Tài liệu Phân tích beta-lactam trong mẫu dược phẩm và sinh học bằng phương pháp hplc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Thị Như Hoa PHÂN TÍCH BETA-LACTAM TRONG MẪU DƯỢC PHẨM VÀ SINH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2012 1 HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------Nguyễn Thị Như Hoa Phân tích beta-lactam trong mẫu dược phẩm và sinh học bằng phương pháp HPLC Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60 44 29 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Nguyễn Văn Ri Hà Nội – Năm 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ...............................................................................................................................1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ................................................................................................10 1.1 Giới thiệu về kháng sinh β -lactam ..........................................................................10 1.1.1 Lịch sử ra đời ..........................................................................................................10 1.1.2 Phân loại .................................................................................................................10 1.1.3 Đánh giá tác dụng ...................................................................................................10 1.2 Kháng sinh β-lactam..................................................................................................11 1.2.1 Định nghĩa...............................................................................................................11 1.2.2 Cấu trúc và phân loại .............................................................................................11 1.2.3 Tính chất vật lí và hóa học .....................................................................................15 1.2.4. Tác dụng ................................................................................................................15 1.2.5. Điều chế ................................................................................................................16 1.2.6. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay.................17 1.3. Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam.....................................................19 1.3.1. Phương pháp quang học.........................................................................................19 1.3.2. Phương pháp điện hóa ...........................................................................................20 1.3.3. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE).........................20 1.3.4. Sắc ký bản mỏng ( TLC)........................................................................................22 1.3.5. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC) ......................................................................22 CHƯƠNG 2:ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................25 2.1. Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu ...........................................................25 2.1.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu.........................................................................25 2.1.2. Nội dung nghiên cứu.............................................................................................25 2.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất........................................................................................26 2.2.1. Thiết bị...................................................................................................................26 2.2.2. Dụng cụ..................................................................................................................26 2.2.3. Hóa chất .................................................................................................................26 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................................28 3.1. Khảo sát điều kiện xác định β – lactam bằng LC/MS/MS........................................28 3.1.1. Khảo sát các điều kiện chạy của detector khối phổ ...............................................28 3.1.2. Chọn pha tĩnh ........................................................................................................30 3.1.3. Chọn pha động .......................................................................................................30 3.2. Đánh giá phương pháp phân tích ..............................................................................32 3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính ...................................................................................32 3.2.2. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ..........................................37 3.3. Phân tích mẫu thực tế................................................................................................38 3.3.1. Phân tích mẫu nước tiểu ........................................................................................38 3.3.2. Phân tích mẫu dược phẩm......................................................................................49 3.4. Hướng phát triển của đề tài...........................................................................................58 KẾT LUẬN..........................................................................................................................59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................60 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Bảng 1.2 Bảng 1.3 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Phân loại và cấu trúc một số penicillin Phân loại và cấu trúc của các cephalosporin Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI Kết quả khảo sát bắn phá các ion mẹ Năng lượng bắn phá và các ion con của beta-lactam Chương trình chạy gradien tối ưu rửa giải các chất beta-lactam Thời gian lưu tr của các kháng sinh nhóm beta-lactam Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ các beta-lactam Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các beta-lactam Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu nước tiểu 1 Bảng 3.9 Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu nước tiểu 2 Bảng 3.10 Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi của quy trình xử lý mẫu nước tiểu thêm chuẩn ở nồng độ 5 ppb Bảng 3.11 Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi của quy trình xử lý mẫu nước tiểu thêm chuẩn ở nồng độ 100 ppb Bảng 3.12 Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi của quy trình xử lý mẫu nước tiểu thêm chuẩn ở nồng độ 200 ppb Bảng 3.13 Bảng 3.14 Bảng 3.15 Bảng 3.16 Bảng 3.17 Kết quả thực hiện trên mẫu nước tiểu thực Thông tin mẫu thuốc phân tích Bảng tính khối lượng trung bình viên của các mẫu thuốc Khảo sát quy trình xử lý mẫu thuốc Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi quy trình xử lý mẫu thuốc thêm chuẩn ở nồng độ 5ppb Bảng 3.18 Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi quy trình xử lý mẫu thuốc thêm chuẩn ở nồng độ 100ppb Bảng 3.19 Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi quy trình xử lý mẫu thuốc thêm chuẩn ở nồng độ 200ppb Bảng 3.20 Kết quả phân tích mẫu thuốc thực DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin Hình 1.2 Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin Hình 3.1 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp beta-lactam 100ppb Hình 3.2 Đường chuẩn AMP Hình 3.3 Đường chuẩn PEN G Hình 3.4 Đường chuẩn PEN V Hình 3.5 Đường chuẩn OXA Hình 3.6 Đường chuẩn CLOX Hình 3.7 Đường chuẩn CEP Hình 3.8 Đường chuẩn CEF Hình 3.9 Đường chuẩn AMO Hình 3.10 Sắc đồ mẫu nước tiểu sau 6h Hình 3.11 Sắc đồ phân tích mẫu thuốc DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN: AMO AMP APCI CAD CE CEF CEP CLOX CUR CXP DP EP ESI GC – MS: GS1 GS2 HPLC IS LC-MS LOD LOQ MeOH OXA PEN G PEN V R% RSD% SPE TLC tr Acetonitrile Amoxicillin Ampicillin Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển Áp suất khí mang trong tứ cực Q2 Thế áp vào tứ cực Q1 Cefaclor Cephalexin Cloxacillin Khí mang Thế áp vào giữa tứ cực Q2 và Q3 Thế đầu vào áp vào màn chắn Thế áp vào nguồn ion mẹ Ion hóa phun điện tử Sắc kí khí khối phổ Áp suất khí hai bên đầu phun Áp suất của luồng khí nóng Sắc kí lỏng hiệu năng cao Thế ion hóa Sắc kí lỏng khối phổ Giới hạn phát hiện Giới hạn định lượng Methanol Oxacillin Penicillin G Penicillin V Độ thu hồi Độ lệch chuẩn tương đối Chiết pha rắn Sắc kí bản mỏng Thời gian lưu MỞ ĐẦU Các kháng sinh là một trong những nhóm thuốc thiết yếu trong y học hiện đại. Nhờ thuốc kháng sinh mà y học đã có thể loại bỏ được các dịch bệnh nguy hiểm như dịch hạch, tả, cúm,..và điều trị hiệu quả nhiều loại bệnh gây ra bởi các loại virus, vi khuẩn. Đối với các nước nghèo thuốc kháng sinh lại giữ một vị trí rất quan trọng vì ở các nước này do điều kiện vệ sinh kém và mức sống còn thấp nên thường xảy ra các dịch bệnh. Hiện nay trên thế giới người ta đã phát hiện trên 8000 kháng sinh và mỗi năm có khoảng vài trăm chất kháng sinh mới được phát hiện. Kể từ khi penicillin được ALEXANDER FLEMING phát hiện năm 1929 và được chứng minh có tác dụng chữa bệnh năm 1941 thì trong hơn nửa thế kỷ qua kháng sinh đã trở thành dược phẩm không thể thiếu được trong việc điều trị các loại bệnh do virus, vi khuẩn gây ra và nó có tác dụng hơn hẳn so với các thuốc kháng khuẩn khác [1, 13]. β -Lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh cho con người, thú y từ khi chúng được giới thiệu vào thị trường vào năm 1938 và là loại kháng sinh được dùng nhiều nhất hiện nay. Liều lượng và cách dùng kháng sinh không đúng sẽ dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ đó việc chữa trị càng khó khăn. Ngoài ra còn gây lãng phí cho người bệnh vì có những bệnh do virus không chữa được bằng kháng sinh nhưng vẫn dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc chuẩn đoán các bệnh và ảnh hưởng tới sức khỏe người bệnh. Hàm lượng lớn kháng sinh trong máu gây các bệnh về thận, đặc biệt là người cao tuổi. Vì vậy, kiểm soát và phân tích thuốc kháng sinh đối với người bệnh là biện pháp cần thiết để nâng cao hiệu quả sử dụng chúng. Hai phương pháp thường dùng để phân tích các β -lactam là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp điện di mao quản (CE). Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao có độ chọn lọc, độ nhạy cao, sử dụng lượng mẫu ít và thời gian phân tích ngắn. Tách và xác định đồng thời kháng sinh β - Lactam bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các detector hiện đại như huỳnh quang, MS trong mẫu dược phẩm và sinh học là một hướng nghiên cứu mới, với những ưu điểm nổi bật của nó về độ nhạy và độ chọn lọc ngày càng được áp dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm và phân tích mẫu dịch vụ. Xuất phát từ những lý do đó nên tôi đã chọn nghiên cứu đề tài: : "Phân tích beta-lactam trong mẫu dược phẩm và sinh học bằng phương pháp HPLC” sử dụng detector MS/MS. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về kháng sinh β -lactam [1, 2, 11] 1.1.1 Lịch sử ra đời Năm 1929, Alexander Fleming phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của nấm Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu và sử dụng kháng sinh, và sau đó là hàng loạt những nghiên cứu, sản xuất và sử dụng kháng sinh phát triển mạnh do tác dụng hơn hẳn trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn so với các thuốc kháng sinh khác. Giới y học định nghĩa : Kháng sinh là những chất tạo thành do chuyển hoá sinh học, có tác dụng ngăn cản sự tồn tại hoặc phát triển của vi khuẩn ở nồng độ thấp, được sản xuất bằng sinh tổng hợp hoặc tổng hợp theo mẫu các kháng sinh tự nhiên. 1.1.2 Phân loại Kháng sinh phân lọai dựa vào cấu tạo hoá học gồm các nhóm sau: - Kháng sinh β-lactam - Kháng sinh Aminoglycosid - Kháng sinh Tetracylin - Cloramphenicol và dẫn xuất - Kháng sinh Macrolid - Kháng sinh Lincosamid - Kháng sinh polypeptide - Các kháng sinh khác: Rifamycin 1.1.3 Đánh giá tác dụng - Theo đơn vị tác dụng (IU): Thường dùng cho các sản phẩm kháng sinh thiên nhiên, không nguyên chất. - Theo khối lượng chất chuẩn (g, mg,…) : Thường dùng cho các chế phẩm kháng sinh bán tổng hợp. 1.2 Kháng sinh β-lactam 1.2.1 Định nghĩa Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam. Gồm các nhóm: penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin. Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA). Các cephalosporin tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm Cephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic (7ACA) xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên. 1.2.2 Cấu trúc và phân loại * Các penicillin Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin, vòng β-Lactam R CO S N H 6 5 C H3 4 3 7 N 1 2 C H3 O COOM Hình 1.1. Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là: (2S,5R,6R 3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình 2S, 5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác nhau. Với M là gốc cation thường là: K, Na, H. Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác nhau. Bảng 1.1. Phân loại và cấu trúc một số penicillin R Hoạt tính CH2- PenicillinG Gồm các Penicillin tự nhiên và dẫn chất.Phổ hẹp: vi khuẩn gram(+). (PENG) tự nhiên Nhóm penicillin Tên kháng sinh Benzyl Benzathin Không kháng β-lactamase Nhóm penicillin kháng penicilliiase CH3 C- Oxacillin N O (OXA) 6-[(5-methyl-3- phenyl-1,2-oxazole-4- Là các Penicillin bán tổng hợp. Phổ carbonyl)amino] hẹp như nhóm I. Kháng penicilliiase, Cl không tác động vào vòng β – O N C- Lactam được. Cloxacillin CH3 6-{[3-(2- (CLO) chlorophenyl )-5-methyl- oxazole-4-carbonyl]amino} NH2 CH- Ampicillin Nhóm penicillin phổ rộng (AMP) 6-([(2R)-2-amino2-phenylacetyl]amino) Amoxicillin (AMO) Phổ rộng, tác dụng cả khuẩn gram NH2 (+) và (-). Không kháng β-lactamase CH- và penicilliiase HO 6-{[(2R)-2-amino 2-(4-hydroxyphenyl)acetyl]amino} * Các cephalosporin Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-Lactam 4 cạnh gắn với 1 dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R. Khác nhau bởi các gốc R R2 S R1 CO N H 7 6 8 N5 1 2 3 4 R3 O COOM Hình 1.2. Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là: (6R,7R) 8-oxo-5thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid Khi thay đổi các gốc R, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R được các cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau. Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ. Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng trên gram âm yếu hơn thế hệ sau. Bảng 1.2. Phân loại và cấu trúc của các cephalosporin Kháng sinh R1 I: Tác dụng mạnh nhất trên vi khuẩn gram (+), yếu nhất trên gram (-). Cephalexin bị NH2 Cephapirin SCH2- H -CH3 H -CH2-OCOCH3 N β- Cephazolin lactamase phá hủy CH- (CEP) Không bền và dễ R2 R3 N N N N CH2- H -CH2 S N CH3 II: tác dụng yếu hơn trên vi khuẩn gram Cefaclor CH- (CEF) H Cl NH2 (+), mạnh hơn trên gram (-) so với thế hệ I. Bền với Cefprozil HO CHNH2 H -CH=CH-CH3 β- lactamase. H2N III: tác dụng yếu hơn trên vi khuẩn Cefixim gram (+) so N S N HOOCCH2O H -CH=CH2 với thế hệ I, tác H2N dụng mạnh trên gram (-). Bền với Ceftazidim β- N S N HOOCC(CH3)2O + H -CH2 H -H2C N CH3 N lactamase IV: hoạt phổ tác dụng như thế hệ III nhưng tốt hơn Cefepim và nhiều kháng β- lactamase hơn H2N N S N CH3O + 1.2.3 Tính chất vật lí và hóa học [1] Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trong nước, dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong metanol và một số dung môi hữu cơ phân cực vừa phải. Tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần chứa đồng thời nhóm –COOH và –NH2. Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp thụ). Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pKa= 2.5-2.8 tùy vào cấu trúc phân tử. Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân tử, mở vòng β-lactam làm kháng sinh mất tác dụng. Bảng 1.3. Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu Tên kháng sinh pKa1 Tên kháng sinh pKa1 AMP 2,70 PEN G 2,74 AMO 2,80 CLO 2,70 CEP 2,60 OXA 2,72 CEF 2,75 1.2.4. Tác dụng[2, 12] Cơ chế: Các penicillin có khả năng acyl hóa các D- alanin tranpeptidase, làm cho quá trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện. Sinh tổng hợp vách tế bào bị ngừng lại. Ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-). Mặc khác, các penicillin còn hoạt hóa enzym tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết quả là vi khuẩn bị tiêu diệt. Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của màng tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn. Các kháng sinh β-lactam có hoạt phổ rộng. Kháng thuốc: Vi khuẩn sinh ra các β-lactamase, là enzim có tác dụng mở vòng β-lactam, theo phản ứng ái nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng. Tất cả các cách kháng không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gián tiếp (được gọi là kháng methicillin). Độc tính: Các kháng sinh β-lactam độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc: dị ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là sốc phản vệ.. Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và trong thời kỳ cho con bú. Chống chỉ định dị ứng với thành phần của thuốc. Đánh giá tác dụng kháng sinh: Theo đơn vị tác dụng: 1 IU là tác dụng của 0,6 μ g penicillin G natri tinh khiết trên một chủng mẫu tụ cầu. Hoạt lục của 1mg chất này là 1667 IU. 1 IU sẽ ứng với 0.672 μ g penicillin G kali tinh khiết, với 1mg chất này ứng với 1585 IU. 1.2.5. Điều chế [ 1] Sinh tổng hợp: Là phương pháp chủ yếu nuôi cấy chủng nấm Penicillium nonatum hoặc Penicillium chrysogennum trong môi trường và điều kiện thích hợp. Chiết xuất dạng kết tinh và muối natri hoặc kali. Để cho độ thu hồi cao thường gây đột biến bằng mù tạt, tia X hoặc tia UV, rồi chọn lọc lấy chủng nấm tốt theo ý muốn, đồng thời thêm vào môi trường nuôi cấy các tiền chất thích hợp để định hướng cho quá trình sinh tổng hợp. Ví dụ khi sản xuất penicillin G, tiền chất thêm vào là acid phenylacetic. Tuy nhiên không phải tiền chất nào cũng định hướng được quá trình nên men. Trong môi trường nuôi cấy có tạo ra các acid amin → peptid → polypeptide. Penicillin tạo thành từ một tripeptid, sau đó acyl hoá bởi men. Bán tổng hợp: Các penicillin bán tổng hợp bằng cách chế tạo acid 6-amino penicillanic (A6AP). Nuôi cấy nấm penicillium không thêm tiền chất, Khi đó môi trường dồi dào A6AP, chiết lấy trực tiếp. Tách phần phenylacetyl ( C6H5-CH2-CO-) khỏi phân tử penicillin G bằng acylase thích hợp rồi chiết lấy A6AP. Acyl hoá A6AP với clorid acid trong môi trường acetone, có mặt triethylamin để hấp thụ HCl giải phóng ra trong phản ứng được penicillin khác. Tổng hợp hoá học: Chưa được ứng dụng rộng rãi. 1.2.6. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay Như đã trình bày ở trên ta thấy có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng các cơ chế khác nhau đối với các vi trùng khác nhau. Kháng sinh chỉ có tác dụng với các bệnh do vi trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi (virus). Để điều trị bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng sinh thích hợp. Việc lạm dụng thuốc kháng sinh hiện nay xảy ra phổ biến do cả bệnh nhân và thầy thuốc cùng tham gia thực hiện để gây nên hiện tượng kháng thuốc sớm. Điều này đã mang lại những hậu quả xấu, làm cho việc đáp ứng điều trị kém hiệu quả, người bệnh không được chữa khỏi hoặc để bệnh kéo dài, ảnh hưởng đến sức khỏe kể cả tính mạng của bệnh nhân. Bệnh nhân, người nhà bệnh nhân và nhiều người khác trong cộng đồng người dân thường quan niệm rằng thuốc kháng sinh có thể chữa được mọi thứ bệnh tật. Mỗi khi bị cảm cúm, đau đầu, sổ mũi ,sốt, ho, viêm họng thông thường…đều đã dùng kháng sinh ngay để chữa trị. Mặc dù kháng sinh đã được Bộ Y tế quy định là loại thuốc cần phải có đơn kê của thầy thuốc, không ở trong các nhóm thuốc được bán không cần kê đơn (OTC) nhưng trên thực tế hiện nay việc mua bán kháng sinh rất dễ dàng.[14] Năm 2000, các bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275 triệu người dân, một nửa đến 2/3 số toa đó được coi là không cần thiết. Theo R. Gonzales [4,31], 3/4 số kháng sinh dùng ở ngoại chẩn là cho viêm đường hô hấp trên trong khi 60% các trường hợp viêm đường hô hấp trên là do siêu vi, không cần và không điều trị được bằng kháng sinh. Dùng cephalosporins bừa bãi khiến enterococus trở nên đề kháng và cũng đã xuất hiện các vi trùng enterococus kháng vancomycin. Theo báo cáo của A.W. McCormick [16] năm 2003, tỉ lệ pneumococus kháng penicillin tăng nhanh ở Hoa kỳ, tác giả dự tính đến năm 2004, 41% pneumococcus sẽ đề kháng penicillin. Tỉ lệ vi trùng lao kháng thuốc tăng cao khiến phải dùng 4 thứ thuốc kết hợp để điều trị bệnh lao. Các vi trùng kháng thuốc không khu trú ở một địa phương nào vì với phương tiện giao thông mau lẹ, vi trùng có thể di chuyển đến khắp nơi trên thế giới trong vòng 24 giờ. D.P. Raymond [21] mỗi năm ở Hoa kỳ có 2 triệu người bị nhiễm trùng vì lây lan trong bệnh viện, hơn một nửa số này là do vi trùng kháng thuốc, gây tử vong cho 70 ngàn người và làm tốn của ngân sách từ 5 đến 10 tỉ đô-la. Tại Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Kim Phượng và J. Chalker [7], năm 1997 tại 23 trạm y tế ở Hải phòng, 69% bệnh nhân được cho kháng sinh, 71% bệnh nhân không dùng kháng sinh đúng liều lượng và đúng thời gian (dưới 5 ngày). Theo [7] Qua thống kê tại khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch Mai cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có không ít trẻ em. Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất, dễ gây tử vong. Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu, thiếu máu huyết tán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan... Phó giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương Nguyễn Văn Lộc thừa nhận, tiền mua kháng sinh đang chiếm tới 60% tổng kinh phí mua thuốc của bệnh viện. Nhiều loại kháng sinh gần như đã bị kháng hoàn toàn. Đối với vi khuẩn E.coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng huyết), tỉ lệ kháng thuốc ở Ampiciline là 88%, Amoxiciline là 38,9%. Đối với vi khuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm trùng huyết và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc của Ampiciline gần 97% và Amoxiciline là 42% Các nhà chuyên môn đã báo động về hậu quả nguy hiểm của sự lạm dụng kháng sinh từ nhiều chục năm nay. Năm 1981, sau hội nghị ở Santa Domingo, các nhà chuyên môn đã thành lập “Liên Hiệp vì sự Sử Dụng Kháng Sinh Hợp Lý” (Alliance for the Prudent use of Antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia nhằm chống lại sự lan tràn của các bệnh do vi trùng kháng thuốc tại các nước đang phát triển. Năm 2001, Tổ Chức Y Tế Thế Giới đã đề ra “Kế Hoạch Toàn Cầu để Kiểm Soát Sự Đề Kháng Kháng Sinh”. Kế hoạch đề cập đến mọi hoạt động y tế của tất cả các quốc gia đã phát triển cũng như đang phát triển: Phòng thí nghiệm phải tăng cường khả năng chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác, đo lường độ nhạy của kháng sinh, đo nồng độ kháng sinh trong máu. Ngành dược cần cung cấp đầy đủ thuốc thiết yếu, ngăn ngừa sự lưu hành của các thuốc giả, 5% lượng thuốc lưu hành tại các nước đang phát triển là thuốc giả mạo, không đúng phẩm chất, hàm lượng hoặc không có hoạt chất. Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta sẽ bảo vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiệu của kháng sinh, hạn chế được chi phí về y tế và cứu đươc nhiều sinh mạng. 1.3. Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam 1.3.1. Phương pháp quang học Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định βlactam, đặc biệt trong dược phẩm. Các β-lactam hấp thụ UV nhưng không nhiều cực đại hấp thụ, chúng cũng tạo phức với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo. Trong nhiều trường hợp, các β-lactam được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để phân tích. Các phương pháp phát quang có thể dùng xác định các β-lactam với độ nhạy khá cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang hóa của các β-lactam. A. Fernández-González và cộng sự [15] dùng Cu2+ thủy phân và tạo phức với AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm có giới hạn phát hiện thu được 4.10-7M (0.16 mg/l). Phương pháp này kết hợp phương pháp dòng chảy cho hiệu quả và tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc uống, huyết thanh… Theo [23], F. Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử. Phương pháp cải tiến sự thủy phân của kháng sinh với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl2, KCl 2M. Kết quả tạo ra phức màu vàng được đo tại bước sóng 335 nm. Khoảng tuyến tính từ 8- 40 mg/l và giới hạn phát hiện của AMO là 0.73 mg/l, AMP 0.76 mg/l Wei Liu và cộng sự [33], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ luminol-K3Fe(CN)6 kết hợp phương pháp chiết pha rắn mắc trực tiếp đã phân tích một số β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP ) trong sữa đạt độ nhạy cao: PEN là 0.5 mg/l, cefradine 0.04 mg/l, cefadroxil là 0.08 mg/l, 0.1 mg/l CEP. Kết quả được kiểm chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV-VIS, nồng độ CEP trong mẫu là 0.1 mg/l. Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp, các phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh và trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích, việc xác định sẽ kém chính xác. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cần thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này. 1.3.2. Phương pháp điện hóa Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β-lactam nhưng không phổ biến nhiều. Theo [19], Daniela P. Santos và cộng sự sử dụng sensor điện thế phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0.92 μM (0.39 mg/l) trong môi trường đệm axetat 0.1M pH=5.2 1.3.3. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE) Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã được ứng dụng để tách và xác định các kháng sinh β-lactam trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau. L. Nozal, L. Arce1,A.R´ıos, M. Valcárcel [27] sử dụng phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với thành phần dung dịch đệm điện di gồm 40 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH 8.5. Tiến hành phân tích tại thế điện di 10 kV, nhiệt độ 200C, thời gian bơm mẫu 10s. Phương pháp cho phép tách 6 kháng sinh gồm: AMO, AMP, PENG, OXA, penicillin V và CLO ứng dụng phân tích trong mẫu nước thải của trang trại chăn nuôi. Giới hạn phát hiện từ 0.14 đến 0.27 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 0.25 đến 0.86%, diện tích pic 1.3 đến 4.15%. Độ thu hồi trên 96%. Biyang Deng và cộng sự [18] đã sử dụng phương pháp điện di với detector điện quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với giới hạn phát hiện thấp 0.31 μg/l, khoảng tuyến tính rộng 1 μg/l – 8 mg/l cùng độ thu hồi cao 95.77%, độ lệch chuẩn tương đối không lớn hơn 2.2% và thời gian phân tích ngắn 6 phút/ mẫu. Attila Gaspar và cộng sự [17] đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh họ cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis – CZE). Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH = 6.8. Phương pháp này tách được 14 kháng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện 14 kháng sinh cefalosporin C, cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon, cefamandol, cefaclor, CEP, CEF, ceftibuten, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim, ceftriaxon với giới hạn phát hiện 0.42 – 1.62 mg/l. Trong đó CEP và CEF có giới hạn phát hiện tương ứng 1.62 và 0.89 mg/l; khoảng tuyến tính 5 – 200 mg/l. Mục đích của phương pháp được ứng dụng để nghiên cứu độ bền của kháng sinh họ Cephalosporins trong nước tại nhiệt độ khác nhau (+25, +4 và -180C). Kết quả cho thấy các kháng sinh giảm nồng độ không lớn hơn 20% tại nhiệt độ phòng sau khi pha loãng. M.I.Bailon-Perez và cộng sự [29] sử dụng phương pháp CZE và detector UV – DAD, pha động dùng hệ đệm tris 175 mM pH 8 và 20% (v/v) ethanol, dùng kĩ thuật chiết pha rắn làm sạch và làm giàu mẫu ứng dụng phân tích đồng thời AMP, AMO, dicloxacillin, CLO, OXA, PEN, nafcillin trong nền mẫu nước ( nước sông,