Tài liệu Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose từ dạ cỏ của dê (capra aegagrus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CELLULOSE TỪ DẠ CỎ CỦA DÊ (Capra aegagrus) CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ThS. VÕ VĂN SONG TOÀN TS. TRẦN NHÂN DŨNG SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN THANH THÚY MSSV: 3077115 LỚP: CNSH K33 Cần Thơ, Tháng 11/2010 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS. Võ Văn Song Toàn Nguyễn Thanh Thúy TS. Trần Nhân Dũng DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Lời đầu tiên tôi xin chân thành cám ơn xin sâu sắc đến thầy Võ Văn Song Toàn và thầy Trần Nhân Dũng-Viện NC & PT Công nghệ Sinh học, đã tận tình hướng dẫn, bổ sung kiến thức và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện luận văn. Mãi không quên công ơn cô Nguyễn Thị Liên-cố vấn học tập lớp Công nghệ Sinh học khóa 33, đã luôn quan tâm, động viên và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong thời gian thực hiện luận văn. Đồng cảm ơn cô Dương Thị Hương Giang và chị Nguyễn Thị Xuân Dung - cán bộ phòng thí nghiệm Công Nghệ Enzyme, Viện NC & PT Công nghệ Sinh học đã đóng góp ý kiến trong quá trình tôi thực hiện luận văn. Xin cảm ơn thầy Lê Thanh Hùng-Phòng thí nghiệm (PTN) Hóa sinh thực phẩm, cán bộ phòng thí nghệm Vi sinh Thực phẩm, anh chị cán bộ PTN Vi sinh môi trường, đã giúp đỡ, hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô thuộc Viện NC và PT Công nghệ Sinh học-Trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình giảng dạy, truyền thụ những kiến thức quý báo trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa học. Cám ơn gia đình đã động viên, khuyến khích, hỗ trợ cho tôi về mặt vật chất và đặc biệt là đời sống tinh thần trong suốt quá trình tôi sinh sống và học tập. Luôn ghi nhớ những tình cảm chân thành và sự nhiệt tình giúp đỡ của các bạn CNSH K33, các anh chị CNSH K32 TT đồng làm luận văn ở PTN Công nghệ enzyme. Kính gửi những lời tri ân sâu sắc và lời chúc tốt đẹp nhất đến gia đình, quý thấy cô, các anh chị cùng với toàn thể bạn bè. Xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến sự quan tâm và giúp đỡ quý báu này! Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thanh Thúy Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 33 – 2010 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Đề tài “Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose từ dạ cỏ của dê (Cabra aegagrus)” được thực hiện nhằm mục tiêu làm phong phú thêm nguồn giống vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose và tuyển chọn những dòng vi khuẩn có hoạt tính cao. Kết quả có 32 dòng vi khuẩn được phân lập từ dạ cỏ dê (Cabra aegagrus) ở thành phố Long Xuyên tỉnh An Giang, bao gồm 21 dòng vi khuẩn kỵ khí và 11 dòng hiếu khí. Các dòng vi khuẩn phân lập được nuôi cấy trên môi trường khoáng: 0,1% (NH4)2SO4, 0,05% MgSO4.7H2O, 0,1% K2HSO4, 0,0001% NaCl và 0,5% bột rơm. Các dòng vi khuẩn phân lập được có một dòng có dạng hình que, còn lại đều là hình cầu. Hoạt tính phân giải rơm của các dòng vi khuẩn được kiểm tra sơ bộ bởi phương pháp nhuộm với Congo Red, 20 dòng vi khuẩn có khả năng tạo đường kính thủy phân, trong đó 2 dòng vi khuẩn có kí hiệu P7H và P2K có đường kính thủy phân lớn nhất lần lượt là 3,8 cm và 3,1 cm. Tất cả 32 dòng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường bột rơm lỏng (M2). Kết quả cho thấy dòng P2K có hoạt tính CMCase (0,03U/ml) cao nhất so với các dòng còn lại. Bên cạnh đó, dòng vi khuẩn D7K cho thấy khả năng phân giải bột rơm là 16,51%. Từ khóa: Cellulase, phân lập vi khuẩn, bột rơm, dạ cỏ dê. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 33 – 2010 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT.......................................................................................... LỜI CẢM TẠ .................................................................................................. TÓM LƯỢC ................................................................................................... i MỤC LỤC ..................................................................................................... ii DANH SÁCH BẢNG.................................................................................... iv DANH SÁCH HÌNH .................................................................................... iv CÁC CHỮ VIẾT TẮC ............................................................................... viii CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU........................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu đề tài ...........................................................................................2 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU....................................................... 3 2.1. Tổng quan về hệ tiêu hóa của dê............................................................ 3 2.2. Tổng quan về rơm rạ.............................................................................. 3 2.3. Khái quát về cellulose và cellulase ......................................................... 4 2.3.1 Thành phần và cấu trúc cellulose .................................................... 4 2.3.2 Enzyme cellulase ............................................................................ 5 2.4. Cơ chế quá trình phân hủy cellulose...................................................... 8 2.4.1 Cơ chế quá trình oxy hóa cellulose (phân hủy hiếu khí) .................. 8 2.4.2 Cơ chế của quá trình phân hủy cellulose trong điều kiện kỵ khí ...... 8 2.5. Vi sinh vật phân hủy cellulose................................................................ 8 2.5.1 Các vi sinh vật phân hủy cellulose trong điều kiện hiếu khí ............ 8 2.5.2 Những vi sinh vật phân hủy cellulose trong điều kiện kỵ khí........... 9 2.6. Các Phương pháp vi sinh ..................................................................... 10 2.6.1 Phương pháp pha loãng vi sinh vật................................................ 10 2.6.2 Phương pháp đếm mật số vi sinh vật bằng phương pháp đếm sống .............................................................................................................. 10 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 33 – 2010 Trường ĐHCT 2.6.3 Phương pháp đo đường kính thủy phân ......................................... 10 2.7. Các phương pháp phân tích sinh hóa .................................................. 10 2.7.1 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford............................ 10 2.7.2 Khảo sát hàm lượng đường khử sinh ra bằng phương pháp Nelson-Somogyi ............................................................... 11 2.8. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước .......................... 11 2.8.1 Tình hình nghiên cứu trong nước .................................................. 11 2.8.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................ 12 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... 14 3.1. Phương tiện nghiên cứu ....................................................................... 14 3.1.1 Thời gian, địa điểm ....................................................................... 14 3.1.2 Nguyên vật liệu............................................................................. 14 3.1.3 Thiết bị, hóa chất .......................................................................... 14 3.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 15 3.2.1 Mục đích thí nghiệm ..................................................................... 15 3.2.2 Chuẩn bị mẫu vật và môi trường nuôi cấy ..................................... 15 3.2.3 Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn................................................... 17 3.2.4 Thí nghiệm 2: Kiểm tra khả năng phân giải bột rơm của các dòng vi khuẩn đã phân lập......................................................................................... 22 3.2.5 Thí nghiệm 3: Khảo sát hàm lượng protein trong dịch nuôi vi khuẩn bằng phương pháp Bradford........................................................................ 24 3.2.6 Thí nghiệm 4: Khảo sát hoạt tính cellulase trong dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng phương pháp Nelson-Somogyi. ................................................ 25 3.2.7 Thí nghiệm 5: Đánh giá khả năng phân giải bột rơm bởi các dòng vi khuẩn sau khi phân lập có hoạt tính mạnh .................................................... 25 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................. 277 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn phân giải cellulose trên cơ chất rơm....... 27 4.1.1 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn............................................. 27 4.1.2 Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn đã phân lập ................ 28 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 33 – 2010 Trường ĐHCT 4.2. Kết quả kiểm tra khả năng thủy phân bột rơm của các dòng vi khuẩn đã phân lập ...................................................................................................... 35 4.3. Khảo sát hàm lượng protein trong dịch trích enzyme của vi khuẩn bằng phương pháp Bradford .............................................................................. 37 4.4. Khảo sát hoạt tính cellulase trong dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng phương pháp Nelson Somogyi ................................................................................. 40 4.5. Đánh giá khả năng phân giải bột rơm bởi các dòng vi khuẩn............ 42 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................... 44 5.1. Kết luận................................................................................................. 44 5.2. Đề nghị .................................................................................................. 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................... 45 PHỤ LỤC......................................................................................................... Phụ lục 1: Các phương pháp vi sinh 1. Phương pháp pha loãng. 2. Phương pháp kiểm tra hoạt tính cellulase bằng đường tròn thủy phân. Phụ lục 2: Các phương pháp sinh hóa 1. Phương pháp Bradrford. 2. Phương pháp Nelson. Phụ lục 3: Kết quả thí nghiệm 1. Bảng 16. Mật số vi khuẩn hiếu khí trước và sau 3 ngày nuôi 2. Bảng 17. Mật số vi khuẩn kỵ khí trước và sau 3 ngày nuôi 3. Bảng 18. Kết quả đường kính vòng halo của 11 dòng vi khuẩn kỵ khí 4. Bảng 19. Kết quả đường kính vòng halo của 21 dòng vi khuẩn hiếu khí 5. Bảng 20. Đường chuẩn BSA thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với độ hấp thụ OD 595nm 6. Bảng 21. Hàm lượng protein trong dịch nuôi vi khuẩn hiếu khí sau 3 ngày 7. Bảng 22. Hàm lượng protein trong dịch nuôi vi khuẩn kỵ khí sau 3 ngày 8. Bảng 23. Đường chuẩn glucose Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 33 – 2010 Trường ĐHCT 9. Bảng 24. Hoạt tính enzyme CMCase của 21 dòng vi khuẩn hiếu khí 10. Bảng 25. Hoạt tính enzyme Avicelase của 21 dòng vi khuẩn hiếu khí 11. Bảng 26. Hoạt tính enzyme CMCase của 11 dòng vi khuẩn kỵ khí 12. Bảng 27. Hoạt tính enzyme avicelase của 21 dòng vi khuẩn kỵ khí 13. Bảng 28. Khả năng phân giải bột rơm (%) sau 5 ngày ủ bởi 5 dòng vi khuẩn Phụ lục 4: Số liệu thống kê 1. Kết quả thống kê thí nghiệm 2 1.1. Kết quả phân tích đường kính thủy phân bột rơm của 21 dòng vi khuẩn hiếu khí. 1.2. Kết quả thống kê phần trăm thủy phân bột rơm của 21 dòng vi khuẩn hiếu khí. 1.3. Kết quả phân tích đường kính thủy phân bột rơm của 11 dòng vi khuẩn kỵ khí. 1.4. Kết quả thống kê phần trăm thủy phân bột rơm của 11 dòng vi khuẩn kỵ khí. 2. Kết quả thống kê thí nghiệm 3 2.1. Kết quả thống kê hàm lượng protein trong dịch nuôi vi khuẩn hiếu khí sau 3 ngày nuôi. 2.2. Kết quả thống kê hàm lượng protein trong dịch nuôi vi khuẩn kỵ khí sau 3 ngày nuôi 3. Kết quả thống kê thí nghiệm 4 3.1. Kết quả thống kê hoạt tính enzyme trong dịch nuôi vi khuẩn hiếu khí sau 3 ngày nuôi 3.2. Kết quả thống kê hoạt tính enzyme trong dịch nuôi vi khuẩn kỵ khí sau 3 ngày nuôi. 4. Kết quả thống kê thí nghiệm 5 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 33 – 2010 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Thành phần môi trường Delafield (2002) cải tiến (M1).................16 Bảng 2. Thành phần môi Delafield (2002) cải tiến (M2).............................16 Bảng 3. Tóm tắt các giai đoạn nhuộm Gram vi khuẩn.................................21 Bảng 4. Nguồn gốc của các dòng vi khuẩn đã phân lập...............................28 Bảng 5. Đặc điểm hình thái của 11 dòng vi khuẩn kỵ khí đã phân lập........29 Bảng 6. Tỷ lệ phần trăm về hình dạng và khả năng chuyển động của 11 dòng vi khuẩn kỵ khí phân lập được ............................................................30 Bảng 7. Tỷ lệ phần trăm về đặc điểm khuẩn lạc của 11 dòng vi khuẩn kỵ khí phân lập..................................................................................................31 Bảng 8. Đặc điểm hình thái của 21 dòng vi khuẩn phân lập hiếu khí...........32 Bảng 9. Tỷ lệ phần trăm về hình dạng và khả năng chuyển động của 21 dòng vi khuẩn hiếu khí phân lập....................................................................33 Bảng 10. Tỷ lệ phần trăm về đặc điểm khuẩn lạc của 21 dòng vi khuẩn hiếu khí phân lập....................................................................................................34 Bảng 11. Khả năng phân giải bột rơm trên môi trường M1 của các dòng vi khuẩn.............................................................................................................37 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 33 – 2010 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Cấu trúc và cấu tạo cellulose (A) và carboxymethylcellulose (B) .........................................................................................................................5 Hình 2. Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase............................................7 Hình 3. Các thiết bị, dụng cụ thí nghiệm.....................................................15 Hình 4. Sơ đồ phương pháp pha loãng mẫu.................................................18 Hình 5. Bình thủy tinh kỵ khí......................................................................19 Hình 6. Cấy ria tách ròng khuẩn lạc vi khuẩn.............................................20 Hình 7. Hình vi khuẩn và vi khuẩn nhuộm gram........................................35 Hình 8. Vòng thủy phân bột rơm của dòng P7H........................................36 Hình 9. Biểu đồ hàm lượng protein của 21 dòng vi khuẩn hiếu khí...........39 Hình 10. Biểu đồ hàm lượng protein của 11 dòng vi khuẩn kỵ khí............40 Hình 11. Biểu đồ thể hiện hoạt tính 21 dòng vi khuẩn hiếu khí.................41 Hình 12. Biểu đồ thể hiện hoạt tính 11 dòng vi khuẩn kỵ khí....................42 Hình 13. Khả năng phân giải bột rơm (%) sau 4 ngày ủ bởi 5 dòng vi khuẩn .....................................................................................................................43 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 33 – 2010 Trường ĐHCT CÁC CHỮ VIẾT TẮT µg Microgram µl Microliter kDa Kilo Dalton BSA Bovin serum albumin CBB Coomassie Brilliant Blue CFU Colony forming unit CMC Carboxymethyl-cellulose mM Mili Mole nm Nanometer OD Optical density w/v Weight/volume Chuyên ngành Công nghệ Sinh học viii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 33 – 2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Thực tế cho thấy con người sống không thể tách biệt với môi trường. Vì vậy, sự phát triển của con người cần phải đi đôi với bảo vệ môi trường. Ngày nay, với tốc độ phát triển không ngừng của các nước trên thế giới, chất lượng cuộc sống của con người ngày càng được nâng cao. Bên cạnh những mặt tích cực đó thì một trong những hậu quả tiêu cực từ sự phát triển đem lại chính là vấn đề ô nhiễm môi trường từ rác và chất thải sản xuất, sinh hoạt. Ngày nay, khi khoa học phát triển mạnh thì nguồn sản xuất enzyme không dừng lại ở đối tượng động vật và thực vật, mà vi sinh vật ngày càng đóng vai trò quyết định trong quy mô sản xuất enzyme công nghiệp trên toàn thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng. Những nghiên cứu cho thấy rằng trong một ngày đêm, vi sinh vật có thể chuyển hóa một lượng thức ăn gấp 30 – 40 lần so với trọng lượng cơ thể của chúng và cao gấp hàng ngàn lần so với tốc độ tăng sinh khối của động vật và thực vật (Nguyễn Đức Lượng, 1998). Để làm được điều này vi sinh vật phải tổng hợp được lượng enzyme rất lớn với tốc độ nhanh.Vì vậy chúng có khả năng phân hủy khối lượng lớn các chất thải tạo ra các chế phẩm sinh học mang lợi ích cao và thân thiện với môi trường. Việt Nam vốn là một nước có nền nông nghiệp lâu đời, hơn 70% người dân sinh sống bằng sản xuất nông nghiệp, các chất thải hữu cơ chứa cellulose chiếm số lượng khá lớn ,vì thế vấn đề xử lí thật sự cần thiết do trong điều kiện tự nhiên các phế phẩm nông nghiệp khó bị phân hủy hoặc thời gian phân hủy khá lâu. Hơn nữa một số phụ phẩm trong thời gian phân hủy lại gây ảnh hưởng đến môi trường hết sức nghiêm trọng. Rất may để giải quyết vấn đề này con người đã tìm ra được vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme cellulsae phân hủy cellulose từ nhiều nguồn khác nhau. (http://www.bienphong.com.vn/nd5/detail/kinh-te/viet-nam-day-manh-phat-triennong-nghiep-nong-thon/34011.038.html, 10-12-2010). Cellulase là hệ enzyme phân hủy cellulose và những dẫn xuất của cellulose, được nghiên cứu và ứng dụng chậm hơn so với nhiều loại enzyme khác như amylase và protease.... Tuy nhiên, enzyme này đóng vai trò rất quan trọng trong nghiên cứu khoa học, cũng như trong đời sống xã hội. Cụ thể như: cellulase phá vỡ thành tế bào nên Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 33 – 2010 Trường ĐHCT thường được áp dụng vào việc nuôi cấy tế bào trần trong việc lai tạo giữa các tế bào khác nhau. Cellulase còn được trộn vào trong thức ăn gia súc để tăng sự tiêu hóa, hấp thụ thức ăn động vật đặc biệt là động vật nhai lại. Ngoài ra, cellulase có chức năng quan trọng thủy phân phụ phẩm nông nghiệp thành dịch rỉ đường, một thành phần không thể thiếu trong lên men ethanol, sản xuất nhiên liệu sinh học. 1.1 Mục tiêu đề tài Ngày nay, vi khuẩn phân giải cellulose ứng dụng ngày càng nhiều, quan trọng nhất là trong phân giải các phế phẩm nông nghiệp, rác thải hữu cơ phục vụ nông nghiệp đồng thời xử lý môi trường. Đối với các dòng vi khuẩn phân giải cellulose có khả năng lên men sinh ethanol còn được ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu từ cellulose. Vi sinh vật nói chung và vi khuẩn nói riêng có khả năng phân hủy cellulose tồn tại và phát triển mạnh trong môi trường tự nhiên như ở đất trồng lúa, trấu đang hoai mục, bãi rác, bã mía đang phân hủy và không thể không nhắc đến hệ tiêu hóa của động vật nhai lại. Động vật nhai lại là loài gia súc có khả năng chuyển hóa cellulose mạnh nhờ hệ vi sinh vật rất phong phú đa dạng có khả năng thủy phân những thức ăn có thành phần chính là cellulose, trợ tiêu hóa. Do đó, “Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose từ dạ cỏ của dê (Capra aegagrus)” được thưc hiện nhằm mục tiêu: (i) tuyển chọn các dòng vi khuẩn phân giải cellulose kỵ khí và hiếu khí, (ii) xác định hoạt tính của những dòng vi khuẩn đã được phân lập, (iii) xác định khả năng phân giải rơm của những dòng vi khuẩn đã tuyển chọn trong điều kiện phòng thí nghiệm. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 33 – 2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về hệ tiêu hóa của dê Khác với những loài vật ăn thịt, ăn tạp, dạ dày của dê có 4 túi (dạ cỏ, tổ ong, lá sách, múi khế) để phù hợp với sự tiêu hóa thức ăn có nhiều chất thô xơ như cỏ, rơm, xác thực vật. Ở dạ cỏ và tổ ong, thức ăn được nhào trộn đều thấm nước mềm đi và lên men rồi bằng động tác ợ của con vật thức ăn được trở lên miệng lúc này nước bọt được tiết ra và con vật bắt đầu nhai lại. Tiêu hóa ở dạ cỏ chiếm vị trí rất quan trọng trong quá trình tiêu hóa gần như thành phần chủ yếu của thức ăn động vật nhai lại (rơm, cỏ) được tiêu hóa ở đây. Dạ cỏ vừa có dung tích lớn nhất chiếm khoảng 80% thể tích dạ dày, lại có hệ thống vi sinh vật cộng sinh rất phát triển, chúng gồm nhóm động vật nguyên sinh (Protozoa), vi khuẩn (Bacteria), nấm. Nhóm vi khuẩn cộng sinh ở dạ cỏ có số lượng rất lớn, trong 1 gam thức ăn dạ cỏ chứa tới 109 tế bào; trong đó, nhóm vi khuẩn có men cellulase để phân giải chất xơ, Streptococcus, vi khuẩn lactic… quan trọng nhất là nhóm vi khuẩn lên men cellulose. Chúng có khả năng chuyển celluose, hemicellulose thành các sản phẩm đường mạch ngắn như disaccharide, polysaccharide và sau đó tiếp tục biến thành các acid béo bay hơi, acid lactic, nhóm vi khuẩn lactic, Streptococcus cũng góp phần chuyển hóa chất bột đường. Quá trình phân giải chất xơ của dạ cỏ sẽ tạo thành sản phẩm là các acid béo bay hơi (acid acetic 60 – 70%, acid propionic 15-20 %, acid butyric 10-15 %), các thể khí như CO22, CH4, H2, O2 , N2…Các acid béo bay hơi chính là nguồn cung cấp năng lượng cho các hoạt động của cơ thể động vật nhai lại, là chất béo của sữa. Các thể hơi sinh ra tích tụ ở 1/3 trên của dạ cỏ được thải ra ngoài bằng cách ợ hơi. Sự có mặt của hệ thống vi sinh vật còn giúp động vật nhai lại sử dụng được nguồn nitơ phi protein như carbamic, muối amon tạo thành protid của chính bản thân vi sinh vật, xác vi sinh vật lại là nguồn cung cấp chất đạm cho chúng ở phần sau đường tiêu hóa (http://rumenasia.org/vietnam/index.php?option=com_content&task=view&id=578&It emid=180, 06-08-2010). 2.2 Tổng quan về rơm rạ Rơm là phụ phẩm của cây lúa sau khi thu hoạch. Rơm rạ có thành phần chính là celllulose, hemicellulose và lignin, chất hữu cơ kết dính (nhựa) và các chất vô cơ khác. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 33 – 2010 Trường ĐHCT Trong đó cellulose chiếm khoảng 37,4%; hemicellulose (44,9%); lignin 4,9% và hàm lượng tro (oxit silic) cao từ 9 đến 14% ( http://vietnamnet.vn/khoahoc/201005/Rom-rava-moi-truong-908398/, ngày 18-11-2010). Trong nông nghiệp rơm rạ sau khi thu hoạch thường được dùng làm thức ăn dự trữ cho trâu bò, giá thể trồng nấm, làm chất đốt cho gia đình, và người dân thường chất thành đóng đốt trên đồng ruộng khi không có chổ tiêu thụ số rơm đó để xuống giống vụ sau. Việc đốt rơm rạ trực tiếp ngay trên đồng ruộng gây bất lợi lớn cho đất canh tác, đất bị chai cứng, một lượng lớn nước bị bốc hơi do nhiệt độ hun đốt trong quá trình cháy rơm rạ và quan trọng hơn vô tình hủy đi nguồn vi sinh vật giàu dinh dưỡng cho đất. Quá trình đốt rơm, rạ ngoài trời không kiểm soát được lượng dioxit cacbon CO2, thải vào khí quyển cùng với cacbon monoxit (CO); khí metan CH4; các oxit nitơ (NOx); và một ít dioxit sunfua (SO2). Thành phần gây ô nhiễm không khí do đốt rơm rạ là các hydrocacbon thơm đa vòng (viết tắt là PAH) ; dibenzo-p-dioxin clo hoá (PCDDs), và dibenzofuran clo hoá (PCDFs), tiềm tàng nguy cơ gây ung thư, đe dọa đến sức khỏe con người. ( http://vietnamnet.vn/khoahoc/201005/Rom-ra-va-moi-truong-908398/, 18-11-2010). 2.3. Khái quát về cellulose và enzyme cellulase 2.3.1 Thành phần và cấu trúc Cellulose Cellulose (tiếng Việt phiên âm là xenlulo, xenlulozơ, xenluloza hoặc xenlulô) là đơn vị cấu thành của sinh khối thực vật, được tìm thấy trong tự nhiên nhất là vách tế bào thực vật có vỏ và một ít loài vi khuẩn. Cellulose là hợp chất hữu cơ cao phân tử có thể có đến 10.000 đơn phân D-glucose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glycosidic có công thức cấu tạo chung là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n ( hệ số n trong khoảng 5000-14000), tạo thành một chuỗi thẳng, nhóm hydroxyl của chuỗi này tạo liên kết hydro với phân tử oxy của chuỗi bên cạnh nhau hình thành cấu trúc tinh thể chắc chắn khó thủy phân (Schwarz, 2001). Các sợi này liên kết với nhau thành bó nhỏ gọi là các micofibrin. Tuy có cấu tạo đồng nhất từ các đơn phân D-glucose, nhưng cellulose có cấu trúc mạng lưới vững chắc nên không có một enzyme đơn lẽ nào có thể phân giải hoàn toàn mà phải có sự kết hợp của một hệ thống enzyme. Cellulose không hòa tan nên rất khó thực hiện trên tinh thể này, khi đó Carboxymethylcellulose (CMC) là chất có nguồn gốc từ cellulose được gắn các nhóm carboxymethyl (-CH2-COOH) vào nhóm hydroxyl của các đơn phân D-glucose, vì thế Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 33 – 2010 Trường ĐHCT CMC có khả năng hòa tan (Hình 1). CMC được dùng làm cơ chất cho nghiên cứu sự phân giải của enzyme endoglucanase. Tuy nhiên, sử dụng CMC không đánh giá được khả năng phân giải cellulose bởi nhiều vi sinh vật không có khả năng phân giải cellulose nhưng có khả năng phân giải CMC nhờ enzyme β-glucanase (Fields et al., 1998). Việc sử dụng sinh khối cellulose càng khó khăn hơn so với cellulose tinh khiết bởi cấu trúc phức tạp của nó do hiện diện cùng hemicellulose và lignin. Các mô thực vật khác nhau về kích thước và cấu tạo. Một vài mô thực vật như thịt lá có tế bào với vách mỏng và chứa ít lignin nên dễ phân giải bởi enzyme. Các mô cứng còn lại có vách tế bào thường dày và giàu lignin nên quá trình phân giải khó khăn hơn (Lee et al., 2002). (B) (A) Hình 1. Cấu trúc và cấu tạo cellulose (A) và carboxymethylcellulose (B) (*Nguồn: Schwarz, 2001) 2.3.2 Enzyme Cellulase Cellulase là enzyme có khả năng xúc tác quá trình thủy phân cellulose thành glucose. Trong tự nhiên, có rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulase như: nấm, vi khuẩn, động vật nguyên sinh… khi được nuôi dưỡng trong môi trường có cellulose. Tuy nhiên để enzyme thủy phân hoàn toàn nguyên liệu cellulose cần có sự phối hợp của các loại cellulase khác nhau; endoglucanase (1,4-β-D-glucan-4glucanohydrolase; EC 3.2.1.4), exocellobiohydrolase (1,4-β-D-glucan glucohydrolase; Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 33 – 2010 Trường ĐHCT EC 3.2.1.74) and β-glucosidase (β-D-glucoside glucohydrolase; EC 3.2.1.21) (Yi et al., 1999). Enzyme thứ nhất là: exoglucanases bao gồm 1,4-β-D-glucan gluconohydrolases (như cellodextrinases) và 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (còn có tên khoa học khác như: exoglucanase, enzyme C1 và avicellase). Enzyme cắt đầu không khử của chuổi cellulose để tạo thành cellobiose và giải phóng từng đơn vị glucose (glucanohydrolases) hoặc cellulobiose (cellobiohydrolase) (Teeri, 1997). Trọng lượng phân tử của enzyme này từ 53 – 75 kDa. Enzyme này không có khả năng phân hủy cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Để xác định hoạt tính hệ enzyme exoglucanases, ủ dịch enzyme cellulase với cơ chất cellulose (Li-Jung et al., 2010). Enzyme thứ hai là: 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase (tên gọi khác: endoglucanse, endo 1,4-β-glucanase, CMCase, enzyme Cx) chứa 418 acid amine, có trọng lượng phân tử 42-49 kDa, chúng họat động ở nhiệt độ khá cao và tham gia phân hủy liên kết β-1,4-glycosidic trong cellulose, trong lichenin và β-D-glucanase (Nguyễn Đức Lượng). Endoglucanse cắt ngẫu nhiên tại các vị trí không đồng dạng bên trong chuỗi cellulose giải phóng các đoạn oligosaccharid có chiều dài khác nhau (Teeri, 1997). Vì vậy hoạt tính của endo 1,4-β-glucanase được xác định khi ủ với cơ chất CMC (Li-Jung et al., 2010). Enzyme thứ ba là: β-D-glucoside glucohydrolase (còn có tên là cellobiase và βglucosidase), có khả năng họat động ở pH khoảng 4,4 – 4,8, trọng lượng phân tử khoảng 50 – 98 kDa, PI = 8,4 và có thể họat động ở nhiệt độ cao. Enzyme này tham gia phân hủy cellobiose, tạo thành glucose, không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 33 – 2010 Vùng kết tinh Trường ĐHCT Vùng vô định hình Vùng kết tinh Hình 2: Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase (*Nguồn: http://www.sinhhocvietnam.com.vn; ngày 06/08/2010 ) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 33 – 2010 Trường ĐHCT 2.4. Cơ chế quá trình phân hủy cellulose 2.4.1 Cơ chế quá trình oxy hóa cellulose ( phân hủy hiếu khí) Quá trình oxy hóa xảy ra bắt đầu bằng sự thủy phân sau đó chuyển hóa thành CO2 và H2O. Cơ chế quá trình oxy hóa cellulose có thể qua hai giai đoạn: Giai đoạn thứ nhất: là sự thủy phân cellulose thành cellulobiose dưới tác dụng của cellulase. Ngoài ra còn tạo thành một lượng đường glucose. Giai đọan thứ hai: là giai đoạn oxy hóa những đường đơn giản. Quá trình này có qua nhiều sản phẩm trung gian loại oxi axit và cuối cùng tạo thành CO2 và H2O (Nguyễn Đức Lượng, 2004). 2.4.2 Cơ chế của quá trình phân hủy cellulose trong điều kiện kỵ khí Quá trình phân hủy kỵ khí khi các chất cellulose được tiến hành qua hai giai đoạn. Giai đoạn biến cellulose thành glucose và sau đó biến glucose theo kiểu lên men butyric. Có hai dạng lên men là lên men dạng hydro và lên men dạng methan. Theo như Omelanskin thì lên men kiểu methan sản phẩm khí tạo ra bằng nửa trọng lượng cellulose còn theo kiểu hydro thì khi tạo ra bằng 1/3 (Nguyễn Đức Lượng, 2004). 2.5. Vi sinh vật phân hủy cellulose Trong điều kiện tự nhiên của môi trường có rất nhiều chủng vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose chúng rất đa dạng và phong phú, điển hình như: nấm mốc, xạ khuẩn, vi khuẩn và một số lọai nấm men. Vi sinh vật phân giải cellulose khác nhau ở nhu cầu oxy, nhiệt độ phát triển, pH, nồng độ cơ chất mà rất ít vi sinh vật cùng một lúc tổng hợp phức hệ enzyme cellulase cho nên việc phân hủy cellulose mất rất nhiều thời gian. 2.5.1 Các vi sinh vật phân hủy cellulose trong điều kiện hiếu khí Trong điều kiện hiếu khí các vi sinh vật tham gia vào việc thủy phân cellulose gồm các niêm vi khuẩn, một số đại diện của các vi khuẩn không sinh bào tử và sinh bào tử, xạ khuẩn và nấm. Ở điều kiện hiếu khí cả nấm và vi khuẩn sử dụng cellulose nhờ nhiều enzyme ngọai bào, chúng tự do trong môi trường, những enzyme riêng lẽ này thường thể hiện hỗ trợ tốt trong quá trình thủy phân cellulose (Rapp et al., 1991). Nhiều vi khuẩn hiếu khí cũng dính chặt vào cơ chất cellulose, tuy nhiên sự dính chặt Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn Tốt nghiệp Đại học khóa 33 – 2010 Trường ĐHCT này không cần thiết cho sự thủy phân. Sự thủy phân cellulose hiếu khí sản sinh số lượng tế bào cao, cho nên được ứng dụng trong sản xuất protein tế bào từ các nguồn phụ phẩm giàu cellulose (Nawwi và Kader, 1996). Theo Nguyễn Lân Dũng (2007) thì tế bào của niêm vi khuẩn có hình que nhỏ bé (0,3-0,4 × 0,7-10 µm) hơi uốn cong, thường có đầu nhọn, có thành tế bào mỏng và nhuộm màu kém hơn so với các vi khuẩn khác. Sporocytophaga là vi khuẩn hình que, đầu tròn, nguyên sinh chất đồng đều, không có phân nhánh hóa, không có tiêm mao. Trong giống này thường gặp hai loại: Sporocytophaga myxoccoides (có màu vàng) và Sporocytophaga ellipsopora (có màu nâu). Chúng đều là những vi khuẩn phân hủy cellulose mạnh. Nguyễn Lân Dũng (2007) cho rằng, ngoài niêm vi khuẩn, trong đất còn thường thấy các loại vi khuẩn phân hủy cellulose thuộc giống Cellvibrio gần gũi với nhóm Pseudomonas. Khuẩn lạc của Cellvibrio có một số loài vô màu, có một số màu vàng – lục. 2.5.2 Những vi sinh vật phân hủy cellulose trong điều kiện kỵ khí Trong điều kiện xâm nhập không khí bị hạn chế, các loài vi khuẩn ưa ẩm hoặc ưa nòng thuộc giống Clostridium và Bacillus tiến hành phân hủy cellulose nhờ phức hệ enzyem trên bề mặt tế bào. Sự thủy phân cellulose ở điều kiện kỵ khí cũng giống như quá trình lên men kỵ khí khác có số lượng tế bào lên men thấp, bao phủ ngoài cơ chất và lên men cho sản phẩm cuối cùng gồm ethanol, acid hữu cơ, CO2 và H2. Đại diện điển hình cho các vi khuẩn ưa ẩm phân hủy cellulose ở 30 0C-400C là Clostridium omelianskii. Vi khuẩn này có hình que (4-8 × 0,5-0,3 µm), có thể di động, khi sinh bào tử có dạng Plectridium (bào tử nằm ở một đầu) (Nguyễn Xuân Thành et al., 2007). Phân hủy kỵ khí các chất cellulose là một trong những kiểu lên men butyric. Quá trình này tham gia chủ yếu là các loài vi khuẩn sau: Bacillus cellulose hydrogenicus: là trực khuẩn rất dài (10-12 µm). Tạo bào tử trên một đầu trực khuẩn. Chúng lên men cellulose tạo thành khí hydro. Bacillus cellulose methanicus: hình dáng rất giống loài trên nhưng kích thước nhỏ hơn. Cũng tạo bào tử trên một đầu vì vậy chúng có hình như một chiếc dùi trống, và khả năng tạo bào tử nhanh hơn. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học