BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SINH
TỔNG HỢP ENZYME COLLAGENASE TỪ
MẮM CÁ TRÈN, MẮM CÁ TRA
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
BÙI THỊ MINH DIỆU
SINH VIÊN THỰC HIỆN
HUỲNH THANH TRANG
MSSV:3102869
LỚP:CNSH K36
Cần Thơ, Tháng 5/2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SINH
TỔNG HỢP ENZYME COLLAGENASE TỪ
MẮM CÁ TRÈN, MẮM CÁ TRA
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
BÙI THỊ MINH DIỆU
SINH VIÊN THỰC HIỆN
HUỲNH THANH TRANG
MSSV:3102869
LỚP:CNSH K36
Cần Thơ, Tháng 5/2014
PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
(ký tên)
Bùi Thị Minh Diệu
SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên)
Huỳnh Thanh Trang
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày tháng năm 2014
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)
LỜI CẢM TẠ
Để có thể hoàn thành luận văn này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
Cha, mẹ gia đình, và những người bạn đã luôn ủng hộ, tiếp sức cho tôi.
Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường đại học
Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện
luận văn.
TS. Bùi Thị Minh Diệu đã tận tình hướng dẫn, giúp tôi đến khi tôi hoàn thành
luận văn.
Tập thể cán bộ, sinh viên phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thực vật và phòng
thí nghiệm Sinh Hóa, đặc biệt xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến bạn Phạm Thái Vy, Trần
Bá Phúc, Nguyễn Thị Cẩm Tiên, Lê Hùng Cường, Lư Trang Nguyên Thảo đã nhiệt
tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị cần thiết trong suốt quá trình thực
hiện đề tài cũng như chia sẽ kinh nghiệm giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này.
Cần Thơ, ngày
tháng
năm 2014
Sinh viên thưc hiện
Huỳnh Thanh Trang
TÓM LƢỢC
Collagenase là enyme được ứng dụng trong nhiều nghành công nghiệp cũng như
trong y tế, dược phẩm, mỹ phẩm đồng thời là enzyme có khả năng thủy phân collagen.
Từ các ứng dụng đó, việc tìm ra phương pháp thu nhận enzyme collagenase rất được
chú ý. Sử dụng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase để sản xuất
collagenase là một phương pháp hiệu quả nhất, vừa an toàn, chi phí thấp, không gây ô
nhiễm môi trường từ đó cũng rất được quan tâm. Lựa chọn nguồn phân lập là các sản
phẩm lên men truyền thống an toàn và đa dạng chủng vi sinh vật như là mắm cá Trèn
và mắm cá Tra. Phân lập được 46 dòng vi khuẩn trên môi trường gelatin và tuyển
chọn được 46 dòng một lần nữa trên môi trường collagen (25 dòng từ nguồn mắm cá
Trèn, 21 dòng từ nguồn mắm cá Tra). Các dòng có dạng hình tròn và hình thoi; độ nổi
đa dạng gồm lài, mô, phẳng; màu sắc vi khuẩn chủ yếu là trắng đục và trắng trong.
Trong 46 dòng vi khuẩn, chỉ có 22 dòng tạo được vòng thủy phân trên cơ chất
collagen. Tuyển chọn 11 dòng vi khuẩn có vòng thủy phân lớn (lớn hơn 10mm) tiến
hành xác định khả năng sinh tổng hợp enzyme. Sau khi nuôi tăng sinh trong môi
trường Czapek 5 ngày ở 35°C, tất cả 11 dòng đều cho có khả năng sinh tổng hợp
enzyme collagenase và hoạt tính enzyme cao nhất vào ngày thứ 4. Dòng TA10 phân
lập từ nguồn mắm cá tra cho hoạt tính cao nhất 5,144 U/ml và dòng TN18 phân lập từ
nguồn mắm cá trèn cho hoạt tính cao thứ 2 đạt 4,480 U/ml, cả hai dòng này đều có
tiềm năng sản xuất enzyme collagenase. Kết quả quan sát hình thái, nhuộm gram vi
khuẩn và khả năng sinh hóa cho thấy cả hai dòng TA10 và TN18 đều có khả năng di
động, gram dương, vi khuẩn hình que, có khả năng sinh enzyme catalase và enzyme
amylase , không có khả năng sinh acetyl–methylcarbinol. Trong thử nghiệm khả năng
sinh tổng hợp enzyme amylase chỉ có dòng TN18 có khả năng sinh enzyme.
Từ khóa: Collagenase, vi khuẩn phân giải collagen, collagen.
MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT ................................................................................................
LỜI CẢM TẠ ..........................................................................................................
TÓM LƢỢC ............................................................................................................ i
MỤC LỤC ................................................................................................................ ii
DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................. v
DANH SÁCH HÌNH .............................................................................................. vi
TỪ VIẾT TẮT ........................................................................................................ vii
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU .................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu đề tài ................................................................................................... 1
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU........................................................... 2
2.1. Tổng quan về mắm ............................................................................................ 2
. 2.1.1. Giới thiệu chung về mắm ......................................................................... 2
2.1.2. Vi sinh vật trong mắm .............................................................................. 2
2.2 Tổng quan về collagen ........................................................................................ 3
2.2.1. Giới thiệu collagen ................................................................................... 3
2.2.2. Thành phần và cấu trúc của collagen ....................................................... 3
2.2.3. Phân loại collagen.................................................................................... 7
2.2.4. Tính chất của collagen .............................................................................. 9
2.2.5. Các nguồn nguyên liệu có chứa collagen ................................................. 10
2.3 Giới thiệu về gelatin............................................................................................ 10
2.4. Tổng quan về collagenase ................................................................................. 12
2.4.1. Khái niệm về collagenase ......................................................................... 12
2.4.2. Nguồn collagenase.................................................................................... 12
2.4.2.1. Collagenase của mô .................................................................... 13
2.4.2.2. Collagenase vi sinh vật ................................................................ 14
2.4.3. Một số tính chất cơ bản của các collagenase đã được phát hiện .............. 17
2.4.4. Ứng dụng của collagenase ........................................................................ 18
2.4.4.1. Sử dụng collagenase trong nghiên cứu collagen .......................... 19
2.4.4.2. Trong công nghiệp thực phẩm ...................................................... 19
2.4.4.3. Trong y - dược .............................................................................. 20
2.4.4.4. Trong mỹ phẩm và các nghành công nghiệp khác ....................... 21
2.5. Vi sinh vật phân giải collagen đã đƣợc nghiên cứu ........................................ 21
2.6. Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về vi khuẩn phân hủy collagen ..... 22
2.6.1. Một số nghiên cứu trong nước................................................................... 22
2.6.2. Một số nghiên cứu ngoài nước .................................................................. 23
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 25
3.1. Thời gian và địa điểm ........................................................................................ 25
3.2. Phƣơng tiện nghiên cứu .................................................................................... 25
3.2.1. Nguyên vật liệu .......................................................................................... 25
3.2.2. Thiết bị và hóa chất ................................................................................... 25
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................. 26
3.3.1. Chuẩn bị mẫu vật và môi trường nuôi cấy ................................................. 26
3.3.2. Phân lập vi khuẩn ....................................................................................... 27
3.3.3. Đánh giá khả năng phân giải collagen của các dòng vi khuẩn ................... 29
phân lập được
3.3.4. Xác định hoạt tính collagenase của các dòng vi khuẩn được tuyển .......... 31
chọn
3.3.5. Đặc tính hình thái và một số khả năng sinh hóa của các dòng ................... 33
được tuyển chọn.
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN ............................................................ 36
4.1. Kết quả phân lập, tuyển chọn sơ bộ các dòng vi khuẩn có khả năng .......... 36
sinh tổng hợp enzyme collagenase
4.2. Khả năng phân giải collagena của các dòng vi khuẩn phân lập .................. 40
đƣợc
4.3. Hoạt tính collagenase của các dòng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn .................... 42
4.4. Xác định hình thái và một số khả năng sinh hóa của các dòng vi khuẩn ... 45
đƣợc tuyển chọn
4.4.1. Xác định hình thái vi khuẩn của các dòng vi khuẩn được ...................... 45
tuyển chọn
4.4.2. Một số đặc tính sinh hóa của các dòng vi khuẩn đươc tuyển ................... 46
chọn
CHƢƠNG 5. KẾT LUÂN ĐỀ NGHỊ ................................................................. 48
5.1. Kết luận ............................................................................................................ 48
5.2. Đề nghị .............................................................................................................. 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 49
PHỤ LỤC ..................................................................................................................
PHỤ LỤC 1. HÌNH ẢNH THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM ..................................
PHỤ LỤC 2. MẬT SỐ VI KHUẨN ..............................................................
PHỤ LỤC 3. SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM ........................................................
PHỤ LỤC 4. MỘT SỐ PHẢN ỨNG SINH HÓA ĐỊNH DANH ................
VI KHUẨN
PHỤ LỤC 5. KẾT QUẢ THỐNG KÊ ...........................................................
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1. Một số loài vi sinh vật trong các sản phẩm lên men .................................... 3
Bảng 2. Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide .................................... 7
Bảng 3. Phân loại collagen ......................................................................................... 8
Bảng 4. Một số collagenase của mô đã đưoc nghiên cứu .......................................... 13
Bảng 5. Một số collagenase vi sinh vật ...................................................................... 15
Bảng 6. Thành phần môi trường Czapek cải tiến ...................................................... 26
Bảng 7. Thành phần môi trường Czapek tăng sinh .................................................... 27
Bảng 8. Phương pháp pha loãng ................................................................................. 28
Bảng 9. Đường chuẩn leucine .................................................................................... 32
Bảng 10. Các giai đoạn và hóa chất trong nhuộm Gram ............................................ 35
Bảng 11. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được trong điều ..... 38
kiện hiếu khí
Bảng 12. Hoạt tính enzyme collagenase của các dòng vi khuẩn được tuyển chọn .... 41
Bảng 13. Đặc tính hình thái của các dòng vi khuẩn được tuyển chọn ....................... 44
Bảng 14. Đặc tính sinh hóa của các dòng vi khuẩn được tuyển chọn ........................ 45
DANH SÁCH HÌNH
Hình 1. Cấu trúc tropocollagen (triple helix) ............................................................. 4
Hình 2. Trình tự sắp xếp các amino acid trong chuỗi xoắn α của collagen ............... 5
loại I ở bò
Hình 3. Cấu trúc sợi của collagen............................................................................... 6
Hình 4. Cấu trúc chuỗi cơ bản của gelatin ................................................................. 11
Hình 5. Nguyên lý nhuộm Gram ................................................................................ 34
Hình 6. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn .................................................. 38
Hình 7. Biểu đồ thể hiện đường kính vòng thủy phân của các dòng vi khuẩn .......... 39
phân lập được
Hình 8. Vòng thủy phân của các dòng vi khuẩn ........................................................ 40
Hình 9. Mẫu vi khuẩn nhuộm gram............................................................................ 44
Hình 10. Kết quả thử nghiệm khả năng sinh hóa của các dòng vi khuẩn được ......... 46
tuyển chọn.
TỪ VIẾT TẮT
CFU
Clony-Forming Unit
DC
Đối chứng
MR
Methyl red
OD
Optical Density
STT
Số thứ tự
TCA
Trichloroacetic acid
VP
Voges – Proskauer
MR - VP Broth
Môi trường methyl red - Voges – Proskauer
UV
Ultraviolet
FACIT
Fibril – Associated Collagen with Interrupted Triple helices
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2014
Trường ĐHCT
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Với xu hướng phát triển của công nghệ sinh học trong đời sống và công nghiệp
ngày nay, công nghệ enzyme trở thành một kỹ thuật quan trọng của công nghệ sinh
học trong việc tối ưu hóa nhiều quy trình công nghiệp, nâng cao chất lượng và an toàn
sản xuất. Nhiều enzyme vi sinh vật được quan tâm và ứng dụng rộng rãi trong nhiều
lĩnh vực. Khoảng 60% lượng enzyme được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, 16
enzyme hiện được coi là enzyme công nghiệp.
Trong những năm gần đây, vai trò của công nghiệp collagen ngày càng quan
trọng trong y học, thực phẩm, khoa học, mỹ phẩm. Enzyme collagenase được xem là
enzyme duy nhất có khả năng phân giải collagen ở trạng thái nguyên thủy. Vì thế, việc
tìm kiếm và sản xuất collagenase trở nên vô cùng hấp dẫn. Ngoài ra, collagenase là
enzyme có nhiều ứng dụng trong các nghành công nghiệp như: thực phẩm (làm mềm
thịt, cải thiện cảm quan của thi ), công nghiệp hóa chất, nghiên cứu khoa học (tách
dòng tế bào như tinh trùng, tế bào mô da..) , đặc biệt là trong y tế (chữa bệnh Peyronie,
phân lập tế bào), dược phẩm, mỹ phẩm (làm vỏ thuốc, da nhân tạo). Hiện nay đã có
nhiều phương pháp sản xuất collagenase từ các phụ phẩm (da động vật, đầu tôm) bằng
việc tách chiết tốn thời gian và chi phí cao, có khả năng gây ô nhiễm môi trường. Vì
vậy việc nghiên cứu các phương pháp sản xuất collagenase hiệu quả và thân thiện với
môi trường là một vấn đề nóng hổi và bức bách. Đặc biệt là tại Việt Nam, có rất ít
nghiên cứu về enzyme collagenase.
Với mục đích phân lập vi khuẩn có khả năng sản xuất collagenase làm cơ sở cho
các nghiên cứu tiếp theo và ứng dụng sản xuất collagen cung cấp cho các nghành khác,
đề tài Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme collagenase từ mắm cá
Trèn, mắm cá Tra” được thưc hiện.
1.2. Mục tiêu đề tài
Đề tài được thực hiện với mục tiêu phân lập và tuyển chọn được một số dòng
vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase mạnh để hướng tới sản xuất
collagen sinh học nhờ các phụ phẩm nông nghiệp.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
1
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2014
Trường ĐHCT
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1.
Tổng quan về mắm
2.1.1. Giới thiệu chung về mắm
Mắm cá là món ăn truyền thống lâu đời tại một số nước Đông Nam Á như:
Lào, Cambodia, Thái Lan, Việt Nam, Malaysia, Myanmar, Indonesia và Philippines.
Tại Việt Nam, mắm được sản xuất nhiều và là đặc sản của miền Tây Nam Bộ nói
chung, Châu Đốc – An Giang nói riêng. Bên cạnh các loại mắm nổi tiếng như: mắm cá
Linh, mắm cá Lóc, mắm cá Chốt, mắm cá tra, mắm ruột cá, mắm trứng cá mắm cá
Trèn cũng được ưa chuộng bởi hương vị đặc biệt.
Về mặt dinh dưỡng có thể mắm không bằng cá tươi nhưng có hương vị đặc thù
và dễ phối hợp tạo ra những món ăn đặc sản của địa phương (bún mắm, lẩu mắm,
mắm chưng,…). Những ưu thế của các sản phẩm mắm đối với dân cư trong khu vực
là: khả năng chấp nhận sản phẩm cao, giá rẻ, dễ chuẩn bị, an toàn, cải thiện khả năng
tiêu hóa và hấp thụ. Mắm được xem là sản phẩm của quá trình lên men lactic, còn
được dùng để ngăn chặn một số loại vi khuẩn đường ruột và dạ dày (P.Saisithi et al.,
1987). Cá lên men có thể trở thành loại thực phẩm tốt cho những người mắc bệnh kém
hấp thu dinh dưỡng (Areekul et al., 1974). Các sản phẩm mắm đều có mặt vi khuẩn
lactic (Saisithi et al., 1987).
2.1.2. Vi sinh vật trong mắm
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy rằng trong mắm có sự hiện diện của 109
loại vi khuẩn khác nhau. Từ mắm đã phân lập được 91 loại vi khuẩn lactic các loại này
có khả năng chịu được nồng độ muối cao và pH thấp. Đặc biệt là Staphylococus
aureus chịu được ở pH = 1,5 – 3 trong hơn 5 giờ.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
2
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2014
Trường ĐHCT
Bảng 1. Một số loài vi sinh vật trong các sản phẩm lên men
Quốc gia
Sản phẩm
Vi sinh vật
Nhật Bản
Shottsuru
Pediococcus homeri , Halobacteriium spp
Ika-shiokara
Micrococcus spp, Staphyloccus sp
Debaryomyces spp
Thái Lan
Plara
P.Halophilus, Staphylococcus spp,
Taipla ( ruột cá lên men)
Halobacterium spp, Halococcus spp.
Budu
Pediococcus spp, P. Halophilus;
Staphylococcus spp.
Pediococcus spp; P.Halophilus
Philippines
Patis
Pediococcus spp, Bacillus spp;
P.halophilus; Micrococcus spp;
Halobacterium spp; Halococcus spp;
Bacillus spp
Việt Nam
Mắm ruốc
Staphylococcus sp, Bacillus sp, Halomonas sp,
Kocuria sp
2.2.
Tổng quan về collagen
2.2.1. Giới thiệu collagen
Collagen là một loại protein chính của mô nối động vật và là protein dồi dào
nhất ở những động vật có vú, chiếm khoảng 25% tới 35% trong tổng số các
protein khung mạng cơ thể. Collagen tạo nên 1% tới 2% của mô cơ, và chiếm 6%
về trọng lượng của gân, xương, dây chằng, sụn và hệ thống tim mạch trong cơ thể
(Sikorski, 2001). Collagen tạo ra hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ cho các đặc tính cơ học
của da như sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm… Tùy theo từng độ tuổi, điều kiện
sống, tác nhân môi trường, da có thể bị lão hóa hay bị tổn thương, sợi collagen
mất dần qua các tác động đó.
2.2.2. Thành phần và cấu trúc của collagen
Hầu hết các collagen tự nhiên đều có cấu trúc giống nhau trừ một số loại
collagen có cấu trúc đặc biệt của mô liên kết ở động vật có xương sống hoặc không có
xương sống, các loại collagen này có thể có thành phần hoặc cấu trúc bậc cao hơi khác
với các collagen thông thường khác.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
3
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2014
Trường ĐHCT
Cấu trúc của collagen
Mỗi phân tử collagen là một protein hình trụ, có cấu trúc bậc 4, do các đơn vị
tropocollagen cấu trúc bậc 3 tổ hợp theo các hướng dọc và ngang làm collagen có
nhiều mức cấu trúc. Đơn vị cơ bản của collagen là Tropocollagen”, liên kết với nhau
tạo thành những sợi nhỏ. Tropocollagen là một cấu trúc dạng sợi hình ống chiều dài
khoảng 300nm, đường kính 1,5nm, gồm ba sợi polypeptide (còn gọi là 3 chuỗi α cuộn
lại với nhau theo chiều từ trái qua phải tạo thành cấu trúc triple – helix, được gọi là
đường xoắn ốc đặc biệt”, được ổn định bởi các liên kết hydro nội phân tử giữa các
chuỗi. Mỗi chuỗi α cuộn thành đường xoắn ốc theo hướng từ phải qua trái với 3 gốc
trên 1 vòng xoắn, hay còn gọi là proline I (xoắn trái với 3,3 gốc aminoacid/vòng)
(Fratzil.P, 2008).
Hình 1. Cấu trúc tropocollagen (triple helix)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
4
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2014
Trường ĐHCT
Các chuỗi collagen sắp xếp song song theo chiều dọc liên kết với nhau bằng các
liên kết ngang tạo thành các sợi theo chu kì nhất định. Chúng được sắp xếp so le nhau
một khoảng 67nm và 1 khoảng trống 40nm ở giữa những phân tử liền kề nhau. Nhờ
vào cấu trúc có trật tự, độ bền vốn có của các chuỗi xoắn ốc được chuyển sang sợi
collagen, cung cấp cho các mô độ cứng, độ đàn hồi và những đặc tính cơ học riêng. Vì
thế collagen rất chắc, dai và bền.
Một đặc điểm đặc trưng của collagen là sự sắp xếp đều đặn của các amino acid
trong mỗi mắt xích của từng chuỗi xoắn ốc collagen này. Thông thường các chuỗi theo
mẫu sau: (-Gly-Pro-X-) hoặc (-Gly-Pro-Hyp-) tạo nên tính đặc trưng cho collagen
(trong đó prolin và hydroxyprolin chiếm 20%) ở đây X là các acid amin bất kỳ với
alanin chiếm 25% trong tổng số các acid amin). Proline hoặc hydroxyproline tạo nên
khoảng 1/6 tổng số chuỗi. Xen giữa các đoạn lặp đó là các vùng có cực với tổng lượng
gốc glycine chiếm 33% số chuỗi, nằm ở vị trí thứ nhất của gốc xoắn ba, ở các vị trí thứ
hai và thứ ba thường là các acid amin có cực. Tại đây, chỉ các gốc glycine là nằm trong
gốc xoắn và vì thế các acid amin khác trong các phân tử collagen có thể tham gia
tương tác với nhau.
Hình 2. Trình tự sắp xếp các amino acid trong chuỗi α của
collagen loại I ở bò
Tại các đầu của từng chuỗi xoắn peptide của collagen, đặc biệt là tại đầu nitơ,
thường tồn tại khoảng 15 gốc acid amin không có trình tự lặp lại đặc trưng của
collagen và thường có thành phần giống thành phần của các protein hình cầu. Phần cấu
tạo này không nằm trong vùng xoắn của collagen và có thể bị các protease khác tấn
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
5
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2014
Trường ĐHCT
công trong khi chỉ có collagenase mới có khả năng tấn công các liên kết nằm trong
vùng xoắn của collagen.
Phần lớn collagen trong mạng lưới ngoại bào được tìm thấy ở dạng sợi, bao
gồm những sợi mảnh nhỏ. Đầu tiên ba sợi của collagen này xoắn lại theo kiểu xoắn ốc
xung quanh một sợi hình thành nên bộ ba tropocollagen. Sau đó tropocollagen liên kết
với nhau theo kiểu đầu nối đuôi hình thành collagen fibril. Các collagen fibril này bó
lại với nhau hình thành sợi collagen siêu cấp – collagen fiber.
Hình 3. Cấu trúc sợi của collagen
Các chuỗi collagen sắp xếp song song theo chiều dọc liên kết với nhau bằng liên
kết ngang tạo thành các sợi theo chu kỳ nhất định. Chúng được sắp xếp so le nhau một
khoảng 67nm và có khoảng trống 40nm ở giữa những phân tử liền kề nhau. Nhờ vào
cấu trúc có trật tự, độ bền vốn có của các chuỗi xoắn ốc được chuyển sang các sợi
collagen, cung cấp cho các mô độ cứng, độ đàn hồi và những đặc tính cơ học riêng. Vì
thế collagen rất chắc dai và bền.
Thành phần các acid amin có trong collagen
Mỗi loại collagen gồm có hàng nghìn cấu trúc amino acid, chủ yếu gồm có
glycine, proline, hydroxyproline. Collagen không chứa tryptopan, và là một trong số ít
các protein chứa hydroxylysine. Các amino acid sắp xếp trong chuỗi xoắn ốc theo các
dãy với sự phân bố như sau:
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
6
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2014
Trường ĐHCT
Bảng 2. Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide
Bộ ba amino acid
Tỷ lệ so với tổng bộ ba (%)
Gly – X – X
44
Gly – X – Y
20
Gly – Y– X
27
Gly – Y – Y
9
Do glycine có các nhánh phụ nhỏ nhất nên sự lặp lại của nó cho phép các chuỗi
polypeptide kết hợp chặt chẽ với nhau tạo thành một đường xoắn ốc với khoảng trống
nhỏ ở phần lõi. Trong collagen không chứa tryptopan, cysteine như các loại protein
khác, còn tyrosin, histidin và các aicd amin chứa lưu huỳnh hiện diện không quá 1%,
điều này làm cho cầu nối disulfur (-S-S) trong cấu trúc collagen xuất hiện ít và là
nguyên nhân cho tính mềm dẻo của nó so với keratin, nhưng chứa rất nhiều
hydroxyproline. Hydroxyproline là một acid amin đặc trưng của collagen mà các loại
proten khác không có, nó được hình thành sau quá trình điều chỉnh proline khi được
kết hợp vào vị trí Y có vai trò quan trọng trong sự ổn định cấu trúc collagen do có gắn
nhóm –OH ở vị trí cacbon gamma. Trong collagen có chứa đến 30% glycine, 10%
hydroxyproline, 12% proline, 11% alanine.
2.2.3. Phân loại collagen
Collagen tồn tại ở nhiều bộ phận trong cơ thể. Tính đến thời điểm hiện nay, có
42 chuỗi polypeptide được nhận dạng. Chúng được mã hóa bởi 41 loại gene khác nhau
tạo thành 27 loại collagen được tìm thấy và thông báo trong các tài liệu khoa học. Trên
90% collagen trong cơ thể là dạng I, II, III và IV.
Dựa theo cấu trúc và tổ chức sắp xếp các phân tử trong chuỗi, collagen được
chia thành 7 dạng chính: collagen hình dạng sợi, FACIT collagen, collagen chuyển
màng, collagen nền và các loại collagen có chức năng duy nhất khác (bảng 3).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
7
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2014
Trường ĐHCT
Bảng 3. Phân loại collagen
Dạng
Loại
I
II
Kết cấu chuỗi
Phân bố
(α1(I))2α2(I), Trimer
da, gân, mạch máu, các cơ quan, xương (
(α1(I))3
thành phần chính của xương)
(α1(II))3
sụn xương( thành phần chính của sụn)
có trong bắp ( thành phần chính của bắp),
Collagen
dạng sợi
III
tìm thấy bên cạnh collagen I. Mạch máo,
(α1(III))3
van tim, hạ bì, ruột, nướu răng, thành tử
cung.
α1(V)α2(V)α3(V) hoặc
V
(α1(V))2α2(V) hoặc
dây chằng, giác mạc, kẽ hở giữa các mô
(α1(v))3
Màng nền
collagen
Collagen
vi sợi
Sợi neo
collagen
Dạng
XI
α1(XI)α2(XI)α3(XI)
Sụn, đĩa đệm cột sống, dịch thủy tinh.
IV
(α1(IV))2α2(IV)
Thành phần chính cấu tạo màng tế bào
VI
α1(VI)α2(VI)α3(VI)
có trong gan, thận, màng sụn, da, cơ tim.
VII
(α1(VII))3
Da, phổi, sụn, giác mạc.
VIII
Chưa biết
có trong màng trong
X
(α1(X))3
Sụn
IX
α1(IX)α2(IX)α3(IX)
Sụn
XII
(α1(XII))3
Gân, dây chằng.
XIV
Chưa biết
sợi liên kết collagen
XIX
Chưa biết
mạng lưới
lục giác
collagen
FACIT
collagen
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
mắt, não, tinh hoàn, mô trong thời kỳ đầu
phát triển
8
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2014
Collagen
chuyển
màng
Trường ĐHCT
Biểu mô giác mạc, phôi da, xương ức,
XX
(α1(XIX))3
XXI
(α1(XXI))3
XIII
(α1(XIII))3
XVII
(α1(XVII))3
XV
(α1(XV))3
XVI
(α1(XVI))3
Nguyên bào sợi, phiến keratin,…
XVII
(α1(XVII))3
Phổi, gan,…
sụn, gân,…
Thành mạch máu,…
Biểu bì, nang tóc, ruột, sụn bào, phổi,
gan,…
Vùng chuyển tiếp biểu bì – da…
Nguyên bào sợi, các tế bào cơ trơn, thận,
tụy,…
(*Nguồn: K.Gelse et al., 2003)
Collagen loại I là phổ biến nhất và thường ở trong các mô liên kết như da,
xương, gân. Collagen loại II hầu như tồn tại tở các mô sụn, mô võng mạc, giác mạc và
thủy tinh thể. Dạng này chứa một lượng lớn cacbonhydrat và hydroxylysin. Collagen
loại III lại phụ thuộc rất lớn vào độ tuổi của động vật (da heo còn non chứa 50%), theo
thời gian tỷ lệ này giảm 5 – 10%, có trong thành mạch máu, trong da của phôi, trong
cơ và trong gan. Những loại collagen khác chỉ hiện diện với lượng rất nhỏ và chỉ ở
một vài cơ quan đặc biệt.
Đối với collagen thuỷ phân sẽ cung cấp được cho cơ thể các nhóm collagen loại
I,II,III,IV,V.
Các bệnh về collagen thường do sự khiếm khuyết của gene gây nên tác động
cho quá trình tổng hợp sinh hóa, sự sắp xếp, sự sao chép bị thay đổi, hoặc các quá trình
khác trong việc hình thành của collagen.
2.2.4. Tính chất của collagen
Collagen là một protein cấu trúc. Chính vì vậy collagen cũng có đầy đủ các tính
chất hóa lý của một protein.
Tác dụng với nước
Collagen không hòa tan trong nước mà nó hút nước để nở ra, nguyên nhân là do
tương tác giữa các mạch polypeptide làm cho phân tử có những vùng kỵ nước và vùng
phân cực mang điện tích sẽ tạo nên khả năng háo nước là trương nở collagen. Cứ 100g
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
9
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
- Xem thêm -