Tài liệu Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây sả (cymbopogone citratus (dc.) stapf) trồng tại tỉnh kiên giang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***    *** LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY SẢ (Cymbopogone citratus (DC.) Stapf) TRỒNG TẠI TỈNH KIÊN GIANG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN HỌ VÀ TÊN SINH VIÊN PGS. TS NGUYỄN HỮU HIỆP TRƢƠNG NGỌC LAN HƢƠNG MSSV: 3113720 LỚP: VSVH - K37 Cần Thơ – Tháng 11/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***    *** LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY SẢ (Cymbopogon citratus (DC.) Stapf) TRỒNG TẠI TỈNH KIÊN GIANG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN HỌ VÀ TÊN SINH VIÊN PGS. TS NGUYỄN HỮU HIỆP TRƢƠNG NGỌC LAN HƢƠNG MSSV: 3113720 LỚP: VSVH - K37 Cần Thơ – Tháng 11/2014 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) (ký tên) Trương Ngọc Lan Hương PGS. TS Nguyễn Hữu Hiệp DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Trong thời gian học tập chuyên ngành Vi Sinh Vật cũng như thực hiện luận văn tốt nghiệp tại trường Đại học Cần Thơ, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm và động viên từ gia đình, sự hướng dẫn và chỉ dạy tận tình của quý thầy cô cùng sự giúp đỡ nhiệt tình của các bạn. Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Quý thầy cô tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn. PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp, Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ người Thầy đã nhiệt tâm hướng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, xây dựng đề cương nghiên cứu, thực hiện thí nghiệm và hoàn thành luận văn này. Cán bộ quản lý tại phòng thí nghiệm vi sinh vật và phòng thí nghiệm sinh hóa đã giúp đỡ, động viên và chia sẻ những khó khăn giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến cha, mẹ đã luôn ủng hộ tôi về mọi phương diện, là sức mạnh tinh thần giúp tôi vươn lên trong cuộc sống. Các bạn lớp Vi Sinh Vật k37 đã cùng tôi vượt qua khó khăn trong quá trình học tập cũng như trong cuộc sống. Xin gửi lới chúc sức khỏe và thành công đến cha mẹ, quý thầy cô và các bạn sinh viên của tôi. Cần Thơ, ngày 27 tháng 11 năm 2014 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT TÓM TẮT Sả là một trong những cây dược liệu được sử dụng nhiều trong đông y. Có nhiều nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của Sả nhưng chỉ tập trung chủ yếu vào dịch trích từ tinh dầu Sả và các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Sả vẫn chưa được nghiên cứu. Vì thế, đề tài phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây Sả được thực hiện. Từ ba mẫu Sả thu ở huyện Hòn Đất, Tân Hiệp, Giồng Riềng- Kiên Giang mười chín dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường PDA. Đa số các dòng vi khuẩn này đều có khuẩn lạc dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, màu trắng đục, thuộc gram âm và có khả năng chuyển động. Kết quả khảo sát khả năng cố định NH4+ và tổng hợp IAA cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn này có thể tổng hợp được một lượng IAA và NH4+ nhất định sau 2 ngày chủng và tùy theo mỗi dòng làm tăng hoặc giảm NH4+ và IAA vào các ngày còn lại. Mười bốn dòng vi khuẩn hòa tan được lân khó tan. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn trên 2 chủng vi khuẩn Escherichia coli và Aeromonas hydrophila cho thấy, hoạt tính kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được trên hai chủng vi khuẩn thử nghiệm không giống nhau. Không có dòng nào kháng được khuẩn Escherichia coli. Năm dòng có hoạt tính kháng khuẩn Aeromonas hydrophila và đặc biệt có 2 dòng kháng Aeromonas hydrophila rất mạnh. Kết quả giải trình tự gene 16S-rRNA, dòng H16 được nhận diện là Bacillus cereus - CCM 2010, dòng H13 là Bacillus megaterium - QM B1551 với tỉ lệ đồng hình lần lượt là 85% và 81%. Từ khóa: Ammonium, cây Sả, hòa tan lân, IAA, kháng khuẩn, vi khuẩn nội sinh. Chuyên ngành Vi sinh vật học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT MỤC LỤC KÝ TÊN HỘI ĐỒNG ............................................................................................ LỜI CẢM TẠ ........................................................................................................ TÓM LƢỢC......................................................................................................... i MỤC LỤC ............................................................................................................ ii DANH SÁCH BẢNG ........................................................................................ vii DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................ viii TỪ VIẾT TẮT .............................................................................................................. ix CHƢƠNG I: GIỚI THIỆU ................................................................................ 1 1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu đề tài .................................................................................................... 2 CHƢƠNG II: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU .......................................................... 3 2.1 Tỉnh Kiên Giang ................................................................................................. 3 2.1.1 Sơ lược về tỉnh Kiên Giang ............................................................................ 3 2.1.2 Vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên ................................................................... 4 a) Vị trí địa lý .......................................................................................................... 4 b) Điều kiện tự nhiên .............................................................................................. 4 2.2 Giới thiệu về cây Sả ............................................................................................ 5 2.2.1 Phân loại thực vật ........................................................................................... 6 2.2.2 Mô tả cây sả ..................................................................................................... 7 2.2.3 Phân bố, thu hái và nhân giống sả ................................................................ 7 a) Phân bố............................................................................................................. 7 b) Thu hoạch và nhân giống sả ............................................................................ 8 2.2.4 Thành phần hóa học ....................................................................................... 8 Chuyên ngành Vi sinh vật học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT 2.2.5 Công dụng trong y học ................................................................................... 9 2.2.6 Tình hình nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của cây Sả ................... 11 2.3 Sơ lƣợc về vi khuẩn nội sinh............................................................................. 12 2.3.1 Vi khuẩn Bacillus ......................................................................................... 13 a) Bacillus cereus ............................................................................................... 14 c) Bacillus subtilis .............................................................................................. 15 d) Bacillus megaterium ....................................................................................... 16 2.3.2 Vi khuẩn Azospirillum .................................................................................. 17 2.3.3 Vi khuẩn Klebsiella ....................................................................................... 17 2.3.4 Vi khuẩn Pseudomonas ................................................................................ 18 2.3.5 Vi khuẩn Azotobacter ................................................................................... 19 2.4 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh ................................................................. 20 2.4.1 Đối kháng sinh học .................................................................................... 20 2.4.2 Phân hủy sinh học ...................................................................................... 20 2.4.3 Sản phẩm từ vi khuẩn nội sinh .................................................................. 20 2.5 Một số đặc tính của vi khuẩn thử nghiệm ........................................................... 21 2.5.1 Escherichia coli (E.coli) ............................................................................. 21 2.5.2Aeromonas hydrophila (A. hydrophila) ...................................................... 22 CHƢƠNG III: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... 23 3.1 Thời gian – Địa điểm thực hiện.................................................................. 23 3.1.2 Dụng cụ - thiết bị......................................................................................... 23 3.1.3 Nguyên liệu.................................................................................................. 23 3.1.4 Hóa chất....................................................................................................... 24 a) Hóa chất dùng để khử trùng mẫu ..................................................................... 24 b) Môi trường phân lập vi khuẩn nội sinh ............................................................ 24 c) Môi trường tăng sinh vi khuẩn ......................................................................... 24 Chuyên ngành Vi sinh vật học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT d) Môi trường khảo sát khả năng hòa tan lân ...................................................... 25 e) Hóa chất kiểm tra đặc tính sinh hóa ................................................................. 25 g) Hóa chất thực hiện phản ứng PCR................................................................... 25 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................. 26 3.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh ................................................. 26 3.2.2 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn .................. 27 3.2.3 Nhuộm Gram vi khuẩn nội sinh ................................................................. 28 3.2.4 Xác định khả năng tổng hợp NH4+ ............................................................ 29 a) Nguyên tắc .................................................................................................... 29 b) Hóa chất ....................................................................................................... 29 c) Tiến hành thí nghiệm: ................................................................................... 30 d) Định lượng đạm do vi khuẩn sinh ra ............................................................ 30 3.2.5 Xác định khả năng hòa tan lân .................................................................. 31 3.2.6 Xác định khả năng tổng hợp IAA .............................................................. 31 a) Chuẩn bị ....................................................................................................... 31 b) Hóa chất ....................................................................................................... 32 c) Phương pháp ................................................................................................ 32 3.2.7 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn ................... 33 3.2.8 Nhận diện các dòng vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn cao .................. 33 CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN....................................................... 36 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn ........................................................................... 36 4.1.1 Phân lập vi khuẩn ....................................................................................... 36 4.1.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được ..... 38 4.1.3 Đặc điểm tế bào vi khuẩn trên môi trường PDA ....................................... 40 4.2 Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn ................. 41 4.3 Khảo sát khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn............................. 43 Chuyên ngành Vi sinh vật học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT 4.4 Khảo sát khả năng tổng hợp indol-3-acetic acid (IAA) của các dòng vi khuẩn ........................................................................................................................ 47 Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của các dòng vi khuẩn ..... 50 4.5 4.6 Kết quả nhận diện bằng kỹ thuật PCR ........................................................ 53 4.6.1 Nhận diện dòng vi khuẩn H16 ................................................................... 54 4.6.2 Nhận diện dòng vi khuẩn H13 ................................................................... 55 4.7 Tổng hợp đặc tính của các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Sả............... 57 CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................ 59 5.1 Kết luận .......................................................................................................... 59 5.2 Đề nghị ............................................................................................................ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 60 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các hình ảnh 1. Đường chuẩn đo đạm 2. Đường chuẩn đo IAA Phụ lục 2: Kết quả Bảng 16. Địa điểm thu các mẫu Sả và pH đất tại nơi thu Bảng 17. Số liệu ammonium do các dòng vi khuẩn tổng hợp được ngày 2 Bảng 18. Số liệu ammonium do các dòng vi khuẩn tổng hợp được ngày 4 Bảng 19. Số liệu ammonium do các dòng vi khuẩn tổng hợp được ngày 6 Bảng 20. Số liệu IAA do các dòng vi khuẩn tổng hợp ngày 2 Bảng 21. Số liệu IAA do các dòng vi khuẩn tổng hợp ngày 4 Bảng 22. Số liệu IAA do các dòng vi khuẩn tổng hợp ngày 6 Bảng 23. Chỉ số đo vòng halo lân ngày 2 Bảng 24. Chỉ số đo vòng halo lân ngày 4 Bảng 25. Chỉ số đo vòng halo lân ngày 6 Chuyên ngành Vi sinh vật học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT Bảng 26. Chỉ số đo vòng kháng khuẩn ngày 1 Bảng 27. Chỉ số đo vòng kháng khuẩn ngày 2 Bảng 28. Chỉ số đo vòng kháng khuẩn ngày 3 Trình tự gen mã hóa 16S-rDNA của các dòng vi khuẩn triển vọng. Phụ lục 3: Kết quả thống kê 1. Bảng kết quả phân tích phương sai khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn a) Ngày 2 b) Ngày 4 c) Ngày 6 2. Bảng kết quả phân tích phương sai thí nghiệm xác định hàm lượng đạm do 19 dòng vi khuẩn tổng hợp được ở 2, 4 và 6 ngày sau khi chủng (trên môi trường NFb) a) Ngày 2 b) Ngày 4 c) Ngày 6 3. Bảng kết quả phân tích phương sai thí nghiệm xác định hàm lượng IAA do 19 dòng vi khuẩn tổng hợp được ở 2, 4 và 6 ngày sau khi chủng (trên môi trường NFb). a) Ngày 2 b) Ngày 4 c) Ngày 6 4. Kết quả phân tích thống kê các dòng vi khuẩn tạo vòng kháng khuẩn với vi khuẩn gây bệnh Aeromonas hydrophila a) Ngày 1 b) Ngày 2 c) Ngày 3 Chuyên ngành Vi sinh vật học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Phân loại cây sả .................................................................................................. 6 Bảng 2: Công thức môi trường PDA đặc có bổ sung đạm ............................................ 24 Bảng 3: Công thức môi trường NFb .............................................................................. 24 Bảng 4: Công thức môi trường NBRIP ......................................................................... 25 Bảng 5: Thành phần các chất trong phản ứng PCR....................................................... 25 Bảng 6: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA ........................ 37 Bảng 7: Đặc tính khuẩn lạc vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA sau 24 giờ ......... 39 Bảng 8: Đặc tính vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA ........................................... 40 Bảng 9: Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn ................................................... 43 Bảng 10: Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn .............................................. 44 Bảng 11: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập ............................. 47 Bảng 12: Khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila của các dòng vi khuẩn .... 51 Bảng 13: Kết quả giải trình tự của một số dòng vi khuẩn triển vọng ........................... 54 Bảng 14: Tổng hợp khả năng tổng hợp đạm và IAA của các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Sả ................................................................................................................... 57 Bảng 15: Tổng hợp khả năng hòa tan lân và kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Sả............................................................................................................ 58 Chuyên ngành Vi sinh vật học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Bản đồ tỉnh Kiên Giang ...................................................................................... 3 Hình 2: Cây sả (Cymbopogon citratus) ........................................................................... 6 Hình 3: Cấu trúc của Citral .............................................................................................. 9 Hình 4: Đường chuẩn để đo nồng độ NH4+ ................................................................... 30 Hình 5: Đường chuẩn để đo nồng độ IAA .................................................................... 32 Hình 6: Pellicle cách mặt môi trường từ 3-6mm sau 2-3 ngày nuôi. ............................ 36 Hình 7: Khuẩn lạc phát triển trên môi trường PDA ...................................................... 38 Hình 8: Vi khuẩn Gram âm và Gram dương ................................................................. 40 Hình 9: Vòng sáng halo do vi khuẩn hòa tan lân tạo ra ................................................ 42 Hình 10: Lượng đạm (µg/ml) do các dòng vi khuẩn triển vọng tạo ra ......................... 46 Hình 11: Lượng IAA (µg/ml) do các dòng vi khuẩn triển vọng tạo ra ......................... 49 Hình 12: Vòng kháng khuẩn trên môi trường trải vi khuẩn A. hydrophila ................... 50 Hình 13: Vòng kháng khuẩn yếu trên môi trường trải E. coli ....................................... 53 Hình 14: Phổ điện di các dòng vi khuẩn với cặp mồi 16S-rRNA ................................. 54 Chuyên ngành Vi sinh vật học viii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT TỪ VIẾT TẮT A. hydrophila Aeromonas hydrophila B. cereus Bacillus cereus B. megaterium Bacillus megaterium BLAST Basic Local Alignment Search Tool DNA Deoxyribo Nucleic Acid E. coli Escherichia coli IAA Indole–3–Acetic Acid LSD Least Significant Difference MS Mean Square OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction PDA Potato Dextrose Agar RNA Ribonucleic Acid SS Sum of Square Chuyên ngành Vi sinh vật học ix Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Việt Nam là nước có hệ thực vật phong phú và đa dạng, trong đó nhiều loại cây có tính kháng sinh đã được đông y sử dụng từ lâu, chiếm khoảng 30%. Kết quả điều tra nguồn tài nguyên dược liệu ở Việt Nam giai đoạn 2001 – 2005 của Viện Dược liệu (2006) cho biết ở Việt Nam có 3.948 loài thực vật bậc cao, bậc thấp và nấm lớn được dùng làm thuốc. Những cây thuốc có giá trị sử dụng cao, có khả năng khai thác trong tự nhiên là những cây thuốc nằm trong danh mục 185 cây thuốc và vị thuốc thiết yếu của Bộ Y tế cũng như những cây thuốc đang được thị trường dược liệu quan tâm gồm có 206 loài có khả năng khai thác (http://www.uphcm.edu.vn/caythuoc/). Trong khi các tài liệu tra cứu về cây thuốc chủ yếu được viết trên sách, do đó hạn chế đối tượng sử dụng nhất là không phải là nhà chuyên môn muốn tìm hiểu sử dụng cây thuốc. Nhiều cây thuốc mà dân gian có thể bị nhầm lẫn trong sự xác định loài dựa theo tên phổ thông hay những loài có hình dạng giống nhau, rất dễ nhầm lẫn nếu thiếu sự mô tả tỷ mỉ đặc điểm hình thái và giải phẫu. Cây Sả (Cymbopogon citratus (DC.) Stapf) là một loại thảo dược thường được sử dụng trong Y học dân tộc, thuộc họ Hòa thảo (Poaceae). Có nguồn gốc từ Trung Quốc và phân bố rộng rãi ở các nước vùng Đông Á và Đông Nam Á. Hiện nay, cây sả được trồng ở khắp các nước nhiệt đới và ôn đới. Tại Việt Nam, sả được trồng ở khắp các vùng miền, ở miền nam có các tỉnh như Kiên Giang, Bạc Liêu, Cà Mau, Sóc Trăng, … Sả là loại cây thân thảo, thuộc họ Hòa thảo, thường mọc thành từng bụi cao từ 1 – 1,5m. Thân màu trắng hoặc hơi tím, có nhiều đốt, kiểu rễ chùm. Sả đẻ chồi ở nách lá tạo thành nhánh như nhánh lúa. Chứa nhiều tinh dầu, có tác dụng sát khuẩn, chống viêm, … Các nhà khoa học đã chứng minh đây là một cây thuốc mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe con người. So với kháng sinh tây y, các cây thuốc kháng sinh tuy hiệu lực kháng khuẩn không mạnh bằng nhưng cũng đủ để chữa khỏi nhiều bệnh nhiễm khuẩn. Không những thế, chúng còn có những ưu điểm mà kháng sinh tây y không có, đó là hiện tượng quen thuốc, kháng thuốc và loạn khuẩn do tình trạng lạm dụng thuốc kháng sinh trong điều trị ngày càng phát triển ở nhiều quốc gia trên thế giới. Đây là chuyện nan giải đối với kháng sinh tây y hiện nay nhưng đối với kháng sinh thực vật chưa thấy Chuyên ngành Vi sinh vật học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT hiện tượng này. Đó là chưa kể đến những tai biến nguy hiểm do nhiều loại kháng sinh gây ra, có khi dẫn đến tử vong, trong khi kháng sinh thực vật ít độc nên không gây ra những tai biến nguy hiểm. Bên cạnh đó, phần lớn kháng sinh thực vật rất bền vững và dễ hòa tan trong nước nên có thể được dùng dưới dạng thuốc sắc là dạng bào chế đơn giản và thông dụng nhất. Tập đoàn vi sinh vật nội sinh hoặc sống ở vùng rễ cây trong đó có cây dược liệu có khả năng giúp cây tăng trưởng tốt. Ngoài ra chúng còn có khả năng sản xuất trực tiếp các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên (Strobel, 2003) nhưng chúng cũng có khả năng kích thích cây chủ sản xuất ra các hợp chất biến dưỡng trung gian như ở cây dược liệu chúng có thể sản xuất ra các hợp chất có tính kháng khuẩn rất tốt (Hardoim et al., 2008; Kaul et al., 2008). Các nhóm vi sinh vật có khả năng này bao gồm các loài thuộc chi Azosprillum, Bacillus, Gluconacetobacter, Pseudomonas … Nhiều nghiên cứu cây dược liệu có tính kháng khuẩn như cây Sả (Cymbopogon citratus), cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L), cây Sài đất (Wedelia calendulacea, Less), cây Diếp cá (Houttuynia cordata, Thunb) … chứng tỏ chúng có hoạt chất kháng khuẩn do có chứa tinh dầu là các nhóm aldehyde và các dẫn xuất ceton như methyl n-nonyl ceton, L-decanal, L-dodecanal. Nhóm terpen bao gồm các chất α-pinen, camphen, … Có tác dụng kháng các loại vi khuẩn như Streptococcus pneumonia, Staphylococcus aureus, Shigella, Salmonella, Escherichia coli (Đỗ Tất Lợi, 2006; Shu-Chen et al., 2008). Phần lớn các nghiên cứu chỉ hướng đến dịch trích từ cây và chưa có nhiều nghiên cứu sâu về vi khuẩn nội sinh trong cây dược liệu. Vì vậy, đề tài: “Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây sả (Cymbopogon citratus (DC.) Stapf) trồng ở tỉnh Kiên Giang” được thực hiện. 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Sả (Cymbopogon citratus) trồng ở tỉnh Kiên Giang có khả năng kháng khuẩn, cố định đạm, sinh tổng hợp IAA và hòa tan lân. Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT CHƢƠNG 2 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tỉnh Kiên Giang 2.1.1 Sơ lược về tỉnh Kiên Giang Hình 1: Bản đồ tỉnh Kiên Giang (*Nguồn: http://kiengiangvn.vn/portal/index.php?pageid=958&topicid=61&pagenum=1, ngày 14/6/2014). Kiên Giang là một tỉnh ven biển thuộc đồng bằng sông Cửu Long ở miền Nam, với phần lớn diện tích của tỉnh thuộc địa bàn tỉnh Rạch Giá trước đó. Tuy nhiên, cũng có thời kỳ toàn bộ diện tích tỉnh Kiên Giang ngày nay đều thuộc tỉnh Rạch Giá, bao gồm cả các vùng Hà Tiên và Phú Quốc. Trung tâm tỉnh là thành phố Rạch Giá, cách thành phố Hồ Chí Minh 250 km về phía Tây. Kiên Giang tiếp giáp Campuchia ở phía Bắc với đường biên giới dài 54 km và vịnh Thái Lan ở phía Tây có đường bờ biển dài hơn 200 km. Ngoài ra Kiên Giang có hơn 100 đảo lớn nhỏ ngoài biển. Tỉnh lỵ của Kiên Giang là Thành phố Rạch Giá, một thành phố biển duy nhất ở Đồng bằng sông Cửu Long. Kiên Giang có vị trí chiến lược quan trọng, nằm trong vùng vịnh Thái Lan, gần với các nước thuộc Đông Nam Á như Campuchia,Thái Lan, Malaysia, Singapo. Chính vì vậy Kiên Giang có nhiều điều kiện thuận lợi trong việc mở rộng giao lưu kinh tế với các nước trong khu vực, đồng thời đóng vai trò cầu nối các tỉnh miền Tây Nam Bộ với bên ngoài. Chuyên ngành Vi sinh vật học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT (*Nguồn: https://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BB%89nh_Ki%C3%AAn_Giang, ngày 14/6/2014) 2.1.2 Vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên của tỉnh Kiên Giang a) Vị trí địa lý: Kiên Giang nằm tận cùng phía tây nam của Việt Nam, trong đó lãnh thổ bao gồm đất liền và hải đảo. Phần đất liền nằm trong tọa độ từ 9°23'50 - 10°32'30 vĩ Bắc và từ 104°26'40 - 105°32'40 kinh Đông. Phía Bắc giáp Campuchia, đường biên giới dài 56,8 km, phía Nam giáp tỉnh Bạc Liêu và tỉnh Cà Mau, phía Tây giáp vịnh Thái Lan với đường bờ biển dài 200 km, phía Đông lần lượt tiếp giáp với các tỉnh là An Giang, thành phố Cần Thơ và tỉnh Hậu Giang. Phần hải đảo nằm trong vịnh Thái Lan bao gồm hơn 100 hòn đảo lớn nhỏ, trong đó lớn nhất là đảo Phú Quốc và xa nhất là quần đảo Thổ Chu, tập trung thành 5 quần đảo là quần đảo Hải Tặc, quần đảo Bà Lụa, quần đảo An Thới, quần đảo Nam Du và quần đảo Thổ Chu. Điểm cực Bắc thuộc địa phận xã Tân Khánh Hoà, huyện Giang Thành. Cực Nam nằm ở xã Vinh Phong, huyện Vĩnh Thuận. Cực Tây tại xã Mỹ Đức, thị xã Hà Tiên và điểm cực Đông nằm ở xã Hoà Lợi thuộc địa phận huyện Giồng Riềng. Vị trí địa lý của Kiên Giang có tiềm năng lớn cho phát triển kinh tế - xã hội tổng hợp, là cửa ngõ hướng ra biển Tây của tỉnh cũng như của vùng đồng bằng sông Cửu Long, có điều kiện thuận lợi để phát triển kinh tế biển, đảo và giao lưu với các nước trong khu vực và quốc tế với các ngành mũi nhọn như du lịch, thương mại, dịch vụ công nghiệp và nuôi trồng thuỷ sản… (*Nguồn: https://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BB%89nh_Ki%C3%AAn_Giang, http://kiengiangvn.vn/portal/index.php?pageid=958&topicid=61&pagenum=1, ngày 14/6/2014) b) Điều kiện tự nhiên: Kiên Giang có đủ các dạng địa hình từ đồng bằng, núi rừng và biển đảo. Trong đó, phần đất liền có địa hình tương đối bằng phẳng, thấp dần từ đông bắc xuống tây nam. Do nằm ở vĩ độ thấp và giáp biển nên Kiên Giang có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm nhiệt độ trung bình hàng tháng từ 27 – 27,5oC. Kiên Giang không chịu ảnh hưởng trực tiếp của bão nhưng lượng nước mưa do bão chiếm một tỷ trọng đáng kể, nhất là vào cuối mùa mưa. Mùa mưa bắt đầu từ tháng 4 đến tháng 11, mùa Chuyên ngành Vi sinh vật học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT khô từ tháng 12 đến tháng 3 năm sau. Lượng mưa trung bình hàng năm khoảng 1.600 – 2.000 mm ở đất liền và 2.400 – 2.800 mm ở vùng đảo Phú Quốc. Khí hậu Kiên Giang rất ít thiên tai, không rét, không có bão đổ bộ trực tiếp, ánh sáng và nhiệt lượng dồi dào, nên rất thuận lợi cho nhiều loại cây trồng và vật nuôi sinh trưởng. Kiên Giang có 4 vùng đất đai chính là vùng phù sa ngọt thuộc tây sông Hậu, vùng phèn ngập lũ thuộc tứ giác Long Xuyên, vùng nhiễm mặn thuộc bán đảo Cà Mau và vùng đồi núi, hải đảo ở hai huyện Phú Quốc và Kiên Hải. Trong đó, đất nông nghiệp, chiếm 64,2% diện tích tự nhiên, đất rừng chiếm 122,8 nghìn ha, đất chuyên dùng 35,4 nghìn ha, đất ở 10,1 nghìn ha. Ngoài ra tỉnh còn có trên 70 nghìn ha đất hoang hoá và sản xuất chưa ổn định với hơn 25 nghìn ha vườn tạp. Rừng tại Kiên Giang rất ít, chủ yếu là rừng phòng hộ. Kiên Giang là tỉnh có tiềm năng khoáng sản tương đối lớn mặc dù đang ở mức thăm dò, nghiên cứu nhưng bước đầu đã xác định được 152 điểm quặng và 23 mỏ khoáng sản các loại khác. Trữ lượng đá vôi toàn tỉnh hiện có 440 triệu tấn, có khả năng khai thác 342 triệu tấn, trong đó trữ lượng khai thác công nghiệp là 235 triệu tấn, đủ nguyên liệu để sản xuất 4,6 triệu tấn clinker/năm trong suốt 40 năm. Than bùn, ước tính còn khoảng 150 triệu tấn. Nền nông nghiệp của Kiên Giang là nông nghiệp trồng lúa nước. Đất canh tác không tập trung nhưng phần lớn phân bố ở ven các trung tâm huyện. Xen kẽ với việc trồng lúa nước là các loại hoa màu và một số cây có giá trị công nghiệp cao như dừa, khóm... Kiên Giang là tỉnh có nghề đánh bắt hải sản phát triển. Với bờ biển dài trên 200 km, có diện tích biển khoảng 63.000 km2, Kiên Giang tiềm năng rất phong phú để phát triển kinh tế biển. Đây là một lĩnh vực mà tỉnh có lợi thế hơn hẳn so với nhiều tỉnh khác trong khu vực đồng bằng sông Cửu Long. (*Nguồn: https://vi.wikipedia.org/wiki/Tỉnh_Kiên_Giang, ngày 14/6/2014). 2.2 Giới thiệu về cây sả Sả có thể được gọi là Sả chanh, Cỏ sả, Cỏ chanh, Hương mao. Tên tiếng Anh là Lemon grass, oil grass, silky heads, citronella grass. Tên khoa học là Cymbopogon citratus (DC.) Stapf, 1906. Thuộc họ Lúa Poaceae (Gramineae) (Đỗ Tát Lợi, 2004). Chuyên ngành Vi sinh vật học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT Hình 2: Cây sả (Cymbopogon citratus) (Chụp ngày 19/11/2014) 2.2.1 Phân loại thực vật Bảng 1. Phân loại cây sả Giới (Kingdom): Thực vật (Plantae) Ngành (Division): Thực vật có hoa (Angiosperms) Lớp (Class): Thực vật 1 lá mầm (Monocots) Phân lớp (Subclass): Cây hạt kín (Commelinids). Bộ (Order): Hòa thảo (Poales) Họ (Family): Hòa thảo (Poaceae) Phân họ (Subfamily): Panicoideae Tộc (Tribe): Andropogoneae Phân tộc (Subtribe): Andropogoninae Chi (Genus): Cymbopogon (khoảng 55 loài) Loài (Species): Cymbopogon citratus (DC.)Stapf (*Nguồn: http://hocvienquany.vn/Web_SVBien/DASinhVatBien/Default.aspx?MaTin=117, ngày 18/6/2014). Chuyên ngành Vi sinh vật học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT 2.2.2 Mô tả cây sả Thân rễ trắng hay hơi tím. Lá hẹp dài, mép lá hơi nháp. Cụm hoa gồm nhiều bông nhỏ không cuống. Toàn cây có mùi thơm đặc biệt mùi sả. Trồng làm thuốc, người ta ít phân biệt sả này với sả khác, nhưng khi trồng để cất tinh dầu người ta phân biệt sả ra hai nhóm có tinh dầu có giá trị khác hẳn nhau:  Nhóm sả cho tinh dầu với thành phần chủ yếu là Citronellal và genariola (citronnelle. Có loài Cymbopogon winterianus, Cymbopogon nardus (L.) Rendl. (Andropogon nardus L.) có hàm lượng tinh dầu cao và chất lượng tốt nhất, sau đến Cymbopogon confertiflorus Stapf cho ít tinh dầu và chất lượng kém hơn.  Nhóm sả cho tinh dầu với thành phần chủ yếu là Citral (Lemon grass-Verveine des Indes) làm tinh dầu có mùi chanh rất rõ. Đứng đầu là sả Cymbopogon flexuosus Stapf. (Andropogon flexuosus Nees), sau đến loài Cymbopogon citratus Stapf. (Andropogon Schoenanthus L.) (Đỗ Tất Lợi, 2004). 2.2.3 Phân bố, thu hái và nhân giống sả: a) Phân bố Chi sả Cymbopogon (lemongrass) là một Chi với khoảng 55 loài (species) sả khác nhau, có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Cựu thế giới, thuộc Châu Phi, Nam Á, Đông Nam Á, Đông Á và Australia. Trong đó loài phổ biến nhất ở Trung Quốc và vùng Đông Nam Châu Á là loài Sả ta hay Sả Tàu (Cymbopogon citratus), phân bố rộng rãi ở các nước vùng Đông Á và Đông Nam Á. Hiện nay nhiều loài sả cao sản được trồng ở khắp các nước nhiệt đới, và ôn đới ở cựu và tân thế giới, ngoài công dụng làm rau gia vị, cây sả còn được trồng để chiết xuất tinh dầu dùng trong thực phẩm, y học , thuốc bảo vệ thực vật và mỹ phẩm. Những nước sản xuất nhiều tinh dầu nhất là Indonesia nổi tiếng sả Java, Sri Lanka nổi tiếng với sả Sri Lanka sau đến Ấn Độ, Trung Quốc. Cây sả được trồng ở khắp nơi của nước ta nhưng diện tích trồng làm thuốc không nhiều, chỉ có tính chất gia đình và người ta chỉ dùng tươi hay phơi trong râm mát (Đỗ Tất Lợi, 2006). Ở miền nam có các tỉnh như Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang, Sóc Trăng... Chuyên ngành Vi sinh vật học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học