BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
TRẦN THANH TRÖC
MSHV: 62030803
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN
MỘT SỐ DÕNG ASPERGILLUS NIGER SINH
PECTIN METHYLESTERASE HOẠT TÍNH CAO
LUẬN ÁN TI N S SINH HỌC
Cần Thơ, năm 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
TRẦN THANH TRÖC
MSHV: 62030803
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN
MỘT SỐ DÕNG ASPERGILLUS NIGER SINH
PECTIN METHYLESTERASE HOẠT TÍNH CAO
LUẬN ÁN TI N S SINH HỌC
Chu n ng nh: VI SINH VẬT HỌC
Mã ngành: 62 42 01 07
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
PGS TS NGUYỄN V N MƢỜI
TS NGUYỄN V N THÀNH
Cần Thơ, năm 2013
Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh
rường ĐH Cần hơ
2008 - 2012
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của NCS Trần Thanh Trúc với sự
hƣớng dẫn của PGS. TS. Nguyễn Văn Mƣời và TS. Nguyễn Văn Thành. Các số liệu
và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, chƣa từng đƣợc công bố riêng lẻ
bởi tác giả khác trong bất kỳ công trình nào trƣớc đây.
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
Tác giả luận văn
PGS. TS. NGUYỄN V N MƢỜI
TRẦN THANH TRÖC
TS. NGUYỄN V N THÀNH
Chuyên ngành Vi sinh v t h
i
i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh
inh h
Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh
rường ĐH Cần hơ
2008 - 2012
LỜI CẢM ƠN
Hơn cả sự biết ơn, tôi cảm thấy thật hạnh phúc và may mắn khi đƣợc thực hiện luận án tiến
sĩ dƣới sự hƣớng dẫn của PGS. TS. Nguyễn Văn Mƣời và TS. Nguyễn Văn Thành.
Lời cảm ơn đầu tiên, tôi xin đƣợc gởi đến PGS. TS. Nguyễn Văn Mƣời – giáo viên hƣớng
dẫn chính. Thật sự vinh dự và tự hào khi tôi đƣợc là học trò của Thầy. Thầy chính là ngƣời
truyền cho tôi lòng nhiệt huyết và thổi lên ngọn lửa đam mê khoa học, khơi dậy ở tôi sự nỗ
lực, tự tin, cố gắng không ngừng và không nản lòng trƣớc những khó khăn trong suốt tiến
trình thực hiện luận án tiến sĩ. Xin cám ơn Thầy đã dành nhiều thời gian, công sức và luôn
giúp em có đƣợc định hƣớng đúng đắn trong công việc.
Tôi cũng xin gởi lời tri ân đến TS. Nguyễn Văn Thành – Thầy luôn đóng góp cho tôi rất
nhiều kinh nghiệm quý báu, không ngại thời gian cùng tôi nghiên cứu những vấn đề mới
phát sinh để có kết quả thu nhận tốt nhất.
Tôi đặc biệt biết ơn sự giúp đỡ và hỗ trợ và cả động viên của TS. Trần Nhân Dũng – Giám
đốc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, đã giúp tôi có thể hoàn tất tốt nội
dung nghiên cứu.
Tiến trình hơn 3 năm thực hiện các thí nghiệm trong luận án, tôi đã luôn đƣợc sự đồng
hành, hỗ trợ của các em học viên cao học ngành Công nghệ sinh học, Công nghệ thực
phẩm, sinh viên đại học từ các khóa 28 đến khóa 35. Các em không quản ngại khó khăn,
thời gian để cùng với tôi thực hiện các nghiên cứu và hơn thế nữa, các em còn luôn tiếp
sức và hỗ trợ tôi trong nhiều lĩnh vực và trong cuộc sống,... đến tận thời điểm này.
Xin chân thành cám ơn Bộ Giáo dục và Đào tạo, Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Cần Thơ,
Phòng Tổ chức Cán bộ, Phòng Quản lý Khoa học, Phòng Đào tạo, Khoa Sau đại học và các
phòng ban chức năng khác của Trƣờng; đặc biệt là Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng
dụng, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi cho
việc thực hiện đề tài nghiên cứu. Xin cám ơn Thầy Cô ở Bộ môn Công nghệ Thực phẩm,
Trƣờng Đại học Cần Thơ – nơi tôi đang công tác đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho
nghiên cứu này.
Tôi cũng xin đƣợc gởi lời cám ơn đến GS. TS. Lƣu Duẫn, PGS. TS. Đống Thị Anh Đào và
nhiều bạn bè gần xa đã luôn động viên và giúp tôi có thêm nỗ lực phấn đấu, hoàn thành
nghiên cứu.
Xin cám ơn quý Thầy Cô trong Hội đồng chấm Luận án Tiến sĩ cấp cơ sở đã có nhiều góp
ý và đƣa ra nhiều lời khuyên bổ ích, giúp tôi hoàn thiện luận án tốt hơn.
Đặc biệt, xin gởi lời cám ơn sâu sắc đến hai phản biện độc lập với những góp ý cụ thể,
những gợi ý bổ ích, giúp tôi hoàn tất tốt hơn nữa các nội dung nghiên cứu của luận án.
Chuyên ngành Vi sinh v t h
ii
i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh
inh h
Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh
rường ĐH Cần hơ
2008 - 2012
Cám ơn các Thầy Cô giáo cũ đã không ngừng động viên, khuyến khích, các bạn bè gần xa
đã luôn khích lệ tôi trong suốt tiến trình học tập.
Cuối cùng, tôi xin đƣợc gởi lời biết ơn đến gia đình với tất cả tình yêu và sự khuyến khích,
ủng hộ đã dành cho tôi trong chặng đƣờng cam go để hoàn thành đƣợc luận án nghiên cứu
này. Đặc biệt, xin dành tặng ba mẹ các thành quả mà hôm nay con đã đạt đƣợc.
Chân thành cám ơn.
Cần Thơ, ngày tháng 03 năm 2013
Nghiên cứu sinh thực hiện
Trần Thanh Trúc
Chuyên ngành Vi sinh v t h
iii
i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh
inh h
Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh
rường ĐH Cần hơ
2008 - 2012
TÓM LƢỢC
Đề tài “Phân lập và tuyển chọn một số dòng Aspergillus niger sinh pectin methylesterase
hoạt tính cao” đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa
Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trƣờng Đại học Cần Thơ và các phòng thí nghiệm có
liên quan, từ tháng 11.2008 đến tháng 9.2012.
Đề tài đƣợc thực hiện với mục tiêu nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp và ứng dụng
enzyme pectin methylesterase (PME, EC 3.1.1.11) từ sự lên men bề mặt trên môi trƣờng
rắn, sử dụng dòng Aspergillus niger (A. niger) đặc hiệu đƣợc phân lập và tuyển chọn trong
điều kiện thực tế tại Việt Nam.
Kết quả nghiên cứu đã phân lập đƣợc 60 dòng có đặc tính giống Aspergillus niger từ vỏ
các loại quả giàu pectin phổ biến ở khu vực đồng b ng sông Cửu Long nhƣ vỏ cam, bƣởi,
chanh, hạnh, táo và sung, sử dụng các môi trƣờng nƣớc trích khoai tây (Potato Dextrose
Agar, PDA), Czapek Dox Agar (CZ) và Malt Extract Agar (MEA). Việc tuyển chọn các
dòng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp pectinase đƣợc thực hiện b ng cách đo đƣờng
kính vòng phân giải pectin cho thấy, tất cả 60 dòng đều có khả năng phân giải pectin, trong
đó 14 dòng nấm đã phân lập có đƣờng kính vòng phân giải lớn hơn 20 mm.
Kết quả sàng lọc các dòng nấm có khả năng sinh tổng hợp PME từ 14 dòng đặc hiệu với
pectinase đã tuyển chọn đƣợc 4 dòng có hoạt tính PME thu đƣợc cao và ổn định, ký hiệu
T1, N1, So2 và R1 phân lập từ vỏ táo ta, vỏ quả chanh núm, vỏ cam soàn và bƣởi Năm Roi.
Sự kết hợp của 2 dòng R1 và So2 với tỷ lệ 1:1 đƣợc lựa chọn trong nghiên cứu xác định
điều kiện thích hợp cho quá trình lên men rắn sinh tổng hợp PME có hiệu quả cao nhất. Kỹ
thuật giải trình tự gene 28S rRNA cũng đƣợc áp dụng để nhận diện bốn (4) dòng T1, N1,
So2 và R1, kết quả cho thấy, 4 dòng này đều thuộc A. niger với mức độ đồng hình 99 ÷
100%.
Điều kiện lên men rắn sinh tổng hợp PME từ tổ hợp A. niger So2 và R1 đã đƣợc xác định
dựa trên việc khảo sát một số yếu tố đơn lẻ (thành phần cơ chất, dinh dƣỡng, tác động của
dung dịch đệm và thời gian ủ) kết hợp với việc tối ƣu hóa một số yếu tố chính (pH ban đầu,
độ ẩm môi trƣờng lên men, tỷ lệ bào tử nấm mốc sử dụng và nhiệt độ lên men) theo
phƣơng pháp bề mặt đáp ứng với mô hình phức hợp tại tâm. Điều kiện ly trích, thu nhận
enzyme sau lên men (pH của dung dịch đệm, tỷ lệ dung môi và cơ chất, nhiệt độ và thời
gian ly trích tƣơng ứng) cũng đƣợc xác định. Kết quả đã cho thấy hiệu quả của việc tận
dụng nguồn phụ phẩm nông nghiệp là bã táo ta khô và vỏ bƣởi Năm Roi tƣơi làm cơ chất
lên men chính (với tỷ lệ bã táo ta và vỏ bƣởi là 1:1 w/w) cho việc thu nhận PME. Quá trình
lên men đạt hiệu quả cao nhất khi môi trƣờng nuôi cấy đƣợc điều chỉnh đến độ ẩm 57,4%
b ng dung dịch đệm citrate pH 4,0, có bổ sung 0,1% urea, 0,5% MgCl2 và 0,15% CaCl2, tỷ
lệ huyền phù bào tử nấm ở mật số 105 cfu/mL sử dụng là 16,5% v/w (mL/g). Sau 96 giờ ủ
Chuyên ngành Vi sinh v t h
iv
i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh
inh h
Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh
rường ĐH Cần hơ
2008 - 2012
ở nhiệt độ 35,5°C, PME thô đƣợc ly trích ở nhiệt độ 35°C trong thời gian 50 phút b ng
dung dịch đệm citrate pH 3,6, sử dụng tỷ lệ dung dịch đệm và cơ chất là 2:1 v/w (mL/g).
Ƣớc tính hoạt tính PME đạt đƣợc ở điều kiện lên men và ly trích tốt nhất là 79,1 U/g cơ
chất.
PME thô thu đƣợc sau khi tinh sạch sơ bộ b ng kết tủa với ethanol ở tỷ lệ 3:1 (v/v), thể
hiện ở hoạt tính riêng là 10,02 U/mgprotein, hiệu suất thu hồi 91,48% và độ tinh sạch tăng
gấp 7,98 lần so với mẫu enzyme thô. Sau khi kết tủa với ethanol, tiến hành lọc màng ở
khoảng phân đoạn 50 kDa thu đƣợc PME có hoạt tính riêng đạt 15,63 U/mgprotein, độ tinh
sạch tăng 12,40 ± 0,89 lần khi so sánh với mẫu enzyme thô. PME từ A. niger có khối
lƣợng phân tử khoảng 43 kDa, h ng số Km của PME đạt đƣợc là 0,6014 mg/mL. Hoạt tính
của PME thu nhận từ A. niger thể hiện cao nhất ở 38 ÷ 40°C và pH môi trƣờng 5,0. Cả hai
muối CaCl2 và NaCl đều có tác dụng hoạt hóa, làm tăng hoạt tính của PME từ A. niger.
Đồng thời, sự bất hoạt nhiệt của PME tuân theo phƣơng trình bậc 1 chuyển đổi một phần
với hệ số góc k tăng dần khi nhiệt độ tăng từ 50 đến 70°C.
Việc nghiên cứu thử nghiệm trên một vài sản phẩm thực phẩm có cấu trúc không ổn định
cũng đã khẳng định hiệu quả tích cực của chế phẩm PME kỹ thuật từ nấm mốc trong việc
cải thiện độ cứng chắc của sản phẩm sau chế biến, điển hình là khóm lạnh đông và dƣa leo
muối chua.
Từ khóa: Aspergillus niger, cải thiện cấu trúc, cơ chất giàu pectin, hoạt tính cao, lên
men bề mặt cơ chất rắn, pectin methylesterase, phân lập, tuyển chọn.
Chuyên ngành Vi sinh v t h
v
i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh
inh h
Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh
rường ĐH Cần hơ
2008 - 2012
SUMMARY
The thesis “Isolation and screening of Aspergillus niger biosynthesize high activity pectin
methylesterase” was performed in the laboratory of Food Technology Department, College
of Agriculture and Applied Biology, Can Tho University and other laboratories, from
11.2008 to 9.2012.
The thesis was conducted to investigate the biosynthesis process and application of pectin
methylesterase (PME, EC 3.1.1.11) in solid state fermentation (SSF) of isolated and
selected Aspergillus niger from the practical conditions of Vietnam.
Sixty species which have morphologically similar Aspergillus niger were isolated from the
peels of rich pectin fruits which have been found to be widely in Mekong delta, such as
orange, pomelo, citrus, apple and fig peels on Potato Dextrose Agar (PDA), Czapek Dox
Agar (CZ) and Malt Extract Agar (MEA). To indicate the pectinase activity of the
organisms, diameters of clear zone around colonies on pectin - agar medium were
measured. The result showed that all of sixty isolates have the ability of pectinolytic
activities, in which 14 out of the 60 isolates were able to produce a higher pectinase
activity, based on the average clear zone diameters were larger than 20 mm.
Further screening of PME production of the 14 selected isolates, the maximum PME
production was obtained by 4 isolates (T1, N1, So2 and R1) which were isolated from the
peels of Ziziphus mauritiana (“tao ta”), Citrus lemon (“chanh num”), Citrus sinensis L.
(“cam soan”) and Citrus maxima (“Nam Roi” pomelo), respectively. The combination of
two isolates of R1 and So2 with the proportion of 1:1, was conducted to investigate the
suitable conditions for PME biosynthesis by solid state fermentation. In addition, the
identification by sequencing of 28S rRNA gene, revealed that 4 selected isolates T1, N1,
So2 and R1 had 99 ÷ 100% identity to Aspergillus niger.
The optimal conditions of pectin methylesterase biosynthesis from A. niger So2 and
R1 in solid-state fermentation were evaluated, based on the individual factors (substrate
characteristics, nutrients, buffer solutions and incubation time) which influenced to PME
production were investigated. After that, the Response surface methodology (RSM) based
on four-variable central composite design (CCD) can be used to model the correlation of
the fermentation conditions such as inducer concentration, initial pH, incubation
temperature and moisture content of medium to PME activity. Moreover, some extraction
parameters consist of type of solvent, pH, ratio of solvent and fermented solids were
studied. In addition, the best combination of extraction temperature, contact time was also
determined.
Especially, the use of rich pectin of agricultural material in Mekong Delta (mixture of
apple pomace and pomelo peels at the ratio of 1:1 w/w) as a fermentation medium was
taken into consideration for the PME production of A. niger in this investigation. With the
Chuyên ngành Vi sinh v t h
vi
i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh
inh h
Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh
rường ĐH Cần hơ
2008 - 2012
addition of 0.1% urea combined with 0.5% MgCl2 and 0.15% CaCl2 into media, the
highest PME obtained after 96 hours incubation at a temperature of 35.5°C, pH 4.0
(adjusted by citrate buffer), fermentation temperature and moisture content adjusted
to 57.4% and 16.5% v/w of inducer concentration (105 cfu/mL). In addition, citrate buffer
(pH 3.6) at 35°C and 50 min provided the best recovery in order to obtain highest value
of PME. The ratio 2:1 (v/w) of solvent and substrate was determined as an optimal
condition for concentrated enzyme extracts. Maximum production of PME (about 79.1 U/g
of substrate) was recorded under optimum conditions of SSF and extraction.
Ethanol was the appropriate precipitant for PME purification with the optimal ratio of cold
ethanol and crude enzyme 3: 1 (v/v). In this case, specific activity of PME was 10.02
U/mgprotein, the purification factor achieved 7.98 fold and the PME recovery yield obtained
91.48%. Combined with the cross flow membrane step, the specific activity of PME
reached to 15.63 U/mgprotein and the purification factor achieved 12.40 ± 0.89 fold in
comparison to the crude enzyme solution. The molecular weight of the enzyme was found
to be 43 kDa and Km was 0.6014 g/L. The activity of the enzyme was stimulated by NaCl
or CaCl2. In addition, the optimum temperature and pH of A. niger PME
were 38 ÷ 40°C and 5.0, respectively. Isothermal inactivation of partial purified
A. niger PME could be described by a fractional – conversion model and the inactivation
rate constants increase with increasing temperatures from 50 to 70°C.
The obtained technical PME enzyme also proved the positive effects to improving of the
texture of frozen pineapples and fermented cucumbers.
Key words: Aspergillus niger, isolation, high activity, pectin methylesterase, rich pectin
substrate, screening, solid state fermentation, texture improvement.
Chuyên ngành Vi sinh v t h
vii
i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh
inh h
Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh
rường ĐH Cần hơ
2008 - 2012
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN....................................................................................................................... ii
TÓM LƢỢC ........................................................................................................................ iv
SUMMARY ......................................................................................................................... vi
MỤC LỤC ......................................................................................................................... viii
DANH SÁCH BẢNG ........................................................................................................ xiii
DANH SÁCH HÌNH .......................................................................................................... xv
TỪ VI T TẮT................................................................................................................... xix
THUẬT NGỮ ..................................................................................................................... xx
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1
1.
Tính cấp thiết của đề t i ......................................................................................... 1
2.
Mục ti u v nội dung nghi n cứu .......................................................................... 2
3.
Đối tƣợng v phạm vi nghi n cứu ......................................................................... 3
4.
Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học v thực tiễn của luận án ..................... 3
5.
Cách tiếp cận v giả thu ết khoa học .................................................................... 4
6.
Kết cấu của luận án ................................................................................................ 5
Chƣơng 1
1.1
T NG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 6
Tổng quan về enz me pectin meth lesterase ...................................................... 6
1.1.1
Tổng quan ............................................................................................................ 6
1.1.2
Tính chất sinh lý của PME .................................................................................. 6
1.1.3
Kiểu phản ứng của PME ...................................................................................... 7
1.1.4
Các yếu tố ảnh hƣởng đến động học của enzyme PME ...................................... 8
1.2
Tầm quan trọng của việc sử dụng PME trong thực tiễn ................................. 10
1.2.1
Các ứng dụng cơ bản ......................................................................................... 10
1.2.2
Tổng quan về công nghệ chế biến rau quả và sự biến đổi đặc tính cấu trúc của
rau quả trong quá trình chế biến .......................................................................................... 12
1.2.3
Vai trò của pectin và PME đối với sự cải thiện đặc tính cấu trúc của thực phẩm
nguồn gốc thực vật ............................................................................................................... 13
1.3
Vai trò của việc thu nhận PME từ nấm mốc Aspergillus niger đặc hiệu........ 19
Chuyên ngành Vi sinh v t h
viii
i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh
inh h
Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh
rường ĐH Cần hơ
2008 - 2012
1.3.1
Tầm quan trọng của việc thu nhận PME từ nấm mốc A. niger ......................... 19
1.3.2
Vai trò của cơ chất pectin đối với sự phát triển của nấm mốc sinh tổng hợp
enzyme PME ........................................................................................................................ 20
1.3.3
Nguồn nguyên liệu cho quá trình phân lập và tuyển chọn A. niger sinh tổng hợp
PME hoạt tính cao................................................................................................................ 21
1.4
Tổng quan về nấm Aspergillus niger ................................................................. 22
1.4.1
Giới thiệu chung ................................................................................................ 22
1.4.2
Đặc điểm hệ sợi của nấm Aspergillus niger ...................................................... 23
1.4.3
Cấu tạo cơ quan sinh sản ................................................................................... 23
1.4.4
Chuyên luận phân loại Aspergillus niger .......................................................... 24
1.4.5
Định danh Aspergillus niger theo phƣơng pháp truyền thống .......................... 24
1.4.6
Định danh nhóm loài Aspergillus b ng phƣơng pháp sinh học phân tử ............ 25
1.5
Phƣơng pháp tu ển chọn dòng nấm mốc Aspergillus niger có khả năng sinh
tổng hợp PME .................................................................................................................... 26
1.5.1
Lý thuyết chung ................................................................................................. 26
1.5.2
Tuyển chọn dòng Aspergillus niger sinh tổng hợp PME theo phƣơng pháp sàng
lọc tự nhiên .......................................................................................................................... 27
1.6
Ảnh hƣởng của th nh phần môi trƣờng đến quá trình sinh tổng hợp PME . 27
1.6.1
Vai trò của cơ chất trong quá trình lên men sinh tổng hợp PME ...................... 27
1.6.2
Ảnh hƣởng của thành phần đa lƣợng................................................................. 29
1.6.3
Ảnh hƣởng của nguồn khoáng dinh dƣỡng ....................................................... 30
1.7
Tác động của phƣơng thức v điều kiện l n men đến hiệu quả sinh tổng hợp
PME
............................................................................................................................... 30
1.7.1
Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy ...................................................................... 30
1.7.2
Độ ẩm môi trƣờng ............................................................................................. 30
1.7.3
Điều kiện pH ban đầu của môi trƣờng............................................................... 31
1.7.4
Ảnh hƣởng của thời gian ủ ................................................................................ 32
1.7.5
Ảnh hƣởng của phƣơng thức lên men đến quá trình tổng hợp PME ................. 33
1.8
Các ếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả thu nhận PME từ canh trƣờng bề mặt 34
1.9
Các biện pháp tinh sạch PME kỹ thuật ............................................................ 35
1.9.1
Tầm quan trọng của chế phẩm enzyme kỹ thuật trong công nghệ thực phẩm .. 36
1.9.2
Tinh sạch sơ bộ PME b ng phƣơng pháp kết tủa .............................................. 37
Chuyên ngành Vi sinh v t h
ix
i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh
inh h
Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh
rường ĐH Cần hơ
2008 - 2012
Ứng dụng kỹ thuật lọc màng trong tinh sạch enzyme kỹ thuật ......................... 38
1.9.3
Qu
1.10
hoạch thực nghiệm xác định điều kiện l n men thích hợp bằng
phƣơng pháp bề mặt đáp ứng (RSM) .............................................................................. 38
Tình hình nghi n cứu trong v ngo i nƣớc về lĩnh vực phân lập, tu ển
1.11
chọn v sinh tổng hợp PME .............................................................................................. 39
Chƣơng 2
2.1
PHƢƠNG TIỆN & PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................. 45
Phƣơng tiện nghi n cứu ...................................................................................... 45
2.1.1
Địa điểm, thời gian ............................................................................................ 45
2.1.2
Thiết bị, hoá chất ............................................................................................... 45
2.2
Phƣơng pháp nghi n cứu .................................................................................... 47
2.2.1
Chuẩn bị mẫu ..................................................................................................... 47
2.2.2
Phƣơng pháp phân tích và đo đạc ...................................................................... 48
2.2.3
Phƣơng pháp phân tích và xử lý số liệu ............................................................ 50
2.3
Nội dung nghi n cứu ........................................................................................... 52
2.3.1
Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ............................................................................... 52
2.3.2
Nội dung 1: Phân lập và tuyển chọn dòng nấm mốc A. niger đặc hiệu cho quá
trình sinh tổng hợp PME ...................................................................................................... 54
Nội dung 2: Xác định các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men rắn sinh tổng
2.3.3
hợp PME ........................................................................................................................... 60
2.3.4
Nội dung 3: Tinh sạch sơ bộ và xác định đặc điểm của PME từ A. niger ......... 71
2.3.5
Nội dung 4: Ứng dụng chế phẩm PME từ A. niger trong cải thiện đặc tính cấu
trúc rau quả .......................................................................................................................... 77
Chƣơng 3
3.1
K T QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 81
Phân lập v xác định đặc điểm hình thái các dòng nấm có đặc tính giống A.
niger từ vỏ các loại quả gi u pectin .................................................................................. 81
3.1.1
Kết quả phân lập các dòng nấm đen thuộc nhóm Aspergillus từ vỏ các loại quả
giàu pectin ........................................................................................................................... 81
3.1.2
Định loại các dòng vừa phân lập dựa trên đặc điểm đại thể của khuẩn lạc ....... 83
3.1.3
Đặc điểm của bào tử đính và bộ máy mang bào tử của các dòng nấm mốc phân
lập
........................................................................................................................... 85
3.2
3.2.1
Tu ển chọn dòng nấm mốc đặc hiệu đối với PME ........................................... 88
Đánh giá khả năng sinh pectinase của các dòng nấm đã đƣợc phân lập ........... 88
Chuyên ngành Vi sinh v t h
x
i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh
inh h
Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh
rường ĐH Cần hơ
2008 - 2012
3.2.2
Tuyển chọn dòng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp PME hoạt tính cao ..... 92
3.2.3
Khả năng kết hợp các dòng nấm mốc đặc hiệu đến hiệu quả thu nhận PME.... 94
3.2.4
Đánh giá khả năng kết hợp hai dòng So2 và R1 đặc hiệu theo các tỷ lệ khác
nhau đến hiệu quả sinh tổng hợp PME hoạt tính cao .......................................................... 96
3.3
Bƣớc đầu định danh một số dòng A. niger đã phân lập bằng kỹ thuật sinh
học phân tử ......................................................................................................................... 98
3.4
Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến quá trình sinh tổng hợp PME từ
2 dòng A. niger R1 và So2 ................................................................................................. 100
3.4.1
Xác định thành phần cơ bản của cơ chất lên men ........................................... 100
3.4.2
Đánh giá tác động của thành phần cơ chất đến hoạt tính PME thu nhận từ quá
trình lên men SSF của hai dòng nấm mốc A. niger R1 và So2 ........................................... 102
3.4.3
Vai trò của việc bổ sung khoáng đến khả năng tổng hợp PME từ A. niger .... 104
3.4.4
Tác động của nguồn nitrogen bổ sung đến hiệu quả thu nhận PME từ quá trình
lên men SSF dòng A. niger So2 và R1 ................................................................................ 107
3.5
Tác động của một số điều kiện l n men đến hiệu quả thu nhận PME từ
A. niger trong quá trình nuôi cấ SSF ........................................................................... 109
3.5.1
Ảnh hƣởng của loại dung dịch đệm sử dụng trong điều chỉnh độ ẩm và pH ban
đầu của môi trƣờng lên men đến hiệu quả sinh tổng hợp PME ......................................... 109
3.5.2
Sự thay đổi hoạt tính PME và thành phần cơ chất của môi trƣờng nuôi cấy theo
thời gian ủ ......................................................................................................................... 111
3.5.3
Sự tƣơng tác giữa pH, độ ẩm ban đầu của môi trƣờng, tỷ lệ huyền phù bào tử
nấm và nhiệt độ ủ đến quá trình sinh tổng hợp PME từ A. niger ...................................... 113
3.6
Ảnh hƣởng của điều kiện l trích đến hiệu quả thu nhận PME sau quá trình
lên men SSF ...................................................................................................................... 120
3.6.1
PME
3.6.2
Ảnh hƣởng của việc thay đổi giá trị pH dung dịch đệm đến hiệu quả ly trích
......................................................................................................................... 120
Ảnh hƣởng của tỷ lệ dung dịch ly trích và canh trƣờng bề mặt sau khi lên men
đến hiệu quả ly trích PME từ nấm mốc A. niger ............................................................... 122
3.6.3
Ảnh hƣởng của nhiệt độ và thời gian đến hiệu quả ly trích PME ................... 124
3.6.4
Ảnh hƣởng của nhiệt độ bảo quản đến độ ổn định của dịch trích PME thô .... 126
3.7
Tinh sạch v xác định đặc điểm của PME đƣợc sinh tổng hợp từ tổ hợp
A. niger So2 và R1 ............................................................................................................ 129
Chuyên ngành Vi sinh v t h
xi
i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh
inh h
Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh
rường ĐH Cần hơ
2008 - 2012
3.7.1
Ảnh hƣởng của loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng đến khả năng kết tủa PME từ
A. niger
......................................................................................................................... 129
3.7.2
Tinh sạch sơ bộ PME từ A. niger b ng phƣơng pháp lọc màng ...................... 135
3.7.3
Một số đặc điểm cơ bản của chế phẩm PME kỹ thuật thu nhận từ A. niger ... 137
Khả năng ứng dụng của chế phẩm PME kỹ thuật thu nhận từ A. niger So2
3.8
và R1 đến khả năng cải thiện cấu trúc rau quả ............................................................. 146
3.8.1
Đối với sản phẩm khóm lạnh đông .................................................................. 146
3.8.2
Tác động của PME đến sự cải thiện cấu trúc dƣa leo muối chua .................... 151
K T LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................................................. 155
1.
Kết luận ................................................................................................................ 155
2.
Đề nghị ................................................................................................................. 156
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 157
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ...................................................... 177
PHỤ LỤC 1 MÔI TRƢỜNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NHẬN DIỆN NẤM MỐC, CÁC
PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ....................................................................................... xxi
PHỤ LỤC 2 MỘT SỐ K T QUẢ KHẢO SÁT ............................................................. xli
PHỤ LỤC 3 K T QUẢ THỐNG KÊ ............................................................................lxiii
PHỤ LỤC 4
MỘT SỐ HÌNH ẢNH ............................................................................ cxv
Chuyên ngành Vi sinh v t h
xii
i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh
inh h
Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh
rường ĐH Cần hơ
2008 - 2012
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1.1: Thành phần pectin và mức độ ester hóa của pectin ở một số loại trái cây .......... 21
Bảng 1.2: Các chất dinh dƣỡng đa lƣợng, vi lƣợng, nguồn gốc và chức năng đối với tế bào
nấm mốc Aspergillus sp. ...................................................................................................... 28
Bảng 2.1: Các chỉ tiêu, phƣơng pháp phân tích và đo đạc ................................................... 49
Bảng 2.2: Công thức tính toán, đánh giá hiệu quả tinh sạch PME ...................................... 50
Bảng 2.3: Giá trị mã hóa và giá trị thực của các nhân tố tƣơng tác đến hiệu quả sinh tổng
hợp PME (U/g) .................................................................................................................... 66
Bảng 2.4: Các nghiệm thức khảo sát theo phƣơng pháp bề mặt đáp ứng, áp dụng thiết kế
trung tâm phức hợp .............................................................................................................. 67
Bảng 3.1: Số dòng nấm mốc đƣợc phân lập từ vỏ các loại quả giàu pectin ....................... 82
Bảng 3.2: Phân nhóm nấm mốc có tính đặc hiệu với enzyme pectinase ............................. 89
Bảng 3.3: Kết quả thống kê sự khác biệt đƣờng kính vòng phân giải pectin (D) của các
dòng nấm mốc thuộc nhóm đặc hiệu cao với pectinase....................................................... 90
Bảng 3.4: Sự thay đổi đƣờng kính vòng phân giải pectin và hoạt tính PME sinh tổng hợp từ
các dòng nấm mốc đặc hiệu với pectinase ........................................................................... 93
Bảng 3.5: Đánh giá khả năng kết hợp hai dòng nấm mốc đến hiệu quả thu nhận enzyme
PME ..................................................................................................................................... 95
Bảng 3.6: Ảnh hƣởng của tỷ lệ kết hợp hai dòng R1 và So2 đến hiệu quả sinh tổng hợp
PME hoạt tính cao................................................................................................................ 97
Bảng 3.7: Thành phần hóa học cơ bản của các nguồn cơ chất lên men ............................ 101
Bảng 3.8: Sự thay đổi hoạt tính PME ở các tỷ lệ kết hợp khác nhau của bã táo ta và vỏ quả
cam/bƣởi ............................................................................................................................ 102
Bảng 3.9: Ảnh hƣởng của nồng độ và loại khoáng bổ sung vào môi trƣờng lên men đến sự
thay đổi hoạt tính của PME từ A. niger ............................................................................. 105
Bảng 3.10: Ảnh hƣởng của việc bổ sung kết hợp các loại khoáng vào môi trƣờng nuôi cấy
đến khả năng sinh tổng hợp PME từ A. niger .................................................................... 107
Bảng 3.11: Ảnh hƣởng của hàm lƣợng và nguồn nitrogen bổ sung đến hoạt tính PME từ
quá trình sinh tổng hợp A. niger ........................................................................................ 108
Bảng 3.12: Sự thay đổi hàm lƣợng pectin, DE, độ ẩm của canh trƣờng sau khi lên men và
pH của dịch trích enzyme sau thời gian nuôi cấy .............................................................. 112
Bảng 3.13: Ảnh hƣởng của các nhân tố mã hóa đối với phƣơng trình hồi quy ................. 114
Bảng 3.14: Ảnh hƣởng của tỷ lệ dung dịch đệm citrate và canh trƣờng sau lên men đến
hiệu quả thu nhận PME ...................................................................................................... 122
Bảng 3.15: Hiệu quả tinh sạch PME b ng phƣơng pháp kết tủa với (NH4)2SO4 .............. 130
Chuyên ngành Vi sinh v t h
xiii
i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh
inh h
Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh
rường ĐH Cần hơ
2008 - 2012
Bảng 3.16: Hiệu quả tinh sạch PME b ng phƣơng pháp kết tủa với NaCl ....................... 131
Bảng 3.17: Hiệu quả tinh sạch PME b ng phƣơng pháp kết tủa với ethanol .................... 132
Bảng 3.18: Hiệu quả tinh sạch PME b ng phƣơng pháp kết tủa với aceton...................... 133
Bảng 3.19: So sánh hiệu quả tinh sạch PME b ng các tác nhân khác nhau ...................... 134
Bảng 3.20: Hiệu quả tinh sạch PME từ A. niger sau quá trình lọc màng .......................... 135
Bảng 3.21: Các thông số động học của quá trình bất hoạt nhiệt PME sinh tổng hợp từ
A. niger............................................................................................................................... 141
Bảng 3.22: Ảnh hƣởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính PME từ A. niger ....................... 142
Bảng 3.23: Ảnh hƣởng của nồng độ CaCl2 đến hoạt tính PME từ A. niger ...................... 143
Bảng 3.24: Độ cứng tƣơng đối trung bình của khóm do tác động của tiền xử lý với PME
nấm mốc và CaCl2 theo các phƣơng thức khác nhau ........................................................ 148
Bảng 3.25: Ảnh hƣởng của hoạt tính PME nấm mốc bổ sung đến sự thay đổi độ cứng
tƣơng đối và độ DE của khóm đông lạnh .......................................................................... 150
Bảng 3.26: Ảnh hƣởng của thời gian tiền xử lý nhiệt (ở 50C) đến sự thay đổi độ ester hóa
pectin và đặc tính cấu trúc dƣa leo..................................................................................... 152
Bảng PL1.1: Phân biệt một số giống Aspergillus và Penicillium ..................................... xxiv
Bảng PL1.2: Cách pha dung dịch đệm citrate .................................................................. xxix
Bảng PL1.3: Cách pha dung dịch đệm acetate ................................................................ xxix
Bảng PL1.4: Cách pha dung dịch đệm citrate-phosphate .................................................. xxx
Bảng PL1.5: Bảng tra nồng độ muối (NH4)2SO4 bão hòa bổ sung trong tiến trình kết tủa
enzyme và protein ............................................................................................................. xxxi
Bảng PL1.6: Chuẩn bị dung dịch đệm CTAB (CTAB buffer) ....................................... xxxiv
Bảng PL1.7: Bảng tra lƣợng đƣờng nghịch chuyển ....................................................... xxxix
Bảng PL2.1: Hình thái khuẩn lạc của 60 dòng Aspergillus niger đã phân lập trên môi
trƣờng MEA và môi trƣờng CZ ........................................................................................... xli
Bảng PL2.2: Đặc tính vi thể của các dòng A. niger phân lập trên môi trƣờng CZ ............ xlv
Bảng PL2.3: Đặc tính vi thể của các dòng A. niger phân lập trên môi trƣờng MEA .......xlvii
Bảng PL2.4: Đƣờng kính vòng phân giải pectin (D) của các dòng A. niger ..................... xlix
Bảng PL2.5: Hiệu quả thu nhận PME theo khối lƣợng cơ chất ly trích khác nhau ............. lix
Chuyên ngành Vi sinh v t h
xiv
i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh
inh h
Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh
rường ĐH Cần hơ
2008 - 2012
DANH SÁCH HÌNH
Hình 1.1: Sơ đồ thủy phân pectin của PME........................................................................... 6
Hình 1.2: Tác dụng của PME trong quá trình làm trong nƣớc quả...................................... 11
Hình 1.3: Cấu trúc phân tử pectin ........................................................................................ 14
Hình 1.4: Sơ đồ mô tả các cấp độ cấu trúc của thực phẩm nguồn gốc thực vật .................. 15
Hình 1.5: Mô hình cấu trúc của vách tế bào thực vật bậc cao ............................................. 15
Hình 1.6: Sơ đồ biểu diễn các chuyển hóa của pectin dƣới tác động của enzyme thủy phân
ảnh hƣởng đến cấu trúc tế bào ............................................................................................. 16
Hình 1.7: Hình thái Aspergillus sp....................................................................................... 23
Hình 1.8: Cấu trúc của trình tự mã hoá cho rRNA ở sinh vật nhân thật .............................. 25
Hình 1.9: Các phƣơng pháp thu chế phẩm enzyme ............................................................. 36
Hình 2.1: Nguyên liệu khóm và cách chuẩn bị mẫu thí nghiệm .......................................... 47
Hình 2.2: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ................................................................................. 53
Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập và tuyển chọn nấm mốc .................................. 54
Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 5 – Khả năng kết hợp các dòng nấm mốc đặc hiệu đến
hiệu quả thu nhận PME ........................................................................................................ 59
Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 8 - Ảnh hƣởng của việc kết hợp bã táo và vỏ quả cam/bƣởi đến
quá trình sinh tổng hợp PME ở điều kiện lên men SSF ............................................................ 62
Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 9a - Ảnh hƣởng của từng thành phần khoáng ................ 63
bổ sung riêng lẻ đến hoạt tính của PME đƣợc tổng hợp bởi A. niger .................................. 63
Hình 2.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 13 - Ảnh hƣởng tƣơng tác của các điều kiện lên men đến
hiệu quả thu nhận PME ........................................................................................................ 68
Hình 2.8: Sơ đồ kết tủa PME b ng dung dịch muối (NH4)2SO4/NaCl ................................ 73
Hình 2.9: Sơ đồ kết tủa PME b ng dung môi hữu cơ .......................................................... 74
Hình 3.1: Mặt trên của mẫu phân lập M3 ............................................................................ 82
Hình 3.2: Mặt dƣới của mẫu phân lập M3 .......................................................................... 82
Hình 3.3: Hình dạng mặt trên của khuẩn lạc ...................................................................... 83
Hình 3.4: Hình dạng mặt dƣới của khuẩn lạc ..................................................................... 83
Hình 3.5: Đặc điểm khuẩn lạc của dòng S2 và G1 khi đƣợc cấy 3 điểm trên môi trƣờng CZ
............................................................................................................................................. 84
Hình 3.6: Dòng A. niger đối chứng (Klich, 2002) ............................................................... 85
Hình 3.7: Dòng nấm mốc H2 trên môi trƣờng MEA ........................................................... 85
Hình 3.8: Sợi nấm có vách ngăn của dòng So2 ở vật kính 4X ............................................. 86
Hình 3.9: Hình ảnh dòng So2 ở vật kính 4X và 10X ........................................................... 86
Chuyên ngành Vi sinh v t h
xv
i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh
inh h
Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh
rường ĐH Cần hơ
2008 - 2012
Hình 3.10: Hình ảnh bào tử dƣới kính hiển vi của dòng A. niger........................................ 86
Hình 3.11: Thể bình còn non (phát triển 1 tầng) dòng So2 .................................................. 87
Hình 3.12: Hai vòng thể bình và bào tử của dòng So2......................................................... 87
Hình 3.13: Mặt trên vòng phân giải pectin của dòng nấm So2 ........................................... 91
Hình 3.14: Mặt dƣới vòng phân giải pectin của dòng nấm So2 ........................................... 91
Hình 3.15: Mẫu đối chứng nƣớc .......................................................................................... 91
Hình 3.16: Mẫu đối chứng A. niger V .................................................................................. 91
Hình 3.17: Vòng phân giải pectin trên môi trƣờng pectin - agarose sau 24 giờ ủ ở 37°C và
nhận diện với thuốc thử CTAB 1% ..................................................................................... 93
Hình 3.18: Ảnh hƣởng của sự kết hợp các dòng nấm mốc khác nhau đến sự thay đổi vòng
phân giải pectin trên môi trƣờng pectin - agarose ............................................................... 95
Hình 3.19: Phổ điện di của sản phẩm PCR của các mẫu nấm đƣợc khuếch đại .................. 98
Hình 3.20: Biểu đồ biểu diễn trình tự của một đoạn RNA gene của 4 mẫu nấm .............. 100
Hình 3.21: Tỷ lệ tƣơng đồng về gene của dòng nấm So2 và dòng A. niger NBL, BR 28s
ribosomal RNA gene hay An03c0110 ............................................................................... 100
Hình 3.22: Đồ thị so sánh ảnh hƣởng của các loại khoáng bổ sung tối ƣu đối với hiệu quả
gia tăng hoạt tính PME từ A. niger .................................................................................... 106
Hình 3.23: Ảnh hƣởng của loại dung dịch đệm sử dụng trong điều chỉnh độ ẩm và pH môi
trƣờng lên men đến hoạt tính PME từ quá trình sinh tổng hợp A. niger ........................... 110
Hình 3.24: Ảnh hƣởng của thời gian ủ đến hoạt tính PME thu nhận từ A. niger .............. 111
Hình 3.25: Đồ thị tƣơng quan giữa hoạt tính PME xác định thực nghiệm và tính toán theo
phƣơng trình hồi quy ......................................................................................................... 115
Hình 3.26: Đồ thị biểu diễn sự tƣơng tác của từng cặp nhân tố đến hiệu quả thu nhận PME
........................................................................................................................................... 116
Hình 3.27: Đồ thị đƣờng đồng điểm biểu diễn tƣơng tác của tỷ lệ huyền phù bào tử nấm và
pH môi trƣờng ban đầu đến hoạt tính PME thu nhận ........................................................ 117
Hình 3.28: Đồ thị đƣờng đồng điểm biểu diễn tƣơng quan của tỷ lệ huyền phù bào tử nấm
bổ sung và nhiệt độ ủ đến hoạt tính PME thu nhận .......................................................... 117
Hình 3.29: Đồ thị đƣờng đồng điểm biểu diễn tƣơng tác của tỷ lệ huyền phù bào tử nấm và
độ ẩm môi trƣờng ban đầu đến hoạt tính PME thu nhận ................................................... 117
Hình 3.30: Đồ thị đƣờng đồng điểm biểu diễn tƣơng tác của nhiệt độ ủ và pH ban đầu của
môi trƣờng đến hoạt tính PME thu nhận .......................................................................... 117
Hình 3.31: Đồ thị đƣờng đồng điểm biểu diễn tƣơng tác của pH và độ ẩm ban đầu của môi
trƣờng lên men đến hoạt tính PME thu nhận .................................................................... 118
Hình 3.32: Đồ thị đƣờng đồng điểm biểu diễn tƣơng tác giữa nhiệt độ ủ và độ ẩm ban đầu
của môi trƣờng lên men đến hoạt tính PME thu nhận ...................................................... 118
Chuyên ngành Vi sinh v t h
xvi
i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh
inh h
Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh
rường ĐH Cần hơ
2008 - 2012
Hình 3.33: Ảnh hƣởng của pH dung dịch ly trích đến hoạt tính PME .............................. 121
Hình 3.34: Ảnh hƣởng của nhiệt độ và thời gian ly trích đến hoạt tính PME ................... 125
Hình 3.35: Sự thay đổi hoạt tính PME thô (A/Ao) theo thời gian bảo quản ...................... 127
ở nhiệt độ lạnh (4°C).......................................................................................................... 127
Hình 3.36: Sự thay đổi hoạt tính PME thô (A/Ao) theo thời gian bảo quản ...................... 127
ở nhiệt độ lạnh đông (-18°C) ............................................................................................. 127
Hình 3.37: Kết quả điện di trên gel SDS–PAGE các mẫu PME từ A. niger ..................... 136
Hình 3.38: Ảnh hƣởng của nồng độ pectin đến hoạt tính PME từ A. niger....................... 137
Hình 3.39: Đồ thị bề mặt đáp ứng và đồ thị đƣờng đồng điểm biểu thị sự tƣơng quan giữa
pH và nhiệt độ đến hoạt tính PME từ A. niger .................................................................. 139
Hình 3.40: Phƣơng trình biểu thị sự vô hoạt nhiệt của PME từ A. niger ........................... 140
Hình 3.41: Quy trình tổng hợp chế phẩm PME kỹ thuật từ A. niger ................................. 145
Hình 3.42: Sự thay đổi độ ester hóa của pectin trong khóm do tác động của tiền xử lý với
PME nấm mốc và CaCl2 theo các phƣơng thức khác nhau ............................................... 146
Hình 3.43: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ cứng tƣơng đối (H/Ho) của dƣa leo muối chua
theo các tỷ lệ PME và CaCl2 bổ sung trong dịch chần ở 50C, 30 phút ............................ 153
Hình PL1.1: Hình thái đại thể và vi thể A. niger ............................................................... xxv
Hình PL1.2: Bào tử của A. awamori (trái) và A. foetidus (phải) ...................................... xxvi
Hình PL1.3: Khuẩn lạc 7 ngày của dòng nấm mốc trên môi trƣờng định loại đặc trƣng: A.
foetidus (h, CZ), A. niger (i, MEA) và A. awamori (j, CZ) ............................................ xxvii
Hình PL2.1: Ảnh hƣởng của các chất kìm hãm đến hoạt động của PME nấm mốc ............. lx
Hình PL2.2: So sánh hiệu quả cải thiện độ cứng của khóm do tác động của quá trình tiền
xử lý với PME ngoại bào có nguồn gốc khác nhau ............................................................lxii
Hình PL3.1: Đồ thị Box – Whisker biểu diễn ảnh hƣởng của dòng nấm mốc đến khả năng
thu nhận PME thông qua đƣờng kính vòng phân giải pectin.......................................... lxviii
Hình PL3.2: Đồ thị Box – Whisker biểu diễn sự thay đổi hoạt tính PME của các dòng nấm
mốc khác nhau .................................................................................................................... lxx
Hình PL3.3: Đồ thị Box – Whisker biểu diễn ảnh hƣởng kết hợp 4 dòng nấm mốc đặc hiệu
đến khả năng thu nhận PME thông qua đƣờng kính vòng phân giải pectin .....................lxxii
Hình PL3.4: Đồ thị Box – Whisker biểu diễn ảnh hƣởng của sự kết hợp 4 dòng nấm mốc
đặc hiệu đến hoạt tính PME ............................................................................................. lxxiv
Hình PL3.5: Đồ thị Box – Whisker biểu diễn ảnh hƣởng của tỷ lệ kết hợp R1 và So2 đến
hiệu quả thu nhận PME dựa trên đƣờng kính vòng phân giải pectin................................ lxxv
Hình PL3.6: Đồ thị Box – Whisker biểu diễn ảnh hƣởng của tỷ lệ kết hợp R1 và So2 đến
hoạt tính PME .................................................................................................................. lxxvi
Hình PL4.1: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu .......................................................... cxv
Chuyên ngành Vi sinh v t h
xvii
i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh
inh h
Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh
rường ĐH Cần hơ
2008 - 2012
Hình PL4.2: Một số hình ảnh chuẩn bị cơ chất và lên men SSF sinh tổng hợp PME ...... cxvi
Hình PL4.3: Các mẫu dƣa leo muối chua ......................................................................... cxvi
Hình PL4.4: Một số công đoạn tiền xử lý và cải thiện đặc tính cấu trúc khóm đông lạnh
......................................................................................................................................... cxvii
Chuyên ngành Vi sinh v t h
xviii
i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh
inh h
- Xem thêm -