Tài liệu Phân tích acid oleanolic và thành phần saponin trong rễ cây sâm vũ diệp (panax bipinnatifidus seem.) thu hái ở tây bắc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ HUỆ PHÂN TÍCH ACID OLEANOLIC VÀ THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG RỄ CÂY SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) THU HÁI Ở TÂY BẮC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ HUỆ PHÂN TÍCH ACID OLEANOLIC VÀ THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG RỄ CÂY SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) THU HÁI Ở TÂY BẮC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa : QH.2012.Y Người hướng dẫn : TS. NGUYỄN HỮU TÙNG Hà Nội – 2017 LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành luận văn là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới GVHD, TS Nguyễn Hữu Tùng, người đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm Khoa, các thầy cô trong Khoa Y Dược đặc biệt là Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc đã luôn tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin cảm ơn tập thể lớp Dược học khóa QH.2012.Y đặc biệt là các bạn Bích, Ngần, Hào đã luôn đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian qua. Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình đã nuôi dạy, khích lệ và sát cánh, giúp tôi có thêm động lực cố gắng để có kết quả như ngày hôm nay. Hà Nội, ngày 8 tháng 6 năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Huệ DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril DAD Detector mảng điốt (Diode array detector) Dd Dung dịch EtOH Ethanol FLD Detector huỳnh quang (Fluorescence Detector) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performace liquid chromatography) MeOH Methanol MOA KTP Hàm lượng acid oleanolic không thủy phân MOA STP Hàm lượng acid oleanolic sau thủy phân Msaponin tổng số Hàm lượng saponin tổng số OA Acid oleanolic RSD Độ lệch chuẩn tương đối SVD Sâm vũ diệp TB Trung bình THF Dimethylformamid TT Thứ tự UV Ultra violete VIS Visible DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng Nội dung Trang 3.1 Tính thích hợp hệ thống 23 3.2 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của acid oleanolic 25 3.3 Kết quả độ lặp lại của phương pháp 26 3.4 Kết quả độ đúng của phương pháp 27 3.5 Kết quả hàm lượng acid oleanolic trong dược liệu và cao sâm vũ diệp 28 3.6 Kết quả hàm lượng saponin tổng số trong dược liệu và cao sâm vũ diệp 29 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Nội dung Trang 1.1 Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) 2 1.2 Cấu trúc hóa học các hợp chất tách được từ rễ cây sâm vũ diệp 4 1.3 Công thức tổng quát các saponin với phần sapogenin là acid oleanolic của sâm vũ diệp 6 1.4 Cấu trúc hóa học của acid oleanolic 6 1.5 Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng 11 2.1 Mẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa Pa, Lào Cai 2.2 Cơ sở phương pháp thủy phân các saponin khung oleanan từ sâm vũ diệp 16 19 3.1 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic 22 3.2 Sắc ký đồ mẫu trắng (đánh giá độ đặc hiệu) 24 3.3 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic (đánh giá độ đặc hiệu) 24 3.4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ acid oleanolic 25 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN ........................................................................................ 2 1.1. TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP ..................................................................... 2 1.1.1. Đặc điểm thực vật............................................................................................ 2 1.1.2. Phân bố và sinh thái......................................................................................... 3 1.1.3. Thành phần hóa học ........................................................................................ 3 1.1.4. Tính vị, công năng ........................................................................................... 4 1.1.5. Công dụng ....................................................................................................... 4 1.1.6. Tác dụng dược lý ............................................................................................. 5 1.2. TỔNG QUAN VỀ SAPONIN ............................................................................. 5 1.3. TỔNG QUAN VỀ ACID OLEANOLIC ........................................................... 6 1.3.1. Công thức hóa học ........................................................................................... 7 1.3.2. Tính chất lý hóa ............................................................................................... 7 1.3.3. Tác dụng sinh học của acid oleanolic.............................................................. 7 1.3.4. Một số nghiên cứu định lượng acid oleanolic bằng HPLC ............................. 7 1.4. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)................. 10 1.4.1. Nguyên tắc của HPLC ................................................................................... 10 1.4.2. Một số thông số đặc trưng ............................................................................. 11 1.4.3. Thẩm định phương pháp phân tích HPLC .................................................... 13 CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 16 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU........................................................................... 16 2.1.1. Nguyên liệu ................................................................................................... 16 2.1.2. Dung môi, hóa chất ....................................................................................... 16 2.1.3. Máy móc, dụng cụ ......................................................................................... 16 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................... 17 2.2.1. Phương pháp chiết xuất sâm vũ diệp ............................................................. 17 2.2.2. Phương pháp phân tích HPLC ....................................................................... 17 2.2.3. Phương pháp định lượng saponin tổng số ..................................................... 19 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................. 20 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 21 3.1. KẾT QUẢ ........................................................................................................... 21 3.1.1. Quy trình chiết xuất sâm vũ diệp .................................................................. 21 3.1.2. Xây dựng quy trình định lượng ..................................................................... 21 3.1.3. Định lượng acid oleanolic trong dược liệu và cao sâm vũ diệp .................... 27 3.1.4. Định lượng saponin tổng số trong cao sâm vũ diệp ...................................... 28 3.2. THẢO LUẬN ..................................................................................................... 30 3.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích acid oleanolic bằng HPLC ...................... 30 3.2.2. Định lượng acid oleanolic và saponin trong dược liệu và cao sâm vũ diệp.. 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm - Araliaceae), còn gọi là Trúc tiết nhân sâm, Tam thất lá xẻ, Sâm hai lần xẻ, Hoàng liên thất là một vị thuốc quý phân bố ở Trung Quốc và dãy núi Hoàng Liên Sơn Tây Bắc nước ta [1,11]. Gần đây sâm vũ diệp đã được thuần hóa và bước đầu được trồng thử nghiệm ở một số địa phương ở Hà Giang, Lào Cai. Về mặt y học, dân gian hay sử dụng sâm vũ diệp làm thuốc bổ và trong một số bài thuốc truyền thống của các dân tộc vùng núi Tây Bắc [1,11]. Thành phần chính trong rễ cây sâm vũ diệp là saponin thuộc khung oleanan với hơn 10 chất khác nhau đã được công bố [1,28]. Các saponin này có phần sapogenin là acid oleanolic. Acid oleanolic là thành phần có hoạt tính, quyết định tác dụng sinh học của nhiều loài dược liệu như chống viêm [22,26], ức chế tế bào ung thư [34] và chống đông máu [37], chống oxi hóa [25,35]. Tra cứu tài liệu thấy rằng ở trong nước có rất ít nghiên cứu về thành phần hóa học, tác dụng sinh học và dược lý của sâm vũ diệp để phát triển sử dụng dược liệu quý thuộc chi sâm Panax này. Đề tài cấp nhà nước thuộc chương trình Tây Bắc “Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai loài cây thuốc sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M. Feng) vùng Tây Bắc” đặt ra mục tiêu chính là xác lập được cơ sở khoa học của giải pháp công nghệ sinh học phân tử, hóa học và dược học để phát triển sản phẩm từ hai loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Phân tích acid oleanolic và thành phần saponin trong rễ cây sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái ở Tây Bắc”. Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lượng dược liệu sâm vũ diệp phục vụ việc quản lý chất lượng dược liệu trên thị trường, tối ưu hóa quy trình chiết cũng như nghiên cứu về tác dụng dược lý sau này. Các mục tiêu của đề tài gồm có: 1. Xây dựng phương pháp định lượng acid oleanolic bằng HPLC và thẩm định phương pháp phân tích. 2. Xác định hàm lượng acid oleanolic và hàm lượng saponin tổng số trong cao sâm vũ diệp và rễ cây sâm vũ diệp thu hái ở Tây Bắc. 1 CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 1.1.1. Đặc điểm thực vật Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem., họ nhân sâm - Araliaceae), còn gọi là Trúc tiết nhân sâm, Tam thất lá xẻ, Sâm hai lần xẻ, Hoàng liên thất có thân thảo ưa bóng và đặc biệt ưa ẩm, sống nhiều năm [1,11], cao 0,25 – 0,7 cm, đường kính thân 0,3 – 0,6 cm [1]. Rễ củ dài có nhiều đốt và những vết sẹo do thân rụng hàng năm để lại. Thân mảnh, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, thường lụi vào mùa khô [11]. Lá kép chân vịt, gồm 2-3 cái mọc vòng. Lá chét 5-7 (ít khi 3) thuôn, dài 2,5 – 14 cm, rộng 1,5- 4 cm, gốc tròn, đầu thuôn thành mũi nhọn, xẻ thùy không đều, mép có răng cưa, có lông [1,11]. Hình 1.1. Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn; cuống cụm hoa 5 – 10 cm; cụm hoa có từ 20 – 90 hoa; cuống hoa mảnh dài 1 – 1,5 cm. Hoa màu trắng đục, mọc thành tán đơn ở ngọn thân, 5 cánh hoa, bầu 2-3 ô [1]. Quả hình cầu đến hình cầu dẹt; đường kính 0,6 – 1,2 cm; khi chín màu đỏ, có chấm đen ở đầu, chứa 1 – 2 hạt. Hạt hình cầu hoặc gần cầu, màu xám trắng; vỏ cứng, có rốn hạt [1,11]. 2 1.1.2. Phân bố và sinh thái Sâm vũ diệp là loài sâm mọc tự nhiên và được phát hiện tương đối sớm ở nước ta. Trong tự nhiên, sâm vũ diệp phân bố ở Trung Quốc, Ấn Độ và Nepan (vùng cận Hymalaya) và dãy núi Hoàng Liên Sơn, Tây Bắc nước ta [1,11]. Sa Pa ở Việt Nam cũng là điểm phân bố cuối cùng của sâm vũ diệp ở phía nam. Năm 1973, cây đã được phát hiện ở núi Hàm Rồng, sát thị trấn Sa Pa, ở độ cao 1600 m. Hiện nay vùng phân bố của sâm vũ diệp đã bị thu hẹp dần, từ độ cao khoảng 1800 m trở lên, cây được coi là cực hiếm [1]. Gần đây sâm vũ diệp đã được thuần hóa và bước đầu được trồng thử nghiệm ở một số địa phương ở Hà Giang và Lào Cai [11]. Sâm vũ diệp là cây thân thảo ưa bóng và đặc biệt ưa ẩm, thường mọc rải rác hay tập trung dưới tán rừng ẩm, gần như quanh năm có sương mù. Hàng năm vào cuối tháng 2 đầu tháng 3, từ phần đầu mầm thân rễ phân nhánh ngang nằm sát mặt đất sẽ mọc lên một hoặc vài chồi thân (tùy thuộc vào số đầu mầm thân rễ phân nhánh). Chồi này sinh trưởng nhanh trong vòng một tháng đã ra lá và gần đạt được chiều cao cực đại. Đến tháng 4, mỗi thân mang lá có thể cho ra một cụm hoa. Quả xanh quan sát được vào cuối tháng 4 – 6, đến tháng 7 quả đã chín và rụng xuống xung quanh gốc cây mẹ. Do quả chín đúng vào thời kì có lượng mưa lớn tháng 7 – 8 nên hạt giống thường bị cuốn trôi, ảnh hưởng đến khả năng tái sinh tự nhiên của sâm vũ diệp. Sau khi quả chín, từ tháng 9 – 10, toàn bộ phần thân mặt đất tàn lụi qua mùa đông, để lộ những vết sẹo thân rễ khá rõ. Đó là dấu hiệu giúp ta xác định tuổi của cây [1]. 1.1.3. Thành phần hóa học Sâm vũ diệp là một trong 4 loài thuộc chi Panax được ghi nhận tại Việt Nam. So với hai đối tượng sâm Việt Nam (P. vietnamensis) và tâm thất (P. notoginseng) đã được nghiên cứu nhiều một cách có hệ thống từ thực vật học, thành phần hóa học, tác dụng sinh học, …thì chưa có nhiều kết quả nghiên cứu trên cây sâm vũ diệp. Thành phần hóa học của lá và rễ cây sâm vũ diệp được phát hiện có nhiều saponin. Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc công bố phân lập 13 saponin khung dammaran từ lá của cây này ở Trung Quốc trong đó bao gồm một số ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3 [16]. Rễ sâm vũ diệp chứa saponin thuộc nhóm oleanan gồm những chất như chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid Ro, Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2 [1]. 3 Gần đây, năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc phân lập một nhóm 10 saponin khung oleanan (1-10, hình 1.2), trong đó có 3 chất mới bifinosid A-C (1-3), là thành phần chính của rễ cây sâm vũ diệp được thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn, Việt Nam [28]. Hình 1.2. Cấu trúc hóa học các hợp chất tách được từ rễ cây sâm vũ diệp 1.1.4. Tính vị, công năng Sâm vũ diệp có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dưỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết, tán ứ [1]. 1.1.5. Công dụng Theo đông y, sâm vũ diệp có tác dụng bổ, chữa thiếu máu, xanh xao, gầy yếu, nhất là đối với phụ nữ sau khi đẻ. Sâm vũ diệp còn được dùng cầm máu, tán ứ, tiêu sưng. Dùng ngoài, rễ phơi khô, tán bột mịn, rắc chữa chảy máu và làm vết thương mau lành. Rễ cây sâm vũ diệp còn được ngâm rượu rồi chiết dưới dạng tinh sâm dùng rất tốt, có tác dụng kích thích sinh dục. Ngoài ra nhân dân ở vùng trồng còn tận dụng cả thân và lá nấu cao. Cao này pha với nước hoặc rượu để uống cũng có tác dụng như rễ. 4 Ở Trung Quốc, sâm vũ diệp là thuốc chữa hư lao, thổ huyết, chảy máu cam, đòn ngã tổn thương [1]. 1.1.6. Tác dụng dược lý Về kết quả nghiên cứu hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý, mặc dù rễ của sâm vũ diệp được dùng trong một số bài thuốc truyền thống cả ở nước ta và Trung Quốc nhưng chưa có nhiều tài liệu, công trình khoa học được công bố. Liên quan đến tác dụng sinh học, một số hợp chất được xác định là thành phần của sâm vũ diệp có tác dụng sinh học bao gồm kháng viêm, chống oxi hóa, chống ung thư, bảo vệ tim mạch, chống tiểu đường, bảo vệ tế bào thần kinh, … có thể phần nào giải thích cho lợi ích về mặt dược học trong việc sử dụng sâm vũ diệp trong y học truyền thống. 1.2. TỔNG QUAN VỀ SAPONIN Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycosid gặp nhiều trong thực vật. Theo truyền thống, saponin thường được định nghĩa dựa trên một số tính chất chung đặc trưng của nhóm hợp chất này bao gồm: - Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước. Làm vỡ hồng cầu ngay cả khi ở nồng độ loãng. Độc với cá, diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên… Kích thích niêm mạc mắt gây hắt hơi, đỏ mắt. Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3β-hydroxysteroid. Cấu trúc của saponin cũng như các glycosid khác, gồm có 2 phần là phần đường và phần aglycon (còn được gọi là sapogenin). Saponin có cấu trúc triterpen với khung cơ bản 30C hoặc steroid với khung cơ bản 27C dẫn xuất từ khung cholestan. Trên các khung cơ bản của sapogenin các sapogenin khác nhau bởi mức độ oxi hóa trên khung hay vị trí, số lượng của các nhóm thế. Nhóm thế trong sapogenin thường là hydroxyl, đôi khi gặp nhóm oxo hay sulfat. Nhóm OH có thể tự do hay glycosid hóa với đường. Một vài trường hợp nhóm có thể được acyl hóa với các acid hữu cơ. Số lượng và vị trí nhóm thế trên khung cũng không nhiều. Ở vị trí C3 của sapogenin gần như luôn có nhóm OH. Nhóm OH này trong đa số trường hợp có định hướng β. Đây cũng là vị trí gắn với đường của đa số saponin. Với số lượng không nhiều các sapogenin, sự đa dạng của saponin chủ yếu do thành phần, số lượng và vị trí của các đường trong phân tử. Ngoài ra, còn có thể gặp các dây nối trên khung. 5 Đa số saponin có từ 1 – 2 mạch đường (được gọi là monodesmosid và bidesmosid – desmos = mạch). Ở các monodesmosid, phần đường gắn vào sapogenin hầu hết là ở vị trí C – 3 bằng dây nối glycosid. Saponin có thể có thêm mạch đường thứ hai. Tổng số đơn vị đường trong một saponin có thể tới 11 đơn vị, nhưng số đường trên một mạch được biết tới nay tối đa là 8. Số đơn vị đường trong saponin thường là 1 – 4 đường. Đường trong saponin là các đường thông thường như β-D-glucose, β-D-xylose, α-L-rhamnose và α-L-arabinose… [14]. Nhiều công trình nghiên cứu trước đây đã cho thấy thành phần chính của rễ cây sâm vũ diệp là saponin thuộc nhóm triterpenoid khung oleanan với phần sapogenin đã được xác định là acid oleanolic [1,28]. Hình 1.3. Công thức tổng quát các saponin với phần sapogenin là OA của sâm vũ diệp 1.3. TỔNG QUAN VỀ ACID OLEANOLIC 1.3.1. Công thức hóa học Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của acid oleanolic - Công thức phân tử: C30H48O3 [21]. - Tên khoa học: (3β) – Hydroxyolean – 12 – en – 28 – oic [21]. - Phân tử lượng: 456,711 g/mol [21]. 6 1.3.2. Tính chất lý hóa Bột kết tinh màu trắng, không tan trong nước, tan trong 65 phần ether, 108 phần alcol 95%, 35 phần alcol 95% sôi, 118 phần cloroform, 118 phần aceton, 235 phần methanol. Nhiệt độ nóng chảy 310ºC, góc quay cực bằng + 83,3º; pKa = 2,52 [21]. 1.3.3. Tác dụng sinh học của acid oleanolic Acid oleanolic - aglycon của nhiều saponin trong dược liệu, được biết đến như là thành phần có hoạt tính, quyết định các tác dụng sinh học của các loài dược liệu như dược liệu chi panax như sâm Hàn Quốc (Panax ginseng), tam thất (Panax notogingseng), Calendula officinalis (Arteraceae), Panax japonicus (Araliaceae), Oleandra neriifolia L, Sapindus mukorossi (Sapindaceae), Cochinchina momordica, Glycyrrhiza uralensis và Achyranthes bidentata … Trong một số nghiên cứu trên thế giới, acid oleanolic có tác dụng kháng khuẩn, chống nấm, chống viêm, chống oxi hóa [27,30,37], chống ung thư [34], chống viêm [22,26], bảo vệ gan [19], lợi tiểu thải trừ Natri, có lợi trong ngừa cao huyết áp nặng, hạ đường huyết, chống oxi hóa [25,35], điều hòa miễn dịch [29,31]. 1.3.4. Một số nghiên cứu định lượng acid oleanolic bằng HPLC Trên thế giới đã có một số nghiên cứu định lượng acid oleanolic trong dược liệu bao gồm cả phương pháp truyển thống cũng như phương pháp hiện đại. HPLC là một trong những phương pháp hiện đại được sử dụng phổ biến hiện nay. Sau đây là một vài nghiên cứu định lượng OA trong một vài loài dược liệu a) Định lượng OA trong bột quả cây Macrocarpium officinalis [32] - Cột: Kromosil C18 (250 × 4,6 mm; 5 μm) - Detector: UV (210 nm) - Pha động: Methanol: Dd H3PO4 - H2O (88:0,05:11,95) - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút - Thể tích tiêm mẫu: 20µl - Đường chuẩn: 0,51–2,55 μg/ml, R2 = 0,9998 - Độ đúng: 97,9% 7 - Độ lặp lại: RSD = 4,83% (n=5) b) Định lượng OA trong lá cây mã đề (Plantago major) [36] - Cột: LiChrosorb RP18 (250 mm x 4,6 mm,5 μm), Nhiệt độ phòng (22°C) - Pha động: MeOH–H2O–THF (94:5:1), chỉnh pH 5 bằng acid acetic. - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút - Detector: DAD (220 nm) - Thể tích tiêm mẫu: 20 µl. - Đường chuẩn: 2,5-100 µg/ml, R2= 0,9997 - Độ đúng: 98,9 -101,6% c) Định lượng OA trong phần trên mặt đất của cây Mitracarpus scaber [18] - Cột: SPHERISORB®ODS (250× 4,6 mm,5 μm), nhiệt độ cột 25ºC - Pha động: MeOH–H2O–THF (94:5:1), chỉnh pH 5 bằng acid acetic - Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút - Detector: UV (215 nm). - Thể tích tiêm mẫu: 20 µl. - Đường chuẩn: 0,5-10 µg/ml, R2 = 0,98 – 0,99. - Độ đúng: 97,4%, RSD = 1,49% (n=5) d) Định lượng OA trong cây Rabdosia rubescens [33] - Cột: C18 column (250 mm x 4 mm, 5µm), nhiệt độ cột 40oC - Pha động: ACN: acid phosphoric 0,1%/nước = 88:12 - Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút - Detector: UV (205 nm) - Thể tích tiêm mẫu: 10 µl - Đường chuẩn: 3-2000 µg/ml, R2 = 0,999 - Độ đúng: 93,47%, n=6, RSD = 2,90% 8 e) Định lượng OA từ cao khô đinh lăng [7] - Cột: Germmini Luna C18 (250 x 4,6 mm; 5µm) - Pha động: MeOH : MeCN : isopropanol : dung dịch acid acetic 2 mM (5:3:1:1) - Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút - Detector: UV 210 nm - Thể tích tiêm mẫu: 10 µl - Detector: UV 210 nm - Thể tích tiêm mẫu: 10 µl - Đường chuẩn: 5-35 µg/ml, R2 = 0,9991 - Độ đúng: 101,6%, RSD = 4,06%, n=5 f) Định lượng OA từ lá đinh lăng [6] - Cột: Cột ACE3 – C18 (4,6 mm x150 mm; 3,5 µm), Nhiệt độ cột 20ºC - Đệm trietylamin (TEA/HCl, pH 3): MeOH chứa 0,1% acid formic (10:90) - Tốc độ dòng 0,5 ml/phút - Thể tích tiêm mẫu: 20 µl - Đường chuẩn: 1-50 µg/ml, R2 = 0,9991 - Độ lặp lại: RSD = 0,5%, n = 3 g) Định lượng OA từ lá của Eriobotrya japonica Lindl [20] - Cột: Alltech Apollo C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm), Nhiệt độ cột 20ºC - Pha động: MeOH : nước (95:5) - Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút - Detector: UV (215 nm) - Thể tích tiêm mẫu: 20 µl - Đường chuẩn: 25 – 30 µg/mL, R2 = 0,996 - Độ lặp lại: RSD =3,21%, n=5 9 h) Định lượng OA trong đinh lăng lá xẻ (Polyscias fruticosa (L.)Harms) [12] - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu - Cột sắc ký: Prontosil LC8 (150 x 4,6 mm, 3 μm). - Pha động: CH3CN – H2O (72:28) - Detector SPD phát hiện ở bước sóng 203 nm - Tốc độ dòng: 0,768 ml/ phút - Thể tích bơm mẫu: 20 μl - Đường chuẩn: 24-300 μg/ml; R2 = 0,9998 - Độ đúng: 99,17%; RSD=1,51% - Độ lặp lại: RSD = 2,66%, n=6 Trên đây là một trong những thông tin quan trọng giúp chúng tôi tham khảo và áp dụng để định lượng acid oleanolic trong sâm vũ diệp. 1.4. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 1.4.1. Nguyên tắc của HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động dưới áp suất cao. Pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân loại theo kích cỡ. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa 2 pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào yếu tố đó. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bằng detector. Nếu ghi quá trình tách sắc ký của hỗn hợp nhiều thành phần, ta sẽ có một sắc đồ gồm nhiều pic. Quá trình sắc ký tốt thì hỗn hợp gồm nhiều thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt được tách ra trên sắc ký đồ [2,3,5,9,10,15]. 10 1.4.2. Một số thông số đặc trưng Hình 1.5. Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng a)Thời gian lưu tR (Thời gian lưu): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó. t0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký tR’(Thời gian lưu thực): tR’= tR – t0 (Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong một điều kiện nhất định). W : là chiều rộng đáy pic. W1/2 : là chiều rộng pic đo ở 1/2 chiều cao pic. b) Hệ số dung lượng k’ Trong thực nghiệm hệ số dung lượng k’ được tính theo công thức: k'= t 'R t R - t 0 t R = = -1 t0 t0 t0 Hệ số dung lượng cho biết khả năng phân bố của chất đó vào hai pha, tức là tỷ lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động tại thời điểm cân bằng. Nếu k’ nhỏ thì tR cũng nhỏ, chất bị rửa giải gần với thời điểm bơm mẫu do đó làm 11 giảm khả năng tách, nếu k’ lớn quá thì sẽ dẫn đến doãng pic, độ nhạy thấp và thời gian lưu kéo dài. Trong thực tế k’ nằm trong khoảng 2-5 là tốt nhất. c) Hệ số chọn lọc α= k 'B t R,B - t 0 = ' k A t R,A - t 0 (k’B  k’A)  khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng. Để tách riêng hai chất thường chọn  nằm trong khoảng 1,05 đến 2. d) Hiệu lực cột Hiệu lực cột được đánh giá thông qua 2 thông số: số đĩa lý thuyết (N) và chiều cao đĩa lý thuyết (H). Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết, ở mỗi tầng sự phân bố chất tan vào hai pha đạt đến một trạng thái cân bằng. Mỗi tầng được giả định như một pha tĩnh có chiều cao H. N = 16 Hay t   W   N = 5 ,5 4  2 R tR W 1 /2   2 Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký thì chiều cao của đĩa lý thuyết H được tính bằng công thức: H= L N e) Hệ số bất đối AF (tailing factor) Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ AF  W 1/20 2a Trong đó: - W1/20 : là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic 12