Tài liệu Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại hòn chồng-nha trang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG ***** ĐIỀN THỊ PHƢƠNG MSSV: 48134256 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME CELLULASE TỪ RONG GIẤY TẠI HÕN CHỒNG – NHA TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD: TS. VŨ NGỌC BỘI Nha Trang, năm 2010 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Đồ án này Trƣớc hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trƣờng, Phòng Đào tạo Đại học và Sau đại học niềm kính trọng, sự tự hào đƣợc học tập tại trƣờng trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin đƣợc giành cho thầy: TS. Vũ Ngọc Bội Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trƣờng - Trƣờng Đại học Nha Trang đã tận tình hƣớng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Xin cám ơn: PGS. TS. Ngô Đăng Nghĩa - Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trƣờng, ThS. Khúc Thị An - Quyền Trƣởng Bộ môn Công nghệ Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu đƣợc hoàn thành có chất lƣợng. Đặc biệt xin đƣợc ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trƣờng - Trƣờng Đại học Nha Trang, Phòng thí nghiệm CNSH đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, ngƣời thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vƣợt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua. ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................................... i MỞ ĐẦU .............................................................................................................................. 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN .............................................................................................. 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ CELLULASE ............................................................................. 3 1.1.1. Giới thiệu về cellulose ............................................................................................. 3 1.1.2. VSV sinh tổng hợp cellulase ................................................................................... 5 1.2. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE ......................................................... 6 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME CELLULASE.................................. 8 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ......................................................................... 8 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ........................................................................... 9 CHƢƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......... 10 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ............................................................................................... 10 2.1.1. Rong giấy ................................................................................................................. 10 2.1.2. VSV sinh cellulase. ................................................................................................ 10 2.1.3. Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật ............................................................................ 10 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................... 11 2.2.1. Phƣơng pháp phân lập ............................................................................................ 11 2.2.2. Phƣơng pháp tuyển chọn chủng VSV sinh cellulase mạnh nhất ...................... 13 2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp ................................... 13 2.2.4. Phƣơng pháp phân loại chủng vi sinh vật ............................................................ 14 2.2.5. Kiểm tra khả năng lên men các loại đƣờng và khả năng sinh hơi .................... 15 2.2.6. Kiểm tra khả năng chịu muối ................................................................................ 15 2.2.7. Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân khác ......................... 15 2.3. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ....................................................................... 16 2.4. DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM........................................................................................ 16 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 17 iii 3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VSV SINH CELLULASE CAO TỪ RONG GIẤY .................................................................................................... 17 3.2. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG N3 VÀ N4 TUYỂN CHỌN ĐƢỢC.................................................................................................................... 19 3.2.1. Ảnh hƣởng của thời gian ....................................................................................... 19 3.2.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ....................................................................................... 211 3.2.3. Ảnh hƣởng của nồng độ chất cảm ứng ................................................................ 23 3.2.4. Ảnh hƣởng của pH ban đầu ................................................................................. 244 3.3. SƠ BỘ PHÂN LOẠI HAI CHỦNG NẤM N3 VÀ N4 ..................................... 266 3.4. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HÓA CỦA N3 VÀ N4 ...................... 30 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ............................................................................. 34 KẾT LUẬN ........................................................................................................................ 34 ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ........................................................................................................... 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................36 TIẾNG VIỆT ..................................................................... Error! Bookmark not defined. TIẾNG ANH ...................................................................... Error! Bookmark not defined. PHỤ LỤC ........................................................................................................................... 40 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số VSV sản xuất cellulase ...................................................................6 Bảng 3.1. Hoạt tính cellulase của một số chủng VSV phân lập ...............................17 Bảng 3.2. Hoạt tính cellulase của 4 chủng đã qua sơ tuyển ......................................18 Bảng 3.3. Khả năng lên men các loại đƣờng của hai chủng N3 và N4.....................30 Bảng 3.4. Khả năng chịu muối của hai chủng N3 và N4 ........................................311 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc không gian của phân tử cellulose .................................................................3 Hình 1.2. Cấu trúc phân tử celulose ............................................................................................3 Hình 1.3. Cơ chế tác dụng của cellulase .....................................................................................5 Hình 2.1. Quá trình phân lập vi sinh vật sinh cellulase từ rong giấy ...................................... 13 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp............................... 14 Hình 3.1. Hình ảnh về hai chủng nấm sợi có khả năng sinh cellulase mạnh nhất ................ 19 Hình 3.2. Hoạt tính cellulase của hai chủng N3 và N4 trên CMC .......................................... 19 Hình 3.3. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của chủng N3 ..... 20 Hình 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của chủng N4 ..... 20 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh cellulase của chủng N3 ....................... 22 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh cellulase của chủng N4 ....................... 22 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ chất cảm ứng đến khả năng sinh cellulase của chủng N323 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ chất cảm ứng đến khả năng sinh cellulase của chủng N4233 Hình 3.9. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến khả năng sinh cellulase của chủng N3........... 25 Hình 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến khả năng sinh cellulase của chủng N4 ...... 255 Hình 3.11. Hình thái khuẩn lạc của chủng N3 trên đĩa petri ................................................. 266 Hình 3.12. Hệ sợi nấm N3 ở các độ phóng đại 10X; 40 X ...................................................... 27 Hình 3.13. Hệ sợi nấm N3 ở các độ phóng đại 40 X và 100X .............................................. 277 Hình 3.14. Hình thái khuẩn lạc chủng N4 trên đĩa petri ........................................................ 277 Hình 3.15. Hệ sợi chủng N4 ở các độ phóng đại 40 X và 100X. ............................................ 28 Hình 3.16. Cuống đính bào tử của chủng N4 ở độ phóng đại 100X ..................................... 288 Hình 3.17. Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus theo Samson và cộng sự, (1995).... 29 Hình 3.18. Một số hình ảnh về khả năng lên men đƣờng của hai chủng N3 và N4 ............... 31 Hình 3.19. Khả năng chịu muối của chủng N3 và N4 ở nồng độ 6% ..................................... 32 Hình 3.20. Khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân của chủng N3 và N4 ...................32 1 MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme đƣợc sản xuất càng nhiều và đƣợc sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực nhƣ: công nghiệp, chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Các enzyme đang đƣợc sử dụng phổ biến protease, amylase, pectinase, glucooxydase, … Cellulase là một trong số các enzyme đƣợc ứng dụng phổ biến trong công nghệ thực phẩm, công nghiệp dệt, bia - rƣợu, bột giặt, sản xuất phân bón hữu cơ, y tế, xử lý môi trƣờng, ... Đặc biệt hiện nay cellulase đƣợc toàn thế giới quan tâm nghiên cứu và phát triển nhằm ứng dụng trong công nghệ chế tạo nhiên liệu sinh học. Đây là nguồn nhiên liệu thân thiện với môi trƣờng và có thể giải quyết đƣợc vấn đề thiếu nhiên liệu khi các nguồn nhiên liệu truyền thống đang ngày càng cạn kiệt. Tuy vậy, hiện nay enzyme cellulase đƣợc sử dụng trong các ngành công nghiệp ở Việt Nam chủ yếu đƣợc nhập khẩu từ nƣớc ngoài với giá thành cao. Nƣớc ta là một nƣớc sản xuất nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme cellulase là rất phong phú. Vì thế, việc nghiên cứu sản xuất ra các enzyme từ vi sinh vật phân lập từ tự nhiên tại Việt Nam hiện nay đang là một đòi hỏi cấp thiết. Việc tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng sản xuất enzyme nhất là cellulase từ tự nhiên không những giúp tận dụng các nguồn gen quý hiếm có sẵn từ tự nhiên mà còn góp phần bảo tồn gen, cải tạo các chủng vi sinh vật công nghiệp đã bị thoái hóa giống sau một thời gian sử dụng. Xuất phát từ lý do trên và tình hình nghiên cứu tại Việt nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn Chồng-Nha Trang” với mục tiêu: thu thập các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase có thể thủy phân rong giấy với họat tính cao làm cơ sở cho việc sản xuất enzyme cellulase, ứng dụng trong sản xuất cồn từ rong biển một hƣớng đang đƣợc toàn thế giới quan tâm. 2 Nội dung của đề tài: 1) Phân lập và tuyển chọn được chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase cao từ rong giấy thu tại Hòn Chồng-Nha Trang; 2) Sơ bộ phân loại các chủng vi sinh vật sinh cellulase cao phân lập được; 3) Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng vi sinh tuyển chọn được. Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo không thể tránh đƣợc các hạn chế. Em rất mong nhận đƣợc các ý kiến góp ý của những ai quan tâm đến vấn đề này, để cho báo cáo thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cám ơn. 3 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ CELLULASE 1.1.1. Giới thiệu về cellulose Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật. Ngoài ra, ngƣời ta còn thấy chúng có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật (VSV). Ở tế bào thực vật và một số tế bào vi sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi. Hình 1.1. Cấu trúc không gian của phân tử cellulose Cellulose không có trong tế bào động vật. Chúng là một homopolimer mạch thẳng, đƣợc cấu tạo bởi các β-D-glucose-pyranose. Các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết glucose, liên kết các glucose này với nhau bằng liên kết α-1,4 glucoside. Các gốc glucose trong cellulose thƣờng lệch nhau một góc 180 o và có dạng nhƣ một chiếc ghế bành. Cellulose thƣờng chứa 10.000-14.000 gốc đƣờng và đƣợc cấu tạo nhƣ hình 1.1 và hình 1.2. Hình 1.2. Cấu trúc phân tử celulose Cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy. Ngƣời và hầu hết động vật không có khả năng phân hủy cellulose. Do đó, khi thực vật chết hoặc con ngƣời thải các sản phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trƣờng lƣợng lớn rác thải hữu cơ. Tuy nhiên nhiều chủng VSV bao gồm nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn có khả 4 năng phân hủy cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ enzyme cellulase (Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007). Cellulase là phức hệ enzyme thủy phân cellulose tạo thành các phân tử đƣờng β-glucose. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, cellulose bị phân hủy dƣới tác dụng hiệp đồng của phức hệ cellulase bao gồm ba enzyme là Exo-β-(1,4)glucananse hay enzyme C1, Endo-β- glucananse hay endocellulase còn gọi là enzyme CMC-ase hay Cx và β-(1,4)-glucosidase hay cellobioase: Exo-1,4-gluconase (hay cellobiohydrolase, C1 EC 3.2.1.91) giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC nhƣng tác dụng mạnh lên cellulose vô định hình hoặc cellulose đã bị phân giải một phần. Tác dụng lên cellulose kết tinh không rõ nhƣng khi có mặt endoglucanase thì có tác dụng hiệp đồng rõ rệt. Endo-1,4-glucanase (hay CMC-ase, Cx, EC 3.2.1.4) thủy phân liên kết ß-1,4glucoside và tác động vào chuỗi cellulose một cách tùy tiện, sản phẩm của quá trình thủy phân là cellobiose và glucose. Do thủy phân CMC hoặc cellulose theo kiểu tùy tiện nên endo-1,4-glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi cellulose và tăng chậm các nhóm khử, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin. Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhƣng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose. ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21) thủy phân cellobiose và các cellodextrin khác hòa tan trong nƣớc sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase, còn cellodextrin thì hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên. Chức năng của ß-glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất cảm ứng của cellulase. Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự thủy phân cellulose thành cellobiose và cuối cùng thành glucose. Sự phân giải cellulose dƣới tác dụng của hệ enzyme cellulase xảy ra theo 3 giai đoạn chủ yếu sau: 5 Trong giai đoạn thứ nhất, dƣới tác dụng của tác nhân C1, cellulose bị thủy phân thành cellulose hòa tan. Trong giai đoạn thứ hai, cellulose hòa tan sẽ bị thủy phân dƣới tác dụng xúc tác của hệ enzyme Cx tạo thành đƣờng cellobiose. Ở giai đoạn cuối cùng, dƣới tác dụng của enzyme ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21), cellobiose bị thủy phân thành glucose. Hình 1.3. Cơ chế tác dụng của cellulase Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên thƣờng bị ảnh hƣởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh, có loài phát triển yếu. Chính vì thế, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên đƣợc tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm. 1.1.2. VSV sinh tổng hợp cellulase Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi VSV cả trong điều kiện hiếu khí và yếm khí. Các loài VSV thay phiên nhau phân hủy cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose. Số lƣợng các loài VSV tham gia sinh tổng hợp enzyme có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số trƣờng hợp các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia quá trình phân giải này. Bảng 1.1 dƣới đây là một số loại VSV đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu kỹ nhất. 6 Bảng 1.1. Một số VSV sản xuất cellulase Nấm sợi Xạ khuẩn Vi khuẩn Aspergillus niger Actinomyces aureus Preudomonas A.oryzae Act.cellulose Fluorescens A.terreus Act.diastaticus B.megaterium A.syndovii Act. roseus B.mensenteroides A. flavus Act.griseus Clostridium sp. Fusarium culmorum Act.melamocylas Acetobacter xylinum Fusarium oxysporum Act.coelicolor Vi khuẩn dạ cỏ Mucor pusilus Act.candidus Ruminoccus albus Pen. notatum Act.chromogenes Ruminobacter parum Penicillium spp Act. hygroscopicus Bacteroides Trichoderma lignorum Act.griseofulvin Amylophillus sp. Trichoderma reesei Act.ochroleucus Clos.butiricum Trichoderma viride Act.thermofulcus Clos.locheheadil Trichoderma konongi Act.xanthostrums Cellulosemonas Thermonospora curvata 1.2. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE Hiện nay, enzyme cellulase đƣợc ứng dụng mạnh mẽ trong các ngành công nghiệp khác nhau nhƣ: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất bia rƣợu, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp dệt, sản xuất bột giặt, sản xuất giấy, trong nông nghiệp ... Ứng dụng trƣớc tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật, đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ em. Một số nƣớc đã dùng cellulase để xử lý các loại rau quả nhƣ bắp cải, hành, cà rốt, khoai tây, táo và lƣơng thực nhƣ gạo, mỳ… hay xử lý 7 chè và các loại tảo biển… Hay trong công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, cellulase cùng với hemicellulase đƣợc ứng dụng nhằm làm tăng khả năng hấp thu các chất từ thức ăn. Trong sản xuất bia, dƣới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó có cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và quá trình đƣờng hóa. Trong sản xuất agar-agar, sử dụng cellulase xúc tác để xử lý rong thu agaragar có chất lƣợng cao hơn so với phƣơng pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào. Mặt khác khi sử dụng cellulase để xử lý rong thu agar-agar lại giúp hạn chế ô nhiễm môi trƣờng so với phƣơng pháp sử dụng acid vốn gây ô nhiễm môi trƣờng. Cellulase ứng dụng trong xử lý môi trƣờng: enzyme cellulase đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc phân hủy cellulose có trong chất thải, sự có mặt của enzyme cellulase sẽ giúp cho sự phân hủy cellulose trong tự nhiên dễ dàng và hiệu quả hơn. Hiện nay enzyme cellulase là thành phần quan trọng của chế phẩm sinh học (các chế phẩm EM) trong xử lý ô nhiễm môi trƣờng. Trong nông nghiệp, cellulase đƣợc dùng để phân hủy cellulose từ các phế phụ phẩm để sản xuất phân bón hữu cơ thay thế cho các loại phân bón hóa học truyền thống làm giảm ô nhiễm môi trƣờng cũng nhƣ sự thoái hóa đất. Trong ngành công nghệ sản xuất bột giặt enzyme cellulase đƣợc sử dụng nhƣ một tác nhân nhằm làm hoàn thiện cho bột giặt (tẩy sạch vết bẩn, vải rờ mịn tay, sợi vải sáng bóng hơn và không làm hại da tay). Cellulase đƣợc ứng dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Sự phá vỡ màng tế bào là một việc đòi hỏi các kỹ thuật công phu và tốn kém. Ngƣời ta có thể thu nhận các tế bào trần bằng phƣơng pháp xử lý qua enzyme cellulase. Khi đó ta sẽ thu đƣợc tế bào trần của thực vật (protoplast) và tế bào trần nấm men (spheroplast). Chế phẩm cellulase tinh khiết đƣợc ứng dụng trong kỹ thuật di truyền. Trong kỹ thuật tạo tế bào trần (protoplas), ngƣời ta thƣờng dùng chế phẩm cellulase tinh khiết để phá vỡ thành tế bào thực vật. Ứng dụng cellulase phá vỡ thành tế bào thực 8 vật không làm tổn thƣơng các cơ quan bên trong tế bào, đảm bảo sự nguyên vẹn các nhân tố di truyền. Ngoài ra, việc sản xuất enzyme cellulase có hoạt độ cao để phân hủy cellulose thành các nguồn nhiên liệu sinh học đang đƣợc quan tâm đặc biệt trong ngành công nghiệp năng lƣợng sạch của toàn thế giới. 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME CELLULASE 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Nghiên cứu và ứng dụng của cellulase bắt đầu từ những năm 1950. Cuối thế kỷ XIX đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulase từ các loại vi sinh vật. Một số nghiên cứu về cellulase từ nấm của một sồ tác giả nhƣ : Trichoderma reseii (Ogawa và cộng sự, 1991), Aspergillus sp. (Lusta và cộng sự, 1999), Schizophillum commune (Wilick & Seligy, 1985), Fusarium lini, Penicillium funiculosum (Fogarty & Kelly, 1990). Năm 2000, Mawadza và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulase từ các loại nấm có tính đặc hiệu cao bao gồm phức hệ 3 enzyme: endoglucanase, cellobihydrolase và β-glucosidase thủy phân hoàn toàn cellulose. Trong số những nghiên cứu về khả năng sinh cellulase của vi khuẩn thì Bacillus là chủng có khả năng sản sinh cellulase ngoại bào với số lƣợng lớn, và đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều hơn cả đặc biệt là: B.subtilis (Park và cộng sự, 1991), B.polymxa, B.cereus (Robson & Chambliss, 1989), B.pumilus (Christakopoulos và cộng sự, 1999), Bacillus sp. KMS-330 (Ozaki & Ito, 1991) và KMS-635 (Ito và cộng sự, 1989). Do cellulase có nhiều ứng dụng, cho nên rất nhiều nghiên cứu về enzyme cellulase nhƣ: nghiên cứu về các tính chất hóa lý của chúng nhƣ xác định khối lƣợng phân tử của Macarrón và cộng sự (1993); Sang và cộng sự (1995); Henriksson và cộng sự (1999); Karisson và cộng sự (2001); Coral và cộng sự (2002); Hiroshi và cộng sự (2005), xác định nhiệt độ tối ƣu của Isabel và cộng sự (1992); Macarrón và cộng sự (1993); Coral và cộng sự (2002), xác định pH tối ƣu 9 (Macarrón và cộng sự, 1993; Coral và cộng sự, 2002), xác định ảnh hƣởng của ion kim loại (Sang và cộng sự, 1995). 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc Trong những năm gần đây ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về vi sinh vật phân hủy cellulose và cellulase (Đặng Minh Hằng, 1999; Hoàng Quốc Khánh và cộng sự, 2003; Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007; Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự, 2006). Những nghiên cứu này chủ yếu đề cập vấn đề phân lập các chủng vi sinh vật và đánh giá ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase nhƣ: tuyển chọn, nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng lên khả năng sinh tổng hợp cellulase và tinh sạch, đánh giá tính chất hóa lý của cellulase từ chủng penicillium sp. DTQ - HK1 (Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007). Nghiên cứu phân loại và xác định hoạt tính cellulase của chủng xạ khuẩn ƣa nhiệt XKS2 (Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự, 2006). Từ các phân tích ở trên cho thấy hiện ở Việt Nam chƣa có công trình nào công bố về việc phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh enzyme celluase từ rong giấy. Vì thế việc “Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn Chồng-Nha Trang” là cần thiết nhằm thu thập các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase có thể thủy phân rong giấy với họat tính cao làm cơ sở cho việc sản xuất enzyme cellulase ứng dụng trong sản xuất cồn từ rong biển - một hƣớng đang đƣợc toàn thế giới quan tâm. 10 CHƢƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1. Rong giấy: Mẫu rong giấy mục đƣợc lấy từ bãi biển Hòn Chồng - Nha Trang. Rong Giấy có tên khoa học là: Ulva retieulata, Thuộc ngành: Chlorophyta, lớp: Chlorophyceae, bộ: Ulvales. 2.1.2. VSV sinh cellulase: Bao gồm cả nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn hiện diện trên rong giấy. 2.1.3. Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật * Môi trƣờng phân lập VSV: các loại môi trƣờng sử dụng: thạch thƣờng, capek, ISP4, các môi trƣờng đƣờng (glucose, maltose, manitol, D-frucrose, sucrose, lactose) đều của Merck - Đức cung cấp. * Môi trƣờng ISP - 4 (g/l): K2HPO4.3H2O 1 g MgSO4.7H2O 1 g CaCO3 2g (NH4)2SO4 2g Tinh bột tan 10 g NaCl 1g Agar 15 g Nƣớc 1 lít pH 6-7 * Môi trƣờng Capek - dox (g/l): NaNO3 3g KH2PO4 1g MgSO4.7H2O 0,5 g KCl 0,5 g Saccarose 30 g Agar 20 g 11 Nƣớc cất 1 lít pH 5-6 * Môi trƣờng thạch thƣờng (g/l): Nƣớc mắm 10 ml Pepton 10 g Agar 15 - 20 g Nƣớc 1 lít pH 7 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VSV có khả năng sinh enzyme cellulase cao là những chủng có khả năng phân giải tốt cơ chất cellulose. Vì thế các chủng VSV sinh enzyme cellulase cao thƣờng hiện diện ở những nơi giàu nguồn cellulose nhƣ: rơm rạ mục, lá cây mục, gỗ mục, mùn cƣa mục hay hiện diện trên thân rong… Vì thế chúng tôi tiến hành phân lập và tuyển chọn những VSV sinh enzyme cellulase trên rong giấy và tuyển chọn các chủng sinh cellulase cao theo các bƣớc sau: - - Nha Trang. các chủng VSV trên môi trƣờng thạch đặc trƣng - (chọn chủng VSV có vòng phân giải CMC lớn nhất là chủng có khả năng sinh cellulase cao nhất). . . 2.2.1. Phƣơng pháp phân lập Tiến hành phân lập các mẫu rong nhƣ sau: Lấy 10 g rong đã ủ mục cho vào bình tam giác chứa 90 ml nƣớc cất đã vô trùng, lắc đều rồi tiến hành pha loãng ở các nồng độ khác nhau. Pha loãng mẫu theo các nồng độ từ 10-1 - 10-8. Lấy 1 ml ở bình tam giác sau khi lắc đều cho vào ống nghiệm thứ nhất chứa 90 ml nƣớc cất, lắc đều rồi lại lấy 1 ml cho vào ống nghiệm thứ hai, cứ làm nhƣ vậy cho đến khi đƣợc nồng độ thí nghiệm (để có số khuẩn lạc 12 trên đĩa phù hợp, mẫu thƣờng đƣợc pha loãng. Do hiếm khi biết trƣớc đƣợc nồng độ VSV trong mẫu, ngƣời ta dùng nhiều nồng độ khác nhau). Tùy vào số lƣợng VSV nhiều hay ít mà ta cho nồng độ cấy thích hợp (thƣờng từ 10-3 – 10-8). Dùng môi trƣờng thạch thƣờng để phân lập các chủng vi khuẩn, môi trƣờng Capek để phân lập các chủng nấm và môi trƣờng ISP4 để phân lập các chủng xạ khuẩn. Các môi trƣờng đƣợc hấp khử trùng rồi phân phối vào các đĩa peptri. Dùng pipet man hút 0.1 ml dịch đã pha loãng nhỏ vào đĩa thạch đã ghi tên mẫu, nồng độ và ngày phân lập. Dùng que cấy tran trang đều dịch mẫu trên mặt thạch. Sau đó cất và nuôi cấy mẫu phân lập ở 370C. Sau khoảng 24 h vi khuẩn đã phát triển trên đĩa thạch tiến hành quan sát, tách và thuần khiết khuẩn lạc đối với vi khuẩn. Sau 2 - 3 ngày đối với nấm và 5 - 7 ngày đối với xạ khuẩn. + Đối với vi khuẩn: bề mặt nhẵn, ƣớt, khi dùng que gạt không còn lại trong thạch. + Đối với xạ khuẩn: bề mặt khô xù xì, có hình tròn. + Đối với nấm: có hệ sợi. Tách và thuần khiết khuẩn lạc: Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa peptri cấy rồi cấy vào ống nghiệm, mỗi khuẩn lạc cấy vào một ống (ghi kí hiệu đầy đủ để cho các bƣớc nghiên cứu tiếp theo), đặt vào tủ ấm 370C. Sau các khoảng thời gian thích hợp cấy ziczac ra đĩa petri để tinh sạch các chủng VSV, tiến hành tinh sạch nhiều lần. Kiểm tra độ thuần khiết của giống bằng cách kiểm tra vết cấy, kiểm tra độ thuần chủng của các khuẩn lạc và kiểm tra tế bào dƣới kính hiển vi. Khi đƣợc khuẩn lạc thuần nhất và tách rời trên đĩa thạch thì cấy vào ống nghiệm giữ giống (hình 2.1). Phƣơng pháp giữ giống và cấy chuyền: Sau khi tinh sạch xong ta chọn khuẩn lạc mọc riêng rẽ cấy vào ống nghiệm thạch nghiêng. Tiến hành cấy ziczac trên ống thạch nghiêng để đƣợc giống thuần khiết. Giống thuần khiết đƣợc bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C, thời gian tốt nhất là 1 tháng. Sau 1 tháng tiến hành cấy chuyền định kì để đảm bảo dinh dƣỡng cho vi sinh vật. Trƣớc khi sử dụng chủng thuần khiết cần đƣợc hoạt hóa. 13 Hình 2.1. Quá trình phân lập vi sinh vật sinh cellulase từ rong giấy Lƣu ý: Mọi thao tác trên phải đƣợc thực hiện trong điều kiện vô trùng: Tay và bề mặt tiếp xúc trong tủ cấy đƣợc khử trùng bằng cồn. Không khí trong tủ cấy đƣợc khử trùng bằng tia UV. Dụng cụ phải đƣợc khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn. 2.2.2. Phƣơng pháp tuyển chọn chủng VSV sinh cellulase mạnh nhất VSV đƣợc nuôi cấy lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng, trong môi trƣờng dịch thể. Sau 24 h đối với vi khuẩn, 36 - 48 h đối với nấm và 72 h đồi với xạ khuẩn tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút hoặc lọc thu dịch enzyme rồi đem xác định hoạt tính cellulase theo phƣơng pháp Miller (phụ lục 02), (Miller, 1959). 2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp * Phƣơng pháp xác định thời gian nuôi cấy thích hợp Nấm mốc đƣợc nuôi cấy lắc 200 vòng/phút ở các khoảng thời gian: 6; 12; 18; 24;30; 36; 42; 48; 54 và 60 h. Sau đó lọc thu sinh khối và xác định hoạt độ enzyme. * Phƣơng pháp xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp Nấm mốc đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng bán rắn ở các nhiệt độ: 25; 30; 35; 40; 45; 50oC. Sau 36 - 48 h sấy ở nhiệt độ 500C, đem nghiền mịn bằng máy nghiền bi rồi cho vào đó một lƣợng nƣớc gấp 4 - 5 lần khối lƣợng canh trƣờng để hòa tan 14 protein-enzyme từ khối canh trƣờng nấm sợi. Sau đó đem xác định hoạt độ enzyme cellulase bằng phƣơng pháp đổ dịch. * Phƣơng pháp xác định nồng độ chất cảm ứng thích hợp Nấm mốc đƣợc nuôi cấy lỏng lắc 200 vòng/phút trong môi trƣờng có chứa nồng độ chất cảm ứng (rơm và rong) ở các nồng độ từ 1% - 8%. Sau 36 - 48 h thu dịch lọc và xác định hoạt tính enzyme cellulase. * Phƣơng pháp xác định pH môi trƣờng nuôi cấy thích hợp Nấm mốc đƣợc nuôi cấy lắc 200 vòng/phút trong môi trƣờng có pH là : 3,4,5,6,7,8 ở nhiệt độ phòng. Sau 36 - 48 h đem xác định hoạt tính enzyme. Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 2.2.4. Phƣơng pháp phân loại chủng VSV (phân loại theo phƣơng pháp truyền thống) Phân loại theo phƣơng pháp truyền thống là phƣơng pháp phân loại chủng VSV dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa. Dựa vào đó ngƣời ta phân