Tài liệu Phân lập và xác định một số đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây màng tang (litsea cubeba (lour.) pers.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI --------------------------------------- PHẠM NGỌC LÂM PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - Năm 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI --------------------------------------- PHẠM NGỌC LÂM PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. PHÍ QUYẾT TIẾN PGS.TS. VŨ THU TRANG Hà Nội - Năm 2017 LỜI CAM ĐOAN Học viên: Phạm Ngọc Lâm Nơi đào tạo: Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Người hướng dẫn : TS. Phí Quyết Tiến PGS.TS. Vũ Thu Trang Tên luận văn: ―Phân lập và xác định một số đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)‖. Nội dung cam đoan: Tôi xin cam đoan, trong suốt quá trình nghiên cứu luận văn thạc sĩ, dưới sự hướng dẫn chỉ bảo tận tình của giáo viên hướng dẫn, tôi đã tiến hành nghiên cứu luận văn một cách trung thực, toàn bộ nội dung trong báo cáo luận văn được tôi trực tiếp thực hiện. Tất cả các nghiên cứu không sao chép từ các báo cáo khoa học, luận văn tiến sĩ, thạc sĩ hay sách của bất cứ tác giả nào. Học viên Phạm Ngọc Lâm I LỜI CẢM ƠN Đối với mỗi học viên cao học, luận văn tốt nghiệp là một công trình khoa học nhỏ nhưng mang ý nghĩa lớn, đánh dấu bước trưởng thành đầu tiên của mỗi người trên con đường ứng dụng những kiến thức đã được học vào thực tiễn. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phí Quyết Tiến, Phó Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và PSG.TS. Vũ Thu Trang, Phó trưởng Khoa Công nghệ thực phẩm, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kiến thức quý báu để giúp tôi hoàn thành luận văn này. Trong thời gian thực tập và làm việc tại phòng Công nghệ Lên men - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ, sự chỉ bảo tận tình về chuyên môn, kĩ thuật và sự động viên chân thành của tập thể cán bộ phòng. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn. Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập để đạt được kết quả như ngày hôm nay. Hà Nội, tháng 10 năm 2017 Học viên Phạm Ngọc Lâm II DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Các kí hiệu/ chữ viết tắt Ý nghĩa 1 DNA Deoxyribonucleic acid 2 FISH Fluorescent insitu hybridization 3 IAA Indole acetic acid 4 IC50 Inhibitory concentration 50% - Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử. 5 KTCC Khuẩn ty cơ chất 6 KTKS Khuẩn ty khí sinh 7 MIC Minimum inhibitory concentrationNồng độ ức chế tối thiểu 8 NRP Nonribosomal peptide 9 NRPS Nonribosomal peptide synthetase 10 PKS Polyketide synthase 11 PKS-I Polyketide synthase type I 12 PKS-II Polyketide synthase type II 13 RNA Ribonucleic acid III DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số hoạt chất được tìm thấy ở xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu. .10 Bảng 1.2. Một số loài xạ khuẩn nội sinh hiếm được phân lập từ cây dược liệu .......16 Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA. ........................................................................................................................32 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng xạ khuẩn nội sinh điển hình phân lập từ các mẫu cây Màng tang tại Thanh Hóa, Hà Nội và Phú Thọ....................................35 Bảng 3.2. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của một số chủng xạ khuẩn. .......45 Bảng 3.3. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của chủng MPT28.......................51 Bảng 3.4. Màu sắc khuẩn lạc của chủng MPT28 khi nuôi cấy trên các môi trường 52 Bảng 3.5. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon, nitơ của chủng xạ khuẩn MPT28 sau 7-14 ngày nuôi cấy ở 30°C........................................................................................53 Bảng 3.6. Nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH thích hợp cho sinh trưởng của chủng MPT28. ......................................................................................................................54 Bảng 3.7. Độ tương đồng của trình tự gen 16S rRNA của xạ khuẩn MPT28 với trình tự gen tương ứng của các chủng xạ khuẩn được đăng ký trên GenBank..................56 IV DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1. Bản đồ vị trí 34 vùng có sự đa dạng thực vật cao và việc lấy mẫu để phân lập xạ khuẩn nội sinh.................................................................................................15 Hình 3.1. Hình ảnh khuẩn lạc các chủng xạ khuẩn nội sinh lần lượt trên môi trường ISP5 (a), SPA (b), HV (c), TA (d), STA (e), CA (f) sau 6 tuần nuôi cấy. ................34 Hình 3.2. Sự phân bố xạ khuẩn nội sinh trên các bộ phận của cây Màng tang: số liệu tổng số của 03 vùng (a); số liệu thống kê theo từng vùng (b)...................................38 Hình 3.3. Sự phân bố của xạ khuẩn nội sinh trên các loại môi trường phân lập khác nhau. ..........................................................................................................................39 Hình 3.4. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn nội sinh phân bố theo nhóm màu sắc khuẩn ty ở Thanh Hóa, Hà Nội và Phú Thọ. ...............................................................................41 Hình 3.5. Biểu đồ thống kê khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của 143 chủng xạ khuẩn nội sinh. ..........................................................................................................42 Hình 3.6. Khả năng kháng vi sinh (VSV) vật kiểm định của 47 chủng xạ khuẩn nội sinh (XKNS)..............................................................................................................43 Hình 3.7. Hoạt tính kháng Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 (A) Bacillus cereus ATCC 11778 (B) của một số chủng xạ khuẩn nội sinh. ................................44 Hình 3.8. Tỉ lệ chủng xạ khuẩn kháng ít nhất một chủng vi sinh vật kiểm định phân bố ở Thanh Hoá, Hà Nội và Phú Thọ........................................................................47 Hình 3.9. Tỉ lệ chủng kháng ít nhất một vi sinh vật kiểm định phân bố theo vị trí rễ, thân, lá. ......................................................................................................................49 Hình 3.10. Hình thái khuẩn lạc (a) trên môi trường ISP1 và bề mặt chuỗi bào tử (b) dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 7.500 lần của chủng MPT28. ...........52 Hình 3.11. Điện di đồ DNA tổng số (a) và sản phẩm PCR (b) trên gel agarose 1,0%. ...................................................................................................................................55 Hình 3.12. Cây phát sinh chủng loại của chủng MPT28. .........................................57 V MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................2 LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................. iii DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................ iv DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ .........................................................................v MỤC LỤC ................................................................................................................. vi MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................3 1.1. Xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dƣợc liệu ....................................3 1.1.1. Khái niệm xạ khuẩn nội sinh ..................................................................3 1.1.2. Cơ chế nội sinh của xạ khuẩn trong thực vật ..........................................4 1.1.3. Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trên thực vật .......................................4 1.2. Phân lập xạ khuẩn nội sinh .......................................................................... 11 1.2.1. Phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh ............................................. 11 1.2.2. Môi trường phân lập .............................................................................13 1.2.3. Các nghiên cứu cải tiến hiệu quả phân lập ...........................................13 1.3. Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên thực vật ...........................................14 1.3.1. Đa dạng thực vật - nguồn tiềm năng về sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh 14 1.3.2. Sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh đánh giá theo phương pháp phân lập và chủng loại ......................................................................................................18 1.4. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây dƣợc liệu................................................................................................................21 1.4.1. Kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh ..........................................................22 1.4.2. Các gen tham gia vào quá trình tổng hợp kháng sinh và các hợp chất trao đổi thứ cấp ...................................................................................................23 1.5. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên thực vật ở Việt Nam .....24 1.6. Cây Màng tang và tiềm năng khai thác xạ khuẩn nội sinh ...................25 Chƣơng II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ......................................................28 2.1. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................28 2.1.1. Mẫu Màng tang, chủng giống vi sinh vật .............................................28 2.1.2. Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu..................................................28 VI 2.1.3. 2.2. Môi trường nuôi cấy .............................................................................29 Phƣơng pháp nghiên cứu ..........................................................................29 2.2.1. Thu thập và chuẩn bị mẫu .....................................................................29 2.2.2. Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên mẫu cây Màng tang ...........................29 2.2.3. Sàng lọc các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ………………………………………………………………………..30 2.2.4. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn MPT28 ...............30 2.2.5. Phân loại chủng xạ khuẩn MPT28 dựa trên phân tích trình tự gen 16S rRNA....………………………………………………………………………..32 2.1.1. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................33 Chƣơng III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................................34 3.1. Phân lập và đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại các vùng sinh thái khác nhau ....................................................................................34 3.1.1. Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại Thanh Hóa, Hà Nội và Phú Thọ ..........................................................................................................34 3.1.2. 3.2. Sự phân bố xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang ...............................37 Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn nội sinh …………………………………………………………………………….42 3.2.1. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn phân bố theo các vùng sinh thái khác nhau ......................................................................47 3.2.2. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn phân bố theo vị trí trên cây ...............................................................................................49 3.3. Đặc điểm sinh học và phân loại của chủng xạ khuẩn MTP28 ...............50 3.3.1. Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT28 .........................................51 3.3.2. Phân loại dựa trên xác định trình tự gen 16S rRNA của chủng xạ khuẩn MPT28 ………………………………………………………………………..55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................58 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ.................................................................................59 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................60 PHỤ LỤC ..................................................................................................................71 VII MỞ ĐẦU Sự xuất hiện của những vi khuẩn gây bệnh kháng nhiều loại kháng sinh cùng với sự lây lan rộng lớn của chúng đang là mối đe dọa nghiêm trọng và thu hút mối quan tâm hàng đầu của cộng đồng. Sự gia tăng của những tác nhân gây bệnh này đã cho thấy nhiều loại thuốc kháng sinh hiện nay đã lỗi thời và không còn hiệu quả. Trong khi đó, những thành công của các giải pháp thay thế như tổng hợp hóa học vẫn còn rất hạn chế, đã tạo ra một khoảng trống trên con đường tìm ra các loại thuốc mới. Vì vậy, cho đến nay, các nhà khoa học và các doanh nghiệp dược phẩm trên thế giới vẫn không ngừng tìm kiếm các nguồn hợp chất tự nhiên khác nhau để phát triển các loại kháng sinh mới nhằm khắc phục tình trạng kháng thuốc như hiện nay. Xạ khuẩn là đối tượng quan tâm nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới về độ đa dạng và các hoạt chất sinh học của chúng, đặc biệt là các chất kháng sinh. Các loài xạ khuẩn nội sinh sống trong mô thực vật và tạo ra một số hợp chất thúc đẩy sự phát triển của cây chủ và giúp chúng tồn tại được trong cây chủ. Trong số các hợp chất này, các chất có hoạt tính sinh học như hoạt tính kháng khuẩn, kháng ung thư, chống oxy hóa, chống sốt rét hứa hẹn nhiều tiềm năng ứng dụng trong y học. Việc phân lập xạ khuẩn nội sinh và sàng lọc các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp các chất có hoạt tính kháng khuẩn là một hướng nghiên cứu tiềm năng. Cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) là một loại dược liệu phân bố ở các nước châu Á, trong đó có Việt Nam. Chúng chứa nhiều tinh dầu mà thành phần chính là citral, có tác dụng kháng khuẩn, kháng ung thư, và chống oxy hóa. Mặc dù tinh dầu Màng tang được sử dụng nhiều trong cuộc sống nhưng đến nay số lượng các nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang và khả năng kháng khuẩn của chúng tại Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Xuất phát từ những định hướng trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu: “Phân lập và xác định một số đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)” 1 Mục tiêu của đề tài: Phân lập, đánh giá và lựa chọn các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang có khả năng kháng khuẩn cao. Đề tài được thực hiện tại ph ng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, gồm 3 nội dung ch nh: - Phân lập và đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên các mẫu cây Màng tang thu thập tại 03 vùng: Thanh Hóa, Hà Nội và Phú Thọ. - Sàng lọc các chủng xạ khuẩn nội sinh có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định. - Tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của một chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn cao. 2 Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dƣợc liệu 1.1.1. Khái niệm xạ khuẩn nội sinh Ngày nay, rất nhiều loại vi sinh vật phổ biến như vi khuẩn và nấm, xạ khuẩn đã được tìm thấy ở các mô bên trong cây. Các vi sinh vật này sống bên trong các mô thực vật mà không gây ảnh hưởng tiêu cực đến cây chủ. Hầu hết thực vật đều có một hoặc nhiều loài vi sinh vật sống trong mô của chúng. Các vi sinh vật sản xuất các chất chuyển hóa thúc đẩy tăng trưởng, thuốc chống côn trùng và sâu bệnh, kháng sinh chống lại mầm bệnh thực vật, bảo vệ cây chủ trong điều kiện stress môi trường. Chúng cũng có tiềm năng sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp có thể khai thác ứng dụng trong các ngành công nghiệp dược phẩm, nông nghiệp và các ngành khác [71]. Thuật ngữ ―nội sinh‖ (endophyte) được đưa ra đầu tiên bởi De Bary năm 1866. Từ đó, nhiều định nghĩa khác nhau được đưa ra bởi các nhà nghiên cứu khác nhau với một vài thay đổi. Tổng hợp các định nghĩa và các nhà khoa học đã thống nhất là ―Sinh vật nội sinh là tập hợp những vi sinh vật sống trong các mô của thực vật bậc cao cũng như các thực vật nhỏ mà không gây bất kỳ ảnh hưởng xấu nào cho cây chủ‖. Chúng đã được chứng minh là nguồn sản xuất các sản phẩm tự nhiên phong phú có nguồn hoạt tính sinh học [82]. Trong số các vi sinh vật nội sinh, xạ khuẩn được chú ý bởi khả năng tổng hợp kháng sinh ức chế vi sinh vật gây bệnh. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định vai trò quan trọng của xạ khuẩn trong sinh tổng hợp chất kháng sinh. Xạ khuẩn nội sinh trong mô thực vật rất đa dạng và phong phú, hứa hẹn tiềm năng khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học do chúng sinh ra trong nhiều lĩnh vực của đời sống. Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh được chứng minh rất đa dạng về mặt số lượng và hoạt t nh như: các chất kiểm soát sinh học, chất kháng vi sinh vật, kháng ung thư, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất k ch th ch sinh trưởng... [76]. Vì vậy, các nhà khoa học ngày càng quan tâm nghiên cứu khảo sát đa dạng sinh học của các xạ khuẩn sống trong thực vật ở các hệ sinh thái khác nhau nhằm sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học nói chung và hoạt tính kháng sinh nói riêng. 3 1.1.2. Cơ chế nội sinh của xạ khuẩn trong thực vật Trước những lợi ích mà xạ khuẩn nội sinh mang lại, việc tìm hiểu về mối quan hệ giữa xạ khuẩn và thực vật cũng như cơ chế nội sinh của chúng trong thực vật ngày càng được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Okazaki và cộng sự (2003) đã quan sát thấy quá trình xâm nhiễm của Microbispora sp., vào bên trong các tế bào biểu bì và Streptomyces galbus vào mầm cây đỗ quyên (Rhododendron) bằng kính hiển vi điện tử quét [68]. Năm 2006, Watt và cộng sự đã nghiên cứu sự có mặt của xạ khuẩn trong các mô thực vật bằng phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH), sử dụng đầu d đặc hiệu cho xạ khuẩn [103]. Nhiều nghiên cứu cho rằng, các mô thực vật có những hốc thích hợp cho sự xâm nhập và sinh sống của các vi sinh vật, tạo nên các mối quan hệ có tính cộng sinh, ký sinh hoặc gây bệnh. Xạ khuẩn nội sinh là các quần thể vi sinh vật có nguồn gốc từ đất vùng rễ của thực vật. Các vi sinh vật thường xâm nhập vào trong mô thực vật qua các khe hở của lỗ khí, vết thương, lỗ hổng trên bề mặt, khu vực rễ non, biểu bì và theo các kênh dẫn truyền nước, dinh dưỡng để đi vào các mô bên trong. Hầu hết xạ khuẩn hình thành hệ sợi mọc trên bề mặt cây và xâm nhập vào vật chủ thông qua lỗ hở tự nhiên, các vết thương do cơ học hoặc côn trùng. Xạ khuẩn nội sinh tổng hợp ra một số hợp chất để thúc đẩy sự phát triển của cây chủ và giúp chúng tồn tại được trong cây chủ. Các hợp chất chuyển hóa này đang được nghiên cứu như một nguồn tiềm năng cung cấp các hợp chất có ứng dụng trong điều trị, kiểm soát sinh học và một số ứng dụng khác [75]. 1.1.3. Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trên thực vật 1.1.3.1. Ứng dụng trong công nghệ sinh học và y dược Năm 2006, El-Shatoury và cộng sự tiến hành nghiên cứu hoạt tính chống sốt rét của Streptomyces sp. phân lập từ Artemisia herba-alba, Echinops spinosus, Balotta undulate và Mentha longifolia. Các tác giả đã thử nghiệm tác động gây độc tế bào ấu trùng Artemia salina của 27 trong số 41 xạ khuẩn nội sinh. Kết quả cho thấy, 9 chủng có khả năng ức chết và giết chết ấu trùng với tỉ lệ lên tới 100% sau 12 4 giờ, các chủng này chủ yếu thu nhận từ cây Artemisia herba-alba và Echinops spinosus [21]. Tương tự, Tanvir và cộng sự (2014) cũng cho thấy Streptomyces albovinaceus và S. badius được phân lập từ các loài thực vật trong họ Cúc (Asteraceae) cũng có tiềm năng đáng kể về khả năng tiêu diệt ấu trùng muỗi (Culex quinquefasciatus) ở giai đoạn đầu và giai đoạn 4 trong chu trình phát triển của chúng [96]. Castillo và cộng sự (2002) đã phát hiện hợp chất munumbicins D có hoạt tính kháng lại ký sinh trùng sốt rét (Plasmodium falciparum), với giá trị IC50 (inhibitory concentration 50%) là 4,5 ng/ml. Các tác giả cũng mô tả hoạt động nổi bật của mỗi loại munumbicins A, B, C, D kháng lại P. falciparum nằm trong phạm vi có ý nghĩa dược lý với gía trị IC50 lần lượt là 175; 130; 6,5 và 4,5 ng/ml. Munumbicins C và D gây sự chú ý đặc biệt với các tác giả do giá trị IC50 cực kỳ thấp. Hơn nữa, họ cũng báo cáo rằng munumbicins B, C và D không gây bất kỳ sự ly giải hồng cầu nào ở người với nồng độ 80 µg/ml. Do đó, để sử dụng các hợp chất này làm thuốc chống sốt rét hoặc chống nhiễm trùng cần thêm kết quả từ những nghiên cứu kiểm tra độc tính trên tế bào và lâm sàng [11]. Ngoài các ứng dụng về kháng sốt rét kể trên, xạ khuẩn nội sinh c n được biết đến với việc tổng hợp các hợp chất có hoạt tính kháng viêm, ức chế tế bào ung thư. Gần đây, một hợp chất mới có tên naphthomycin K (dẫn xuất của kháng sinh ansamycin có gắn thêm nhóm chức chlorine) được phát hiện lần đầu tiên từ Streptomyces sp. CS nội sinh trong cây mỹ đăng mộc (Maytenus hookeri) - loại cây thuốc có tác dụng điều trị ung thư, hoạt huyết,.... Kết quả nghiên cứu cho thấy naphthomycin K có khả năng gây độc và ức chế dòng tế bào P388 (tế bào ung thư bạch cầu) và A-549 (tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt của người) ở nồng độ lần lượt là 0,07 và 3,17 µM [58]. Hai hợp 5, 7-dimetoxy-4-phenylcoumarin và 5, 7dimetoxy-4-p-methoxylphenylcoumarin có hoạt tính kháng tế bào ung thư mạnh, được tìm thấy trong loài Streptomyces aureofaciens CMUAc130 nội sinh. Hoạt tính kháng ung thư của hai chất này không chỉ ở việc hình thành nhóm nitric oxide, prostaglandin E2 và tác nhân hoại tử khối u (TNF-α), mà c n cảm ứng nitric oxide synthase và cyclooxygenase-2 trong lipopolysaccharide gây đại thực bào tế bào 5 RAW 264.7. Tác dụng ức chế phụ thuộc vào nồng độ chất và ức chế sự hình thành TNF-α [92]. Ngoài việc đóng vai tr quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất thông qua các enzyme thủy phân ngoại bào và khả năng sinh tổng hợp kháng sinh đã được khoa học biết đến từ lâu. Gần đây, các nghiên cứu trên xạ khuẩn còn phát hiện ra nhiều sản phẩm trao đổi chất của chúng có ý nghĩa rất quan trọng đối với sức khỏe con người. Một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất phá hủy tế bào hồng cầu của động vật (như haemolysin ở Rhodococcus equi). Các nhà khoa học đã phát hiện các hợp chất này từ xạ khuẩn có tiềm năng rất lớn trong việc làm tan cụcmáu đông ở người bị bệnh tim mạch. Trong phòng thí nghiệm, việc sàng lọc các chất có hoạt tính chống đông máu từ xạ khuẩn được tiến hành trên mẫu máu động vật như máu ngựa, máu thỏ [78]. Một ví dụ khác là việc tạo ra các hợp chất có hoạt tính chống các tác nhân gây oxy hóa, nhờ đó làm tăng tuổi thọ của tế bào. Nguyên lý hoạt động của các chất chống oxy hóa tìm thấy ở xạ khuẩn cũng tương tự như axit ascorbic (vitamin C) hay tocopherol (vitamin E). Các hợp chất này trung hòa thể oxy hóa rất cao của các hợp chất oxy hóa (được tạo ra trong quá trình trao đổi chất của tế bào hay dưới tác dụng của tia cực tím) qua đó làm giảm tác dụng oxy hóa của chúng [89]. Năm 2012, nhóm nghiên cứu của Sri đã phân lập 65 xạ khuẩn nội sinh trên 13 cây dược liệu chữa bệnh tiểu đường như cây lô hội (Alloe vera), dây ký ninh (Tinospora crispa), xuyên tâm liên (Andrographis paniculata), nghệ xanh (Curcuma aeruginosa), rau má (Centela asiatica)... Trong đó, các chủng thể hiện hoạt tính α-glucosidase ức chế quá trình thủy phân tinh bột thành glucose thẩm thấu vào ruột non. Kết quả nghiên cứu trên đã tuyển chọn được chủng BWA65 có hoạt tính ức chế α- glucosidase gấp hơn hai lần so với chất có hoạt t nh tương tự thu được từ dịch chiết cây dây ký ninh [88]. Mặc dù ý nghĩa khoa học của các hợp chất trao đổi chất kể trên đối với sự sinh trưởng và cạnh tranh của xạ khuẩn trong môi trường tự nhiên c n chưa rõ ràng, nhưng tác dụng mà chúng mang lại trong lĩnh vực công nghệ sinh học và y dược đã được chứng minh. Chính vì lý do này, các nhà khoa học hiện nay rất quan tâm tới 6 việc nghiên cứu phân lập xạ khuẩn nội sinh và sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học từ chúng. 1.1.3.2. Ứng dụng trong nông nghiệp Xạ khuẩn nội sinh có ý nghĩa rất lớn trong sản xuất nông nghiệp. Chúng là nhân tố thúc đẩy quá trình chuyển hóa, cải thiện sự tăng trưởng cây chủ cũng như giảm các triệu chứng bệnh do các tác nhân vi sinh vật hay stress môi trường gây ra [71]. Các nhà khoa học cũng chứng minh khả năng k ch th ch sinh trưởng thực vật và sinh tổng hợp hoocmon sinh trưởng thực vật của xạ khuẩn nội sinh. Năm 2013, Dochhil và cộng sự đã sử dụng hai chủng Streptomyces sp. phân lập từ cây rau má (Centella asiatica) để kích thích sự sinh trưởng của cây trồng và nẩy mầm của hạt. Kết quả cho thấy, cây trồng sinh trưởng tốt hơn và khả năng nảy nầm của hạt được nâng cao. Các chủng này có khả năng tổng hợp axit indole acetic (IAA) – một chất k ch th ch sinh trưởng thực vật – với nồng độ đạt 71 µg/ml và 197 µg/ml [19]. Shutsrirung và cộng sự (2014) chứng minh các chủng thuộc chi Nocardiopsis có khả năng sản xuất IAA cao nhất trong số tất cả các chi khác [86]. Trong các thử nghiệm thực địa được thực hiện bởi El-Tarabily cộng sự (2010), các chủng Actinoplanes campanulatus, Micromonospora chalcea và Streptomyces spiralis được sử dụng riêng lẻ và kết hợp với nhau. Kết quả là các chủng này làm kích thích tăng trưởng và tăng năng suất cây dưa leo [24]. Igarashi (2004) và Igarashi và cộng sự (2002) đã thu nhận axit pteridic A và B có hoạt tính giống auxin từ Streptomyces hygroscopicus phân lập trên cây dương xỉ (Pteridium aquilinum) làm chất k ch th ch tăng trưởng thực vật. Axit pteridic gây ra sự hình thành rễ bất định của cây đậu thận (Phaseolus vulgaris), ở nồng độ 1 mM hiệu quả như IAA. Ngoài ra, các tác giả nhận định rằng axit pteridic A kích thích sự kéo dài rễ ở nồng độ 20 ppm. Tuy nhiên, sự nảy mầm của lúa đã bị ức chế khi xử lý với IAA nồng độ 100 ppm [41, 42]. Nghiên cứu của Gangwar và cộng sự (2014) cũng cho thấy xạ khuẩn nội sinh mà chủ yếu là Streptomyces sp. có khả năng sản xuất IAA với hàm lượng khoảng 9,0-38,8 µg/ml [29]. 7 Bên cạnh khả năng sinh tổng hợp các chất k ch th ch sinh trưởng, xạ khuẩn nội sinh còn tổng hợp nhiều hợp chất giúp cây trồng chống lại các mầm bệnh. Xạ khuẩn nội sinh đã thu hút sự chú ý của các nhà vi sinh vật, bởi khả năng kiểm soát sinh học đối với mầm bệnh do khả năng tổng hợp sản phẩm trao đổi chất kháng vi sinh vật gây bệnh. Nhiều nghiên cứu chứng minh đặc tính bảo vệ cây chủ của xạ khuẩn nội sinh chống lại các vi sinh vật gây bệnh như Rhizoctonia solani, Verticillium dahliae, Plectosporium tabacinum, Gaeumannomyces graminis var. tritici, Fusarium oxysporum, Pythium aphanidermatum và Colletotrichum orbiculare [15, 26]. Cơ chế kiểm soát sinh học tập trung chủ yếu vào các sản phẩm trao đổi chất như chất kháng khuẩn, kháng nấm, enzyme thủy phân, phytohormone.... Ngoài ra, các chủng xạ khuẩn giúp tăng cường hệ thống miễn dịch đối với thực vật nhờ kích thích các thụ thể tế bào. Ví dụ như chủng S. galbus R-5 không chỉ sinh cellulase, pectinase mà còn sản xuất actinomycin X2 và fungichromin giúp tăng cường sức đề kháng trong cây đỗ quyên, tăng cường sản sinh jasmonate kích thích hệ thống miễn dịch [84]. Conn và cộng sự (2008) công bố kết quả nghiên cứu gây nhiễm Streptomyces sp. EN27 và Micromonospora sp. EN43 trên hạt giống cây Arabidopsis thaliana nhằm làm tăng sức đề kháng chống lại nấm bệnh Erwinia carotovora và F. oxysporum, kích hoạt biểu hiện gen tổng hợp axit jasmonic, axit salicilic và etylen [14]. Xạ khuẩn nội sinh có thể tổng hợp các hợp chất kháng nấm như siderophores và chitinase. Chitin là polysaccharide đặc trưng nhất của thành tế bào nấm. Các xạ khuẩn nội sinh có thể phân huỷ tế bào nấm do khả năng sản xuất chitinase [25]. Vai trò của các phân tử siderophores sinh ra bởi các xạ khuẩn nội sinh đã được quan tâm nhiều hơn bởi những chất này tham gia vào việc kích thích sự phát triển của cây chủ cũng như sự đối kháng với tác nhân gây bệnh ở thực vật. El-Shatoury và cộng sự (2009) đã công bố xạ khuẩn nội sinh thu nhận được từ cây Achillea fragrantissima có khả năng sản xuất chitinase hoặc siderophores đồng thời cũng cho thấy hoạt động ức chế đáng kể đối với nấm gây bệnh trên cây trồng. Enzyme chitinase được sinh ra bởi loài Actinoplanes missouriensis gây phân giải sợi nấm và giảm sự nảy 8 mầm của bào tử đ nh [22, 25]. Kết quả của El-Shatoury cộng sự (2009) đã được Gangwar và cộng sự (2014) củng cố, các tác giả ghi nhận sản phẩm siderophores dạng hydroxamate dao động từ 5,9-64,9 µg/ml và dạng catechol trong khoảng 11,223,1 µg/ml trong môi trường nuôi cấy xạ khuẩn nội sinh phân lập từ Aloe vera, Mentha arvensis và Ocimum sanctum [29]. Trong một nghiên cứu khác, El-Tarabily và cộng sự (2010) đã sử dụng Actinoplanes campanulatus, Micromonospora chalcea và Streptomyces spiralis để điều trị thành công bệnh thối cổ rễ ở cây dưa leo trưởng thành do tác nhân là nấm Pythium aphanidermatum. Các tác giả cũng cho rằng những dòng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm có thể sử dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học [24]. Năm 2004, Igarashi tìm thấy hợp chất 6-prenylindole từ Streptomyces sp. được phân lập từ cây hành lá (Allium fistulosum) có hoạt tính kháng lại các tác nhân gây bệnh trên thực vật như nấm Alternaria brassicicola và F. oxysporum. Hợp chất 6-prenylindole lần đầu tiên được tìm thấy là một thành phần trong cây rêu tản (lớp Hepaticae). Đây là một ví dụ thú vị về sự phát hiện của cùng một hợp chất từ thực vật và vi sinh vật. Tác giả cũng báo cáo hợp chất fistupyrone thu nhận từ Streptomyces sp. có khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm A. brassicicola, tác nhân gây ra bệnh đốm đen – một bệnh phổ biến của cây trồng họ cải (Brassicaceae). Mặc dù fistupyrone không thể hiện hoạt tính kháng A. brassicicola ở điều kiện in vitro, nó ức chế hoàn toàn sự xâm nhiễm của A. brassicicola khi xử lý các cây con với nồng độ 100 ppm của hợp chất này [41]. Các nghiên cứu của Igarashi và cộng sự (2002) cho thấy fistupyrone không ảnh hưởng đến sự phát triển của sợi nấm nhưng có khả năng ngăn chặn nảy mầm của bào tử nấm ở nồng độ 0,1 ppm [42]. Năm 2014, Zhang và cộng sự tìm thấy bốn hợp chất mới có dẫn xuất indole là 3-acetonylidene-7-prenylindolin-2-one, axit 7-isoprenylindole-3- carboxylic, 3-cyanomethyl-6-prenylindole và axit 6-isoprenylindole-3-carboxylic từ chủng Streptomyces sp. neau-D50, có hoạt tính kháng các loại nấm gây bệnh trên thực vật như Colletotrichum orbiculare, Phytophthora capsici, Corynespora 9 cassiicola và F. oxysporum với các giá trị IC50 trong khoảng 30,55-89,62 µg/ml [106]. Bảng 1.1. Một số hoạt chất được tìm thấy ở xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu. Cây dƣợc liệu Achillea fragrantissima Vị trí Loài xạ khuẩn Hợp chất Rễ, Kibdelosporangium sp., Siderophores, thân, lá Kitasatosporia sp., Nocardia sp., Nocardioides sp., Promicromonospora sp., Pseudonocardia sp., Chitinase TLTK [22] Streptomyces sp. Monstera sp. Thân Streptomyces sp. MSU- Coronamycin 2110 [27] Lô hội (Aloe vera), Bạc hà (Mentha Rễ, thân, [30] arvensis), Hương nhu tía (Ocimum sanctum). lá Actinopolyspora sp., Micromonospora sp., Siderophore Saccharopolyspora sp., Streptomyces sp. catechol), Indole (hydroxamate và acetic acid (IAA) Kennedia nigriscans Thân Streptomyces sp. NRRL Munumbicins A, B, 30562 C và D [11] Rau má (Centella asiatica) Rễ, thân, lá [19] Hành hoa (Allium fistulosum) Lá Streptomyces sp. Indole acetic acid (IAA) Streptomyces sp. TPA0569, Fistupyrone, 7’- [43] Demethylnovobioc, Novobiocin, 6Prenylindole, Pteridic acids A-B Dương xỉ (Pteridium aquilinum) Su ối (Xylocarpus granatum) Thân Streptomyces hygroscopicus TPA0451 Rễ Clethramycin Jishengella endophytica Alkaloids 161111 10 [43] [111] Riềng nếp (Alpinia galanga) Rễ Microbispora sp., Micromonospora sp., Nocardia sp., Streptomyces sp. Tc022 Actinomycin D [102] Maytenu saquifolia, Putterlickia retrospinosa, Putterlickia verrucosa Rễ, thân, lá Streptomyces setonii, Streptomyces sampsonii, Streptomyces sp. Q21, Streptomyces sp. MaBQuH-8 Celastramycins A [78] và B Những nghiên cứu này cho thấy các chất chuyển hóa thu được từ xạ khuẩn nội sinh ức chế nấm và các tác nhân gây bệnh thực vật có thể là những lựa chọn thay thế tốt hơn và an toàn hơn đối với khỏe con người. Việc nghiên cứu mối liên hệ giữa xạ khuẩn nội sinh với các cây chủ và các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học được sinh ra bởi xạ khuẩn giúp tìm ra các loại thuốc đặc hiệu có tiềm năng ứng dụng trong bảo vệ và tăng năng suất cây trồng. 1.2. Phân lập xạ khuẩn nội sinh 1.2.1. Phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh Các nhà nghiên cứu đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để phân lập xạ khuẩn nội sinh. Takahashi và Omura (2003) nhấn mạnh rằng sự đa dạng của xạ khuẩn phụ thuộc chủ yếu vào các phương pháp phân lập. Qua đó, quá trình xử lý mẫu bằng khử trùng bề mặt là một bước quan trọng được sử dụng nhiều nhất trong các phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh [95]. Ngoài ra, kết quả phân lập xạ khuẩn nội sinh trên thực vật còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, bao gồm: loài cây chủ, tuổi của cây chủ và loại mô, phân bố địa lý và môi trường sống, mùa lấy mẫu, hóa chất khử trùng bề mặt, môi trường phân lập và điều kiện nuôi cấy [28]. Nhìn chung, quy trình phân lập xạ khuẩn nội sinh bắt đầu từ việc thu gom các bộ phận của cây như lá, thân, rễ, hoa, quả,... được xử lý tươi hoặc bảo quản ở nhiệt độ 4°C cho đến khi tiến hành phân lập (trong vòng 24 giờ). Các mẫu được rửa sạch bằng nước máy để loại bỏ đất, bụi bẩn, và các mô chết, sau đó được khử trùng 11