Tài liệu Phân lập xác định và đánh giá các gene độc tính của vi khuẩn vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên tôm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC GENE ĐỘC TÍNH CỦA VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus GÂY BỆNH TRÊN TỐM Ngành học: CỐNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: NGUYÊỄN HOÀNG PHƯƠNG Niên khóa: 2010 – 2014 Tháng 02 năm 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC GENE ĐỘC TÍNH CỦA VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus GÂY BỆNH TRÊN TỐM Hướng dẫẫn khoa học Sinh viên thực hiện TS. NGUYỄỄN BẢO QUỐỐC NGUYỄỄN HOÀNG PHƯƠNG Tháng 02 năm 2015 1 LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn Cha, mẹ người thân đã luôn ủng hộ và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này. Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM, Ban ch ủ nhiệm B ộ môn Công nghệ Sinh học, cùng tâất cả thâầy cô đã truyềần dạy kiềấn th ức cho tôi trong suôất những năm học vừa qua. TS. Nguyềễn Bảo Quôấc đã tận tình hướng dâễn , giúp đỡ, đ ộng viền và t ạo m ọi điềầu kiện thuận lợi cho tôi suôất thời gian làm đềầ tài và hoàn thành khóa lu ận tôất nghiệp này. Các bạn lớp DH10SH đặc biệt là các thành viền trong phòng thí nghi ệm Bệnh học người đã giúp đỡ, động viền, chia sẻ cùng tôi trong thời gian làm đềầ tài vừa qua Sinh viền thực hiện Nguyềễn Hoàng Phương 2 TÓM TĂỐT Hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính (AHPNS) là căn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở tôm nuôi. Căn bệnh này có thể được phát hiện quanh năm nhất là vào mùa hè từ tháng 4 đến tháng 8 khi điều kiện khí hậu thuận lợi cho vi sinh vật phát triển. Gặp điều kiện phù hợp bệnh có thể bùng phát nhanh và phát triển thành đại dịch và gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi tôm. Các triệu chứng ban đầu của tôm bị bệnh như là: lờ đờ, kém ăn hoặc bỏ ăn. Tôm bệnh thường có xu hướng tách đàn, có thể được nhìn thấy ở mặt ao, gần bờ hay bơi lòng vòng. Tôm bị bệnh chết thường có các biểu hiện: vỏ tôm bị mềm, xuất hiện các vết thương hoại tử, ăn mòn trên vỏ và gan tụy tôm. Nguyên nhân gây bê nh AHPNS được cho là do nhóm vi khuẩn Vibrio ê parahaemolyticus gây ra. Mục đích của nghiên cứu này là phân lập và xác định vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus từ các mẫu tôm bê nh thu thâ êp được từ các ao nuôi tôm ở mô t sô ê ê tỉnh miền Tây Nam Bô ê. Bằng việc sử dụng phương pháp sinh hoá và PCR với các đoạn mồi chuyên biệt cho nhóm V. parahaemolyticus như AP3, 16s-rDNA, và các gen độc tô của nó như là ToxR, tdh, tlh, trh. Kết quả của nghiên cứu này là có một chủng vi khuẩn V. Parahaemolyticus đã được phân lập và xác định, bên cạnh đó các chủng vi sinh vật khác bao gồm Vibrio spp. và staphylococcus cũng đã được phát hiện từ mẫu tôm bệnh. Kết quả nghiên cứu làm cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu sâu hơn về sự biểu hiện của các gen độc nhằm xây dựng và phát triển các vaccin điều trị V.parahaemolyticus trên tôm cũng như cho những nghiên cứu tiếp theo về sự đa dạng của các loài vi khuẩn Vibrio ở Việt Nam 3 SUMMARY The acute pancreatic necrosis liver (AHPNS) has been considered as one of the most dangerous diseases in shrimp. AHPNS can be detected throughout the year, particularly in the summer (April-August) when climatic conditions are favorable for microbial growth. The initial symptoms of AHPNS in shrimp are not clear, but they showed lethargy, listlessness, poor appetite. Then AHPNS based patients manifest with soft shelled shrimp, prawns change color, liver, pancreas limp, shrink or swell. The causal agent of AHPNS disease in shrimp has been known to be the bacteria Vibrio parahaaemolyticus producing a potent toxin rapidly that can destroy tissue and liver dusfunction in the pancreatic digestive system. In this study, the bacteria Vibrio parahaemolyticus was isolated from infected shrimp samples collected from various shrimp raising ponds at some provinces in the South West of Vietnam. The detection of V. parahaemolyticus was conducted by using biochemical methods and PCR with specific primers of AP3, 16S rDNA and tbe toxin genes such as ToxR , tdh, tlh and trh. The results obtained here will be helpful for further studies involving in the expression profiles of toxic genes in vitro and in vivo to build and to develop the vaccine based treatment to V. parahaemoliticus on shrimp as well as for further research on the diversity of Vibrio species in Vietnam. 4 MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ.............................................................................................................................ii TÓM TẮT..................................................................................................................................iii SUMMARY...............................................................................................................................iv MỤC LỤC..................................................................................................................................v DANH SÁCH CÁC BẢNG......................................................................................................vii DANH SÁCH CÁC HÌNH......................................................................................................viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT.......................................................................................ix Chương 1 MỞ ĐẦU..................................................................................................................1 1.1 Đă êt vấn đề.....................................................................................................................1 1.2. Yêu cầu.........................................................................................................................2 1.3. Nô êi dung thực hiê n ê .......................................................................................................2 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIÊêU.........................................................................................3 2.1 Đă êc điểm về giông Vibrio............................................................................................3 2.2 Lịch sử phát hiê ên và sự phân bô của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus.....................3 2.3 Đă êc điểm dịch tễ học....................................................................................................4 2.3.1 Đặc điểm phân bô......................................................................................................4 2.3.2 Thời gian xuất hiện bệnh............................................................................................5 2.3.3 Tác hại của bệnh........................................................................................................5 2.3.4 Đă êc điểm sinh hóa của Vibrio....................................................................................6 2.4 Dấu hiê êu bê ênh lí ...........................................................................................................6 2.4.1 Dấu hiệu lâm sàng......................................................................................................6 2.4.2 Dấu hiệu bệnh tích.....................................................................................................7 2.5 Gene đô êc tô của V.parahaemolyticus...........................................................................7 2.6 Các phương pháp phát hiê ên Vibrio spp........................................................................8 2.6.1 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vâ êt.........................................................................8 2.6.1.1 Nguyên tắc..........................................................................................................8 2.6.1.2 Cách thực hiện....................................................................................................8 2.6.2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction).................................................8 Chương 3 VÂêT LIÊêU VÀ PHƯƠNG PHÁP...........................................................................11 3.1 Thời gian và địa điểm.................................................................................................11 3.2 Dụng cụ và vâ êt liê êu .....................................................................................................11 3.2.1 Đôi tượng nghiên cứu.........................................................................................11 3.2.2 Thiết bị và dụng cụ..............................................................................................11 3.2.3 Môi trường và hóa chất.......................................................................................12 5 3.2.3.1 Môi trường và hóa chất dùng cho phương pháp nuôi cấy................................12 3.2.3.2 Môi trường và hóa chất dùng cho phản ứng PCR.............................................13 3.3 Phương pháp nghiên cứu............................................................................................13 3.3.1 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu.............................................................13 3.3.2 Phân lập...............................................................................................................13 3.3.3 Định danh vi khuẩn.............................................................................................14 3.3.3.1 Định danh bằng các phản ứng sinh hóa............................................................14 3.3.3.2 Định danh bằng phương pháp PCR..................................................................14 3.3.4 Lưu mẫu..............................................................................................................19 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUÂêN................................................................................20 4.1 Kết quả phân lâ p.............................................................................................................20 ê 4.2 Kết quả phân tích các chỉ tiêu sinh hoá...........................................................................21 4.3 Đánh giá các phương pháp ly trích DNA tổng sô của vi khuẩn......................................23 4.4 Xác định vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bằng phương pháp PCR...........................24 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................27 5.1 Kết luận...........................................................................................................................27 5.2 Kiến nghị.........................................................................................................................27 TÀI LIÊêU THAM KHẢO.........................................................................................................28 PHỤ LỤC..................................................................................................................................32 6 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Đă êc điểm sinh hóa của vi khuẩn Vibrio harveyi....................................................6 Bảng 3.1 Danh sách các cặp mồi chuyên biệt dùng cho vi khuẩn V. parahaemolyticus ..............................................................................................................................................15 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR..................................................................................18 Bảng 3.3 Quy trình phản ứng PCR.....................................................................................18 Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra sinh hóa một sô chủng vi khuẩn Vibrio đã phân lập được......22 Bảng 4.2 Kết quả thử sinh hóa một sô chủng vi khuẩn Vibrio đôi chứng..........................22 DANH SÁCH CÁC HÌNH 7 Hình 3.1 Máy PCR..............................................................................................................12 Hình 4.1 Hình ảnh các dòng khuẩn lạc màu xanh trên môi trường TCBS........................21 Hình 4.2 Kết quả ly trích DNA tổng sô từ các dòng vi khuẩn phân lập đươc...................24 Hình 4.3 Kết quả chạy PCR với cặp mồi AP3. P22: vi khuẩn Vibrio spp.; SC: Staphylococcus; M: Marker.................................................................................................25 Hình 4.4 Xác định sự hiện diện các gen độc tô của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. VP: Vibrio parahaemolyticus; SC: Staphylococcus sp.;(-): PCR đôi chứng âm; M: Marker..................................................................................................................................26 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIÊỐT TĂỐT AHPNS: Acute hepatopancreatic necrosis disease EMS: Early Moratlity Syndrome 8 PCR: Polymerase Chain Reaction KIA: Kligler Iron Agar NB: Nutrient Broth tdh: Themostable direct hemolysin trh: Themostable related hemolysin tlh: Themostable hemolysin TCBS: Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose TSA Tryptica Soy Agar 9 Chương 1 MƠ ĐÂÂU 1.1 Đăăt vẫân đêê Ngành nuôi tôm thương phẩm trên thế giới đã có từ rất lâu nhưng chỉ thực sự phát triển vào những năm 1980, khi lần đầu tiên tôm giông được sản xuất ra với sô lượng lớn cung cấp cho người nuôi. Ngày nay, ở nhiều nơi trên thế giới, ngành nuôi tôm thương phẩm đang gă êp rất nhiều khó khăn bởi các nạn dịch bệnh nguy hiểm, có tôc đô ê lan truyền rất nhanh như: bệnh đôm trắng, bệnh đầu vàng, bệnh còi, bệnh xuất huyết,… do bị các tác nhân như là virus, vi khuẩn, nấm,…gây ra đã và đang gây nhiều thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi tôm. Trong đó, đôi tượng gây bệnh đáng quan tâm hiện nay đó là vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đã được chỉ ra là nguyên nhân gây ra bệnh chết sớm (EMS) và bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPNS). Căn bệnh này rất nguy hiểm vì tôm mắc bệnh có thể bị chết lên đến 100 % trong vài ngày. Nhiều nước trên thế giới đã xác nhận sự hiện diện của căn bệnh này như: Australia, Ấn Độ, Indonesia, Philippines, Đài Loan, Thái Lan,.. trong đó có Việt Nam. Căn bệnh này đã gây ra sự giảm sút nghiêm trọng về mặt sản lượng tôm gần đây ở các nước như Việt Nam, Ấn Độ, Bangladesh, Philippines và Trung Quôc. Tôm nhiễm bệnh do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus thường có các dấu hiệu như: biếng ăn, bơi yếu, xuất hiện những vùng hoại tử ở vỏ và mô gan. Xuất phát từ thực trạng trên, đề tài “phân lâ p, â xác định và đánh giá sự hiện diện các gene độc tính của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bê ânh trên tôm” đã được thực hiê n tại Tòa nhà A1, Viện ê nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường - Trường ĐH Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh từ tháng 01 năm 2014 đến tháng 02 năm 2015, nhằm mục đích phân lập và xác định V.parahaemolyticus làm nguồn vật liệu ban đầu cho các nghiên cứu về biểu hiện của các gen độc cũng như là cho việc xây dựng quy trình chuẩn đoán vi khuẩn này trên tôm. 1 1.2. Yêu cẫêu - Xác định sự hiện diện của vi khuẩn Vibrio spp. trền tôm băầng các chỉ tiều - sinh hóa. Thiềất lập quy trình PCR trong việc chu ẩn đoán vi khu ẩn V.parahaemolyticus - băầng việc sử dụng các đoạn môầi chuyền biệt như AP3, 16S rDNA Xác định sự hiện diện của các gen độc như là: ToxR, tdh, tlh, trh trền chủng V. parahaemolyticus đã phân lập được. 1.3. Nôăi dung thực hiêăn - Phân lập Vibrio spp. trền các mâễu tôm thu thập được. Đánh giá các chỉ tiều sinh hoá trền các ch ủng vi khu ẩn Vibrio spp. phân lập - được. Định danh sự hiện diện của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus băầng phương - pháp PCR. Xác định sự hiện diện các gene gây độc của vi khu ẩn V.parahaemolyticus băầng phương pháp PCR. 2 Chương 2 TÔNG QUAN TÀI LIÊăU 2.1 Đăăc điêm vêê giôâng Vibrio Giông Vibrio thuộc họ Vibrionaceae là những loài vi khuẩn Gram (-), hình que thẳng hoặc hơi uôn cong, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm. Chúng không sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu vi khuẩn. Tất cả những loài vi khuẩn thuộc giông Vibrio đều là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, vi khuẩn không phát triển trong môi trường không có muôi (NaCl) và không sinh H2S.  Phân loại Vibrio Bộ: Eubacteriales Họ: Vibrionaceae Giông: Vibrio Loài: V.alginolyticus; V.parahaemolyticus; V.anguillarum; V.harveyi; V. salmonicida; V.splendidus 2.2 Lich sư phat hiêăn và sự phẫn bôâ của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Bệnh do vi khuẩn Vibrio (Vibriosis) đã được phát hiện từ rất sớm trên các động vật thủy sản thuộc họ giáp xác. Cho đến nay bệnh Vibriosis đã được phát hiện ở nhiều nước trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Một nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các loài tôm hùm châu Mỹ như: Homarus americarus, H. gammarus... và tôm hùm châu Á như: Panulirus homarus, P. ornatus... đều có thể bị nhiễm bệnh do vi khuẩn Vibrio (Fisher và ctv, 1977; Phillips, 2013). Ở Việt Nam, một sô nghiên cứu cho rằng nguyên nhân gây ra bệnh đỏ thân là do tôm ăn Artemia và tảo. Từ năm 1989 đến 1990 các nghiên cứu đã chỉ ra rằng bệnh Vibriosis, đặc biệt là bệnh phát sáng xảy ra khá phổ biến ở các trại sản xuất tôm sú giông và ở ao nuôi tôm thương phẩm tại Việt Nam (Đỗ Thị Hòa, 1994). Trong những năm gần đây, khi nghề nuôi tôm phát triển thì bệnh Vibriosis đã trở nên quen thuộc với người nuôi tôm. Hằng năm, bệnh vẫn gây ra những 3 tổn thất lớn về sản lượng tôm. Tại Việt Nam, trong năm 2012 dịch bệnh Hội chứng tôm chết sớm (EMS) ảnh hưỏng nghiêm trọng trên diện rộng. Cả nước có khoảng 100.766 ha diện tích nuôi tôm đã bị ảnh hưởng bởi dịch bệnh này (Lê Hằng và Nguyễn Thị Bích, 2012). Các loài vi khuẩn thuộc giông Vibrio chủ yếu sông ký sinh trên cơ thể động vật thủy sản và gây ra một sô triệu chứng bệnh lý nhất định. Gần đây, một sô nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là nguyên nhân gây ra bệnh EMS/AHPNS trên tôm nuôi (Lightner và ctv, 2012). Bệnh này xảy ra và phát triển thành dịch phụ thuộc vào nhiều điều kiện khác nhau: tôm bị bệnh truyền nhiễm hoặc các bệnh về dinh dưỡng, tôm bị thương hoặc điều kiện môi trường khắc nghiệt. Việc phân lập Vibrio parahaemolyticus từ mẫu tôm bệnh không khó nhưng xác định được vai trò của chúng trong một bệnh là điều không đơn giản và việc gây bệnh thực nghiệm khó thành công do không tạo được các yếu tô phù hợp để bệnh bùng phát. Trong tự nhiền, vi khuẩn Vibrio spp. có mặt ở hâầu hềất các môi trường nước đặc biệt là vùng nước lợ ở cửa sông và vùng nước ngập mặn. Ion Na + là yềấu tôấ câần thiềất cho sự phát triển của các loài vi khu ẩn này, v ới m ột sôấ loài thì ion này là nhu câầu tuyệt đôấi và không thể thiềấu. 2.3 Đăăc điêm dich têẫ học 2.3.1 Đặc điêm phẫn bôâ - Địa lý: Bệnh Vibriosis có thể được phát hiện được ở mọi khu vực trền thềấ giới, nơi có nghềầ nuôi động vật thủy sản nước lợ và nước mặn. Các khu v ực t ập trung nhiềầu nhâất như là ở châu Á, châu Phi và châu Myễ. T ừ các mâễu b ệnh c ủa âấu trùng, hậu âấu trùng và tôm bệnh, một sôấ loại khác nhau c ủa giôấng vibrio đã phân lập được. Như ở Philippines, Lavilla-Pitogo đã phân lập được 2 loài V.harveyi và V.splendidus (Lavilla-Pitogo và ctv, 1990). Trong khi ở Thái Lan, V.parahaemolyticus được phát hiện trền các mâễu tôm bệnh. Tại Việt Nam, 2 loài vi khuẩn thuộc giôấng này đã được phân lập là V.alginolyticus và V.parahaemolyticus. - Ký chủ: Hâầu hềất các loài động vật thủy sản nước lợ, mặn đềầu có th ể mang và bị ảnh hưởng của bệnh Vibriosis như: các loài tôm he ( Penaeus spp.) và tôm thẻ 4 (Metapenaeus spp.), các loài tôm hùm châu Myễ (Homarus spp.) và tôm hùm châu Á (Panulirus spp.), các loài cua biển như cua xanh, cua đá... - Giai đoạn phát bệnh: xảy ra ở hâầu hềất các giai đo ạn phát tri ển c ủa tôm như : âấu trùng, hậu âấu trùng, âấu niền, cơ thể trưởng thành và cả cá th ể bôấ m ẹ. Nhưng tùy vào từng loại bệnh mà vi khuẩn Vibrio spp. có thể gây bệnh mạnh ở giai đoạn này và nhẹ hơn ở giai đoạn kia. Ví d ụ: B ệnh phát sáng do Vibrio harveyi có thể xảy ra ở nhiềầu giai đoạn khác nhau, nhưng tác hại nặng nhâất là giai đo ạn tiềần âấu trùng Zoae và Mysis. - Con đường lan truyềần: vi khuẩn Vibrio spp. xâm nhập vào ao nuôi thuỷ sản theo một sôấ con đường như: nguôần nước, dụng cụ dùng, tôm bôấ m ẹ ho ặc tôm giôấng, thức ăn đặc biệt là thức ăn tươi sôấng Artemia và chúng có th ể năầm săễn ở thành bể hay dưới đáy ao. 2.3.2 Thơi gian xuẫât hiện bệnh. Thời gian xuất hiện bệnh do vi khuẩn Vibrio spp. tùy thuộc theo loài và địa điểm nuôi. Nhìn chung vi khuẩn Vibrio spp. sinh sản rất nhanh ở độ mặn 10 – 40 ppt (phát triển mạnh nhất ở độ mặn 20 – 30 ppt), lây lan nhanh ở nhiệt độ cao (mùa hè), phát triển tôt ở nơi có nhiều chất hữu cơ, oxy thấp và pH trong khảng 7 – 9. Trong bể nuôi, lượng vi khuẩn Vibrio tăng theo thời gian nuôi. Mật độ vi khuẩn Vibrio spp. tăng nhanh rõ rệt khi thời tiết thay đổi, vào các thời điểm biển động do bão, gió mùa hay áp thấp nhiệt đới hoặc theo con nước của thủy triều (nước cường, nước ròng) (Đỗ Thị Hòa, 1997). 2.3.3 Tac hại của bệnh Theo thông kê của tổng cục thủy sản Việt Nam, trong 10 tháng đầu năm 2013, dịch bệnh do vi khuẩn Vibrio spp. gây ra đã được phát hiện tại 192 xã của 57 huyện thuộc 18 tỉnh, thành phô trong cả nước. Tổng diện tích nuôi tôm xuất hiện bệnh là 5.705 ha, bao gồm 2.423 ha nuôi tôm thẻ chân trắng và 3.282 ha nuôi tôm sú. Dịch bệnh diễn ra ở hầu hết các vùng trọng điểm nuôi tôm, trên cả 2 đôi tượng nuôi chính là tôm sú và tôm thẻ chân trắng, trong đó các tỉnh nuôi tôm ở Đồng bằng Sông Cửu Long là bị thiệt hại nặng nề nhất (Kiều Ngọc Hà, 2013). 5 Thông thường bệnh do vi khuẩn Vibrio spp. gây ra ở tôm có thể xảy ra ở dạng cấp tính hoặc mãn tính, trong trường hợp cấp tính, tỷ lệ chết có thể lên đến 100 %. 2.3.4 Đăăc điêm sinh hóa của Vibrio Bang 2.1 Đăăc điểm sinh hóa của vi khuẩn Vibrio harveyi. 2.4 Dẫâu hiêău bêănh li 2.4.1 Dẫâu hiệu lẫm sàng Tôm bị nhiễm vi khuẩn Vibrio spp. ở trạng thái không bình thường, lờ đờ, kém ăn hoặc bỏ ăn. Tôm có thể được nhìn thấy ở mặt ao, gần bờ hay bơi lòng vòng. Tôm chết bệnh thường xuất hiện các triệu chứng như : vỏ tôm bị mềm, xuất hiện các vết thương hoại tử, ăn mòn trên vỏ và bộ phận khác của tôm. 6 Vỏ kitin của tôm khi mang vi khuẩn này có th ể xuâất hi ện các vềất th ương t ổn màu nâu đen do bị ăn mòn và viềm nhiềễm. Hội ch ứng này g ọi là b ệnh v ỏ hay b ệnh nhiềễm nâu. Ấu trùng tôm và tôm giông khi nhiễm V. parahaemolyticus và V. harveyi sẽ có sự phát sáng ở phần giáp đầu ngực trong tôi. Sau đó sẽ kèm theo hiện tượng lắng đáy và chết hàng loạt. Hội chứng này gọi là bệnh phát sáng trên tôm Xuất hiện các chấm đỏ ở gôc râu ngực, ở thân hay ở các phần phụ của ấu trùng tôm khi nhiễm V. alginolyticus. Xuất hiện vùng mờ ở phần cơ bụng, tôm bị nhiễm bệnh thường có các biểu hiện: bỏ ăn, xuất hiện sắc tô nâu đen trên mặt lưng của phần bụng gây nên những khoảng tôi sáng khác với tôm bình thường, các cơ quan phần phụ chuyển màu đỏ. 2.4.2 Dẫâu hiệu bệnh tich Vi khuẩn Vibrio cũng có thể nhiễm ở gan tụy, ruột và một sô vùng cơ của tôm. Tuy nhiên, khi giải phẩu cơ thể tôm bệnh chúng ta không thể phát hiện được dấu hiệu bệnh tích. Một sô bệnh đặc trưng do Vibrio spp. gây ra trên tôm: - Bệnh phôầng đuôi: Nguyền nhân chính là do sôấ l ượng th ức ăn d ư th ừa và v ật châất khác tích tụ ở đáy ao tạo điềầu kiện thuận lợi cho vi khu ẩn phát tri ển, chủ yềấu là vi khuẩn thuộc giôấng Vibrio mà chiềấm đa sôấ là - V.parahaemolyticus (Đôễ Thị Hòa, 2004). Bệnh đỏ dọc thân: Nguyền nhân chính là do nước và đáy ô nhiềễm nặng, th ức ăn thừa quá nhiềầu, công tác vệ sinh kém, nhiềễm vi khu ẩn Vibrio mà chủ yềấu là V.alginolyticus (Đôễ Thị Hòa, 2004). 2.5 Gene đôăc tôâ của V. parahaemolyticus Gen toxR là gen điềầu hòa các gen độc tôấ, có trình tự bảo tôần đặc tr ưng cho loài nên có thể được sử dụng làm gen đích để xây dựng phương pháp phát hiện nhanh vi khuẩn Vibrio trong mẫu tôm bê nh bằng kỹ thuật PCR. Bên cạnh đó, gen tlh là gen ê mã hóa một hemolysin không bền nhiệt có trình tự amino acid bảo thủ trong họ 7 Vibrionaceae, nên có tiềm năng làm vaccin điều trị bệnh thủy sản và marker chẩn đoán bệnh do Vibrio (Nguyễn Văn Duy và ctv, 2012). Ngoài khả năng gây bệnh trền tôm V.parahaemolyticus còn có khả năng gây bệnh trền người do loài vi khuẩn này có các gen mã hóa cho đ ộc tôấ hemolysin nh ư là: themostable direct hemolysin (tdh), themostable related hemolysin (trh) và themostable hemolysin (tlh). Đây là loại độc tôấ làm phân giải tềấ bào hôầng câầu và giải phóng hemoglobin. Có nghiền cứu đã ch ỉ ra răầng, các gen đ ộc tôấ c ủa vi khu ẩn V.parahaemolyticus là nguyền nhân gây ra bệnh viền dạ dày câấp tính (Honda T và Iida T, 1993). 2.6 Cac phương phap phat hiêăn Vibrio spp. 2.6.1 Phương phap nuôi cẫây vi sinh vâăt 2.6.1.1 Nguyên tắâc Nuôi câấy tăng sinh khôấi trong môi tr ường canh peptone kiềầm, phân l ập trền môi trường phân lập đặc trưng. Quan sát chọn nh ững khu ẩn l ạc đ ặc tr ưng trền đĩa câấy. Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, dềễ th ực hi ện và ít tôấn kém. Tuy nhiền, nhược điểm của nó là mâất thời gian để thực hiện. 2.6.1.2 Cach thực hiện Lấy mẫu mô gan tụy của tôm bệnh, nghiền nhỏ và pha loãng đến nồng độ thích hợp. Sau đó nhỏ 0.3 ml dịch mẫu lên các đĩa chứa môi trường TCBS, dàn đều khắp bề mặt môi trường, mỗi mẫu cấy lên một đĩa. Ủ trong tủ ấm ở 30 0 C trong 24 giờ. Tách dòng các chủng vi khuẩn mọc trên bề mặt môi trường. Tiến hành thử nghiệm các đặc tính sinh hóa của Vibrio spp. như khả năng sử dụng các đường glucose, sorbitol, maltose, sucrose, lactose, galactose; khả năng sử dụng Citrate như nguồn carbon duy nhất trên môi trường Simons Citrate Agar; khả năng sinh gar của glucose, kiểm tra khả năng lên men và oxy hóa; khả năng phân giải gelatin; khả năng sử dụng Nitrate; phản ứng Indol hóa; khả năng sử dụng các acid amin. 8 2.6.2 Phương phap PCR (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Karl Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985, từ đó đã tạo ra một tác động to lớn đôi với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới. Ðây là phương pháp in vitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp một sô lượng lớn bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt dựa trên hoạt động của enzyme polymerase. Phương pháp PCR dựa trên nguyên tắc hoạt động của DNA polymerase trong việc tổng hợp DNA mới từ mạch khuôn. Tất cả các DNA polymerase đều cần có những mồi, là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn DNA. Ðoạn mồi này sau đó sẽ được kéo dài dưới tác động của DNA polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh. Để phản ứng PCR có thể khuyếch đại một trình tự đặc biệt nào đó thì cần phải có những thông tin tôi thiểu về trình tự đó để thiết kế các mồi tương ứng bao gồm một mồi xuôi (sense primer) và một mồi ngược (antisense primer) so với chiều phiên mã của gene. Khi phản ứng xảy ra sẽ cho hàng loạt bản sao của đoạn DNA nằm giữa hai mồi đó. Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nôi tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA khuôn mẫu được biến tính ở nhiệt độ cao trong vòng 30 giây – 1 phút, thường là ở 94 0 C. Giai đoạn bắt cặp là giai đoạn mà nhiệt độ được hạ thấp, cho phép các mồi bắt cặp bổ sung với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng từ 30 – 70 0 C và thời gian dao động trong khoảng 40 giây – 1 phút. Giai đoạn tổng hợp: trong giai đoạn này, nhiệt độ được tăng lên đến 720 C kéo dài từ 20 giây đến nhiều phút để cho DNA polymerase thực hiện quá trình tổng hợp. Trong phản ứng PCR, chu kỳ gồm ba giai đoạn trên sẽ được lặp lại nhiều lần, mỗi lần lặp lại sẽ làm tăng sô lượng bản sao lên gấp đôi. Theo tính toán, sau 30 chu kỳ, sô bản sao sẽ là 106 so với sô lượng bản mẫu ban đầu. Rất nhiều nghiên cứu không chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiều nước trên thế giới đã sử dụng phương pháp này để phát hiện vi khuẩn V.parahaemolyticus. Các nghiên cứu sử dụng cặp mồi ToxR như là: Nguyễn Văn Duy và ctv, 2012; Lightner và ctv, 2012; Kim và ctv, 1999 hay với 3 cặp môầi tdh, trh, tlh như là: Bej và ctv, 1999; Honda và ctv, 1993 và gâần đây nhâất là nghiền cứu s ử d ụng ph ương pháp này v ới cặp môầi AP3 là Kongrueng và ctv, 2014 cũng cho phép xác định loài vi khu ẩn này. 9 Ngoài 2 phương pháp trên, với sự tiến bộ của khoa học công nghệ, các nhà nghiên cứu đã phát triển một sô phương pháp mới như là multiplex PCR, realtime PCR, multipleax realtime PCR, kỹ thuật LAMP,... Các phương pháp mới này dựa trên nguyên lí hoạt động của phương pháp PCR truyền thông nhưng lại có tính ưu việt hơn. Ví dụ như: phương pháp realtime PCR có sự gắn kết giữa máy PCR và máy vi tính cho phép việc xem xét mức độ biểu hiện của các gen mục tiêu hay kỹ thuật LAMP sử dụng cùng lúc các cặp mồi chuyên biệt cho phép xác định nhanh loài vi khuẩn quan tâm trong thời gian ngắn. Một sô nghiên cứu sử dụng phương pháp realtime PCR trong việc xác định vi khuẩn V.parahaemolyticus như nghiên cứu của Nordstrom, J. L. và ctv, 2007. Nội dung của nghiên cứu này là xác định sự hiện diện của vi khuẩn V.parahaemolyticus gây bệnh viêm dạ dày ở Hoa Kỳ. Bằng kỹ thuật realtime multiplex PCR sử dụng đồng thời 3 cặp mồi là tdh, trh, tlh. Kết quả của nghiên cứu này dùng để chứng minh sự tiện ích của phương pháp PCR và ứng dụng phương pháp này trong việc phát hiện vi khuẩn V.parahaemolyticus trong các ổ dịch. 10