Tài liệu Phân lập và tuyển chọn nấm men trong viên men cơm rượu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MEN TRONG VIÊN MEN CƠM RƯỢU CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS. NGUYỄN VĂN THÀNH SINH VIÊN THỰC HIỆN LÊ PHAN ĐÌNH QUÍ MSSV: 3102854 LỚP: CNSH K36 Cần Thơ, Tháng 11/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS. Nguyễn Văn Thành Lê Phan Đình Quí DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Đầu tiên, con xin chân thành cảm ơn cha mẹ đã có công sinh thành và nuôi dưỡng, dạy dỗ con cho đến hôm nay. Xin cám ơn tất cả quý thầy cô đã tận tình giảng dạy tôi trong suốt thời gian học tập tại trường Đại học Cần Thơ, cám ơn các thầy cô của Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức bổ ích trong quá trình theo học tại trường. Xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của tôi đến PGs.Ts. Nguyễn Văn Thành – người Thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này. Xin cám ơn cô Bùi Thị Minh Diệu – cô cố vấn học tập, người đã dìu dắt, giúp đỡ, khuyên bảo tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Xin chân thành cám ơn anh Nguyễn Ngọc Thạnh, anh Huỳnh Xuân Phong, anh Phạm Hồng Quang – cán bộ phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Phẩm, các anh chị cao học K18, K19, CNSH TT K35, các bạn VSV K36 đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Xin cám ơn tất cả các bạn lớp Công nghệ Sinh học K36 đã luôn cổ vũ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập qua. Xin ghi ơn cha mẹ và tất cả bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Kính chúc quý thầy cô được nhiều sức khỏe, thành đạt trên nhiều lĩnh vực và luôn có những cống hiến quý báu cho sự nghiệp giáo dục và đạo tạo. Xin chân thành cảm ơn! Cần Thơ, ngày 29 tháng 11 năm 2013 Lê Phan Đình Quí TÓM LƯỢC Với mục đích tuyển chọn dòng nấm men cho hoạt tính lên men tốt để tiến đến sản xuất bột men lên men cơm rượu, đề tài “Phân lập và tuyển chọn nấm men trong viên men cơm rượu” đã được tiến hành. Đề tài đã phân lập nấm men từ 10 loại viên men cơm rượu trên thị trường một số tỉnh Cần Thơ, An Giang, Đồng Tháp,... Khảo sát hoạt tính các dòng nấm men đã phân lập để tuyển chọn ra dòng nấm men cho hoạt tính cao. Tiến hành thử nghiệm sản xuất bột men với dòng nấm men tuyển chọn ở tỷ lệ phối trộn phù hợp nhằm đạt tế bào nấm men nhiều nhất. Khảo sát tỷ lệ bột men và thời gian sử dụng thích hợp cho quá trình rượu hóa thông qua hoạt tính bột men sản xuất được. Kết quả đã phân lập được 27 dòng nấm men, trong đó dòng nấm men TNL2 (phân lập từ men cơm rượu loại lớn ở Thốt Nốt, Cần Thơ) có hoạt lực lên men mạnh (thời gian lên men làm đầy cột khí (3 cm) trong ống Durham ngắn nhất (10 giờ) và cho độ rượu là 7,81 %v/v. Thử nghiệm sản xuất bột men với mật số tổng số nấm men khá cao (2,4 x 10 9 tế bào/gck). Đồng thời khảo sát hoạt tính của bột men với tỷ lệ bột men 0,75% (mật số nấm men 9 x 108 tế bào/gck) và thời gian lên men 4 ngày là hiệu quả, cho ra độ rượu cao (11,66 %v/v). Từ khóa: bột men, nấm men, phân lập, viên men cơm rượu. i MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ................................................................................................................................. TÓM LƯỢC ..................................................................................................................................i MỤC LỤC.....................................................................................................................................ii DANH SÁCH BẢNG..................................................................................................................iv DANH SÁCH HÌNH.................................................................................................................... v TỪ VIẾT TẮT.............................................................................................................................vi CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU......................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ...........................................................................................................................1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu........................................................................................................... 2 1.3. Nội dung nghiên cứu.......................................................................................................... 2 CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................................. 3 2.1. Một số loại bánh men cơm rượu .......................................................................................3 2.1.1 Bánh men thường......................................................................................................... 3 2.1.2 Bánh men lá.................................................................................................................. 3 2.1.3 Bánh men thuốc Bắc .................................................................................................... 4 2.2. Hệ vi sinh vật trong viên men cơm rượu .......................................................................... 4 2.2.1. Nấm men......................................................................................................................4 2.2.2. Nấm mốc....................................................................................................................10 2.2.3. Vi khuẩn ....................................................................................................................10 2.3. Quá trình rượu hóa ...........................................................................................................11 2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm men.........................13 CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................16 3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ...................................................................................16 3.2. Phương tiện nghiên cứu ...................................................................................................16 3.2.1. Nguyên vật liệu .........................................................................................................16 3.2.2. Dụng cụ, thiết bị........................................................................................................16 3.2.3. Hóa chất.....................................................................................................................16 3.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................................17 3.3.1. Thí nghiệm 1: Phân lập nấm men trong các loại men cơm rượu ...........................17 ii 3.3.2. Thí nghiệm 2: Tuyển chọn nấm men phân lập có hoạt tính lên men cao..............18 3.3.3 Thí nghiệm 3: Thử nghiệm sản xuất bột men .........................................................21 3.3.4. Thí nghiệm 4: Thử hoạt tính bột men .....................................................................22 3.3.5. Phương pháp phân tích .............................................................................................23 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................24 4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập nấm men trong các loại viên men cơm rượu ..........................24 4.2. Thí nghiệm 2: Tuyển chọn nấm men phân lập có hoạt tính cao ...................................25 4.3. Thử nghiệm sản xuất bột men .........................................................................................28 4.4. Thử hoạt tính bột men......................................................................................................29 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...............................................................................31 5.1. Kết luận.............................................................................................................................31 5.2. Đề nghị..............................................................................................................................31 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................33 PHỤ LỤC...................................................................................................................................viii PHỤ LỤC 1. MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM............................................................viii PHỤ LỤC 2. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ..............................................................xi PHỤ LỤC 3. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM................................................................................xv PHỤ LỤC 4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ ...........................................................xxi iii DANH SÁCH BẢNG Bảng 2. Chiều cao cột khí CO2 (cm) trong ống Durham của 27 dòng nấm men......................... đã phân lập....................................................................................................................26 Bảng 3. Khả năng lên men của 27 dòng nấm men đã phân lập trên môi trường MF7............27 Bảng 4. Khả năng lên men của từng tỷ lệ bột men qua các thời gian .....................................30 lên men khác nhau.........................................................................................................30 iv DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Cấu tạo nấm men.............................................................................................................. 5 Hình 2. Biểu đồ thể hiện đường tăng trưởng nấm men .............................................................10 Hình 3. Lên men rượu bởi nấm men thông qua con đường glycolysis ....................................12 Hình 4. Quy trình phân lập các dòng nấm men từ 10 loại men cơm rượu trên thị trường......17 Hình 5. Quy trình thí nghiệm đo chiều cao cột khí sinh ra trong ống Durham .......................18 Hình 6. Quy trình thí nghiệm so sánh độ Brix, pH, độ rượu các dòng nấm men đã phân lập 20 Hình 7. Quy trình sản xuất bột men............................................................................................21 Hình 8. Quy trình thí nghiệm thử hoạt tính của bột men ..........................................................22 Hình 9. Hình dạng 5 nhóm nấm men .........................................................................................24 Hình 10.Quy trình đề nghị sản xuất bột men cơm rượu ở quy mô phòng thí nghiệm ............32 v TỪ VIẾT TẮT AG: dòng nấm men được phân lập từ men cơm rượu ở Châu Phú, An Giang. BD: dòng nấm men được phân lập từ men cơm rượu ở Bạch Đằng, Thốt Nốt, Cần Thơ. CP: dòng nấm men được phân lập từ men cơm rượu Chú Phương, Vĩnh Long. TNL: dòng nấm men được phân lập từ men cơm rượu ở Thốt Nốt (Viên lớn) TNN: dòng nấm men được phân lập từ men cơm rượu ở Thốt Nốt (Viên nhỏ) TS: dòng nấm men được phân lập từ men cơm rượu ở Tập Sơn, Trà Vinh TO: dòng nấm men được phân lập từ men cơm rượu ở Trà Ôn, Vĩnh Long ST: dòng nấm men được phân lập từ men cơm rượu ở Vĩnh Châu, Sóc Trăng HG: dòng nấm men được phân lập từ men cơm rượu ở Phụng Hiệp, Hậu Giang NK: dòng nấm men được phân lập từ men cơm rượu ở Ninh Kiều, Cần Thơ ĐT: dòng nấm men được phân lập từ men cơm rượu ở Lấp Vò, Đồng Tháp CFU: Colony – forming Unit (đơn vị tạo khuẩn lạc) OGYA: Oxytetracyline – Glucose Yeast Extract Agar PGA: Potato – Glucose – Agar bổ sung khoáng PG: Potato – Glucose bổ sung khoáng gck: gram chất khô vi Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Từ hàng nghìn năm trước con người đã biết sử dụng nấm men để chế biến thực phẩm. Và ngày nay vai trò của nấm men cũng rất to lớn trong đời sống chúng ta. Nấm men có mặt trong quá trình chế biến nhiều loại thực phẩm và thức uống, không chỉ giúp hoàn tất quá trình chế biến mà còn rất tốt cho sức khỏe. Lên men là một trong những kỹ thuật lâu đời nhất của sự chế biến thực phẩm và mang tầm quan trọng kinh tế to lớn. Lên men cổ truyền là một dạng lên men mà thường sử dụng một tổ hợp vi sinh vật tạo nên nhiều loại thực phẩm lên men có giá trị dinh dưỡng. Thực phẩm lên men có nhiều ưu điểm như: + Hàm lượng protein cao. + Các vitamin được bảo tồn. + Có lợi cho sức khỏe con người. Tuy nhiên lên men cổ truyền cũng có nhược điểm: Do đây là quá trình lên men trong điều kiện tự nhiên, được thực hiện bởi các vi sinh vật tự nhiên và vật chất lên men rất phức tạp, không đồng đều về chủng loại và số lượng. Mặt khác quá trình lên men tự nhiên là quá trình không kiểm soát, do đó xảy ra hiện tượng giao thoa trong khối lên men. Quá trình lên men này là quá trình nhiều pha và không định hướng. Sản phẩm quá trình lên men không ổn định, chất lượng sản phẩm kém và không đồng nhất. Ở Việt Nam, những loại thực phẩm lên men cổ truyền rất được ưa chuộng như thạch dừa, nước mắm, nước giải khát lên men, rau quả muối chua, chao, bánh mì… Trong đó, cơm rượu là một thức ăn dân giã, ngon, có hương thơm khá hấp dẫn, vị ngọt đặc trưng nên được nhiều người ưa thích, được xem như một món ăn “văn hóa” thường phải có trong dịp Tết Đoan Ngọ. Vì thế, việc tiến hành những đề tài phân lập, tuyển chọn lại các dòng nấm men thuần, có khả năng lên men cao là rất cần thiết, cần tập trung giải quyết những mặt hạn chế như chất lượng men kém, không ổn đinh để cho ra những sản phẩm cơm rượu ngon hơn, chất lượng hơn, đặc trưng của Việt Nam nhằm duy trì “văn hóa” ẩm thực của Việt Nam ngày một tốt hơn. Qua đó nghiên cứu, phân lập các dòng nấm men có khả năng lên men cao từ các viên men cơm rượu ở các địa phương nhằm lưu trữ nguồn gen quý bản địa. Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 1 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Do đó, việc thực hiện đề tài “Phân lập và tuyển chọn nấm men trong viên men cơm rượu” là rất cần thiết và phù hợp với thực tiễn. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập và tuyển chọn một số dòng nấm men từ viên men cơm rượu để sản xuất bột nấm men thuần. 1.3. Nội dung nghiên cứu - Phân lập các dòng nấm men trong viên men cơm rượu từ các tỉnh Cần Thơ, An Giang, Vĩnh Long, Hậu Giang, Trà Vinh, Đồng Tháp, Sóc Trăng. - Tuyển chọn những dòng nấm men trong viên men cơm rượu có khả năng rượu hóa cao nhất. - Thử nghiệm sản xuất bột nấm men ở mức độ phòng thí nghiệm: kiểm tra hoạt lực men giống thông qua khả năng rượu hóa. Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 2 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Một số loại bánh men cơm rượu Ở các nước châu Á, theo truyền thống, người ta hay dùng các loại bánh men để sản xuất rượu, cồn từ tinh bột. Lúc đầu người ta sản xuất hoàn toàn nhờ vào hệ vi sinh vật tự nhiên được rơi vào khối ủ. Tuy nhiên, cách làm này thường cho kết quả không ổn định. Do đó, bằng kinh nghiệm, người ta chọn khối ủ tốt nhất để lại một phần để làm mẻ sau. Cách làm này tốt hơn cách làm trên nhưng khi thực hiện vẫn không thu được kết quả ổn định do không bảo quản được lâu. Sau đó, người ta tiến hành sản xuất bánh men. Lúc đầu, bánh men cũng được tạo ra từ những mẻ ủ tốt nhất bằng cách tạo hình chúng, đem sấy khô, rồi bảo quản để dùng dần. Bằng cách này, người ta đã hoàn toàn chủ động được quá trình sản xuất và đảm bảo được chất lượng sản phẩm. Từ đó, phương pháp sản xuất bánh men phát triển khá hoàn thiện, và tạo ra được nhiều loại bánh men khác nhau, tuỳ theo từng dân tộc và thị hiếu của người tiêu dùng. Các loại bánh men được sản xuất theo phương pháp truyền thống về nguyên tắc là giống nhau, nhưng tùy theo đặc điểm khí hậu, nguyên liệu và sở thích của từng địa phương mà người ta có thể bổ sung vào bánh men một số thành phần khác. 2.1.1 Bánh men thường Thành phần chính của bánh men thường là bột gạo và giống vi sinh vật. Một trong những cách làm bánh men thường được thực hiện như sau: Gạo ngâm nước (3 giờ) để ráo → xay thành bột → nhào bột với men giống + nước → định hình bánh men → ủ men ở 29°C-30°C, trong 48 giờ → sấy khô ở 40°C hay phơi nắng → bánh men thành phẩm (Bùi Ái, 2005). 2.1.2 Bánh men lá Bánh men lá thường được đồng bào dân tộc thiểu số sản xuất và tiêu thụ. Đồng bào các dân tộc thiểu số thường dùng bánh men lá để sản xuất rượu cần. Ở bánh men lá thay cho các vò thuốc Bắc, người ta dùng các loại lá sử dụng có thể khác nhau. Chất lượng rượu phụ thuộc rất nhiều và số lượng và thành phần các loại lá này. Thường bánh men có 3 loại: loại bánh men một lá, hai lá và ba lá (Bùi Ái, 2005). Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 3 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 2.1.3 Bánh men thuốc Bắc Thành phần ngoài bột gạo, giống vi sinh vật còn có các vò thuốc bắc. Trong bánh men thuốc bắc ở Mai Đông- Vân Hà (Hà Bắc) có 10 – 20 vò thuốc bắc như bạch truật, nhục đậy khấu, nhục quế… Đây chính là loại bánh men để làm món cơm rượu. Việc cho thuốc bắc vào được cho rằng có tác dụng kích thích sinh trưởng của vi sinh vật trong bánh men, có khả năng sát trùng, ngoài ra còn có tác dụng tạo hương vò đặc trưng cho món cơm rượu (Bùi Ái, 2005) 2.2. Hệ vi sinh vật trong viên men cơm rượu 2.2.1. Nấm men Mỗi gam bánh men chứa vài chục triệu đến vài trăm triệu tế bào nấm men. Chúng gồm 2 giống: Endomycopsis (chủ yếu là Endo fibuligenes) và Saccharomyces (chủ yếu là S. cerevisiae). Endo fibuligenes là loài nấm men rất giàu enzyme amylase, glucoamylase nên chúng vừa có khả năng đường hóa vừa có khả năng rượu hóa. Có khả năng lên men nhiều loại đường như: glucose, saccharose, maltose, fructose, rafinose, galactose. Đồng thời, chúng có thể lên men ở nhiệt độ cao (36 ÷ 40oC) và có khả năng chịu được độ acid. Đặc điểm này rất thuận lợi trong trường hợp lên men có sử dụng thuốc sát trùng. Điều quan trọng hơn là có khả năng lên men nhiều loại nguyên liệu: gạo, ngô, khoai, sắn với đường trong dung dịch 12 – 14%, có khi 16 – 18%. Nồng độ rượu cao nhất trong dịch lên men mà nấm men có thể chịu được là 10 – 12%. Nhiệt độ lên men thích hợp nhất là 28 – 32oC. Ngoài 2 chi nấm men cơ bản trên, trong men thuốc bắc còn nhiều loài men dại khác. Chúng vừa có khả năng thủy phân tinh bột vừa có khả năng chuyển đường thành rượu tuy nhiên sự chuyển hóa này thấp. Đặc biệt các loài men dại này chịu được nhiệt độ rất cao (Walker, 1998). 2.2.1.1. Hình thái, kích thước và thành phần cấu tạo của nấm men a. Hình thái và kích thước - Hình dạng tế bào nấm men Nấm men có nhiều hình dạng khác nhau. Tùy loại, tùy giống, chúng có thể là hình tròn, hình trứng như Saccharomyces cerevisiae, hình elip như Saccharomyces ellipsoideus, hình quả chanh như Saccharomyces apicultus, đôi khi hình chai như Saccharomyces ludwigii hoặc hình ống dài như Pichia. Nói chung, hình dáng của tế bào nấm men ở các loài khác nhau thì khác Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 4 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT nhau, trong cùng một loài hình dáng tế bào cũng có thể thay đổi tùy thuộc vào điều kiện môi trường, điều kiện nuôi cấy và tuổi của tế bào (Lê Xuân Phương, 2001). - Kích thước tế bào nấm men Kích thước của tế bào nấm men khác nhau rất nhiều, tùy theo loài giống, điều kiện sinh trưởng có thể thay đổi trong khoảng 1,5 – 5,3 µm hay có khi dài hơn nữa, các loài nấm men thường dùng trong sản xuất rượu vang có kích thước khoảng 4 – 7 µm. b. Thành phần cấu tạo và hóa học của nấm men - Thành phần cấu tạo của nấm men CW: vách tế bào chất P: tế bào chất CM: màng tế bào CMI: sự lõm vào BS: vết sẹo sinh C: tế bào chất N: nhân M: ty thể ER: lưới nội chất SV: bọng secretory V: không bào PER: peroxisome. (Walker, 1998) Hình 1. Cấu tạo nấm men (http://biopost.blogspot.com/, ngày 02/08/2013) Tế bào nấm men cũng như nhiều loại tế bào khác được cấu tạo chủ yếu từ các phần cơ bản sau: - Thành tế bào: Thành tế bào nấm men được cấu tạo từ nhiều thành phần khác nhau. Trong đó đáng kể nhất là: glucan, protein, lipd,…và một số thành phần nhỏ khác như kitin. - Màng nguyên sinh chất: Có cấu tạo tương tự như màng nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn, gồm có các hợp chất phức tạp như protein, phospholipids,… Trong thời kỳ còn non, màng nguyên sinh chất bám sát thành tế bào làm cho khả năng trao đổi chất của nấm men gặp Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 5 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT rất nhiều khó khăn. Ở thời kỳ tế bào già màng nguyên sinh chất co lại, tạo thành một khoảng trống giữa thành tế bào và chất nguyên sinh vì thế mà khả năng trao đổi chất của nấm men cũng gặp khó khăn. - Chất nguyên sinh: Chất nguyên sinh thường có màu xám. Khi tế bào còn non hầu như không nhận thấy, càng về già ta càng thấy có sự thay đổi rõ rệt. Tế bào còn non chất nguyên sinh thường đồng nhất hơn, càng về già tế bào càng không đồng nhất vì xuất hiện nhiều không bào và hạt volutin. Trong thành phần của chúng cũng giống như của các vi sinh vật khác chủ yếu được cấu tạo từ nước, protid, glucid, lipid, các muối khoáng, enzyme và các bào quan. Tế bào chất luôn luôn chuyển động. thường chuyển động theo một chiều xung quanh thành tế bào. Ngoài ra, nó còn phụ thuộc vào trạng thái sinh lý của nấm men. Thí dụ nấm men trong trạng thái hô hấp tế bào chất thường đồng nhất, trong khi đó ở trạng thái lên men thấy xuất hiện nhiều chất làm mất tính đồng nhất của không bào. Độ nhớt của tế bào chất lớn hơn độ nhớt của nước 800 lần. - Nhân tế bào: Khác với tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men đã có nhân thật. Nhân thường có hình bầu dục hay hình cầu. Nhân được bao bọc một lớp màng, bên trong là lớp dịch nhân, có trong đó một thể rắn gọi là hạch nhân hay nhân con, nhân nấm men có chứa protein và acid nucleic. - Những thành phần khác: + Không bào: Trong mỗi tế bào nấm men có một hoặc nhiều không bào. Không bào chứa đầy dịch tế bào, bên ngoài được bao bọc bởi một lớp màng không bào (tonoplaste). Hình dạng không bào có thể thay đổi tùy theo tuổi và trạng thái sinh lý của tế bào. Vị trí không bào trong tế bào cũng khác nhau. Nếu có một không bào thì chúng nằm ở một đầu, có hai thì chúng nằm ở hai đầu và nhiều thì chúng nằm chung quanh. Không bào là nơi chứa đựng các protease. Các enzyme tham gia quá trình tự phân rất mạnh. + Volutin: Thường thấy trong không bào. Nó không phải là thành phần cấu trúc của tế bào. Chúng chỉ thấy xuất hiện ở điều kiện đặc biệt khi nuôi cấy trên môi trường giàu hydrade carbon và phosphate vô cơ. Số lượng volutin còn phụ thuộc vào tỷ lệ C:N, sự có mặt của S và vitamine, Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 6 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT pH trong môi trường. Trong điều kiện lên men tế bào thường chứa ít hạt volutin hơn khi phát triển trong điều kiện hiếu khí. Volutin đóng vai trò quan trọng sau: _ Là chất dự trữ các chất dinh dưỡng của tế bào _ Tham gia vào việc điều hòa quá trình sinh trưởng, phát triển của tế bào _ Làm nguồn năng lượng cho tế bào như polyphosphate của volutin dung làm nguồn năng lượng cho quá trình sinh hóa học của tế bào, thông qua hệ thống ATP. Polyphosphate của volutin có thể tham gia vào quá trình lên men, hô hấp, acid nuclein của volutin là nguồn dự trữ dung để tổng hợp acid nucleic tế bào chất và một số enzyme. Ngoài volutin ra còn thấy hạt mỡ, glycogen, lipid… + Ty thể, lạp thể: Ty thể, lạp thể của nấm men cũng giống như ty thể, lạp thể của nhiều sinh vật khác. Nghĩa là cũng tham gia như một nhà máy cung cấp cho tế bào hoạt động. Về cấu tạo thì ty thể, lạp thể được chia ra thành những lớp sau: Màng phía ngoài chia thành 3 lớp Màng phía trong có vách cũng chia thành 3 lớp Khoảng cách giữa các lớp là nơi xảy ra những phản ứng tạo ATP. + Ribosome: Tham gia mọi quá trình tổng hợp các chất trong cơ thể. Khác với vi khuẩn, ribosome của nấm men tồn tại hai loại: - Loại 80S (gồm hạt 60S + 40S) tồn tại tự do - Loại 70S (gồm 50S + 40S) liên kết với cấu trúc màng. Loại này thể hiện khả năng tổng hợp mạnh (Nguyễn Đức Lượng, 1996). - Thành phần hóa học của nấm men Bảng 1. Thành phần hóa học của nấm men Các chất Carbon CaO Nitơ Hydro P2O 5 K2O SO3 MgO Fe2O3 SiO Thành phần (%) 49,8 12,4 6,7 3,54 2,34 0,04 0,42 0,38 0,035 0,09 (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 1996) Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 7 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 2.2.1.2. Sự biến dưỡng và sinh sản của nấm men a. Quá trình biến dưỡng Quá trình biến dưỡng của nấm men gồm giai đoạn chất dinh dưỡng qua màng tế bào chất vào tế bào và các chuỗi phản ứng hóa học để biến đổi các chất dinh dưỡng tổng hợp và vật liệu cho tế bào. Theo Walker (1998), trong điều kiện có oxy thì pyruvate bị oxy hóa cho ra CO2 và ATP để nấm men phát triển sinh khối. Trong điều kiện không có oxy thì Pyruvate sẽ bị mất CO2 và tạo thành acetaldehyde CH3COCOH CH3CH=O + CO2 Sau đó acetaldehyde được khử thành ethanol do enzyme alcoldehydrogenase xúc tác CH3CH=O + NADH + H+ CH3CH2OH + NAD+ Tùy theo điều kiện của môi trường mà sự lên men có thể theo các kiểu: - Kiểu lên men bình thường: xảy ra khi pH = 4 – 5, sản phẩm của kiểu lên men này là: C6H12O6 + 2(P) + 2ADP 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + 2H2O - Kiểu lên men rượu trong môi trường kiềm, sản phẩm của kiểu lên men này là: 2C6H12O6 + H2O 2CH2CH2CH(OH) + CH3COOH + C2H5OH + 2CO2 b. Sự sinh sản của nấm men (Lê Xuân Phương, 2001) - Sự sinh sản vô tính + Sinh sản bằng hình thức nảy chồi Bình thường đến một giai đoạn nào đó, tế bào phân chia và tạo thành những tế bào con, lúc đầu những tế bào này nhỏ hơn tế bào mẹ, sau đó lớn dần, hoặc tách khỏi tế bào mẹ hoặc không tách khỏi mà tạo thành những chồi nhỏ liên kết với nhau ngay cả khi trường thành tạo thành chuỗi tế bào gọi là khuẩn ty giả. Đây là hình thức sinh sản vô tính chủ yếu nhất ở nấm men. + Sinh sản bằng hình thức phân chia Một số loài phân đôi tế bào thành 2 tế bào con, lúc đầy chất nhân chia làm 2 phần, sau đó ở phần giữa tế bào xuất hiện thành tế bào, thành này lớn dần lên và màng nguyên sinh chất lọt vào bên trong. Lúc này thành tế bào mới phát triển hoàn thiện và chia tế bào mẹ làm 2 tế bào con độc lập. - Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi (ascospore) Bào tử túi của nấm men là những bào tử được sinh ra trong những túi gọi là túi hay nang (ascus) mỗi túi chứa 4 – 8 bào tử túi. Túi hay nang bào tử có thể được sinh ra theo 2 phương thức: tiếp hợp đẳng giao, tiếp hợp dị giao. Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 8 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT - Sinh sản đơn tính Tạo thành bào tử trực tiếp từ 1 tế bào riêng lẻ không thông qua tiếp hợp (nhiều loài trong các giống Pichia, Torulosporus, Saccharomyces. Bào tử túi sau khi ra khỏi túi gặp điều kiện thích hợp sẽ phát triển thành một tế bào nấm men giới. Tế bào này lại tiếp tục sinh sản theo lối nảy chồi. Sự hình thành bào tử túi là một quá trình đồng thời mang hai ý nghĩa vừa sinh sản, vừa tạo dạng bền vững vì bào tử túi có vỏ dày chịu được điều kiện không thuận lợi của môi trường, chịu được nhiệt độ cao và sự khô hạn. c. Các quá trình sinh lý của tế bào nấm men * Sinh dưỡng của nấm men: cấu tạo của nấm men thay đổi khác nhau tùy theo loài, độ tuổi và môi trường sống, nhưng nhìn chung bao gồm: nước, chất khô, oxy, hydro, cacbon, nitơ, phosphor, kali, magie, các vitamin và chất khoáng. * Cơ chế vận chuyển các chất dinh dưỡng vào trong tế bào nấm men (Nguyễn Đức Lượng, 1996): Nấm men hoàn toàn không có cơ quan dinh dưỡng riêng biệt, các chất dinh dưỡng mà nó sử dụng chủ yếu được vận chuyển qua thành tế bào theo 2 con đường cơ bản: thẩm thấu bị động và hấp thụ chủ động. * Quá trình sinh trường và phát triển Sự sinh trưởng: trong quá trình nuôi cấy, trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, tế bào nấm men tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều. Sự phát triển: Các nấm men sinh sản bằng phương pháp nhân đôi thường cho một lượng sinh khối rất lớn sau một thời gian ngắn. Để xác định số lượng tế bào nấm men phát triển theo thời gian hiện nay người ta dùng nhiều phương pháp khác nhau như: * Xác định số lượng tế bào bằng phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi hay gián tiếp trên mặt thạch. * Đo độ đục của tế bào trong dung dịch nuôi cấy trên cơ sở xây dựng một đồ thị chuẩn của mật độ tế bào. Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 9 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Quá trình sinh trưởng của nấm men trong dịch lên men tĩnh có thể chia làm 5 giai đoạn: Hình 2. Biểu đồ thể hiện đường tăng trưởng nấm men - Giai đoạn tiềm phát: giai đoạn này tế bào làm quen với môi trường, sinh khối chưa tăng nhiều. - Giai đoạn logarit: đây là giai đoạn phát triển rất nhanh, sinh khối tăng ào ạt, kèm theo sư thay đổi mạnh mẽ của dịch lên men. - Giai đoạn chậm dần: tốc độ tăng trưởng nấm men giảm dần, thành phần dịch lên men còn ít, các sản phẩm lên men được tích tụ nhiều. - Giai đoạn ổn định: số lượng tế bào nấm men không tăng nữa, tốc độ sinh sản bằng tốc độ chết. - Giai đoạn chết: tốc độ chết tăng nhanh, tốc độ sinh sản rất ít, số lượng tế bào nấm men giảm dần. 2.2.2. Nấm mốc Trong bánh men thuốc bắc, nấm mốc chủ yếu là các chi: Mucor, Aspergillus, Penicillum, Rhizopus. Trong đó, đặc biệt là loài Mucor rouxii có nhiều đặc tính quý như sau: có khả năng chịu nhiệt độ cao 32 – 35oC, vừa có khả năng đường hóa vừa có khả năng rượu hóa. Năm 1998, Lee et al., đã khảo sát hệ sinh vật trong viên men rượu được sản xuất tại Việt Nam, kết quả phân lập được các dòng nấm mốc như: Rhizopus oryzae, Mucorindicus, Mucorcircinilloides, Amylomyces rouxii (Nout et al., 1995). 2.2.3. Vi khuẩn Trong bánh men thuốc bắc có rất nhiều loại vi khuẩn phát triển, nhưng chủ yếu là vi khuẩn acid lactic như Lactobacillus, Streptococcus và vi khuẩn acid acetic như A. aceti, A. Suboxydans; vi khuẩn gây thối (Lee và Fujio, 1998). Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 10 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Đề cương tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Vi khuẩn sinh sản bằng cách tự nhân đôi, thời gian cho một thế hệ vi khuẩn thường ngắn. Một khảo sát khả năng sinh sản của một số dòng vi khuẩn sinh acid acetic trên môi trường tinh bột ngô ở 30 oC cho thấy thời gian pha log khoảng 4 – 8 giờ, thời gian cho một thế hệ khoảng 1,2 – 2 giờ, mật số phát triển tối đa có thể đến 10 9 CFU/ml. Sự hiện diện của vi khuẩn trong viên men rượu được xem là gây hại cho quá trình sản xuất rượu (Holzapel, 1997). Thời gian đầu của quá trình lên men, các vi khuẩn này phát triển tạo ra pH môi rường thích hợp cho sự phát triển của nấm men. Tuy nhiên nếu pH quá thấp sẽ ức chế hoạt động của nấm men. Mặt khác, nếu trong dịch lên men có sự hiện diện của oxy thì vi khuẩn acetic sẽ oxy hóa rượu thành acid acetic làm giảm lượng rượu hình thành. 2.3. Quá trình rượu hóa Lên men là quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ, về cơ bản là chuyển carbohydrate thành rượu bởi hoạt động của vi sinh vật. Ethanol là sản phẩm mong muốn của quá trình lên men carbohydrate, nhưng ngoài rượu còn có rượu bậc cao, acid, ceton và aldehyde có thể hình thành như là các sản phẩm phụ (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Sản xuất ethanol qua quá trình lên men được dựa trên việc chuyển đổi đường thành ethanol bằng nấm men trong điều kiện yếm khí. Để đảm bảo rằng các vi khuẩn kỵ khí phát triển mạnh, cẩn thận kiểm soát nồng độ chất nền, độ pH, nhiệt độ, chất dinh dưỡng. Hầu hết quá trình lên men rượu cồn được tiến hành dùng chủng nấm men S. cerevisiae (Berry, 1995). Nấm men có thể chuyển hóa đường theo hai con đường lên men và hô hấp. Lên men rượu cồn bằng nấm men thông qua con đường glycolysis (Hình 3). Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 11 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học