Tài liệu Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ trái cây có múi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ACID ACETIC CHỊU NHIỆT TỪ TRÁI CÂY CÓ MÚI CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS. HUỲNH XUÂN PHONG NGUYỄN THỊ THUỲ DƢƠNG MSSV: 3113707 LỚP: VI SINH VẬT HỌC K37 Cần Thơ, Tháng 12/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ACID ACETIC CHỊU NHIỆT TỪ TRÁI CÂY CÓ MÚI CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS. HUỲNH XUÂN PHONG NGUYỄN THỊ THUỲ DƢƠNG MSSV: 3113707 LỚP: VI SINH VẬT HỌC K37 Cần Thơ, Tháng 12/2014 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS. Huỳnh Xuân Phong Nguyễn Thị Thuỳ Dương DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………….……………………….. Cần Thơ, ngày tháng 12 năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, cùng Quý Thầy Cô đã tận tình giảng dạy tôi trong thời gian học tập vừa qua và tạo mọi điều kiện cho tôi thực hiện luận văn này. Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ cán bộ và sinh viên trong Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực phẩm. Tôi chân thành cảm ơn cô Ngô Thị Phương Dung, thầy Huỳnh Xuân Phong và thầy Phạm Hồng Quang đã tận tình truyền đạt kiến thức cùng với anh Nguyễn Ngọc Thạnh đã tận tình giúp đỡ hướng dẫn và đóng góp ý kiến cho tôi trong suốt quá trình thực hiện thí nghiệm, các anh chị cán bộ các phòng thí nghiệm của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ để tôi hoàn thành tốt luận văn này. Cám ơn gia đình, người thân và bạn bè luôn là chỗ dựa vững chắc cho tôi về tinh thần và vật chất giúp tôi an tâm học tập và làm luận văn trong thời gian qua. Nguyễn Thị Thùy Dương Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ TÓM LƢỢC Acid acetic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, acid acetic là một acid hữu cơ được sử dụng phổ biến trong điều vị và chế biến thực phẩm. Vi khuẩn acid acetic có ý nghĩa rất quan trọng trong các quá trình lên men, trong đó lên men giấm được ứng dụng rộng rãi và phổ biến nhất. Đề tài đã phân lập được 25 dòng vi khuẩn acid acetic (Acid Acetic Bacteria, AAB) từ 11 mẫu trái cây có múi được lấy từ 7 tỉnh ĐBSCL (Vĩnh Long, Đồng Tháp, Hậu Giang, Kiên Giang, Bến Tre, Sóc Trăng, Cà Mau. Định danh sơ bộ thông qua khả năng oxy hóa acetate cho thấy có 22 chủng thuộc giống Acetobacter và 3 chủng thuộc giống Gluconobacter. Kết quả thử nghiệm khả năng sinh acid trên môi trường 0,01% bromocresol green, khảo sát khả năng phát triển ở các nhiệt độ (30oC,37oC, 39oC, 41oC, 43oC và 45oC) và nồng độ acid ban đầu (0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5% và 3%) đã sơ tuyển được 10 chủng AAB (VB.VL1, VB.VL6, RB.BT1, RB.BT2, RC.BT, RC.KG1, VCh.VL1, VCh.VL3, VCh.CM2 và VQ.BT). Kết quả thí nghiệm lên men ở các nhiệt độ khác nhau đã tuyển chọn được hai chủng vi khuẩn chịu nhiệt và có khả năng lên men acid mạnh là VCh.VL1 và VQ.BT, trong đó chủng VCh.VL1 vượt trội hơn chủng còn lại ở nhiệt độ cao về cả mật số và khả năng sinh acid, đạt 0,6% w/v vào ngày lên men thứ 5. Kết quả thử nghiệm khả năng phát triển trên môi trường có bổ sung acid acetic cho thấy cả hai chủng VCh.VL1 và VQ.BT có thể phát triển đến trên nồng độ 0,4% w/v ở cả 37oC và 39oC. VCh.VL1 có khả năng có khả năng sinh acid tốt hơn chủng RB.ST2 trong môi trường có 4% w/v ethanol ở 37oC đạt đến 0,64% w/v. Từ khoá: acid acetic, vi khuẩn acid acetic. Chuyên ngành Vi Sinh vật học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ............................................................................................................. 0 TÓM LƢỢC................................................................................................................ i MỤC LỤC .................................................................................................................. ii DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................ iv DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................. v CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................................. vi CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU ....................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1 1.2. Mục tiêu đề tài ................................................................................................. 2 CHƢƠNG 2: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................... 3 2.1. Giới thiệu quá trình lên men từ vi sinh vật .................................................... 3 2.1.1. Bản chất của quá trình lên men ................................................................... 3 2.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ............................................... 3 2.2. Giới thiệu quá trình lên men acid acetic ........................................................ 4 2.3. Vi khuẩn acid acetic ........................................................................................ 5 2.3.1. Một số loài Vi khuẩn acid acetic có nhiều ý nghĩa thực tế ........................... 5 2.3.2. Một số ứng dụng quan trọng của vi khuẩn Acetobacter ............................... 7 CHƢƠNG 3: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 9 3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu .................................................................................. 9 3.1.1. Nguyên liệu ................................................................................................ 9 3.1.2. Hoá chất...................................................................................................... 9 3.1.3. Thiết bị, dụng cụ ......................................................................................... 9 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................ 9 3.2.1. Phân lập các dòng vi khuẩn acid acetic ....................................................... 9 3.2.2. Xác định đặc tính hình thái, sinh hoá của các dòng vi khuẩn acid acetic.... 10 3.2.3. Thử nghiệm khả năng sinh acid acetic ....................................................... 10 3.2.4. Khảo sát khả năng phát triển và lên men ở các nồng độ acid khác nhau ... 11 Chuyên ngành Vi Sinh vật học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ 3.2.5. Khảo sát khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn acid acetic .............................. 11 3.2.6. Tuyển chọn dòng vi khuẩn acetic chịu nhiệt có khả năng sinh acid mạnh .. 11 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 12 4.1. Phân lập các dòng vi khuẩn acid acetic ........................................................ 12 4.2. Xác định đặc tính hình thái, sinh hóa của các dòng vi khuẩn acid acetic . .. 14 4.3. Thử nghiệm khả năng sinh acid acetic. ........................................................ 18 4.4. Khả năng phát triển ở các nồng độ acid khác nhau. .................................... 20 4.5. Khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn acid acetic. ............................................. 22 4.6. Tuyển chọn vi khuẩn acetic chịu nhiệt có khả năng sinh acid mạnh. ......... 24 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 30 5.1 Kết luận........................................................................................................... 30 5.2 Đề nghị ............................................................................................................ 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 31 Chuyên ngành Vi Sinh vật học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 1. Kết quả xác định hình thái, sinh lý, sinh hóa ............................................ 14 Bảng 2. Kết quả định danh sơ bộ các chủng AAB ................................................. 17 Bảng 4. Khả năng phát triển ở các nồng độ acid khác nhau của các chủng AAB 21 Bảng 5. Kết quả thử nghiệm khả năng chịu nhiệt cao của các dòng AAB ............ 23 Chuyên ngành Vi Sinh vật học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Vi khuẩn Acetobacter xylinum .................................................................... 6 Hình 2. Khuẩn lạc tạo vòng halo trên môi trƣờng (A), môi trƣờng đối chứng có CaCO3 (B) và không có CaCO3 (C) ........................................................... 12 Hình 3. Một số chủng AAB tạo vòng sáng halo trên môi trƣờng có CaCO 3 ......... 12 Hình 4. Hình nhuộm Gram (độ phóng đại 100) của một số dòng AAB ................ 13 Hình 5. Sƣ biến đổi màu môi trƣờng chỉ thị sau 72 giờ. ....................................... 16 Hình 6. Sự biến đổi màu chỉ thị của một số dòng AAB ở 24 giờ ............................ 18 Hình 7. Khả năng phát triển ở nồng độ acid 0,5% của một số chủng AAB .......... 20 Hình 8. Thử khả năng chịu nhiệt của một số chủng AAB ở: 41oC (A) và 43oC (B) ..................................................................................................................... 22 Hình 9. Sự phát triển của mƣời chủng vi khuẩn AAB ở 30oC ............................... 25 Hình 10. Sự biến đổi hàm lƣợng acid của mƣời chủng vi khuẩn AAB ở 30oC ..... 25 Hình 11. Sự phát triển của mƣời chủng vi khuẩn AAB ở 37oC ............................. 26 Hình 12. Sự thay đổi hàm lƣợng acid sinh ra của mƣời chủng AAB ở 37oC ........ 26 Hình 13. Sự phát triển của mƣời chủng vi khuẩn AAB ở 38oC ............................. 27 Hình 14. Sự thay đổi hàm lƣợng acid sinh ra của mƣời chủng AAB ở 38oC ........ 27 Hình 15. Sự phát triển của mƣời chủng vi khuẩn AAB ở 39oC ............................. 28 Hình 16 . Sự thay đổi hàm lƣợng acid sinh ra của mƣời chủng AAB ở 39 oC ....... 28 Chuyên ngành Vi Sinh vật học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ CÁC TỪ VIẾT TẮT AAB Acetic Acid Bacteria ĐBSCL Đồng bằng Sông Cửu Long MC Bacterial cellulose NADP Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Chuyên ngành Vi Sinh vật học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Acid acetic là một hoá chất có giá trị kinh tế cao, nó được ứng dụng nhiều trong công nghiệp như: công nghiệp tổng hợp hữu cơ, công nghiệp thực phẩm, công nghiệp chế biến mủ cao su,... cho nên nhu cầu ngày càng tăng. Acid acetic được dùng nhiều trong sản xuất các sản phẩm như: giấm, L-sorbose, dihydroxyacetone, D-gluconate, keto-D-gluconates (Matsushita, 2009). Acid acetic có thể dùng trực tiếp trong các bữa ăn như giấm. Trong những nghiên cứu gần đây của các nhà khoa học, giấm có chứa các chất như acid amin, glucerin có tác dụng làm giảm gàu, giảm cân, tốt cho những người bị viêm khớp, tốt cho dạ dày, giảm đau do viêm xoang,... đặc biệt là các sản phẩm lên men acid acetic giàu chất dinh dưỡng và an toàn cho sức khoẻ. Các sản phẩm lên men này nhớ một nhóm vi khuẩn gọi chung là vi khuẩn acid acetic (AAB, Acetic Acid Bacteria). Việc phân lập và tuyển chọn dòng vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng lên men acetic đang thu hút nhiều sự quan tâm vì nó mang nhiều lợi nhuận cho xã hội trong khi nhiệt độ trái đất đang nóng dần lên gây nhiều trở ngại cho việc lên men công nghiệp hiện nay. Thông qua đó có thể mở rộng quy trình sản xuất giấm và các sản phẩm lên men từ AAB ở quy mô công nghiệp mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nhà sản xuất, giảm giá thành và an toàn sức khoẻ cho người tiêu dùng. Việc phân lập và định danh các dòng AAB cũng góp phần làm phong phú thêm nguồn đa dạng sinh học nói chung và nguồn vi sinh vật nói riêng. Theo đó có thể định danh các dòng AAB có đặc tính tốt và sản xuất giống thuần chủng cung cấp cho các cơ sở sản xuất. Nguồn nguyên liệu để sản xuất acid acetic rất phong phú như: mật rỉ, nước trái cây chín, tinh bột, cồn và các loại có chứa cellulose như gỗ,... Việt nam là nước nông nghiệp có khí hậu nhiệt đới nên các nguyên liệu này rất dồi dào, đặc biệt là trái cây chín nói chung và trái cây có múi nói riêng. Trong dịch trái cây có múi (cam, chanh, bưởi, quýt,...) chứa nhiều chất bổ dưỡng như nước, glucid, protid, cellulose, acid citric, caroten...và nhiều khoáng như: Ca, Mg, Fe,... và vitamin như: C, B, B2,... là môi trường dinh dưỡng thuận lợi cho vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn acid acetic phát triển. Từ đó đề tài phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ trái cây có múi được thực hiện. Chuyên ngành Vi Sinh vật học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ 1.2. Mục tiêu đề tài Mục tiêu của đề tài là phân lập và tuyển chọn chủng AAB chịu nhiệt từ trái cây có múi có khả năng lên men acid tốt. Chuyên ngành Vi Sinh vật học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ CHƢƠNG 2: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu quá trình lên men từ vi sinh vật 2.1.1. Bản chất của quá trình lên men Công nghệ lên men từ vi sinh vật là công nghệ vi sinh và cũng là một trong các ngành quan trọng của công nghệ vi sinh vật. Công nghệ lên men vi sinh là một quá trình được ứng dụng nhiều trong sản xuất tạo ra các sản phẩm bằng kỹ thuật lên men với sự tham gia của các chủng vi sinh vật khác nhau. Quá trình lên men là một quá trình sinh học diễn ra liên tục, bắt đầu từ khâu tạo giống sinh khối, lên men và thu nhận sản phẩm cuối cùng và các giai đoạn này có liên quan mật thiết với nhau, ảnh hưởng qua lại lẫn nhau và hàng loạt các phản ứng sinh hoá diễn ra với sự tham gia xúc tác của các hệ enyme vốn được sinh ra từ chủng vi sinh tham gia trong quá trình. Bản chất của công nghệ lên men là những phản ứng oxy hoá khử sinh học, oxy hoá các hợp chất hữu cơ ở cơ thể sinh vật do các hệ enzyme oxy hoá khử cung cấp. Các quá trình này diễn ra trong điều kiện yếm khí hoặc hiếu khí. Tuỳ theo hệ enzyme tham gia vào quá trình lên men và tuỳ thuộc vào chủng vi sinh vật mà người ta chia quá trình lên men thành ba nhóm chính.  Lên men nhờ vi khuẩn như lên men acetic, lactic, butylic,…  Lên men nhờ nấm mốc như lên men acid citric, gluconic,…  Lên men nhờ nấm men như lên men bia, rượu, men bánh mì,… 2.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men Từ dịch đường bằng phương pháp lên men ta có thể thu được nhiều sản phẩm khác nhau. Mỗi loại vi sinh vật có thể cho một hoặc nhiều sản phẩm khác nhau tuỳ theo điều kiện môi trường hoặc một loại sản phẩm có thể thu được từ nhiều loại vi sinh vật khác nhau. Nhìn chung các quá trình lên men dù khác nhau về cơ chế, về điều kiện lên men nhưng đều có thể bị ảnh hưởng nhất định bởi môi trường. Chuyên ngành Vi Sinh vật học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ  Ảnh hưởng của nhiệt độ Mỗi vi sinh vật đều có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng. Đối với chủng ưu nhiệt trung bình, thì nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển sinh khối và lên men là 3032oC. Ở những nhiệt độ không thích hợp, làm giảm hoạt tính enzyme và có thể xảy ra hiện tượng lên men phụ phức tạp.  Ảnh hưởng của pH Nồng độ ion H+ trong môi trường có ảnh hưởng đến hoạt động của vi sinh vật. Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men. Đối với vi khuẩn lactic, khi pH nhỏ hơn 4 thì vi khuẩn ngừng hoạt động trong khi nấm men vẫn hoạt động bình thường và phát triển mạnh.  Ảnh hưởng của nồng độ dịch lên men Nồng độ dịch lên men là cơ chất của quá trình lên men. Nếu nồng độ đường quá cao sẽ làm tăng áp suất thẩm thấu và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của vi sinh vật. Bình thường dịch lên men có nồng độ chất tan từ 16-18% tương đương với khoảng 15% đường đối với quá trình lên men rượu và khoảng 10% đường đối với quá trình lên men lactic 2.2. Giới thiệu quá trình lên men acid acetic Acid acetic (CH3COOH) có thể thu được bằng phương pháp: chưng cất gỗ, tổng hợp hoá học hoặc lên men. Acid này được dùng trong sản suất chất màu, chất thơm, dung môi hữu cơ, ướp chua rau quả, chế biến thực phẩm,… Acid acetic dùng ăn trực tiếp trong các bữa ăn gọi là giấm ăn. Đó là sản phẩm lên men acid acetic. Quá trình lên men nhờ một nhóm vi khuẩn được gọi chung là vi khuẩn acetic, chúng oxy hoá rượu etylic thành acid acetic. Hiếu khí 2CH3CH2OH +2O2 2CH3COOH +2H2O Thực chất của quá trình này gồm hai phản ứng với 2 enzyme của vi khuẩn acetic xúc tác là Alcohol-dehyrogenase và Aldehyde-dehydrogenase. Hydro được NADP nhận và qua các Cytocrom của chuỗi hô hấp được chuyển cho O2 (chất nhận). Từ đến nay quá trình lên men acid acetic thuộc lên men hiếu khí nhưng thực chất đây là một quá trình chuyển hoá: vi sinh vật sử dụng cơ chất etanol và Chuyên ngành Vi Sinh vật học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ chuyển thành acid acetic. NADPH2 xuất hiện trong quá trình này có lẽ được chuyển hoá qua chuỗi hô hấp để thu năng lượng. Quá trình này cũng được coi là oxy hoá không hoàn toàn. Cơ chất bị phân giải không hoàn toàn, trong đó oxy là chất nhận hydro (Lương Đức Phẩm, 1998). 2.3. Vi khuẩn acid acetic Hiện nay người ta đã biết tới hơn 20 loài vi khuẩn có khả năng lên men acetic, chúng được gọi chung là vi khuẩn acetic. Những vi khuẩn này dễ tìm thấy trong không khí, đất, nước. Cho nên khi để các dịch nước quả, bia, rượu thấp, dịch đường tiếp xúc với không khí dễ bị vẫn đục nhẹ, phía trên mặt tạo một lớp màng mỏng, mịn màu trắng xám hoặc vàng xám. Đó là do các vi khuẩn acetic phát triển. Trước đây Pasteur cho rằng quá trình lên men giấm là do một loại vi sinh vật gấy ra được gọi là Mycoderma aceti. Sau này, người ta biết đó là nhiều loài vi khuẩn thuộc nhóm Acetobacter hoặc Bacterium. Theo Trần Minh Tâm (2000), vi khuẩn Acetobacter là loại vi khuẩn Gram âm, có thể xếp thành chuỗi dài hay ngắn, có khi đứng riêng lẻ. Vi khuẩn Acetobacter là các trực khuẩn, không sinh bào tử (Lương Đức Phẩm, 2001). Vi khuẩn acetic rất hiếu khí. Tốc độ sinh trưởng của chúng rất nhanh, từ 1 tế bào sau 12 giờ có thể phát triển thành 17 triệu tế bào. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển chúng tạo thành acid acetic và nồng độ acid thấp lại kích thích sự sinh trưởng của chúng. Vì vậy trong sản xuất giấm có thể dùng rượu không cần thanh trùng được bổ sung một ít acetic để acid hoá môi trường. 2.3.1. Một số loài Vi khuẩn acid acetic có nhiều ý nghĩa thực tế Acetobacter pasteurianum: Hình que ngắn, tế bào nhuộm bằng iod có màu xanh. Acetobacter orleaneuse: Hình que nhỏ, hau đầu hơi nhọn, phát triển thành màng mỏng nhưng chắc trên bề mặt dịch nuôi cấy. Tế bào chết nhuộm iod cho màu vàng. Giống này có thể phát triển ở dung dịch 10-12% rượu và tạo thành được 9,5% acid acetic Acetobacter xylinum: Có khả năng tạo thành màng mạnh và đôi khi màng khá dày. Màng nhuộm bằng iod và acid sulfuric cho màu xanh. Giống này tích tụ được Chuyên ngành Vi Sinh vật học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ 4,5% acid acetic. Đôi khi loài này được dùng với nấm men để sản xuất đồ uống có độ rượu thấp. Hình 1. Vi khuẩn Acetobacter xylinum (Nguồn: BLACKSBURG, Va., Nov. 12, 2008) Acetobacter aceti: Hình que ngắn, không sinh bào tử, thường kết dính nhau thành chuỗi dài. Tế bào chất được nhuộm bằng iod cho màu vàng. Giống này có thể phát triển ở nồng độ rượu 11% và tích tụ trong môi trường tới 6% acid acetic. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 34oC. Acetobacter suboxydans: Vi khuẩn này được dùng nhiều trong công nghiệp vitamin để sản xuất acid ascorbic (vitamin C). Trong lên men nhờ các chủng vi khuẩn suboxydans acid acetic được tích tụ và giữ lại trong môi trường mà không bị oxy hoá tiếp. Các loài có khả năng oxy hoá cao tiếp tục chuyển hoá acid acetic xếp vào nhóm peroxydans, như Acetobacrer suboxydans, Acetobacter pasteurianum (Lương Đức Phẩm, 1998). Acetobacter schiitzenbachii: Hình que tương đối dài kết hợp thành chuỗi, không sinh bào tử, không chuyển động, Gram âm. Các tế bào già tạo thành màng chặc nhưng không chắc. Vì vậy, giống này có thể dùng sản xuất giấm theo phương pháp chìm và có thể tạo thành 11,5-12% acid acetic trong dịch cấy. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của Acetobacter schiitzenbachii là 28oC. Acetobacter curvum: Có đặc tính tương tự như Acetobacter schiitzenbachii tạo thành màng chắc, không là bẩn vỏ tế bào và làm đục giấm. Chuyên ngành Vi Sinh vật học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của Acetobacter curvum là 35-37oC. Nâng cao nhiệt độ quá giới hạn này giống phát triển kém và tạo thành acid kém. Trong thực tế lên men acetic người ta thường giữ ở nhiệt độ 32-34oC đối với vi khuẩn Acetobacter curvum. Các loài Acetobacter chứa 5 đặc điểm: có mặt catalase, oxy hoá ethanol qua acid acetic tới CO2 và H2O, oxy hoá lactate thành carbonate, oxy hoá glycerol thành DHP và sự sản sinh acid gluconic từ glucose (Kiều Hữu Ảnh, 1999). Các loài vi khuẩn, xạ khuẩn, nguyên sinh động vật phát triển thích hợp ở pH từ 6,5-7,5; nấm men và nấm mốc phát triển thích hợp ở pH từ 3-6. Trong khi đó vi khuẩn acetic chịu được nhiệt độ cao, một số vẫn phát triển ở pH = 3,2 (Lương Đức Phẩm, 2001). 2.3.2. Một số ứng dụng quan trọng của vi khuẩn Acetobacter  Sản xuất giấm ăn Trong lên men acid acetic, cơ chất chủ yếu là ethanol với nồng độ trên dưới 10% trong môi trường. Có 2 phương pháp lên men acetic: Phương pháp chậm: còn gọi là phương pháp Orlean hoặc phương pháp Pháp. Giống được sử dụng ở đây là Acetobactre orleaneuse. Phương pháp này có hiệu suất thấp nhưng thích hợp làm giấm ở quy mô gia đình hay các cơ sở nhỏ. Phương pháp nhanh: còn gọi là phương pháp Đức được dùng để sản xuất giấm ăn trên thế giới. Giống được sử dụng là Acetobacter schiitzenbachii và Acetobacter curvum. Với phương pháp này có thể lên men các thùng gỗ tới 10 m3 chỉ trong 8-10 ngày. Ngoài ra còn có phương pháp lên men chìm với chủng vi khuẩn Acetobacter suboxydans (Lương Đức Phẩm, 1998).  Sản xuất thạch dừa Thạch dừa (nata de coco) là món ăn thú vị dùng để tráng miệng và được dùng chung với siro thêm hương. Thạch dừa được tạo thành bởi sự lên men của vi khuẩn Acetobacter xylinum trong môi trường nước dừa già và nước cốt dừa loại béo. Khi vi khuẩn Acetobacter xylinum song trong môi trường nước dừa thì glucose sẽ kết hợp với một acid béo để tạo thành một chất mầm ở màng tế bào, sau đó tiền chất này được tiết ra ngoài tế bào cũng với enzyme. Enzyme này có thể polymer hoá glucose thành cellulose. Chuyên ngành Vi Sinh vật học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ  Sản xuất Vitamin C Trong sản xuất vitamin C cần nguyên liệu đầu là L-sorbose. Muốn có sorbose cần phải chuyển hoá socbit thành sorbose phải nhờ vi khuẩn Acetobacter suboxydans với enzyme xúc tác là sorbit-dehydrogenase. Quá trình chuyển hoá kéo dài 1-3 ngày và có thể bổ sung sorbit một lần nữa để tổng nồng độ đạt tới 30%. Hiệu suất chuyển hoá sorbit thành sorbose đạt tới 90% (Lương Đức Phẩm, 1998).  Một số ứng dụng khác Màng BC (bacterial cellulose) thu nhận bằng phương pháp lên men bề mặt sau 1 ngày. Sau khi xử lý màng thực phẩm BC đạt giá trị cảm quan, có độ chịu lực cao và không bị biến tính khi xử lý nhiệt. Sử dụng màng BC làm màng bao xúc xích được đánh giá tốt. Dùng BC làm màng bảo quản dừa tươi giữ nguyên chất lượng sau 2 tuần bảo quản ở nhiệt độ phòng và 4 tuần bảo quản ở nhiệt độ mát. Sử dụng màng BC hấp thụ Bacterionic 200 AU/mL có thể bảo quản 3 ngày thịt tươi sơ chế tối thiểu ở nhiệt độ mát. Sản phẩm sữa chua uống với nồng độ bột BC 0,5% đạt chất lượng về chỉ tiêu cảm quan, không tách lớp, dung dịch đồng nhất trong thời gian bảo quản (Tạp chí Công nghệ Sinh học, số 1/080). Ngoài ra, vi khuẩn Acetobacter còn được ứng dụng trong sản xuất nước giải khát, bánh mì đen,… (Bùi Thị Quỳnh Hoa và Nguyễn Bảo Lộc, 2008). Chuyên ngành Vi Sinh vật học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ CHƢƠNG 3: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thời gian thực hiện: Từ tháng 6/2014 đến tháng 11/2014. Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm thuộc Viện nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học. 3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu 3.1.1. Nguyên liệu Các loại trái cây có múi: cam, chanh, quýt, bưởi, tắc,… 3.1.2. Hoá chất Yeast extract, polypeptone, D-glucose, glycerol, agar, CaCO3, cồn tuyệt đối, oxytetracyline, bromocresol green, phenoltalein, NaOH,… 3.1.3. Thiết bị, dụng cụ Thiết bị: Kính hiển vi, tủ cấy, tủ ủ, thiết bị thanh trùng, máy lắc, tủ lạnh,… Dụng cụ: Đĩa petri, que cấy, pipet, ống đong, bình tam giác, đèn cồn, các loại ống nghiệm, giá để ống nghiệm,… 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1. Phân lập các dòng vi khuẩn acid acetic  Thu 5 loại trái cây chín có múi (bưởi, cam, quýt, chanh, hạnh) trên địa bàn 7 tỉnh ĐBSCL (Vĩnh Long, Đồng Tháp, Hậu Giang, Kiên Giang, Bến Tre, Sóc Trăng, Cà Mau).  Rửa sạch mẫu bằng nước cấy khử trùng và lấy 1 gam mẫu vỏ và 1 gam thịt quả nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng lỏng YPGD chứa 4% ethanol.  Ủ 30oC trong 1-2 ngày.  Từ dung dịch cấy trên môi trường YPGD (yeast extract 5 g/L, polypeptone 5 g/L, glycerol 5 g/L, D-glucose 5 g/L ) bổ sung 0,5% CaCO3 và 4% ethanol (Amornrut và Wasu, 2008).  Lựa chọn các khuẩn lạc tạo vòng halo trên môi trường là AAB. Khuẩn lạc vi khuẩn acetic sẽ tạo vòng sang xung quanh do vi khuẩn này tạo ra acid acetic hoà tan CaCO3 làm mất màu trắng đục của CaCO3.  Tiếp tục cấy phân lập nhiều lần để thu được dòng thuần. Chuyên ngành Vi Sinh vật học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ 3.2.2. Xác định đặc tính hình thái, sinh hoá của các chủng vi khuẩn acid acetic  Các chủng vi khuẩn thuần đã phân lập sẽ được định danh sơ bộ thông qua các đặc điểm về hình dạng và một một phản ứng sinh hoá đặc trưng dựa theo tài liệu phân loại Bergey (Holt et al., 1994).  Quan sát hình dạng và đo kích thước tế bào và khuẩn lạc.  Nhuộm Gram, thử catalase và oxydase.  Phản ứng oxy hoá acetate tạo CO2 và H2O. Cấy các chủng AAB trên môi trường YPGD bổ sung 0,02% bromocresol green ủ ở 30oC trong 24-72 giờ cho tới khi không có sự thay đổi màu sắc. Phương pháp đánh giá như sau: Sau 24 giờ tất cả các chủng đều chuyển đổi môi trường từ xanh lam sang vàng; sau 48-72 giờ, giống Gluconobacter thì môi trường vẫn giữ màu vàng, giống Acetobacter làm chuyển môi trường từ vàng sang xanh lục. (Kanchanarach et al., 2009). 3.2.3. Thử nghiệm khả năng sinh acid acetic  Nuôi các chủng AAB trong ống nghiệm chứa môi trường YPGD trong 24 giờ ở 30oC.  Nhỏ một giọt dung dịch nuối cấy lên giữa đĩa môi trường thạch màu xanh chứa bromocresol green ethanol agar (ethanol 0,2%, yeast extract 0,3%, bromocresol green 0,01%) đã chuẩn bị từ trước và đem ủ ở 30oC.  Theo dõi và so sánh vòng màu vàng sinh ra xung quanh AAB, vòng phân giải tạo ta càng lớn chứng tỏ chủng AAB đó có khả năng sinh acid acetic nhanh và càng mạnh (quan sát sau 24 và 48 giờ).  Các nghiệm thức được thực hiện 3 lần để lấy giá trị trung bình. Các chủng sinh acid mạnh sẽ được lựa chọn để thử khả năng chịu nhiệt. Chuyên ngành Vi Sinh vật học 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học