Tài liệu Phân tích độc tố vi nấm aflatoxin trong thực phâm ( ngũ cốc và sữa).pptx

Môn Phân tích dư lượng & độc tố Giảng Viên : PHÙNG VÕ CẨM HỒNG Nhóm 15 Đề tài: Phân tích độc tố vi nấm Aflatoxin trong thực phâm ( ngũ cốc và sữa) Tóm tắt nội dung :      I Giới thiệu khái quát vấn đề II Afltoxin là gì? Và tác hoại củl Afltoxin với con người. III Các phương pháp xác định lfltoxin IV Phương pháp xác định lfltoxin bằng sắc khí lỏng V Công thức tính hàm lượng Afltoxin I-Giới thiệu khái quát vấn đề  Trong những năm gần đây, vấn đề ngộ độc thực phẩm đã xảy ra ngày một nhiều hơn và không loại trừ bất cứ vùng miền nào, từ nông thôn đến thành thị, từ các bếp ăn tập thể đến các hộ gia đình nhỏ lẻ. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến các vụ ngộ độc, chẳng hạn như thực phẩm kém chất lượng, thực phẩm không được bảo quản đúng quy định hoặc thực phẩm bị nhiễm bẩn,…  Một trong những nguyên nhân gây nên ngộ độc là ăn phải thức ăn có nấm mốc chứa độc tố Aflatoxin . Chính vì vậy, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm là một vấn đề hết sức quan trọng. Đặc biệt ngũ cốc, các loại hạt và sữa là đối tượng dể nhiễm chũng nấm này.  Vì vậy để chắc chắn ngũ cốc, sữa không bị nhiễm độc aflatoxin do nấm thì ta phải đem chúng đi giám định phân tích, và nhóm em xin trình bày sơ lượt về cách phân tích chũng nấm chứa độc tố aflatoxin này trên thực phẩm . II-Afltoxin là gi ?   Afltoxin là độc tố vi nấm được sản sinh tựn nhiên do một số loài Asperggillus. Đây là một loại nấm mốc có chứl độc tố, là tác nhân gây ung thư. Các Afltoxin slu khi xâm nhập vào cơ thể có thể được thuỷ phân trgở thành M1 ít độc hơn hoặc được gln chuyển hól thành dạng trgung giln epoxit hoạt hól. Các dạng Afltoxin và dạng chuyển hól Nguồn nấm cung cấp độc tố :  Aflatoxin B và B : được sinh ra bởi Aspergillus parasiticus và Aspergillus flavus. 1 2  Aflatoxin G1và G2: được sinh ra bởi Aspergillus parasiticus. Aflatoxin M1: chất chuyển hóa của aflatoxin B1 trên người và động vật (trong sữa mẹ có thể phơi nhiễm tới mức ng).  Aflatoxin M : chất chuyển hóa của aflatoxin B trong sữa của bò được cho ăn thức 2 2 ăn nhiễm aflatoxin. Công thức cáu tạo và tính chất của các loại Aflatoxin: • AFB1: C17H12O6 • AFB2: C17H14O6 • AFG1 : C17H12O7 • AFG2 : C17H14O7 - AFB1: Có điểm nóng chảy 268-269 oC, có màu xanh lam trên đèn huỳnh quang. - AFB2: Có điểm nóng chảy 286-289 oC, có màu xanh lam trên đèn huỳnh quang. - AFG1: Có điểm nóng chảy 244-246 oC, có màu xanh lục trên đèn huỳnh quang. - AFG2: Có điểm nóng chảy 229-231 oC, có màu xanh lục trên đèn huỳnh quang. (Hendricks, 2002) [30]  III-CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH AFLATOXIN 1. Phương pháp vật lý hoá học:Phương pháp này dựa trên nguyên lý các aflatoxin dễ dàng tách khỏi mẫu phân tích bằng các dung môi hữu cơ phân cực mạnh như cloroform, methanol, ethanol, benzen,… - Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC): - Phương pháp sắc khí lớp mỏng hiệu suất cao (HPTLC): - Phương pháp sắc khí lỏng cao áp (HPLC): - Phương pháp sắc kí cột: 2. Phương pháp hoá sinh học:hương pháp hoá sinh học miễn dịch mang đặc hiệu cao, dựa trên nguyên lý kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu. -Phương pháp ELISA trực tiếp: -Phương pháp ELISA gián tiếp: - Phương pháp kháng thể đơn dòng: - Phương pháp sử dụng kit ELISA thương phẩm: IV-PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH AFLATOXIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG 1. Sắc ký lỏng 1 chiều.  2. Sắc ký lỏng 2 chiều  Phương pháp sắc ký lớp mỏng 1 chiều  1. chọn dung môi -Việc chọn dung môi : Cloroform/axeton, hỗn hợp (90 + 10) Ete dietyl/metanol/nước, hỗn hợp (96 + 3 + 1 ) Ete dietyl/metanol/nước, hỗn hợp (94 +4,5+1,5) Cloroform/metanol hỗn hợp (94 + 6). Cloroform/metanol, hỗn hợp (97 + 3).) phải thực hiện trước để đảm bảo rằng các aflatoxin 1 và 2 được tách ra hoàn toàn khi chạy tấm sắc ký, điều này phụ thuộc vào các tấm được sử dụng. Chấm 25 ml dung dịch định tính lên Các tấm TLC bằng thủy tinh 200 mm x 200 mm (mỗi tấm dùng cho một dung môi cần kiểm tra) Tiến hành chạy sắc ký, cho bay hơi và chiếu ánh sáng bằng đèn tử ngoại. Với dung môi thích hợp, thì sẽ tạo ra hai điểm phân tách. 2. Cách tiến hành -Dùng pipet mao quản hoặc microxyranh chấm các thể tích dung dịch chuẩn aflatoxin lên tấm TLC với các điểm cách mép 20 mm, cách nhau 20 mm và chấm dịch chiết dưới đây: - 10 ml, 15 ml, 20 ml, 30 ml và 40 ml dung dịch aflatoxin chuẩn (dung dịch chuẩn chứa khoảng 0,1 mg aflatoxin B1 trên mililit, pha trong cloroform hoặc trong hỗn hợp benzen/axetonitril ) - 10 ml dịch chiết thu được trong làm sạch và chấm chồng lên điểm 20 ml dung dịch chuẩn aflatoxin - 10 ml và 20 ml dịch chiết thu được trong làm sạch -Lấy tấm sắc ký ra khỏi bình, để dung môi bay hơi ở nơi tối, sau đó đem kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại, đặt tấm sắc ký cách đèn tử ngoại bước sóng dài 10 cm. Các vết aflatoxin sẽ cho huỳnh quang màu xanh da trời. Phương pháp sắc ký lớp mỏng 2 chiều 1. Chấm các dung dịch (xem Hình 1) Kẻ hai đường thẳng trên tấm sắc ký và song song với hai cạnh tấm (một đường cách cạnh 50 mm, đường kia cách cạnh 60 mm) để thiết lập giới hạn sự di chuyển của dung môi. Dùng pipet mao quản hoặc microxyranh chấm các dung dịch sau đây lên tấm sắc ký: - Tại điểm A: 20 ml dịch chiết mẫu được đã làm sạch thu được trong 7.4.2; - Tại điểm B: 20 ml dung dịch aflatoxin B1 chuẩn (4.14); - Tại điểm C: 10 ml dung dịch aflatoxin B1 chuẩn (4.14); - Tại điểm D: 20 ml dung dịch aflatoxin B1 chuẩn (4.14); - Tại điểm E: 40 ml dung dịch aflatoxin B1 chuẩn (4.14). Làm khô dưới luồng không khí hoặc khí trơ (4.12). Các vết thu được phải có đường kính khoảng 5 mm. 2. Chạy sắc ký (xem Hình 1) Chạy sắc ký theo chiều I ở nơi tối, sử dụng dung môi khai triển (4.6.3) ( lớp dung môi dày 1 cm trong bình đã bão hòa) cho đến khi dung môi chạm tới đường giới hạn. Lấy tấm sắc ký ra khỏi bình, để khô ở nơi tối nhiệt độ phòng ít nhất là 15 phút. Kích thước tính bằng milimét Hình 1 – Chấm các dung dịch Sau đó chạy sắc ký theo chiều II ở nơi tối, sử dụng dung môi khai triển (4.6.1) (lớp dung môi dày 1 cm trong bình chưa bão hòa) đến khi dung môi chạm tới đường giới hạn. Lấy tấm sắc ký ra khỏi bình và để khô ở nơi tối ở nhiệt độ môi trường. 3. Diễn giải về sắc phổ (xem hình 2) Kiểm tra sắc phổ dưới ánh sáng tử ngoại, bằng cách đặt tấm sắc ký cách đèn 10 cm. Xác định vị trí của các điểm huỳnh quang màu xanh da trời B, C, D và E của aflatoxin B1 từ dung dịch chuẩn và kẻ hai đường thẳng mờ đi qua các điểm này tạo thành các góc vuông với hướng chạy sắc ký. Giao điểm P của hai đường này điểm nghi ngờ của aflatoxin B1 có trong dịch chiết tại điểm chấm A (xem Hình 1). Tuy nhiên, vị trí thực của điểm aflatoxin B1 có thể nằm tại điểm Q là giao điểm của hai đường kẻ ở trên tạo với nhau một góc khoảng 100o theo thứ tự đi qua điểm B và điểm C. Kích thước tính bằng milimét Hình 2 – Diễn giải về sắc phổ 4. Sắc ký bổ sung Kẻ hai đường thẳng trên tấm sắc ký mới giao nhau và song song với hai cạnh của tấm sắc ký như Hình 1 và tại điểm A chấm 20 ml dịch chiết đã được làm sạch thu được trong 7.4.2 và chấm chồng lên nó 20 ml dung dịch aflatoxin B1 chuẩn (4.14). Chạy sắc ký như ở 7.5.2.2. Kiểm tra sắc phổ dưới ánh sáng tử ngoại và kiểm tra rằng: - Các vết aflatoxin B1 của dịch chiết và của dung dịch chuẩn phải trùng nhau, và - Huỳnh quang tại điểm này phải mạnh hơn huỳnh quang tại điểm aflatoxin B 1 đã tiến hành ở điểm Q trên tấm thứ nhất. V-Công thức xác định hàm lượng Aflatoxin : Xác định bằng mắt Hàm lượng aflatoxin B1, được biểu thị theo microgam trên kilogam mẫu, tính bằng công thức sau đây: Trong đó: C là nồng độ của aflatoxin B1 trên mililít dung dịch chuẩn (4.14) (khoảng 0,1 mg/ml), tính bằng microgam; m là khối lượng của phần mẫu thử tương ứng với thể tích dịch chiết được đưa lên cột để làm sạch (10,0 g), tính bằng gam; V1 là thể tích cuối cùng của dịch chiết kể cả những lần pha loãng nếu có, tính bằng microlít; V2 và V3 là thể tích tương ứng của dịch chiết và dung dịch aflatoxin B 1 chuẩn (4.14) chấm lên tấm có cường độ huỳnh quang giống nhau, tính bằng microlít. Đo bằng máy đo cường độ huỳnh quang  Hàm lượng aflatoxin B1, được biểu thị bằng microgam trên kilogam mẫu, tính theo công thức sau đây:  Trong đó m là khối lượng của phần mẫu thử tương ứng với thể tích của dịch chiết được đưa lên cột để làm sạch (10,0 g), tính bằng gam;   M1 là khối lượng aflatoxin B1 trong điểm chấm dịch chiết (kể cả thể tích V2) được suy ra từ các phép đo, tính bằng nanogam;  V1 là thể tích cuối cùng của dịch chiết kể cả những phần pha loãng nếu có, tính bằng microlit;  V2 là thể tích của dịch chiết chấm lên tấm sắc ký (10 ml hoặc 20 ml), tính bằng microlít. TÀI LIỆU THAM KHẢO a)Tài liệu chính: TIÊU CHUẨN VIỆT NAM(TCVN 6599 : 2007) VỀTHỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH BÁN ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXIN B1 – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG https://vlnblnphlplult.co/tcvn-6599-2007-thuc-ln-chln-nuoi-xlc-dinh-bl n-dinh-luong-lfltoxin-b1?fbclid=IwAR0FykJ5vcMNdm29YVmtn1wLJ1mrgbwzWx-n ONQ-5iimtIIeCrgxFDL9rgo550 b) Tài liệu tham khảo thêm: ĐỘC TỐ AFLATOXIN CỦA CHI CỤC THÚ Y THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH https://chicucthuyhcm.orgg.vn/lfltoxin/ Thlnks forg listening