Tài liệu Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp collagenase từ mắm cá chốt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP COLLAGENASE TỪ MẮM CÁ CHỐT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. BÙI THỊ MINH DIỆU SINH VIÊN THỰC HIỆN LÊ HÙNG CƢỜNG MSSV: 3102724 LỚP: CNSH K36 Cần Thơ, Tháng 4/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP COLLAGENASE TỪ MẮM CÁ CHỐT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. BÙI THỊ MINH DIỆU SINH VIÊN THỰC HIỆN LÊ HÙNG CƢỜNG MSSV: 3102724 LỚP: CNSH K36 Cần Thơ, Tháng 4/2014 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN (ký tên) SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) TS. Bùi Thị Minh Diệu Lê Hùng Cường DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn. TS. Bùi Thị Minh Diệu đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi đến khi hoàn thành luận văn. Tập thể các thầy cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường đại học Cần Thơ. Tập thể cán bộ và sinh viên phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thực vật đã tạo điều kiện về các trang thiết bị cần thiết cho quá trình thực hiện luận văn cũng như chia sẻ kinh nghiệm giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này. Gia đình và bạn bè đã luôn giúp đỡ và động viên tôi. Cần Thơ, ngày 12 tháng 05 năm 2014 Sinh viên thực hiện Lê Hùng Cường Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2014 Trường ĐHCT TÓM LƢỢC Hằng năm, tại Việt Nam có hàng ngàn tấn rác thải từ da cá basa, cá tra thải ra môi trường mà chưa được xử lý. Collagen là thành phần chính có trong da của các loại cá da trơn này. Đây là những hợp chất rất khó phân hủy trong tự nhiên. Việc ứng dụng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase đạt được các ưu thế quan trọng là không gây hại với môi trường, nâng cao giá trị dinh dưỡng của sản phẩm protein, cũng như mỹ phẩm và đạt được hiệu quả về kinh tế hơn so với các phương pháp vật lý và hóa học. Vì vậy, việc phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn sinh tổng hợp collagenase mạnh để góp phần phát triển nông nghiệp bền vững và cải thiện môi trường bị ô nhiễm là rất cần thiết. Từ 5 mẫu mắm cá chốt thu tại các chợ ở hai huyện Thoại Sơn và Tri Tôn thuộc tỉnh An Giang đã phân lập được 33 dòng vi khuẩn ở điều kiện hiếu khí trên môi trường thạch gelatin. Đa số các dòng vi khuẩn đều có khuẩn lạc tròn, độ nổi mô, bìa nguyên, màu trắng đục. Trong số 33 dòng vi khuẩn phân lập được chỉ có 22 dòng có hoạt tính collagenase. Kết quả khảo sát cho thấy các dòng vi khuẩn có hoạt tính collagenase từ 0,07 – 2,42U/ml. Trong đó dòng TS9 và TS13 cho hoạt tính cao nhất ở ngày thứ 4 lần lượt là 2,3U/ml và 2,42 U/ml. Hai dòng được chọn để quan sát hình dạng một số đặc tính sinh hóa. Dòng TS9 được xác định là Gram âm và có hình cầu, TS13 thuộc nhóm Gram dương và có hình que ngắn, cả 2 dòng đều có khả năng di động. Với các phản ứng kiểm tra sinh hóa, cả 2 dòng đều có hoạt tính amylase và catalase. Dòng TS9 cho kết quả dương tính với kiểm tra methyl red và indol, âm tính với kiểm tra VP. Ngược lại, dòng TS13 cho kết quả âm tính với kiểm tra methyl red và indol, dương tính với kiểm tra VP. Từ khóa: Cá da trơn, collagen, collagenase, gelatin, mắm cá chốt, vi khuẩn sinh tổng hợp collagenase. Chuyên ngành Công nghệ sinh học i Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2014 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang KÝ TÊN HỘI ĐỒNG ................................................................................................. LỜI CẢM TẠ.............................................................................................................. TÓM LƢỢC............................................................................................................... i MỤC LỤC ................................................................................................................. ii DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................ v DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................ vi TỪ VIẾT TẮT ........................................................................................................ vii CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU ....................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề............................................................................................................ 1 1.2. Mục tiêu đề tài..................................................................................................... 1 CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................... 2 2.1. Tổng quan về mắm cá chốt ................................................................................. 2 2.1.1. Giới thiệu chung về cá chốt ......................................................................... 2 2.1.2. Giới thiệu chung về mắm cá chốt ................................................................. 2 2.2. Tổng quan về collagen ........................................................................................ 3 2.2.1. Khái niệm .................................................................................................... 3 2.2.2. Phân loại collagen........................................................................................ 3 2.2.3. Cấu trúc và thành phần collagen .................................................................. 4 2.2.4. Tính chất của collagen ................................................................................. 6 2.2.5. Các tính chất khác của collagen ................................................................... 8 2.2.6. Ứng dụng của collagen ................................................................................ 8 2.3. Tổng quan về gelatin ........................................................................................... 9 2.3.1. Khái niệm .................................................................................................... 9 2.3.2. Cấu trúc và thành phần của gelatin ............................................................ 10 2.4. Tổng quan về enzyme collagenase .................................................................... 11 2.4.1. Đại cương về collagenase .......................................................................... 11 Chuyên ngành Công nghệ sinh học ii Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2014 Trường ĐHCT 2.4.2. Kích thước và cấu trúc phân tử enzyme collagenase .................................. 13 2.4.3. Ứng dụng của collagenase ......................................................................... 14 2.5. Những vi sinh vật có khả năng sản xuất collagenase ....................................... 15 2.5.1. Vi khuẩn Pseudomonas ............................................................................. 15 2.5.2. Vi khuẩn Bacillus ...................................................................................... 15 2.5.3. Vi khuẩn Clotridium .................................................................................. 16 2.6. Các nghiên cứu về vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp collagenase ............. 17 2.6.1. Nghiên cứu trong nước .............................................................................. 17 2.6.2. Nghiên cứu ngoài nước .............................................................................. 17 CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 19 3.1. Thời gian và địa điểm ....................................................................................... 19 3.2. Phƣơng tiện nghiên cứu .................................................................................... 19 3.2.1. Nguyên vật liệu ......................................................................................... 19 3.2.2. Thiết bị, hóa chất ....................................................................................... 19 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................. 20 3.3.1. Phân lập vi khuẩn có tiềm năng sinh tổng hợp collagenase ........................ 20 3.3.2. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp collagenase............................................ 22 3.3.3. Khảo sát hoạt tính collagenase từ các dòng vi khuẩn được tuyển chọn ...... 23 3.3.4. Xác định đặc điểm hình thái, sinh hoá các dòng vi khuẩn được tuyển chọn25 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 26 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn có tiềm năng sinh tổng hợp collagenase .............. 26 4.2. Khả năng sinh tổng hợp collagenase của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc . 27 4.3. Hoạt tính collagenase của các dòng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn ...................... 29 4.4. Đặc điểm hình thái, sinh hoá của các dòng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn .......... 30 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 33 5.1. Kết luận ............................................................................................................. 33 5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 34 Chuyên ngành Công nghệ sinh học iii Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2014 Trường ĐHCT PHỤ LỤC ..................................................................................................................... Phụ lục 1: Các hình ảnh Phụ lục 2: Hình thái khuẩn lạc và mật số vi khuẩn Phụ lục 3: Số liệu thí nghiệm Phụ lục 4: Kết quả thống kê Chuyên ngành Công nghệ sinh học iv Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1: Phân bố của các loại collagen ...................................................................... 4 Bảng 2: Sự phân bố các acid amin trong chuỗi polypeptide ...................................... 5 Bảng 3: Một số collagenase từ các nguồn vi sinh vật ...............................................12 Bảng 4: Một số collagenase từ các mô, tế bào động vật ...........................................13 Bảng 5: Thành phần môi trường Czapek cải tiến nuôi cấy mẫu ................................21 Bảng 6: Nồng độ pha loãng mẫu ..............................................................................21 Bảng 7: Nồng độ dung dịch leucine dựng đường chuẩn ...........................................24 Bảng 8: Các giai đoạn và hóa chất trong nhuộm Gram .............................................25 Bảng 9: Tỷ lệ về đặc điểm khuẩn lạc của 33 dòng vi khuẩn phân lập được .............26 Bảng 10: Hoạt tính collagenase của các dòng vi khuẩn được tuyển chọn .................29 Bảng 11: Đặc điểm hình thái của 2 dòng vi kuẩn TS9 và TS13 ................................30 Bảng 12: Đặc tính sinh hóa của 2 dòng vi khuẩn TS9 và TS13 ................................31 Chuyên ngành Công nghệ sinh học v Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Cá chốt ......................................................................................................... 2 Hình 2. Các gốc carboxyl và amin trong môi trường kiềm và acid ............................ 7 Hình 3. Gelatin dạng bột và cấu trúc phân tử ...........................................................10 Hình 4. Enzyme collagenase ....................................................................................11 Hình 5. Vi khuẩn Pseudomonas ...............................................................................15 Hình 6. Vi khuẩn Bacillus ........................................................................................16 Hình 7. Phương pháp đếm sống ...............................................................................22 Hình 8. Hình thái khuẩn lạc của dòng TS1 ...............................................................27 Hình 9. Biểu đồ khả năng phân giải collagen của các dòng vi khuẩn ........................28 Hình 10. Đặc tính Gram của 2 dòng vi khuẩn TS9 và TS13 .....................................31 Hình 11. Kết quả kiểm tra hoạt tính catalase của 2 dòng TS9 và TS13 .....................31 Hình 12. Kết quả kiểm tra amylase (A) và methyl Red (B) của TS9 và TS13 ..........32 Hình 13. Kết quả kiểm tra VP (A) và indol (B) của 2 dòng TS9 và TS13 .................32 Chuyên ngành Công nghệ sinh học vi Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2014 Trường ĐHCT TỪ VIẾT TẮT CFU Colony Forming Unit CNSH Công nghệ Sinh học ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long ĐC Đối chứng ĐHCT Đại học Cần Thơ ĐK Đường kính kDa Kilo Dalton MR Methyl Red NC & PT Nghiên cứu và phát triển OD Optical Density SHPTTV Sinh học phân tử thực vật TCA Trichloroacetic acid TS Tiến sĩ UV Ultraviolet VASEP Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers (Hiệp hội Chế biến & Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam) VP Voges Proskauer Chuyên ngành Công nghệ sinh học vii Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2014 Trường ĐHCT CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Collagen là thành phần chính của mô liên kết, chiếm tới 25% tổng lượng protein trong cơ thể con người và cũng là thành phần chính trong da cá, đặc biệt là cá da trơn. Các loại cá này chủ yếu được nuôi trên các con sông lớn thuộc các tỉnh An Giang, Đồng Tháp. Từ khi Việt Nam mở rộng xuất khẩu thì nghề nuôi cá da trơn bước sang một trang mới và trở thành một nguồn xuất khẩu mang về ngoại tệ cao. Bên cạnh đó là vấn đề môi trường, hệ thống xử lý nước thải và các công trình bảo vệ môi trường tuy đã được đầu tư nhưng chưa thường xuyên được nâng cấp nên vẫn còn tình trạng chất thải quá tải từ các nhà máy vẫn còn nhiều. Ước tính nếu đưa vào sản xuất 700.000 tấn cá tra sẽ loại ra 10.000 tấn mỡ và khoảng 50.000 - 70.000 tấn phế liệu da và xương (Hiệp hội Chế biến & Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam, viết tắt VASEP). Do đó, nguồn phụ phẩm từ da cá là khá nhiều cần được xử lý. Sau khi chết, tất cả sản phẩm sinh khối của cá da trơn sẽ được khoáng hóa nhờ hệ thống enzyme được cung cấp bởi vi sinh vật. Việc ứng dụng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase đạt được các ưu thế quan trọng là không gây hại với môi trường, nâng cao giá trị dinh dưỡng của sản phẩm protein, cũng như mỹ phẩm và đạt được hiệu quả về kinh tế hơn so với các phương pháp vật lý và hóa học. Mắm cá chốt là một loại mắm được sản xuất từ một trong những loại cá da trơn phổ biến ở vùng ĐBSCL, chúng chứa 1 số vi khuẩn có khả năng phân giải collagen trong da cá. Vì vậy đề tài “phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp collagenase từ mắm cá chốt” được thực hiện với mục đích tuyển chọn các dòng vi khuẩn sinh tổng hợp collagenase cao để ứng dụng vào việc tận dụng và xử lý các phụ phế phẩm của nghề nuôi cá da trơn, giúp hướng tới sự phát triển nông nghiệp bền vững và thân thiện với môi trường. 1.2. Mục tiêu đề tài Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme collagenase có hoạt tính cao để sản xuất collagen từ phần phụ phế phẩm của cá da trơn. Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học 1 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2014 Trường ĐHCT CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về mắm cá chốt 2.1.1. Giới thiệu chung về cá chốt Cá chốt trắng là một loài cá thuộc họ cá lăng (Bagridae). Theo Bleeker (1851), cá chốt trắng có tên khoa học: Mystus wolffii và tên tiếng Anh: Iridescent mystus. Cá chốt là một loài cá da trơn, thân dẹp bên, đầu nhỏ, hình nón, mặt dưới hơi phẳng, mõm có dạng bầu dục có 4 đôi râu, mắt to, không có da che phủ, nằm lệch về phía lưng của đầu, gần như cách đều chót mõm với điểm cuối xương nắp mang, lỗ mang rộng, màng mang phát triển, gai vây ngực và gai vây lưng cứng nhọn, mặt sau của gai này có răng cưa hướng xuống gốc, vây mỡ nằm đối diện với vây hậu môn và chiều dài hai gốc vây này tương đương nhau. Phần lưng của thân và đầu có màu trắng xám, toàn thân ánh lên màu vàng nghệ, các vây có màu vàng sậm, phần ngọn vây lưng, vây đuôi, vây hậu môn, vây mỡ màu xám đen, râu mép màu đen, các râu khác màu nhạt hơn, thịt có màu vàng óng hoặc trắng (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993). Loài này sinh sống ở Xumatra, Borneo, Thái Lan và ở Việt Nam loài này tập trung nhiều trong khu vực ĐBSCL. Cá chốt trắng sống ở những khe đá tại khu vực nước chảy xiết, mực nước sâu từ 7 đến 7,5 m, ở những khu vực nước chảy mạnh và sâu. Cá chốt là một loại cá có nhiều trên các sông rạch gần biển, thích nghi với môi trường nước lợ. Khi mưa xuống, cá chốt từ sông lên đồng đẻ trứng. Hình 1. Cá chốt (*Nguồn: http://www.scotcat.com, ngày 15/01/2014) 2.1.2. Giới thiệu chung về mắm cá chốt Mắm là một loại thực phẩm được chế biến từ cá hay thủy sản có ướp muối mặn để bảo quản lâu, có thể được sử dụng trực tiếp hoặc xử lý tiếp bằng cách nấu, lọc. Ví dụ: nước mắm có xử lý tiếp bằng cách nấu, lọc. Ở Việt Nam thường làm từ cá biển (như cá cơm) hoặc đôi khi từ tôm, tép biển. Mắm tôm, mắm tép, mắm ruốc: không qua nấu lọc. Thường có thêm gia vị để tạo hương vị thơm ngon hơn. Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học 2 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2014 Trường ĐHCT Mắm cá chốt là một loại mắm làm từ cá chốt. Để mắm cá chốt ngon hơn, cá chốt bắt về ngâm nước lạnh chừng 2 giờ, chặt hai ngạnh to dính ở đầu, bỏ ruột, rửa sạch, để ngoài trời phơi nắng vừa ráo, xong đem vào ướp muối, đặc biệt muối cá chốt là muối rang hết nổ. Theo kinh nghiệm làm mắm của một số người làm mắm truyền thống ở ĐBSCL, cứ 1kg cá chốt cho vào khoảng 10ml rượu đế, 5g đường, 10g thính, 3g muối rang. Trộn thật đều cho vào hũ ém chặt lại, quá trình lên men từ 7 – 10 ngày là dùng được. Khi cá lên men thường chứa hơi nước, trước khi ăn nên ép bớt nước. 2.2. Tổng quan về collagen 2.2.1. Khái niệm Collagen là loại protein cấu trúc trong cơ thể động vật, được phân bố trong các bộ phận như da, cơ, gân, dây chằng xương, móng, răng, sụn, giác mạc,... Collagen có nhiệm vụ kết nối các mô trong cơ thể lại với nhau. Chúng giống như một chất keo dính các bộ phận trong cơ thể người lại thành một khối hoàn chỉnh, nếu không có chúng cơ thể người sẽ chỉ là các phần rời rạc, điều này chỉ ra tầm quan trọng của collagen với sự sống của con người. Trong thành phần của da, ở lớp bì chứa rất nhiều collagen tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ cho các đặc tính cơ học của da như sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm,… Tùy theo từng độ tuổi, điều kiện sống, tác nhân môi trường, da có thể bị lão hóa hoặc tổn thương, sợi collagen mất dần tính đàn hồi và săn chắc do cấu trúc collagen bị phá vỡ (Osamo Masushita et al., 1994). 2.2.2. Phân loại collagen Tính đến thời điểm hiện nay, có 42 chuỗi polypeptide của collagen đã được nhận dạng. Chúng được mã hóa bởi 41 loại gen khác nhau tạo thành 29 loại collagen. Trên 90% collagen trong cơ thể là dạng I, II, III và IV. Hiện tại có khoảng 13 loại collagen được ly trích. Chúng khác nhau về chiều dài chuỗi xoắn ốc cũng như thành phần và kích cỡ của những thành phần không xoắn ốc. Collagen loại I là phổ biến nhất và thường có trong các mô liên kết như da, xương và gân. Collagen loại II hầu như tồn tại ở các mô sụn. Collagen loại III phụ thuộc rất lớn vào độ tuổi của động vật (da heo non chứa 50%), tỷ lệ này sẽ giảm 5– 10% theo thời gian. Những loại collagen khác chỉ hiện diện với lượng rất nhỏ và chỉ ở một số cơ quan đặc biệt. Những bệnh tật liên quan đến collagen là do sự khuyết tật về Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học 3 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2014 Trường ĐHCT gen ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp, sự sắp xếp cũng như các quá trình khác trong sự sản sinh collagen một cách không bình thường. Bảng 1: Phân bố của các loại collagen Loại Phân bố I Da, gân, mạch máu, các cơ quan, xương (thành phần chính của xương) II Sụn xương(thành phần chính của sụn) III Có trong bắp (thành phần chính của bắp), tìm thấy bên cạnh collagen I. Mạch máu, van tim, hạ bì, ruột, nướu răng, thành tử cung. IV Thành phần chính cấu tạo màng tế bào V Dây chằng, giác mạc, kẽ hở giữa các mô VI Có trong gan, thận, màng sụn, da, cơ tim. VII Da, phổi, sụn, giác mạc, nhau. VIII Có trong màng trong IX - X Sụn XI Sụn, đĩa đệm cột sống, dịch thủy tinh. XII Gân, dây chằng. XIII Biểu bì da, nang tóc, tế bào gốc móng, xương. XIV Sợi liên kết collagen XV Các mô khác nhau, tương đồng với collagen loại XVII XVIII Da XIX Mắt, não, tinh hoàn, mô trong thời kỳ đầu phát triển XX - XXIX Còn đang nghiên cứu (*Nguồn: http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-cong-nghe-trich-ly-collagen-va-ung-dung-collagen-trong-linhvuc-y-khoa-8830/, ngày 15/1/2014) 2.2.3. Cấu trúc và thành phần collagen  Cấu trúc collagen Collagen có cấu trúc rất phức tạp, dạng sợi hình ống chiều dài khoảng 300nm với đường kính 1,5 nm. Mỗi sợi collagen được cấu tạo từ ba chuỗi polypeptide (anpha peptide) nối với nhau bằng liên kết hydro và xoắn lại với nhau giống như sợi “dây thừng”. Mỗi một vòng xoắn có độ dài là 3,3 gốc acid amin, chiều cao là 2,9Ao. Mỗi Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học 4 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2014 Trường ĐHCT chuỗi có hình dạng ống xoắn từ trái sang phải. Ba chuỗi này xoắn lại với nhau hình thành một cuộn có hướng từ trái sang phải, gọi là triple helix. Trong những năm 30 của thế kỷ XIX, collagen lần đầu tiên được phát hiện là có cấu trúc phân tử. Những người đoạt giải Nobel như Francis Crick (1962), Linus Pauling (1992), Rich (1954), Ada Yonath (2009) và những người khác đã tiến hành nghiên cứu cấu trúc và những chức năng của collagen. Mô hình Madras (cấu trúc xoắn ba) cung cấp một cách chính xác mô hình của cấu trúc bậc bốn của phân tử. Collagen được tập hợp thành các loại collagen sợi theo hình lục giác, có thể có dạng tấm hoặc dạng sợi siêu nhỏ. Cấu trúc sợi siêu nhỏ của gân người trưởng thành được xác nhận bởi Fraser, Miller và Wess vào năm 2006. Các chuỗi collagen sắp xếp song song theo chiều dọc liên kết với nhau bằng liên kết ngang tạo thành các sợi theo chu kỳ nhất định. Chúng được sắp xếp so le nhau một khoảng 67nm và có khoảng trống 40nm ở giữa những phân tử liền kề nhau. Nhờ vào cấu trúc có trật tự, độ bền của collagen đã cung cấp cho các mô độ chắc, độ đàn hồi và những đặc tính cơ học riêng.  Thành phần các acid amin có trong collagen Mỗi loại collagen gồm có hàng nghìn cấu trúc acid amin, chủ yếu gồm có glycine, proline, hydroxyproline. Collagen không chứa tryptophan, và là một trong số ít các protein chứa hdroxylysine. Các acid amin sắp xếp trong chuỗi xoắn ốc theo các dãy với sự phân bố như sau: Bảng 2: Sự phân bố các acid amin trong chuỗi polypeptide Bộ ba acid amin Tỷ lệ Gly–X–X 0,44 Gly–X–I 0,20 Gly–I–X 0,27 Gly–I–I 0,09 (*Nguồn: Kunardi, 2003) Trong đó, I là proline hoặc hydroxyproline, X là các acid amin khác. Do glycine có các nhánh phụ nhỏ nhất nên sự lặp lại của nó làm các chuỗi polypeptide kết hợp chặt chẽ với nhau tạo thành một đường xoắn ốc với khoảng trống nhỏ ở phần lõi. Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học 5 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2014 Trường ĐHCT Trong collagen không chứa tryptophan, cysteine như các loại protein khác, đồng thời tyrosine, histidine và các acid amin chứa lưu huỳnh hiện diện không quá 1%, điều này làm cho cầu nối disulfur (-S-S) trong cấu trúc collagen ít xuất hiện và là nguyên nhân cho collagen có tính mềm dẻo hơn so với keratin. Trong collagen có chứa đến 30% glycine, 10% hydroxyproline, 12% proline, 11% alanine. Một đặc trưng của collagen là sự sắp xếp đều đặn của các acid amin trong từng chuỗi xoắn collagen này. Thông thường các chuỗi có cấu trúc theo mẫu sau: Gly– Protein–Y hoặc Gly–X–Hyp, trong đó X và Y là các acid amin khác. Proline (Pro) hoặc hydroxyproline (Hyp) chiếm khoảng 1/6 tổng số chuỗi, glycine chiếm 1/3 số chuỗi. Tổng cộng chỉ riêng proline, hydroxyproline và glycine chiếm 1/2 chuỗi collagen, các acid amin khác chiếm 1/2. Sự phân bố đều đặn với số lần lặp lại cao được tìm thấy ở một số ít loại protein dạng sợi, như sợi tơ tằm. Chiếm 75 - 80 % của sợi tơ tằm là Gly–Ala–Gly–Ala với 10% serine. 2.2.4. Tính chất của collagen  Tác dụng với nước Collagen không hòa tan trong nước mà nó hút nước để “nở ra”, cứ 100g collagen khô có thể hút được khoảng 200g nước. Collagen “nở” trong nước, độ dày tăng lên chừng 25% nhưng độ dài tăng lên không đáng kể, tổng thể tích của phân tử collagen tăng lên 2 – 3 lần. Do nước phân cực tác dụng lên liên kết hydro trong liên kết phối trí của collagen làm giảm tính vững chắc của sợi gelatin 3 – 4 lần. Khi nhiệt độ tăng lên cao, độ linh hoạt của mạch polypeptide tăng mạnh, làm cho mạch bị yếu đi. Khi nhiệt độ tăng lên khoảng 60 – 65oC collagen “hút” nước bị phân giải. Nhiệt độ phân giải của collagen trong nguyên liệu chưa xử lý tương đối cao. Khi nguyên liệu đã khử hết khoáng thì nhiệt độ phân giải sẽ giảm xuống (Hwang J. H. et al., 2007).  Tác dụng với acid, kiềm Collagen có thể tác dụng với acid và kiềm, do trên mạch collagen có hai nhóm carboxyl và amin. Trong điều kiện có nước, nước có thể tác dụng với những ion Na +, Cl- và nhóm gốc có mang điện tích của collagen làm tăng tính hấp phụ nước, do đó trong môi trường acid và kiềm thì tính trương nở của collagen được tăng lên. Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học 6 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2014 Trường ĐHCT Hình 2. Các gốc carboxyl và amin trong môi trƣờng kiềm và acid (*Nguồn: http://doc.edu.vn/tai-lieu/do-an-tong-quan-ve-collagen-va-ung-dung-cua- collagen-52829/, ngày 16/01/2014) Ngoài ra, acid và kiềm còn gây ra một số biến đổi: - Cắt đứt liên kết giữa –NH3+ và –COO- làm đứt mạch petide trong mạch chính. - Làm đứt liên kết hydrogen giữa gốc –CO, NH– của mạch xung quanh nó. - Làm acid amin bị phân hủy giải phóng ra ammoniac. - Cùng với biến đổi đó, điểm đẳng điện của collagen hạ xuống thấp, acid và kiềm có thể phân hủy collagen. - Trong điều kiện thường, thời gian có thể làm cho collagen bị phân giải (mức độ phân giải thấp) khi nhiệt độ tăng thì phân giải cũng tăng lên nhanh chóng. Collagen phân giải biến thành gelatin, căn cứ vào giả thuyết của Hofmeister (1902) phản ứng sẽ tiến hành như sau: (to, xt) C102H149O38 (collagen) + H2O C102H151N31O39 (Gelatin) Nếu xử lí trong điều kiện nhiệt độ cao và có nước thì keo (gelatin) dễ tiếp tục biến đổi thành: (to) C102H151N31O39 + 2H2O C55H85N17O22 (Gelstose) + C47H70O19 (Gletone) + 7N2 Do đó nếu muốn sản xuất genlatin thì cần phải khống chế nhiệt độ thích hợp cho chất lượng gelatin được đảm bảo. Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học 7 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2014 Trường ĐHCT 2.2.5. Các tính chất khác của collagen  Khả năng tạo nhũ tương: Là một loại protein không tan, collagen ít có khả năng là một chất nhũ hóa. Tuy nhiên, collagen có nguồn gốc từ da sống được xử lý và biến tính ở mức độ khác nhau có thể là một chất nhũ hóa tốt hơn sữa gầy.  Khả năng hòa tan: Collagen tan trong glycerin, acid acetic, ure nhưng không tan trong nước lạnh. Collagen cũng đã được phân chia thành bốn lớp trên cơ sở tính hòa tan trong các dung dịch đệm khác nhau: tan trong muối trung tính, tan trong acid, tan trong kiềm và không tan trong kiềm.  Sự biến tính: Dưới tác dụng của các chất hóa học như acid, kiềm, muối, các dung môi alcohol và các tác nhân vật lý như khuấy trộn cơ học, nghiền, tia cực tím,… các liên kết hydro, các cầu nối disunfide, các liên kết ion bị phá vỡ làm cho các cấu trúc bậc hai, ba và bốn của collagen bị biến đổi nhưng không phá vỡ liên kết peptide, tức là cấu trúc bậc một vẫn giữ nguyên, collagen sẽ thay đổi tính chất so với ban đầu.  Tính kỵ nước: Độ kỵ nước có thể giải thích là do các acid amin có chứa các gốc R- không phân cực nên nó không có khả năng tác dụng với nước. Tính kỵ nước sẽ ảnh hưởng rất nhiều đến tính tan của collagen.  Tính chất của dung dịch keo: Khi hòa tan collagen thành dung dịch keo thì nó không đi qua màng bán thấm. Hai yếu tố đảm bảo độ bền của dung dịch keo là: sự tích điện cùng dấu của các protein và lớp vỏ hydrate bao quanh phân tử protein.  Tính chất điện ly lưỡng tính: Collagen có tính chất lưỡng tính vì trong acid amin có chứa gốc acid (COO-) và gốc base (NH2-). 2.2.6. Ứng dụng của collagen Cùng với keratin mềm, collagen là thành phần tạo ra độ dẻo dai của da và nếu nó thoái hóa sẽ gây ra nếp nhăn ở tuổi già. Collagen còn tạo nên độ bền của thành mạch máu và đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển mô tế bào. Nó có trong giác mạc, thủy tinh thể của mắt. Collagen cũng được dùng trong phẫu thuật thẩm mỹ và phẫu thuật bỏng. Collagen đã phân giải có thể đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh cân nặng, giống như protein khi ta dùng nó có cảm giác cung cấp đủ năng lượng.  Ứng dụng trong công nghiệp Trong lĩnh vực dinh dưỡng, collagen là nguồn protein nghèo, chúng không cung cấp đầy đủ tất cả các acid amin thiết yếu cho cơ thể con người. Các nhà sản xuất Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học 8 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2014 Trường ĐHCT collagen để làm thực phẩm bổ sung cho rằng sản phẩm của họ giúp tái tạo da, móng tay và tăng cường sức khỏe. Tuy nhiên, các nghiên cứu khoa học hiện nay chưa chỉ ra được những bằng chứng cho điều này. Xuất phát từ tiếng Hy Lạp của từ keo (glue), kola, collagen trên thế giới có nghĩa là “nhà sản xuất keo”, quá trình nấu da với gân của ngựa và động vật khác có thể thu được keo. Keo dán collagen đã được sử dụng ở Ai Cập từ 400 năm trước và người châu Mỹ cổ đã dùng nó trong cung tên từ 1500 năm trước. Keo dán từ động vật có tính nhiệt dẻo, mềm trở lại khi gia nhiệt, vì vậy chúng được sử dụng làm dụng cụ âm nhạc như dây đàn violon, đàn guitar.  Ứng dụng trong y học và dược phẩm Collagen đã được sử dụng rộng rãi trong phẫu thuật thẩm mỹ, như là hỗ trợ chữa bệnh bỏng, làm tái tạo xương và rất nhiều trong nha khoa, phẫu thuật chỉnh hình. Collagen đang được dùng rộng rãi để thay thế da nhân tạo trong việc chữa trị bỏng nặng. Những collagen có thể được bắt nguồn từ bò, ngựa hoặc lợn, thậm chí cả con người, đôi khi được sử dụng kết hợp với silicones, glycosaminoglycan, nguyên bào sợi, các yếu tố tăng trưởng và các chất khác. Collagen cũng được bán thương mại như là một chất bổ sung tính linh động. Gần đây, một nguồn collagen có sẵn thay thế cho collagen động vật đã được sử dụng mặc dù đắt tiền. Đó là collagen của con người, bắt nguồn từ xác người hiến tặng, nhau thai và bào thai bị bỏ, có thể giảm thiểu khả năng xảy ra các phản ứng miễn dịch. Mặc dù không thể hấp thụ qua da, collagen đang được sử dụng như một thành phần chính cho một số mỹ phẩm trang điểm. 2.3. Tổng quan về gelatin 2.3.1. Khái niệm Gelatin là một chất rắn trong, không màu, dễ gãy (khi khô), không mùi, có nguồn gốc từ collagen của các sản phẩm thu được từ các loài động vật khác nhau. Gelatin là một dạng collagen được phân giải không thể phục hồi và được phân loại như một loại thực phẩm. Nó được tìm thấy trong hầu hết các loại kẹo gummy (kẹo thạch) cũng như các sản phẩm khác như kẹo dẻo, một số kem và sữa chua. Số lượng gelatin sản xuất trên toàn thế giới là khoảng 375.000 tấn mỗi năm. Trên quy mô thương mại, gelatin được làm từ các sản phẩm của thịt và da công nghiệp. Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học 9