Hiện trạng ô nhiễm Asen trên thế giới và ở Việt Nam vẫn đang là vấn đề quan trọng, đáng quan tâm, bởi nguy hại của nước thải nhiễm Asen ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường sinh thái và đối với sức khỏe con người.
Theo như những nghiên cứu trên thế giới thì cây dương xỉ Pteris vittata được biết là loài có khả năng hấp thụ Asen cao trong thời gian ngắn. Cây dương xỉ Pteris vittata có khả năng hấp thụ được Asen có thể là do hệ sinh vật trong lá hấp thụ và chuyển hóa Asen. Qua đó tiến hành phân lập vi khuẩn có khả năng kháng chịu Asen trong lá cây dương xỉ.
Mục đích của đề tài là phân lập và định danh vi khuẩn có khả năng kháng chịu Asen trong lá cây dương xỉ. Bằng việc sử dụng phương pháp sinh hóa và PCR với đoạn mồi 16S rDNA để định danh vi khuẩn phân lập được. Kết quả nghiên cứu đã phân lập và định danh được ba chủng vi khuẩn có khả năng kháng chịu Asen trong lá cây dương xỉ là Bacillus licheniformis, Bacillus cereus và Bacillus anthracis.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP VI KHUẨN KHÁNG CHỊU ASEN
TRONG LÁ CÂY DƯƠNG XỈ
Ngành học:
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã ngành:
D420201
Chuyên ngành:
CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÔI TRƯỜNG
Sinh viên thực hiện:
TRẦN MINH XÔNG
Niên khóa:
2011 – 2015
Tháng 08 năm 2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP VI KHUẨN KHÁNG CHỊU ASEN
TRONG LÁ CÂY DƯƠNG XỈ
Hướng dẫn khoa học
Sinh viên thực hiện
TS. NGUYỄN BẢO QUỐC
TRẦN MINH XÔNG
Tháng 08 năm 2015
LỜI CẢM ƠN
Mãi khắc ghi công ơn sinh thành, nuôi nấng, dạy dỗ của ba, má và những người thân
trong gia đình đã cho con có được ngày hôm nay.
Chân thành cảm ơn
Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM, Ban chủ nhiệm bộ môn Công
nghệ Sinh học cùng toàn thể quý thầy cô đã tận tình dạy bảo và truyền đạt kiến thức cho
em trong suốt thời gian học tập tại trường.
Chân thành biết ơn sâu sắc đến quý thầy TS. Nguyễn Bảo Quốc đã tận tình chỉ bảo
và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Chân thành cảm ơn đến anh chị, các bạn ở phòng Bệnh học người cùng toàn thể lớp
DH11SM đã động viên, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện đề tài.
Sinh viên thực hiện
Trần Minh Xông
i
TÓM TẮT
Hiện trạng ô nhiễm Asen trên thế giới và ở Việt Nam vẫn đang là vấn đề quan trọng,
đáng quan tâm, bởi nguy hại của nước thải nhiễm Asen ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi
trường sinh thái và đối với sức khỏe con người.
Theo như những nghiên cứu trên thế giới thì cây dương xỉ Pteris vittata được biết là
loài có khả năng hấp thụ Asen cao trong thời gian ngắn. Cây dương xỉ Pteris vittata có
khả năng hấp thụ được Asen có thể là do hệ sinh vật trong lá hấp thụ và chuyển hóa Asen.
Qua đó tiến hành phân lập vi khuẩn có khả năng kháng chịu Asen trong lá cây dương xỉ.
Mục đích của đề tài là phân lập và định danh vi khuẩn có khả năng kháng chịu Asen
trong lá cây dương xỉ. Bằng việc sử dụng phương pháp sinh hóa và PCR với đoạn mồi
16S rDNA để định danh vi khuẩn phân lập được. Kết quả nghiên cứu đã phân lập và định
danh được ba chủng vi khuẩn có khả năng kháng chịu Asen trong lá cây dương xỉ là
Bacillus licheniformis, Bacillus cereus và Bacillus anthracis.
ii
SUMMARY
Isolater arsinic-resistant bacteria in fern leaves
Arsenic contamination is an important issue in the World and Viet Nam, because
poisonous Arsenic in waste water seriously affects the ecological environment and human
health.
According to research in the word, Pteris vittata has known for being a species that
is able to highly absorb arsenic in a short time. Pteris vittata can absorb arsenic likely due
to biomass in leaves which absoteria and metabolizes arsenic. It thereby isolates Arsenicresistant bacteria in fern leaves.
The purpose of this project is the isolation and identification of bacteria in fern
leaves that can resist arsenic. By using biochemical mathod and 16S rDNA with PCR for
identification of bacteria isolated, research results have isolated and identified the three
strains of bacteria that can resist arsenic is Bacillus licheniformis, Bacillus cereus and
Bacillus anthraci.
Keywords: arsenic-resistant, Bacillus lecheniformis, Bacillus cereus,
Bacillus anthracis, Pteris vittata
iii
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN.........................................................................................................................i
TÓM TẮT..............................................................................................................................ii
SUMMARY..........................................................................................................................iii
MỤC LỤC............................................................................................................................iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................vii
DANH SÁCH BẢNG BẢNG............................................................................................viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH..................................................................................................ix
Chương 1 MỞ ĐẦU..............................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề...............................................................................................................1
1.2. Yêu cầu của đề tài....................................................................................................2
1.3. Nội dung thực hiện...................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................................3
2.1. Tình hình chung trên thế giới về vấn đề ô nhiễm Asen...........................................3
2.2. Tình hình ô nhiễm Asen ở Việt Nam.......................................................................3
2.3.
Giới thiệu về Asen...................................................................................................4
2.4.
Sự chuyển hóa Asen trong cơ thể con người..........................................................6
2.5 Cơ chế gây độc của Asen lên cơ thể sinh vật..........................................................7
2.6. Cơ chế gây độc của Asen lên màng tế bào.............................................................8
2.7.
Nguồn gây ô nhiễm Asen........................................................................................9
2.8
Những bệnh gây ra bởi Asen.................................................................................9
2.9
Các hợp chất của Asen trong tự nhiên.................................................................11
2.10 Khái quát về cây dương xỉ...................................................................................13
2.11 Một số nghiên cứu về sử dụng cay dương xỉ để xử lí Asen.................................14
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP......................................................................16
3.1. Thời gian và địa điểm............................................................................................16
iv
3.2. Dụng cụ và vật liệu................................................................................................16
3.2.1.Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................16
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ...........................................................................................16
3.2.3. Môi trường và hóa chất...................................................................................17
3.2.3.1. Môi trường và hóa chất dùng cho phương pháp nuôi cấy............................17
3.2.3.2. Môi trường và hóa chất dùng cho phản ứng PCR.......................................17
3.3.
Phương pháp nghiên cứu......................................................................................18
3.3.1. Lấy mẫu.........................................................................................................18
3.3.2. Phân lập vi khuẩn...........................................................................................19
3.3.3. Định danh vi khuẩn...................................................................................... 19
3.3.3.1. Định danh bằng các phản ứng sinh hóa..................................................19
3.3.3.2. Định danh bằng phương pháp PCR........................................................22
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...........................................................................28
4.1. Kết quả phân lập......................................................................................................28
4.2. kết quả phân tích các chỉ tiêu sinh hóa...................................................................29
4.3. Kết quả ly trích DNA từ những mẫu vi khuẩn phân lập được...............................31
4.4. Kết quả khuếch đại trình tự rDNA 16S bằng phản ứng PCR................................31
4.5. Kết quả xác định gen arsC bằng phương pháp PCR................................ ...........33
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................34
5.1. Kết luận...................................................................................................................34
5.2. Kiến nghị.................................................................................................................34
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................................35
PHỤ LỤC............................................................................................................................36
v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BLAST: Basic local alignment sequence tool
LB:
Luria Betanni
NB:
Nutrient Broth
NCBI:
National Center for Biotechnology Information
PCR:
Polymerase Chain Reaction
UNICEF: United Nations Chiiden’s Fund
TYEG: Trytone Yeast extrat Glucose
V/P:
Voges-Proskauer
vi
DANH SÁCH BẢNG BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR 16S rDNA và PCR arsC....................................24
Bảng 3.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 16S rDNA...............................................24
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR arsC........................................................ 25
Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra sinh hóa................................................................................27
vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình
2.1 Asen tự
nhiên.............
......................
......................
......................
......................
....5
Hình 2.2 Cây dương xỉ Pteris vittata..................................................................................14
Hình 3.1 Tủ cấy vi sinh......................................................................................................17
Hình 3.2 Máy PCR.............................................................................................................17
Hình 3.3 Sơ đồ quy trình thí nghiệm.................................................................................18
Hình 4.1 Hình ảnh các vi khuẩn phân lập được.................................................................28
Hình 4.2 Kết quả nhuộm Gram và catalase........................................................................30
Hình 4.3 Kết quả catalase dương tính................................................................................30
Hình 4.3 Kết quả chạy PCR với cặp mồi 63F – 1489R......................................................32
viii
Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1.
Đặt vấn đề
Hiện trạng ô nhiễm môi trường nói chung, trong đó ô nhiễm môi trường đất, nước
đặt biệt nghiêm trọng, một số tác nhân làm cho môi trường ô nhiễm là do hoạt động trong
nông nghiệp, trong các nghành công nghiệp. Trong đó vấn đề ô nhiễm kim loại nặng như
ô nhiễm Asen, kẽm, chì, đang ảnh hưởng xấu đến môi trường sống của con người và một
số loài sinh vật khác, trong đó ô nhiễm Asen đang ngày càng trở nên nghiệm trọng và ảnh
hưởng lớn đến tự nhiên và con người, nguyên nhân gây ô nhiễm Asen là do hoạt động
nông nghiệp như lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật, bởi vì trong thuốc bảo vệ thực vật có
chưa Asen, khi sử dụng các loại thuốc này sẽ làm tăng hàm lượng Asen trong đất, nước ở
khu vực đó. Ngoài ra trong hoạt động công nghiệp cũng xả thải ra môi trường một lượng
Asen và hợp chất của nó. Làm cho môi trường bị ô nhiễm nghiêm trọng. Nếu con người
sử dụng nước có chứa Asen vượt quy định thì sẻ ảnh hưởng rất lớn tới sức khỏe, tùy vào
mức độ phơi nhiễm Asen mà có thể gây ra tác hại tức thì như gây buồn nôn, chóng mặt,
rối loạn nhịp tim,… hoặc ảnh hưởng lâu dài như ưng thư da, ung thư phổi, ảnh hưởng tới
hệ thần kinh,… và nếu nhiễm một lượng lớn Asen có thể gây tử vong.
Hiện nay trên thế giới và Việt Nam có một số phương pháp xử lý Asen như: hấp thụ
Asen bằng sắt hyroxit, xử lý Asen bằng rỉ sắt kim loại, xử lý bằng nhôm hoạt động, xử lý
bằng các vật liêu đi từ mangan, ngoài các biện pháp xử lý Asen bằng các chất hóa học thì
việc sử dụng thực vật để hấp thụ Asen cũng được áp dụng, loài thực vật điển hình xử lý
Asen là cây dương xỉ. Các nhà khoa học đã tìm thấy loải dương xỉ có tên Pteris vittata
(dương xỉ diều hâu) có thể hút Asen chứa trong nước, làm giảm nồng độ Asen gần bằng
100 lần trong vòng 24 tiếng (Elless và ctv). Qua đó ta thấy cây dương xỉ diều hâu là một
loài siêu tích lũy Asen, nhưng việc áp dụng phương pháp này trong xử lý Asen chưa thật
sự hiệu quả, vì phương pháp này chỉ áp dụng xử lý trong hoạt động nông nghiệp và trong
sinh hoạt, chứ chưa áp dụng rộng rãi với quy mô lớn trong công nghiệp, và việc xử lý
sinh khối cây dương xỉ làm sao không ô nhiễm môi trường cũng gặp khó khăn. Xuất phát
từ những vấn đề trên, đề tài “phân lập vi khuẩn kháng chịu Asen trong lá cây dương xỉ”
1
đã được thực hiê ên nhằm mục đích phân lập và xác định vi khuẩn có khả năng kháng chịu
Asen trong lá cây dương xỉ.
1.2. Yêu cầu của đề tài
Phân lập một số chủng vi khuẩn kháng chịu được Asen trong lá cây dương xỉ.
Thiết lập quy trình PCR trong việc định danh chủng vi khuẩn kháng chịu được
Asen trong lá cây dương xỉ bằng việc sử dụng đoạn mồi 16S rDNA.
Định danh chủng vi khuẩn đó bằng một số biện pháp sinh hóa và sinh học phân tử.
1.3. Nội dung thực hiện
Phân lập vi khuẩn có trong lá cây dương xỉ.
Thử khả năng kháng chịu Asen của vi khuẩn trên môi trường thạch có arsenate.
Định danh các chủng vi sinh vật bằng phương pháp sinh hóa và PCR.
Xác định sự hiện diện của gen arsC bằng phương pháp PCR.
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tình hình chung trên thế giới về vấn đề ô nhiễm Asen
Cuộc khủng hoảng thạch tín bắt đầu nhen nhóm từ năm 1983 khi mà tại Bang Tây
Bengal của Ấn Độ người ta đã phát hiện trên 2 000 000 ca nhiễm độc Asen và trên một
2
triệu người đang nằm trong vùng bị phơi nhiễm. Tại Bangladesh, đất Nước dẫn đầu về số
lượng giếng khoan bơm tay của khu vực Châu Á từ năm 1993 sự nhiễm độc nước giếng
do Asen càng được khẳng định và tới nay đã có khoảng 35 đến 77 triệu người có nguy cơ
bị ngộ độc. Tổ chức Y tế thế giới mô tả sự kiện này là “một thảm họa môi trường lớn nhất
từ trước tới nay”.
Từ những năm đầu thập niên 10 của thế kỷ XX. Nguồn nước ngầm từ những giếng
khoan được coi là không bị ô nhiễm bởi các sinh vật gây bệnh và các chất hữu cơ, nguồn
nước này đã được đưa vào sử dụng, cung cấp nước sinh hoạt cho cộng đồng dân cư, thay
thế dần cho việc sử dụng nước bề mặt. Song ở một số vùng, nguồn nước này chứa các
kim loại nặng như: Chì, Mangan, đặc biệt là Asen với nồng độ cao, đáng lo ngại.
Theo số liệu của tổ chức y tế thế giới về ô nhiễm Asen trong nguồn nước, nồng độ
Asen trong khu vực Nam Lowa và Tây Missouri của Mỹ dao động từ 0,034 – 0,490 mg/l,
Mexico từ 0,008 – 0,624 mg/l,…
Ở Trung Quốc, trường hợp bệnh nhân nhiễm độc Asen đầu tiên được phát hiện từ
năm 1953. Đến năm 1993 mới có 1546 nạn nhân của căn bệnh Asenicosis (bệnh nhiễm
độc Asen) nhưng cho đến thơi điểm này đã phát hiện 13 000 bệnh nhân trong số 558 000
người được kiểm tra ở 462 làng thuộc 47 vùng bị liệt vào khu vực nhiễm Asen cao. Trên
cả nước Trung Quốc có tới 13 – 14 triệu người sống trong những vùng có nguồn gốc bị ô
nhiễm Asen cao, tập trung nhiều nhất ở tỉnh An Huy, Sơn Tây, Nội Mông, Ninh Hạ, Tân
Cương. Tại Sơn Tây đã phát hiện 105 làng bị ô nhiễm Asen. Hàm lượng Asen tối đa thu
được trong nước uống là 4,43 mg/l gấp tới 443 lần giá trị Asen cho phép của tổ chức y tế
thế giới WHO (10 µg/l).
2.2. Tình hình ô nhiễm Asen ở Việt Nam
Ở Việt Nam vào đầu những năm 1990, vấn đề ô nhiễm Asen được biết đến qua các
nghiên cứu của Viện Địa Chất và các liên đoàn địa chất về đặc điểm địa chất thủy văn và
đặc điểm phân bố Asen trong tự nhiên. Theo nghiên cứu khảo sát phân tích nước bề mặt
và các nguồn nước đổ ra sông Mã ở khu vực Đông Nam bản Phúng, hàm lượng Asen
trong các mẫu nước đều vượt quá 0,05 mg/l. Kết hợp với trường đại học Y Hà Nội cho
thấy sự ô nhiễm này có khả năng ảnh hưởng đến sức khỏe dân cư khu vực đó.
3
Từ những năm 1995 - 2000, nhiều công trình nghiên cứu điều tra về nguồn gốc Asen
có trong nước ngầm, mức độ ô nhiễm, chu trình vận chuyển,… đã tìm thấy nồng độ Asen
trong các mẫu nước khảo sát ở khu vực thượng lưu sông Mã, Sơn La, Phú Thọ, Bắc
Giang, Hưng Yên, Hà Nội, Hà Nam, Nam Định, Thanh Hóa,… đều vượt tiêu chuẩn cho
phép đối với nước sinh hoạt của Quốc Tế và Việt Nam.
Từ những kết quả phân tích đó, bộ y tế tiến hành điều tra, đánh giá sơ bộ về ảnh
hưởng của Asen tới sức khỏe cộng đồng dân cư và phát hiện 13 trường hợp bị nhiễm độc
Asen mãn tính ở giai đoạn sớm với các biểu hiện bệnh ngoài da như: dày sừng, “nhú
sừng”, biến đổi sắc tố (tăng, giảm hoặc kết hợp cả 2 dạng) có những nét đặc trưng của
biến đổi ngoài da do Asen, hàm lượng Asen trong nước tiểu và tóc rất cao.
Theo đánh giá mới đây của một số chuyên gia thì địa phương có người nhiễm Asen
nhất chính là Hà Nội mở rộng hiện nay. Rất nhiều nơi qua kiểm tra cho thấy mức nhiễm
vượt quá hàng chục lần cho phép. Ô nhiễm hầu hết là các giếng nhỏ gia đình, riêng đồng
bằng Bắc Bộ có khoảng 5 triệu chiếc giếng như vậy. Đánh giá của UNICEF còn cho thấy,
khu vực phía nam Hà nội (cũ) ô nhiễm Asen nặng nhất, thậm chí đứng đầu danh sách các
địa chỉ ô nhiễm Asen trên toàn quốc, đặc biệt một số khu vực thuộc phường Quỳnh Lôi
(quận Hai Bà Trưng). Khu vực Thanh Trì. Và khu vực Hà Nội mở rộng hiện nay bao gồm
cả Hà Nội cũ và Hà Tây cũ đều nằm trong danh sách có nguồn nước bị nhiễm Asen cao
như xã Đông Lỗ (Ứng Hòa), Liên Phương, Khánh Hà (Thường Tín). Thọ Xuân (Đan
Phượng), Phương Trung (Thanh Oai).
2.3.
Giới thiệu về Asen
Asen hay còn gọi là thạch tín, một nguyên tố hóa học có ký hiệu As, số nguyên tử là
33. Asen lần đầu được Albertus Magnus (Đức) viết về nó vào năm 1250. Khối lượng
nguyên tử của nó bằng 74,92. Asen là một á kim gây ngộ độc khét tiếng và có nhiều dạng
thù hình: màu vàng (phân tử phi kim) và một vài dạng màu đen và xám (á kim) chỉ là số ít
mà người ta có thể nhìn thấy. Ba dạng có tính kim loại của Asen với cấu trúc tinh thể khác
nhau cũng được tìm thấy trong tự nhiên (các khoáng vật asen sensu stricto và hiếm hơn là
asennolamprit cùng parasenolamprit), nhưng nói chung nó hay tồn tại dưới dạng các hợp
chất Asenua và asenat. Vài trăm loại khoáng vật như thế đã được biết tới. Asen và các hợp
4
chất của nó được sử dụng như là thuốc trừ dịch hại, thuốc trừ cỏ, thuốc trừ sâu và trong
một các loại hợp kim.
Asen về tính chất hóa học rất giống với nguyên tố đứng trên nó là photpho. Tương
tự như photpho, nó tạo thành các oxit kết tinh, không màu, không mùi như As 2O3 và
As2O5 là những chất hút ẩm và dễ dàng hòa tan trong nước để tạo thành các dung dịch có
tính axit. Axit asenic (III), tương tự như axit photphoric, là một axit yếu. Tương tự như
photpho, Asen tạo thành hidrua dạng khí và không ồn định, đó là arsin (AsH 3). Sự tương
tự lớn đến mức Asen sẽ thay thế phần nào cho photpho trong các phản ứng hóa sinh học
và vì thế nó gây ra ngộ độc. Tuy nhiên, ở các liều thấp hơn mức gây ngộ độc thì các hợp
chất Asen hòa tan lại đóng vai trò của các chất kích thích và đã từng phổ biến với các liều
nhỏ như là các loại thuốc chữa bệnh cho con người vào giữa thế kỷ XVIII.
Hình 2.1 Asen tự nhiên. (nguồn: vi.wikipedia.org).
Khi bị nung nóng trong không khí, nó bị oxi hóa để tạo ra trioxit asen, hơi từ phản
ứng này có mùi như mùi tỏi. Mùi này cũng có thể phát hiện bằng cách đập các khoáng vật
asenua như asenopyrit bằng búa. Asen (và một số hợp chất của Asen) thăng hoa khi bị
nung nóng ở áp suất tiêu chuẩn, chuyển hóa trực tiếp thành dạng khí mà không chuyển
qua trạng thái lỏng. Trạng thái lỏng xuất hiện ở áp suất 20 atmotphe trở lên, điều này giải
thích tại sao điểm nóng chảy lại cao hơn điềm sôi. Asen nguyên tố được tìm thấy ở nhiều
dạng thù hình rắn: dạng màu vàng thì mềm, dẻo như sáp và không ổn định, và nó làm cho
các phân tử dạng tứ diện As4 tương tự như các phân tử của photpho trắng. Các dạng màu
5
đen, xám hay ‘kim loại’ hơi có cấu trúc kết tinh thành lớp với các liên kết trả rộng khắp
tinh thể. Chúng là các chất bán dẫn cứng với ánh kim.
Asen là một trong những chất có độc tính cao. Con người có thể bị phơi nhiễm Asen
qua hít thở không khí, hấp thụ thức ăn và qua nước uống. Một lượng nhỏ Asen trong nước
có thể đe dọa đến sứa khỏe con người bởi vì phần lớn các hợp chấ Asen trong nước uống
đều ở dạng vô cơ rất độc (Abernathy và ctv, 2003). Hầu hết sự nhiễm Asen được phát hiện
sau quá trình phơi nhiễm Asen trong nước uống. Lý do chính cho tình trạng này là hầu hết
các hợp chất Asen trong thức ăn thường ở dạng hữu cơ và ít độc hoặc không độc. Trong
nhiều trường hợp, sự phơi nhiễm Asen từ nước uống là phơi nhiễm với các hợp chất Asen
vô cơ rất độc và phơi nhiễm với nồng độ cao (Winski, 1995). Hai dạng tồn tại chính của
Asen vô cơ được tìm thấy trong môi trường là arsenite (Asen hóa trị III) và arsenate
(Asen hóa trị V) (Abernathy và ctv, 2003).
2.4 Sự chuyển hóa của Asen trong cở thể con người
Trong cơ thể người, cũng như hầu hết động vật có vú, Asen vô cơ bị methyl hóa tạo
thành acid monomethylarsonic và dimethylarsinic bởi phản ứng khử luân phiên Asen từ
hóa trị V thành hóa trị III và gắn thêm một nhóm methyl. Nhiều năm qua, người ta tin
rằng độc tính cấp của Asen vô cơ mạnh hơn Asen hữu cơ. Do đó, sự methyl hóa Asen vô
cơ được xem là một phản ứng khử độc Asen (Vahter, 2002).
Trong tế bào, Asen tồn tại ở các dạng hóa trị +5, +3, 0 và -3 có thể tạo phức với các
kim loại và liên kết hóa trị với carbon, hydrogen và sulfur (Feguson và Gavis, 1972). Bởi
vì các thuộc tính sinh hóa của arsenate tương tự như phosphate, cho nên arsenate có thể
thay thế các gốc phosphate trong các phản ứng phosphoryl chuyển hóa năng lượng. Kết
quả là tạo nên các adenosine diphosphate (ADP)-arsenate thay vì tạo thành adenosine
triphosphate (ATP) (Gresser, 1981). Tuy nhiên, nồng độ để thực hiện phản ứng tạo thành
ADP-arsenate thường cao, vào khoàng 0,8 mM arsenste (Moore và ctv, 1983). Asen còn
được biết là hợp chất có khả năng tạo nên các superoxide, một hợp chất có tính oxi hóa
mạnh (Barchowsky và ctv, 1999; Lym và ctv, 2000). Nếu một lượng lớn superoxide được
tạo ra trong tế bào tuyến tụy, thì quá trình tiết insuline sẽ bị ảnh hưởng (Tseng, 2004).
6
Đối với tế bào, có một vài báo cáo chỉ ra rằng các hợp chất Asen gây ảnh hưởng đến
cấu trúc và chức năng của màng, đặc biệt là đối với màng tế bào hồng cầu (Zang và ctv,
2000); Winski và ctv, 1997, 1998).
2.5 Cơ chế gây độc của Asen lên cơ thể sinh vật
Asen tự do cũng như hợp chất của nó rất độc. Trong hợp chất thì hợp chất của Asen
(III) là độc nhất. Tổ chức Y tế thế giới đã xếp Asen vào nhóm độc loại A gồm: Thủy ngân,
chì, Selen, Cadimi, Asen. Người bị nhiễm độc Asen thường có tỷ lệ bị đột biến nhiễm sắc
thể rất cao. Ngoài việc gây nhiễm độc cấp tính Asen còn gây độc mãn tính do tích lũy
trong gan với các mức độ khác nhau, liều gây tử vong là 0,1 g (tính theo As 2O3).
Từ lâu, Asen ở dạng hợp chất vô cơ đã được sử dụng làm chất độc (thạch tín), một
lượng lớn Asen loại này có thể gây chết người, mức độ nhiễm nhẹ hơn có thể thương tổn
các mô hay các hệ thống của cơ thể. Asen có thể gây 19 loại bệnh khác nhau, trong đó có
các bệnh nan y như ung thư da, phổi.
Sự nhiễm độc Asen được gọi là arsenicosis. Đó là một tai họa môi trường đối với
sức khỏe con người. Những biểu hiện của nhiễm độc Asen là chứng sạm da (melanosis),
dày biểu bì (kerarosis), từ đó dẫn đến hoại thư hay ưng thư da, viêm răng, khớp. Hiện tại
trên thế giới chưa có phương pháp hữu hiệu chữa bệnh nhiễm độc Asen.
Asen ảnh hưởng đối với thực vật như một chất ngăn cản quá trình trai đổi chất, làm
giảm năng suất cây trồng.
Tổ chức Y tế thế giới đã hạ thấp nồng độ giới hạn cho phép của Asen trong nước cấp
uống trực tiếp xuống 10 µg/l. USEPA và cộng đồng châu Âu cũng đề xuất hướng tới đạt
tiêu chuẩn Asen trong nước cấp uống trực tiếp là 2 – 20 µg/l. Nồng độ giới hạn của Asen
theo tiêu chuẩn nước uống của Đức là 10 µg/l.
Cơ chế gây độc của Asen là nó tấn công vào nhóm sulfuahydryl của enzyme làm cản
trở hoạt động của enzyme.
Asen (III) ở nồng độ cao làm đông tụ các protein do Asen (III) tấn công vào liên kết
có nhóm sunphua.
Tóm lại, tác dụng hóa sinh chính của Asen là: làm đông tụ protein, tạo phức với
coenzyme và phá hủy quá trình photphat tạo ra ATP.
7
Hàm lượng Asen trong cơ thể người khoảng 0,08 – 0,2 ppm, tổng lượng Asen có
trong người bình thường khoảng 1,4 mg. Asen tập trung trong gan, thận , hồng cầu,
homoglobin và đặc biệt tập trung trong não, xương, da, phổi, tóc. Hiện nay người ta có
thể dựa vào hàm lượng Asen trong cơ thể con người để tìm hiểu hoàn cảnh và môi trường
sống, như hàm lượng Aasen trong tóc nhóm dân cư khu vực nông thôn trung bình là 0,4 –
1,7 ppm, khu vực thành phố công nghiệp 0,4 – 2,1 ppm, còn khu vực ô nhiễm nặng 0,6 –
4,9 ppm.
Độc tính của các hợp chất Asen, arsenat, arsenit đối với cơ thể sinh vật dưới nước
tăng dần theo dãy Asen hợp chất hữu cơ. Trong môi trường sinh thái, các dạng hợp chất
Asen hóa trị (III) có độc tính cao hơn dạng hóa trị (V). Môi trường khử là điều kiện thuận
lợi để cho nhiều hợp chất Asen hóa trị V chuyển sang Asen hóa trị III. Trong những hợp
chất Asen thì H3AsO3 độc hơn H3AsO4. Dưới tác dụng của các yếu tố oxi hóa trong đất thì
H3AsO3 có thể chuyển thành dạng H3AsO4.
2.6 Cơ chế gây độc của Asen lên màng tế bào
Màng tế bào được xem như là một “bức tường” chống lại sự tấn công của chất độc
(Zang và ctv, 2000). Để hiểu sâu hơn về các phản ứng của màng với độc chất, các thí
nghiệm được tiến hành bằng cách sử dụng liposome làm đối tượng nghiên cứu và độc
chất ở đây vẫn được sử dụng là arsenate. Các kết quả thí nghiệm cho thấy liposome bị phá
hủy bởi arsenate. Điều này được xem như là một bằng chứng cho thấy arsenic đã liên kết
với liposome và tác động trực tiếp lên chúng. Tuy nhiên, liên kết hóa học của arsenic với
các phân tử PCPC liposome có thể đã diễn ra sau khi chúng liên kết một cách lỏng lẻo với
liposome. Arsenic liên kết với màng ở mức khá cao ngay khi bắt đầu quá trình tương tác
cho thấy sự kiên kết nhanh chóng của arsenate trong dung dịch màng. Sự giải phóng sau
khi liên kết nhanh cũng có thể xuất phát từ động thái chuyển arsenic từ các vị trí ưu tiên
trên màng đến các dạng bền vững hơn ở trên màng và trong tế bào chất (Winski và Barbe,
1995). Một báo cáo khoa học gần đây về Asen (III) cho thấy arsenite có lẽ tạo các liên
kết
hydrogen
trực
tiếp
với
nhóm
phosphate
của
các
phân
tử
dimyristoylphosphatidylcholine (DMPE) trong quá trình cạnh tranh với các phân tử nước
hydrate hóa cũng như các nhóm amino. Sự giảm tương tác giữa các nhóm PE – PE sẽ làm
8
giải phóng các nhóm phosphate và do đó độ linh hoạt của lipid sẽ tăng lên trên bề mặt
màng liposome. Do đó, arsenic chèn vào những chỗ trống để lại trên bề mặt ưa nước của
màng tế bào (Suwalsky và ctv, 2007).
2.7. Nguồn gây ô nhiễm Asen
Với tình trạng sử dụng Asen trong chế tạo thuốc trừ sâu dùng nhiều trong nông
nghiệp, qua thời gian lượng hóa chất này ngấm dần trong lòng đất xuống mạch nước
ngầm, rồi từ mạch nước ngầm bơm lên lấy nước sử dụng. Lâu dần qua thời gian lượng
Asen tích tụ trong cơ thể và gây nguy hại cho sức khỏe con người.
Asen có và thoát ra từ đất đá nhưng không phải nơi nào cũng có sẵn chất này. Quan
trọng hơn là nhiễm Asen trong nguồn nước lại do con người gây ra từ thuốc phun hoa
quả, khi sản xuất vải vóc, vũ khí, trong thuốc trừ sâu, và các dược phẩm, từ các nguồn
nước nhiễm bẩn khác của các nhà máy hóa chất dẫn vào các mạch nước ngầm. Việt Nam
sử dụng lượng rất lớn thuốc bảo vệ thực vật, phân bón chứa Asen làm phát tán Asen vào
nước.
2.8. Những bệnh gây ra bởi Asen
Asen xâm nhập vào con người qua con đường nước uống, không khí trong vùng ô
nhiễm, nhiễm da do tiếp xúc nhiều liên tục với nguồn nước, không khí ô nhiễm. Vào
trong cơ thể con người Asen thường tích tụ trong não, các mô da, móng tay, tóc, răng,
xương và trong các bộ phận giàu biểu mô như niêm mạc vòm miệng, thực quản, dạ dày,
ruột non gây nhiễm độc cấp tính cao. Nhưng sự xâm nhập Asen qua đường ăn uống mới
là nguy hiểm nhất. Dù ở mức độ nào đi nữa vì nó diễn ra hằng ngày, theo con đường tiêu
hóa mà nước trong cơ thể chiếm tỉ lệ cao. Khi tích tụ trong cơ thể như vậy thì nó tác động
gây ra bệnh.
Theo nhiều nhà khoa học Asen có thể gây ra tới 19 loại bệnh khác nhau. Nếu bị
nhiễm độc Asen với liều lượng dù nhỏ nhưng tích tụ trong thời gian dài, sau 5 - 10 năm,
sẽ gây mệt mỏi, buồn nôn, hồng cầu và bạch cầu giảm. Hai loại bệnh phổ biến nhất do
Asen gây ra là ung thư da và phổi. Nhiều nơi có hội chứng xạm da, sừng hóa bẩm sinh
gan bàn tay. Thay đổi sắc tố da, phát sinh các điểm tối diểm sáng trong lòng bàn tay, chân,
gây sừng cứng và hoại tử.
9
Tích tụ Asen lâu ngày gây nên da mặt xạm, rụng tóc, giảm trí nhớ, mạch máu bị tổn
thương, bệnh rối loạn nhịp tim, đau mắt, đau tai, bệnh viêm dạ dày và ruột làm kiệt sức,
gây mụn loét, bệnh ung thư, bệnh gây cảm giác về sự di động bị rối loạn, bệnh tiểu
đường. Người uống nước ô nhiễm Asen lâu ngày sẽ có triệu chứng các đốm sẫm màu trên
thân thể hay đầu các chi, niêm mạc lưỡi hoặc sừng hóa da, gây sạm và mất saắc tố.
Nguồn nước bị nhiễm Asen dù nhỏ củng ảnh hưởng đến sức khỏe các bà mẹ,làm
động thai ảnh hưởng đến thai nhi và gây ra những bệnh phổi ác tính, những tác động xấu
lên sự phát triển thể chất và trí tuệ của trẻ con mới lớn.
Nếu nồng độ Asen cao trong nguồn nước thì khi uống vào có thể gây ngộ độc cấp
tính, gây ung thư, thậm chí có thể chết ngay.
Nhiễm độc cấp tính
Qua đường tiêu hóa: Khi anhydrit arsenous hoặc chì arsenate vào cơ thể sẽ biểu hiện
các triệu chứng nhiễm độc như rối loạn tiêu hóa (đau bụng, nôn, bỏng, khô miệng, tiêu
chảy nhiều và cơ thể bị mất nước,...). Bệnh cũng tương tự như bệnh tả có thể dẫn tới tử
vong từ 12 – 18 giờ. Trường hợp nếu còn sống, nạn nhân có thể bị viêm da tróc vảy và
viêm dây thàn kinh ngoại vi. Một tác động đặc trưng khi bị nhiễm độc Asen dạng hợp
chất vô cơ qua đường miệng là sự xuất hiện các vết màu đen và sáng trên da.
Qua dường hô hấp (hít thở không khí có bụi, khói hoặc hơi Asen): Có các triệu
chứng như: kích ứng các đường hô hấp với biểu hiện ho, đau khi hít vào, khó thỏ, rối loạn
thần kinh như nhức đầu, chóng mặt, đau các chi, hiện tượng xanh tím mặt được cho là tác
dụng gây liệt của Asen đối với các mao mạch. Ngoài ra còn có các tổn thương về mắt
như: viêm da mí mắt, viêm kết mạc.
Nhiễm độc mãn tính
Nhiễm độc Asen mãn tính có thể gây ra các tác dụng toàn thân và cục bộ. Các triệu
chứng nhiễm độc Asen mãn tính xảy ra sau 2 – 8 tuần, biểu hiện như sau:
Tổn thương da, biểu hiện: Ban đỏ, sần và mụn nước, các tổn thương kiểu loát nhất là
ở các phần da hở, tăng sừng hóa gan bàn tay và bàn chân, nhiễm sắc (đen da do Asen),
các vân trắng ở móng (gọi là đám vân Mess).
10
- Xem thêm -