.4. Thành phần hóa học.............................................................................. 3 1.1.5. Tính vị, công năng.................................................................................8 1.1.6. Tác dụng dược lý...................................................................................8 M 1.1.7. Công dụng............................................................................................. 8 of 1.2. Tổng quan về Saponin....................................................................................9 1.3. Tổng quan về Stipuleanosid R2................................................................... 10 ol 1.4. Tổng quan về một số nghiên cứu phân tích định tính và định lượng về Sc ho thành phần hóa học trong Sâm Vũ Diệp............................................................. 11 2. CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 14 t@ 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU..................................................................... 14 2.1.1. Nguyên liệu......................................................................................... 14 rig h 2.1.2. Dung môi, hóa chất............................................................................. 14 2.1.3. Thiết bị................................................................................................ 14 Co py 2.2. PHƯƠNG PHÁP.......................................................................................... 15 2.2.1. Phương pháp chiết xuất Sâm Vũ Diệp................................................15 `2.2.2. Phương pháp phân tích TLC..............................................................16 2.2.3. Phương pháp định lượng Stipuleanosid R2 bằng HPLC....................17 NU 3. CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ...................................................................................... 25 3.1. Chiết xuất saponin từ các bộ phận lá, thân, rễ Sâm Vũ Diệp...................... 25 ac y, V 3.2. Định tính bằng TLC thành phần Stipuleanosid R2 trong các bộ phận Sâm Vũ Diệp................................................................................................................25 3.3. Định tính thành phần Stipuleanosid R2 trong cao chiết từ các bộ phận Sâm dP ha rm Vũ Diệp bằng HPLC........................................................................................... 26 3.4. Định lượng Stipuleanosid R2 trong các bộ phận Sâm Vũ Diệp bằng HPLC................................................................................................................... 27 4. CHƯƠNG 4 - BÀN LUẬN................................................................................... 29 an 4.1 Về chiết xuất và xác định thành phần saponin có trong các bộ phận của Sâm Vũ Diệp................................................................................................................29 ed ici ne 4.2. Về định lượng sơ bộ thành phần Stipuleanosid R2 trong các bộ phận của Sâm Vũ Diệp bằng HPLC................................................................................... 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 31 M TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... 33 Co py rig h t@ Sc ho ol of PHỤ LỤC...................................................................................................................35 LỜI CẢM ƠN NU Trong thời gian tiến hành nghiên cứu và hoàn thiện đề tài cùng khóa luận, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, hỗ trợ và giúp đỡ tận tình và tâm huyết của các ac y, V thầy cô, các anh chị đi trước tại Khoa Y Dược-ĐHQGHN cùng với sự ủng hộ của bạn bè và người thân gia đình. Qua đây, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành tới những người đã luôn bên cạnh, dìu dắt, chỉ dạy và ủng hộ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận. dP ha rm Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Dương Thị Ly Hương, T.S Nguyễn Hữu Tùng - Khoa Y Dược ĐHQGHN, thầy cô đã dành thời gian để trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm quý báu và động viên tôi trong suốt quá trình hoàn thiện khóa luận của mình. Tôi xin cảm ơn sâu sắc tới anh Nguyễn Hoàng Việt ; chị Đặng Thị Ngần - Khoa Y an Dược ĐHQGHN, những người tiền bối đã luôn bên cạnh tôi trong suốt quá trình thực nghiệm tại labo, giúp tôi khắc phục những sai sót hay vượt qua những khó ed ici ne khăn thất bại trong qúa trình thí nghiệm. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm Khoa, các thầy cô trong Khoa Y Dược, đặc biệt là bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc đã luôn tạo M điều kiện cho tôi thực hiện khóa luận này. of Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể Dược học khóa QH.2014.Y, đặc biệt là các bạn Nông Mỹ Hoa, Nguyễn Thị Hồng Nhung, Cao Thị Phương Thảo, Bùi Thị ol Thanh Vân đã đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian nghiên cứu. Co py rig h t@ hôm nay. Sc ho Và cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình thân yêu và bạn bè đã ở bên ủng hộ tôi trong cả quá trình học tập, phấn đấu để đạt được thành tích như ngày Hà Nội, ngày 09 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Trần Thị Ngọc Hà Danh mục ký hiệu và tên viết tắt Tên đầy đủ EtOH Ethanol HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC-DAD Sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò mảng diod MeOH Methanol ac y, V dP ha rm LOD Giới hạn phát hiện Giới hạn định lượng RDS Độ lệch chuẩn tương đối SVD Sâm vũ diệp an LOQ TLC Sắc ký lớp mỏng Tài liệu tham khảo ed ici ne TLTK TPHH Thành phân hóa học TT Co py rig h t@ Sc ho ol of M UV UV-DAD NU Ký hiệu Thuốc thử Tử ngoại UV-detector aray diode Danh mục các bảng NU Bảng 1.1. Các thành phần hóa học đã nghiên cứu trong Sâm Vũ Diệp............... 7 Bảng 1.2. Điều kiện sắc ký và kết quả phân tích định tính, định lượng acid ac y, V oleanolic trong dược liệu Sâm Vũ Diệp............................................................. 12 Bảng 1.3. Chương trình pha động chạy HPLC-DAD.........................................13 Bảng 2.1. Chương trình dung môi chạy HPLC-DAD........................................ 18 dP ha rm Bảng 3.1. Hàm lượng cắn các phân đoạn chiết xuất từ thân rễ Sâm Vũ Diệp... 25 Bảng 3.2. Hàm lượng cắn phân đoạn chiết xuất từ lá và thân Sâm Vũ Diệp.....25 Bảng 3.3. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký....................................................19 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của stipuleanosid R2.................20 an Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp.....................................21 ed ici ne Bảng 3.6. Khảo sát độ thu hồi............................................................................. 22 Bảng 3.7. Kết quả định lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD.................. 27 Co py rig h t@ Sc ho ol of M Bảng 3.8. Kết quả định lượng stipuleanosid R2 trong thân và lá SVD..............28 Danh mục các hình vẽ và đồ thị NU Hình 1.1 . Đặc điểm hình thái Sâm Vũ Diệp........................................................ 2 Hình 1.2 . Đặc điểm thực vật và vùng phân bố Sâm Vũ Diệp............................. 3 ac y, V Hình 1.3 . Cấu trúc hóa học của 10 saponin tách được từ rễ SVD.......................5 Hình 1.4 . Cấu trúc hóa học của β-sitosterol, oleanolic acid và daucosterol....... 5 Hình 1.5 . Cấu trúc hóa học của Stipuleanosid R2(a) và Aralosid A methyl(b) dP ha rm ester........................................................................................................................ 6 Hình 1.6 . Thành phần saponin thuộc nhóm triterpenoid có trong Sâm Vũ Diệp.10 Hình 1.7 Công thức cấu tạo của Stipuleanosid R2............................................ 11 Hình 2.1 . Mẫu dược liệu Sâm Vũ Diệp............................................................. 14 an Hình 2.2 . Sơ đồ quy trình chiết.......................................................................... 16 ed ici ne Hình 2.3 . Dịch lọc rễ, thân, lá SVD................................................................... 16 Hình 3.1 . Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử...................19 Hình 3.2 . Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của stipuleanosid R2......................... 21 Hình 3.3 . Kết quả TLC Stipuleanosid R2 của các bộ phận dược liệu Sâm Vũ M Diệp......................................................................................................................26 of Hình 3.4 . Sắc ký đồ HPLC của stipuleanosid R2 (A) và các mẫu cao của thân ol rễ (B), thân và lá (C) Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.).................... 26 Co py rig h t@ Sc ho Hình 3.5 . Sắc ký đồ cao tổng lá và thân SVD....................................................28 ĐẶT VẤN ĐỀ NU Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm - Araliaceae) là một trong những cây thuốc quý phân bố ở Trung Quốc và dãy núi Hoàng Liên Sơn ac y, V Tây Bắc nước ta [9]. Gần đây Sâm Vũ Diệp (SVD) đã được thuần hóa và bước đầu được trồng thử nghiệm ở một số địa phương ở Hà Giang, Lào Cai. Về mặt y học, SVD được sử dụng làm thuốc bổ và là thành phần trong một số bài thuốc truyền thống của các dân tộc vùng núi Tây Bắc. Theo các tài liệu cũng như các nghiên cứu dP ha rm trước [2,12] cho thấy dược liệu SVD đang được sử dụng là phần thân rễ, chứa hàm lượng lớn saponin-Stipuleanosid R2-thành phần hoạt chất chính mang lại tác dụng dược lý và giá trị sử dụng của dược liệu quý này trong y học. Tuy nhiên, chưa có công bố chính thức nào về thành phần saponin này trong bộ phận trên mặt đất của SVD. Do đó, việc tập trung nghiên cứu thành phần saponin trong các bộ phận SVD an cũng như định lượng được thành phần đó có ý nghĩa rất quan trọng trong việc ứng dụng dược liệu SVD trong thực tiễn. Vậy liệu trong các bộ phận khác trên mặt đất ed ici ne của SVD (lá, thân, hoa) có chứa thành phần saponin như phần (dưới mặt đất) thân rễ hay không? Nếu có thì hàm lượng là bao nhiêu? Có thể sử dụng các bộ phận đó thay thế dược liệu SVD được không? Để trả lời những câu hỏi trên, đồng thời đóng góp vào việc nghiên cứu một M cách có hệ thống về saponin và xây dựng các tiêu chí định tính, định lượng, cơ sở dữ liệu về hóa thực vật và tiêu chuẩn hóa dược liệu SVD; chúng tôi thực hiện đề tài of “Phân tích thành phần Stipuleanosid R2 có trong các bộ phận của cây Sâm Vũ ol Diệp” tiếp nối nghiên cứu bước đầu về thành phần hóa học của thân rễ SVD và “Nghiên cứu thành phần saponin có trong thân rễ của SVD trồng ở Sa Pa”-luận văn Sc ho thạc sĩ Nguyễn Thị Thu Thủy [12], với các mục tiêu định tính và bước đầu định lượng thành phần stipuleanosid R2 trong các bộ phận của cây Sâm Vũ Diệp gồm: Co py rig h t@ thân (trên mặt đất), lá và thân rễ. 1 CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN NU 1.1. Tổng quan về Sâm Vũ Diệp 1.1.1. Tên khoa học chi Sâm (Panax. L), họ Ngũ gia bì (Araliaceae) [2]. 1.1.2. Đặc điểm thực vật ac y, V Sâm Vũ Diệp có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem. [1], SVD thuộc dP ha rm Sâm Vũ Diệp là cây thân thảo sống nhiều năm, ưa bóng và đặc biệt ưa ẩm. Thân rễ dài có nhiều đốt và những vết sẹo do thân rụng hàng năm để lại. Thân khí sinh mảnh, cao 20 - 30 cm, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, thường lụi vào mùa đông, mọc chồi thân mới từ giữa tháng 2 đến đầu tháng 3 dương lịch. Lá kép chân vịt, gồm 2 - 3 cái mọc vòng. Lá chét 5 - 7 (ít khi 3) thuôn, an dài 2,5 - 14 cm, rộng 1,5 - 4 cm, gốc tròn, đầu thuôn thành mũi nhọn, xẻ thùy of M ed ici ne không đều, mép có răng cưa, có lông [1]. Sc ho ol Hình 1.1. Đặc điểm hình thái Sâm Vũ Diệp 1.1.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái Trong tự nhiên, SVD phân bố ở Trung Quốc, Ấn Độ và Nepan (vùng cận t@ Hymalaya) và dãy núi Hoàng Liên Sơn, Tây Bắc nước ta [1]. Sa Pa-Việt Nam cũng là điểm phân bố cuối cùng của SVD ở phía nam. Năm 1973, cây đã được phát hiện ở núi Hàm Rồng, sát thị trấn Sa Pa, ở độ cao 1600 m. Hiện nay vùng phân bố của rig h SVD đã bị thu hẹp dần, từ độ cao khoảng 1800 m trở lên, cây được coi là cực hiếm [1]. Gần đây SVD đã được thuần hóa và bước đầu được trồng thử nghiệm ở một số Co py địa phương ở Hà Giang và Lào Cai [18]. 2 NU ac y, V dP ha rm Hình 1.2. Đặc điểm thực vật và vùng phân bố Sâm Vũ Diệp. Sâm Vũ Diệp thường mọc rải rác hay tập trung (vài chục khóm) dưới tán rừng ẩm, gần như quanh năm có sương mù. Đất nơi có SVD mọc được xác định là an feralit có mùn, có những chỗ SVD mọc lần với thảm rêu dày trên hốc đá hay ở gốc ed ici ne cây gỗ lớn. SVD còn là cây ưa khí ẩm mát. Các chỉ số về khí hậu ở Trạm quan trắc đèo Hoàng Liên Sơn, cho thấy SVD đã tồn tại và phát triển vững bền từ bao đời nay trong một điều kiện khí hậu có nền nhiệt độ khá thấp (nhiệt độ trung bình năm 12.8°C, lượng mưa: 3552 mm/năm; lượng bốc hơi là 494 mm/năm và độ ẩm không M khí và độ ẩm không khí trung bình khoảng 90%..) Hàng năm vào cuối tháng 2 đầu tháng 3, từ phần đầu mầm thân rễ phân of nhánh ngang nằm sát mặt đất sẽ mọc lên một hoặc vài chồi thân (tùy thuộc vào số đầu mầm thân rễ phân nhánh). Chồi này sinh trưởng nhanh trong vòng một tháng ol đã ra lá và gần đạt được chiều cao cực đại. Đến tháng 4, mỗi thân mang lá có thể Sc ho cho ra một cụm hoa. Quả xanh quan sát được vào cuối tháng 4 – 6, đến tháng 7 quả đã chín và rụng xuống xung quanh gốc cây mẹ. Do quả chín đúng vào thời kì có lượng mưa lớn tháng 7 – 8 nên hạt giống thường bị cuốn trôi, ảnh hưởng đến khả t@ năng tái sinh tự nhiên của SVD. Sau khi quả chín, từ tháng 9 – 10, toàn bộ phần rig h thân mặt đất tàn lụi qua mùa đông, để lộ những vết sẹo thân rễ khá rõ. Đó là dấu hiệu giúp ta xác định tuổi của cây [1]. py 1.1.4. Thành phần hóa học Hiện tại các nghiên cứu về Sâm Vũ Diệp chưa nhiều, song hầu hết các kết quả nghiên cứu đều cho thấy thành phần hóa học mang hoạt tính chính của SVD là Co Saponin. Trần Công Luận và cộng sự năm 2009, đã định lượng saponin tổng số của thân rễ và rễ củ của SVD theo phương pháp trọng lượng của Namba là 5,86% [7]. 3 Trong lá và thân rễ Sâm Vũ Diệp được các nhà nghiên cứu xác định có chứa thành một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn [11,12]. NU phần chính là các Saponin khung oleanan với hàm lượng tương đối cao cùng với ac y, V Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc công bố phân lập 13 saponin khung dammaran từ lá của cây này ở Trung Quốc trong đó bao gồm một số ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3 [17].Thân rễ SVD chứa saponin thuộc nhóm oleanan gồm những chất như dP ha rm chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid Ro, Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2 [1]. Ở Việt Nam, nghiên cứu về TPHH của SVD còn khá mới mẻ. Nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự năm 2002, kết quả định tính sơ bộ cho thấy trong thân rễ và rễ củ SVD có chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin cùng với acid béo, acid amin. Đồng thời bằng cách thủy phân saponin rồi kết tinh an sapogenin toàn phần thu được acid oleanolic [7,8]. ed ici ne Năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam-Hàn Quốc đã phân lập và xác định được một nhóm gồm 10 saponin khung oleanan (1-10, hình 1.2) là thành phần chính của rễ cây SVD được thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn (Việt Nam), trong đó có Sc ho ol of M 3 chất mới bifinosid A-C (1-3) [3]. Ara(p) H H Me H 2: H Xy (1→6) H Me H Co py rig h t@ 1: gc 3: Xy Ara(p) H Me Gc 4: H H Ara(p) Me H 5: H H H Me Gc 6: Xy H H Me H 4 Gc Ara(f) H H 8: Xy H H Me Gc 9: Xy Ara(p) H H Gc 10: H Gc Ara(f) Me Gc Me: methyl Ara(f): α-L-arabinofuranosy dP ha rm Ara(p): α-L-arabinopyranosy NU H ac y, V 7: G c: β-D-g ucopyranosy Xy: β-D-xy opyranosy an Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của 10 saponin tách được từ rễ SVD ed ici ne Đỗ Văn Hào năm 2017, đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học 3 hợp chất β-sitosterol, oleanolic acid và daucosterol từ phân đoạn ethyl acetat thân M rễ SVD [4]. β-sitosterol t@ Sc ho ol of Oleanolic acid Daucostero Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của β-sitosterol, oleanolic acid và daucosterol. rig h Năm 2018, Thạc sỹ Nguyễn Thu Thủy đã phân lập và xác định được cấu trúc Co py hóa học của 2 hợp chất khác có trong thân rễ SVD là stipuleanosid R2 , aralosid methyl ester [12]. 5 NU ac y, V dP ha rm an Stipuleanosid R2. Aralosid A methyl ester. t@ b) Sc ho ol of M ed ici ne a) Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của Stipuleanosid R2(a) và Aralosid A methyl(b) ester. rig h Như vậy, tổng cộng có 23 hợp chất saponin đã được xác định từ các phần Co py của cây SVD có liên quan đến tác dụng sinh học. 6 STT Hợp chất TLTK 24(S)-pseudoginsenosid F11 2 Bifinosid A 3 Bifinosid B 4 Bifinosid C 5 Bipinnatifidusosid F1 6 Bipinnatifidusosid F2 7 Chikusetsusaponin IVa 8 Ginsenosid F 9 Ginsenosid F2 10 Ginsenosid F3 [15] 11 Ginsenosid Rb1 [15] 12 Ginsenosid Rb3 [15] 13 Ginsenosid Rd [15] 14 Ginsenosid Re [15] 15 Ginsenosid Rg1 [15] Ginsenosid Rg2 [15] 17 Majorosid F1 [15] 18 Momordin IIe [13] 19 Narcissiflorin methyl este [13] 20 Panasenosid [13] 21 Pseudoginsenosid RT1 methyl este [13] 22 Stipuleanosid R1 [13] 23 Stipuleanosid R2 methyl este [13] [14] [14] dP ha rm [14] [15] ol of M ed ici ne an [15] Co py rig h t@ Sc ho 16 [15] ac y, V 1 NU Bảng 1.1. Các thành phần hóa học đã nghiên cứu trong Sâm Vũ Diệp 7 [13] [15] [15] Nhận xét: Các kết qủa nghiên cứu bước đầu chỉ ra rằng saponin NU Stipuleanosid R2 là thành phần chính trong dược liệu SVD (thân rễ) với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn ac y, V [1,7,12,14]. Song các nghiên cứu chỉ mới thực hiện chủ yếu trên đối tượng là thân rễ của SVD mà chưa có nhiều báo cáo về các thành phần có trong các bộ phận khác như lá, phần thân trên mặt đất của cây. Do đó từ tổng quan về TPHH của SVD đã trình bày, đề tài định hướng nghiên cứu phân tích TPHH của các bộ phận thân, lá, dP ha rm thân rễ SVD trồng ở Sa Pa, đặc biệt là thành phần Stipuleanosid R2 với mục đích so sánh về thành phần và hàm lượng thành phần này giữa các bộ phận. Từ đó cung cấp cơ sở khoa học cho dược liệu SVD trồng ở Việt Nam. 1.1.5. Tính vị, công năng Tính vị, công năng: SVD có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dưỡng ed ici ne 1.1.6. Tác dụng dược lý an huyết, hoạt lạc, chỉ huyết, tán ứ [1]. Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý của SVD cho thấy khi thử trên động vật thí nghiệm, SVD có độc tính cấp rất thấp, tăng cường chức năng sinh lý, ảnh hưởng tốt đến hệ thần kinh trung ương, tăng sức dẻo dai của cơ thể, tăng sức đề M kháng, tác dụng tán huyết [1]. Bên cạnh đó một số Saponin có tác dụng dược lý như: chống viêm, chống oxi hóa, chống ung thư, bảo vệ tim mạch, chống tiểu of đường, bảo vệ tế bào thần kinh, …có thể phần nào giải thích cho lợi ích về mặt ol dược học trong việc sử dụng SVD trong y học truyền thống [16]. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự đã chỉ ra rằng SVD có Sc ho tác dụng chống stress, chống trầm cảm, có tác dụng bảo vệ gan và kích thích tăng miễn dịch [5] t@ 1.1.7. Công dụng Từ xa xưa, dân gian đã dùng SVD làm thuốc bổ huyết, chủ yếu cho phụ nữ sau sinh và người cao tuổi. SVD còn được dùng ngoài, bôi lên các vết thương để rig h cầm máu, tán ứ, tiêu sưng, làm lành vết thương nhanh. Bên cạnh đó SVD còn được dân gian sử dụng như một thực phẩm tăng cường sinh lực, kích thích sinh dục bằng Co py cách ngâm rễ SVD rồi chiết dưới dạng tinh sâm, rất tốt cho sức khỏe [1]. 8 Trong y học cổ truyền Việt Nam, thân rễ của SVD đã được sử dụng như một NU loại thuốc bồi bổ tinh thần và thể chất, cải thiện trí nhớ, giảm nguy cơ ung thư và làm giảm đường huyết ở bệnh nhân tiểu đường [3]. ac y, V Ở Trung Quốc, SVD còn được dùng làm thuốc chữa lao, chảy máu cam, thổ huyết, đòn ngã tổn thương [1]. 1.2. Tổng quan về Saponin dP ha rm Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycoside với phần genin có cấu trúc triterpene hay steroid 27 Cacbon gặp nhiều trong thực vật; ở động vật tìm thấy nhiều trong Sao Biển, Hải Sâm. Theo truyền thống, saponin thường được định nghĩa dựa trên một số tính chất chung đặc trưng của nhóm hợp chất này bao gồm: Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước.  Làm vỡ hồng cầu ngay cả khi ở nồng độ loãng.  Độc với cá, diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên…  Kích thích niêm mạc mắt gây hắt hơi, đỏ mắt.  Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3β-hydroxysteroid. ed ici ne an  Tuy nhiên không phải tất cả steroid đều thể hiện tất cả tính chất trên. M Cấu trúc của Saponin cũng như các glycosid khác, gồm có 2 phần là phần of đường và phần aglycon (còn được gọi là sapogenin). Saponin có cấu trúc triterpen với khung cơ bản 30C hoặc steroid với khung cơ bản 27C dẫn xuất từ khung ol cholestan. Trên các khung cơ bản của sapogenin các sapogenin khác nhau bởi mức Sc ho độ oxi hóa trên khung hay vị trí, số lượng của các nhóm thế. Nhóm thế trong sapogenin thường là hydroxyl, đôi khi gặp nhóm oxo hay sulfat. Nhóm OH có thể tự do hay glycosid hóa với đường. Một vài trường hợp nhóm có thể được acyl hóa với các acid hữu cơ. Số lượng và vị trí nhóm thế trên khung cũng không nhiều. Ở t@ vị trí C3 của sapogenin gần như luôn có nhóm OH. Nhóm OH này trong đa số trường hợp có định hướng β. Đây cũng là vị trí gắn với đường của đa số saponin. rig h Với số lượng không nhiều các sapogenin, sự đa dạng của saponin chủ yếu do thành Co py phần, số lượng và vị trí của các đường trong phân tử. Ngoài ra, còn có thể gặp các dây nối trên khung. Đa số saponin có từ 1-2 mạch đường (được gọi là monodesmosid và bidesmosid). Ở các monodesmosid, phần đường gắn vào sapogenin hầu hết là ở vị 9 trí C-3 bằng dây nối glycosid. Saponin có thể có thêm mạch đường thứ hai. Tổng NU số đơn vị đường trong một saponin có thể tới 11 đơn vị, nhưng số đường trên một mạch được biết tới nay tối đa là 8. Số đơn vị đường trong saponin thường là 1-4 ac y, V đường. Đường trong saponin là các đường thông thường như β-D-glucose, β-Dxylose, α-L-rhamnose và α-L-arabinose… [11]. Dựa trên cấu trúc hóa học của phần genin người ta chia saponin thành 2 nhóm lớn là saponin triterpenoid và saponin steroid; mỗi nhóm lại được chia thành dP ha rm nhiều nhóm nhỏ [11]. Nhiều công trình nghiên cứu trước đây đã cho thấy thành phần chính của thân rễ và rễ củ của cây SVD là saponin thuộc nhóm triterpenoid ed ici ne an khung oleanan với phần sapogenin đã được xác định là acid oleanolic [1]. M Hình 1.6. Thành phần saponin thuộc nhóm triterpenoid có trong Sâm Vũ Diệp. of 1.3. Tổng quan về Stipuleanosid R2 Stipuleanosid R2 là một hoạt chất saponin quan trọng, thành phần mang ol hoạt tính, đang tiếp tục được sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học, hợp Co py rig h t@ Sc ho chất này được phân lập trong một số dược liệu như: Sâm Vũ Diệp, Tam Thất hoang, Aralia taibaiensis [14], Aralia elata [17] … 10 NU ac y, V dP ha rm Hình 1.7 Công thức cấu tạo của Stipuleanosid R2 an Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: (2S,3S,4R,5R,6R)-6[[(3S,4aR,6aR,6bS,8aS,12aS,14aR,14bR)-4,4,6a,6b,11,11,14b-heptamethyl-8a- ed ici ne [(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxycarbonyl1,2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14,14-tetradecahydropicen-3-yl]oxy]-3[(2S,3R,4R,5S)3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-5-hydroxy-4- M [(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxane-2carboxylic acid [16]. of Công thức phân tử: C53H84O23 [19]. ol Phân tử lượng: 1089.232 g/mol [19]. Sc ho Tính chất lý hóa: Chất bột màu trắng, độ tan: 0,57 g/L, điểm nóng chảy 210 - 215 0C [19]. 1.4. Tổng quan về một số nghiên cứu phân tích định tính và định lượng về t@ thành phần hóa học trong Sâm Vũ Diệp rig h Trần Công Luận và cộng sự năm 2009, đã định lượng saponin tổng số của thân rễ và rễ củ của Sâm vũ diệp theo phương pháp trọng lượng của Namba là 5,86% [7]. Năm 2017, Đỗ Văn Hào và Nguyễn Thị Huệ đã tiến hành khảo sát và lựa py chọn điều kiện sắc ký và xây dựng phương pháp định tính, định lượng acid Co oleanolic trong dược liệu SVD bằng phương pháp HPLC–DAD. Điều kiện sắc ký và kết quả phân tích định tính, định lượng như bảng 1.2. 11 oleanolic trong dược liệu Sâm Vũ Diệp NU Bảng 1.2. Điều kiện sắc ký và kết quả phân tích định tính, định lượng acid - Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt ac y, V 3,5μm) - Pha động: MeOH - Acid acetic 0,15%/H2O (85:15, v/v) - Detector UV-DAD phát hiện ở bước sóng: 203 nm - Tốc độ dòng: 1 - Thể thích bơm mẫu: 20 µl - Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phòng - Dung môi pha mẫu: Methanol dP ha rm ml/phút an Định tính: Kết quả phân tích Định lượng: Kết quả cho thấy dung dịch thử (cao tổng ethanol) hàm lượng acid oleanolic trong cao ed ici ne có pic oleanolic acid xuất hiện ở SVD và dược liệu SVD lần lượt là: thời gian lưu tR=10,485 phút tương 0,034% và 0,0066% [12]. tự như thời gian lưu của pic oleanolic acid chuẩn (tR=10,690 M phút) [4]. of Năm 2018, Nguyễn Thị Thu Thủy đã xác định và định lượng thành phần chính stipuleanosid R2 trong mẫu thân rễ SVD nghiên cứu trong đề tài là 0,49% ol bằng phương pháp HPLC-DAD được thực hiện trong điều kiện như sau: Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity.  Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm).  Detector DAD phát hiện ở bước sóng 203 nm. Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút. Thể thích bơm mẫu: 20 µl. rig h  t@  Sc ho  py  Co   Nhiệt độ: 25℃. Dung môi pha mẫu: Methanol. Pha động: Acetonitril (kênh A): 0,5% acid acetic/H2O (kênh B) với chương trình gradient như bảng 1.3. 12