Tài liệu Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin từ nước dưa lên men truyền thống nhằm bảo quản thực phẩm

Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn Văn Duy, Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn, dạy bảo và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành đồ án tốt nghiệp này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang và các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học đã tạo môi trường thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Trong thời gian qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của cô Nguyễn Thị Hải Thanh, chị Nguyễn Minh Nhật và một số bạn sinh viên lớp 49, 50 SH. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Nha Trang, tháng 07 năm 2011 Sinh viên Nguyễn Thị Thanh Tâm Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang i Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i MỤC LỤC .................................................................................................................. ii DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. vi DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. vii LỜI NÓI ĐẦU ........................................................................................................... 1 Chƣơng I. TỔNG QUAN .......................................................................................... 2 1.1. Tình hình bảo quản nguyên liệu thực phẩm ......................................... 2 1.1.1. Trên thế giới .............................................................................................................. 2 1.1.2. Ở Việt Nam................................................................................................................ 6 1.2. Tổng quan về bacteriocin ...................................................................... 8 1.2.1. Đặc điểm chung về bacteriocin ............................................................................... 8 1.2.2. Phân loại bacteriocin ................................................................................................ 9 1.2.3. Một số tính chất của bacteriocin ........................................................................... 11 1.2.3.1. Độ bền nhiệt .................................................................................................11 1.2.3.2. Độ bền pH ....................................................................................................11 1.2.3.3. Độ bền với các enzyme ................................................................................11 1.3. Tổng quan về vi khuẩn lactic ............................................................. 13 1.3.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic..................................................................... 13 1.3.2. Phân loại vi khuẩn lactic ........................................................................................ 13 1.3.3. Đặc điểm sinh trưởng ............................................................................................. 15 1.3.4. Ứng dụng ................................................................................................................. 16 1.4. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh bacteriocin ...................... 18 1.4.1. Trên thế giới ............................................................................................................ 18 1.4.2. Ở Việt Nam ............................................................................................................. 21 Chƣơng II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 23 2.1. Vật liệu ................................................................................................. 23 Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang ii Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 2.1.1. Mẫu ........................................................................................................................... 23 2.1.2. Chủng vi khuẩn chỉ thị ........................................................................................... 23 2.1.3. Thiết bị chuyên dụng............................................................................................. 24 2.1.4. Hóa chất, môi trường và thuốc thử ....................................................................... 24 2.2. Phƣơng pháp nguyên cứu ................................................................... 28 2.3. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic từ mẫu nƣớc dƣa lên men truyền thống có khả năng sinh bacteriocin .................................................. 29 2.3.1. Phân lập vi khuẩn ................................................................................................... 29 2.3.2. Nuôi cấy và bảo quản chủng vi khuẩn ................................................................. 31 2.3.3. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn lactic ......................................... 32 2.3.4. Thử với enzym proteinase K và α-chymotrypsin .............................................. 34 2.3.5. Xác định độ bền nhiệt của dịch bacteriocin ........................................................ 35 2.3.6. Xác định độ bền pH đối với dịch bacteriocin thô ............................................... 36 2.3.7. Xác định đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn lactic sinh bacteriocin ............... 36 Chƣơng III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 38 3.1.Phân lập vi khuẩn lactic từ nƣớc dƣa muối lên men truyền thống .... 38 3.2.Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin ............................ 38 3.2.1. Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic ....................................... 38 3.2.2. Kết quả kiểm tra với enzym proteinase K và α-chymotrypsin ......................... 41 3.3. Một số tính chất của dịch bacteriocin thô .......................................... 42 3.3.1. Độ bền nhiệt của dịch bacteriocin thô .................................................................. 43 3.3.2. Độ bền pH của dịch bacteriocin thô ..................................................................... 44 3.4. Một số đặc điểm sinh học và phân loại của vi khuẩn lactic sinh bacteriocin .................................................................................................. 45 3.5. Đặc điểm của các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin đƣợc phân lập bổ sung từ ruột cá giò ...................................................................................... 47 3.5.1. Phân lập chủng vi khuẩn sinh bacteriocin từ ruột cá giò .................................. 47 3.5.2. Hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn từ mẫu ruột cá giò ................................... 48 Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang iii Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 3.5.3. Kết quả kiểm tra với enzym proteinase K và α-chymotrypsin ....................... 50 3.5.4. Một số tính chất của dịch bacteriocin thô của chủng CT 1.1 ............................ 51 3.5.5. Một số đặc điểm sinh học và phân loại của vi khuẩn phân lập từ mẫu ruột cá giò sinh bacteriocin ................................................................................................... 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 56 Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang iv Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT Kí hiệu viết tắt Nghĩa 1 LAB Lactic Acid Bacteria 2 MRS de Man, Rogosa and Sharpe 3 APW Alkaline Peptone Water 4 TSB Tryptone Soya Broth 5 TSA Tryptone Soya Agar 6 RV Rappaport - Vassiliadis 7 XLD Xylose Lysine Desoxycholate Agar 8 B 1.1 Bacillus B 1.1 9 C1 Vibrio C1 10 Sal 1 Salmonella Sal 1 TT Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang v Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Bảng phân loại bacteriocin .......................................................................... 10 Bảng 2. Tính chất hóa lý của một số bacteriocin của vi khuẩn Gram dương ........... 12 Bảng 3. Bảng lấy mẫu phân lập vi khuẩn lactic ....................................................... 23 Bảng 4. Số chủng vi khuẩn phân lập được từ nước dưa, ruột cá giò ........................ 38 Bảng 5. Bảng khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch ngoại bào từ vi khuẩn lactic... 39 Bảng 6. Đường kính vòng kháng Bacillus B1.1 của dịch bacteriocin từ các chủng T8 và T13 sau khi xử lý nhiệt và pH……………………………………………… 43 Bảng 7. Bảng khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch ngoại bào của các chủng vi khuẩn được phân lập từ ruột cá giò………………………………….......................46 Bảng 8. Đường kính vòng kháng Bacillus B1.1 của dịch bacteriocin từ chủng CT 1.1 sau khi xử lý nhiệt và pH …………………………………………………….49 Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang vi Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 DANH MỤC HÌNH Hình 1. Cấu trúc của nisin ........................................................................................... 8 Hình 2. Cấu trúc của colicin ........................................................................................ 9 Hình 3. Kiểu hoạt động của bacteriocin của vi khuẩn lactic (LAB) ......................... 11 Hình 4. Một số chủng vi khuẩn lactic ....................................................................... 15 Hình 5. Pho mát chứa loại vi khuẩn có thể làm ra loại thuốc kháng sinh có khả năng chống nhờn thuốc ...................................................................................................... 21 Hình 6. Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài ............................. 29 Hình 7. Sơ đồ pha loãng mẫu .................................................................................... 30 Hình 8. Quy trình thử hoạt tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô với các chủng chỉ thị…. .................................................................................................................. 33 Hình 9. Các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nước dưa thể hiện tính kháng với chủng chỉ thị Salmonella Sal 1 trên môi trường XLD .............................................. 40 Hình 10. Các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nước dưa thể hiện tính kháng với chủng chỉ thị Bacillus B1.1 trên môi trường TSA……………...............................40 Hình 11. Kết quả kiểm tra dịch bacteriocin thô của chủng vi khuẩn T13 (A) và T8 (B) với enzym proteinase K trên môi trường TSA với chủng chỉ thị Bacillus B1.1. 41 Hình 12. Kết quả kiểm tra dịch bacteriocin thô của chủng vi khuẩn T8 (A) và T13 (B) với enzym α-chymotrypsin trên môi trường TSA với chủng chỉ thị Bacillus B1.1.......... ................................................................................................................. 42 Hình 13. Vòng kháng Bacillus B1.1 của dịch bacteriocin từ chủng T13 sau khi xử lý các nhiệt độ khác nhau. ............................................................................................. 43 Hình 14. Vòng kháng Bacillus B1.1 của dịch bacteriocin từ chủng T8 sau khi xử lý ở pH 2-12 ………………………………………………………………………….44 Hình 15. Vòng kháng Bacillus B1.1 của dịch bacteriocin từ chủng T13 sau khi xử lý ở pH 2-12 ..................................................................................................................45 Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang vii Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 Hình 16. Khuẩn lạc chủng T8 sau 24 giờ nuôi trên môi trường thạch MRS ở pH 6,5 và nhiệt độ 40OC ....................................................................................................... 46 Hình 17. Tế bào của chủng vi khuẩn lactic T8 sau khi nhuộm Gram được quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại X-100 ................................................................... 46 Hình 18. Tế bào của chủng vi khuẩn lactic T13 sau khi nhuộm Gram được quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại X-100 ................................................................... 47 Hình 19. Khuẩn lạc chủng CT 1.1 được nuôi cấy trên môi trường thạch TSA, pH 7,5 và ở nhiệt độ 400C. .............................................................................................. 48 Hình 20. Các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột cá giò thể hiện hoạt tính kháng với chủng Vibrio C1 trên môi trường thạch TSA ở 400C…………………………….49 Hình 21. Các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột cá giò thể hiện tính kháng với chủng Bacillus B 1.1 trên môi trường thạch TSA, ở 400C. ................................................. 50 Hình 22. Kết quả kiểm tra dịch bacteriocin thô của vi khuẩn CT 1.1 với enzym proteinase K trên môi trường TSA với chủng chỉ thị Vibrio C1............................... 50 Hình 23. Kết quả kiểm tra dịch bacteriocin thô của vi khuẩn CT 1.1 với enzym αchymotrypsin trên môi trường TSA với chủng chỉ thị Vibrio C1 ............................. 51 Hình 24. Vòng kháng Vibrio C1 của dịch bacteriocin từ chủng CT 1.1 sau khi xử lý các nhiệt độ khác nhau. ............................................................................................. 52 Hình 25. Vòng kháng Vibrio C1 của dịch bacteriocin từ chủng CT 1.1 sau khi xử lý ở pH 2-12 .................................................................................................................53 Hình 26. Khuẩn lạc chủng CT 1.1 phân lập từ ruột cá giò được nuôi cấy trên môi trường thạch TSA sau 7 ngày nuôi ở 400C ............................................................... 53 Hình 27. Tế bào của chủng vi khuẩn CT 1.1 sau khi nhuộm Gram được quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại X-100 ................................................................... 54 Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang viii Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 LỜI NÓI ĐẦU Thực phẩm là một trong những nhu yếu phẩm không thể thiếu trong đời sống hằng ngày của mỗi người. Thực phẩm phải tươi, ngon theo đúng nghĩa của nó mà không bị mất đi giá trị dinh dưỡng ban đầu, không gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Những yêu cầu trên cũng chính là đòi hỏi hàng đầu của các phương pháp bảo quản thực phẩm. Vì hầu hết các loại nông sản thực phẩm tươi sống ở nước ta thường được bảo quản bằng các chất hóa học. Tuy nhiên, phương pháp này chưa đáp ứng được yêu cầu về an toàn thực phẩm. Hiện nay trên thế giới, các nhà khoa học đã tìm được một phương pháp bảo quản thực phẩm bằng sinh học nhưng còn khá mới mẻ ở nước ta – chính là sử dụng bacteriocin làm chất bảo quản sinh học an toàn. Mặc dù có một vài phương pháp khác bacteriocin, nó có thời gian bảo quản lâu hơn nhưng ngày nay con người càng ý thức nhiều về sức khỏe nên họ tránh dùng những thực phẩm được bảo quản bằng chất hóa học. Chính vì vậy, việc thực hiện đề tài: ―Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin từ nước dưa lên men truyền thống nhằm bảo quản thực phẩm‖ là rất cấp thiết. Đề tài này được tiến hành với các mục tiêu sau: + Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic sinh bacteriocin từ nước dưa muối lên men truyền thống + Xác định một số tính chất của dịch bacteriocin thô từ các chủng tuyển chọn được + Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang 1 Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 Chƣơng I. TỔNG QUAN 1.1. Tình hình bảo quản nguyên liệu thực phẩm 1.1.1. Trên thế giới Trong suốt chiều dài lịch sử, con người đã thích ăn thực phẩm còn tươi hơn là các dạng thực phẩm khác như bị ươn, thực phẩm dạng sấy khô…. Tuy nhiên, do thực phẩm hư hỏng rất nhanh nên từ lâu loài người đã phải phát triển những phương pháp để bảo quản nguyên liệu thực phẩm. Có rất nhiều phương pháp bảo quản thực phẩm trên thế giới, song nhìn chung các phương pháp đều tuân thủ theo ba nguyên tắc Bioza, Abiosis và Anabioza. Thực chất các nguyên tắc này như sau: Theo nguyên tắc Bioza (Bios = sự sống) thì thực phẩm được cất giữ ở điều kiện vệ sinh tốt, với môi trường vô trùng tuyệt đối để luôn luôn giữ nguyên trạng thái tươi sống ban đầu của nguyên liệu. Ví dụ, thịt lợn, thịt bò tươi trong phòng mát, vô trùng luôn được giữ ở nhiệt độ 00C – 100C. Tuy nhiên, các phương pháp này không thích hợp ở điều kiện nhiệt đới, lại đòi hỏi thiết bị đắt tiền, do vậy ở Việt Nam rất ít ứng dụng. Còn theo nguyên tắc Abioza (Abiosis = không sống), người ta dùng những biện pháp đình chỉ hoàn toàn sự sống của vi sinh vật gây nhiễm. Dưới tác dụng của các yếu tố diệt khuẩn như vậy thì bản thân khối nguyên liệu được bảo quản cũng thay đổi trạng thái, không còn tươi sống nữa. Thuộc nguyên tắc này có ba phương pháp được sử dụng như thanh trùng ở nhiệt độ cao, chiếu xạ và siêu âm, dùng hóa chất bảo quản. Thanh trùng ở nhiệt độ cao còn gọi là sử dụng quá trình nhiệt nóng. Vì là dưới tác dụng của nhiệt, hoặc do chính các tế bào vi sinh vật bị tiêu diệt, hay do chính các enzym quan trọng của chúng bị bất hoạt, do vậy không gây nhiễm được. Cũng tùy vào loại thực phẩm người ta có thể thực hiện việc khử trùng nguyên liệu ở ba khoảng nhiệt độ khác nhau, kéo dài trong những khoảng thời gian nhất định. Ví dụ như đối với loại thực phẩm có nhiều đường bột dễ cháy cần duy trì ở 800C–900C trong 30–45 phút, những nguyên liệu dạng đạm duy trì ở 900C–1000C Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang 2 Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 trong 45–60 phút còn với những nguyên liệu dạng đồ hộp hoặc vỏ giáp cứng có thể duy trì ở 110 –1500C ở áp suất 1,2 -1,5at. Phương pháp chiếu xạ và siêu âm sử dụng các tia hồng ngoại, tia bức xạ dạng α, β, γ …gây oxi hóa hoặc ion hóa ; do đó tạo ra một trong những hiệu quả dưới đây đối với vi sinh vật: thay đổi thành phần cấu trúc tế bào, phá vỡ màng, bất hoạt hệ enzym và song siêu âm với tần số trên 20000 Hz phá vỡ màng tế bào. Trên thế giới, 37 quốc gia đã có luật cho phép chiếu xạ thực phẩm và có hơn 30 nhà máy chiếu xạ thực phẩm đã được xây dựng. Ở Mỹ cho đến nay Cục quản lý thực phẩm và thuốc của Mỹ đã cấp phép cho các loại thực phẩm: lúa mì, bột mì, khoai tây, thịt lợn, hoa quả, rau, gia vị, gia cầm, thức ăn gia súc, thịt đỏ, trứng, sò. Đối với thực phẩm đã chế biến và hải sản đang được xem xét để cấp phép. Tuy nhiên, hạn chế lớn của phương pháp này là giá thành rất cao và đôi khi không an toàn cho người thực hiện cũng như người tiêu dùng do thiếu hiểu biết về cách thức sử dụng, do đó ít được sử dụng ở các nước kém phát triển. Phương pháp sử dụng hóa chất để bảo quản có tác dụng sát trùng bằng các loại hợp chất vô cơ cũng như hữu cơ. Cơ chế tác dụng của nó thể hiện qua nhiều phương thức khác nhau như: phá hủy thành phần cấu trúc tế bào, ngăn ngừa sự sinh tổng hợp enzym và các protein cấu trúc khác (theo cơ chế cảm ứng hoặc ức chế), gây rối loạn quá trình thẩm thấu qua màng tế bào. Các loại hóa chất thường dùng gồm: Các hợp chất sulfit và bisulfit như K2SO3, Na2SO3, Na2HSO3, KHSO3, Ca(HSO3)2. Các hợp chất này thường dùng với nồng độ dưới 3%. Tác dụng của nó ức chế quá trình sinh tổng hợp protein có chứa S (theo cơ chế cảm ứng). Điều cần lưu ý là những hợp chất này là những hợp chất trên đều gây độc hại cho người tiêu dùng, do vậy không được dùng quá liều quy định. Ngoài các hợp chất nói trên người ta còn sử dụng một số vài loại kháng sinh có hoạt tính kháng khuẩn mạnh như Tyrozin, Biomycine… những chất này có tác dụng tốt với vi khuẩn nhưng ít hiệu quả với nấm mốc. Cuối cùng là nguyên tắc Anabioza (= giảm sức sống) (Anabiosis = dạng sống Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang 3 Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 ngầm = sống tiềm sinh), người ta áp dụng những biện pháp nhằm hạn chế sự phát triển của vi sinh vật và hạn chế các hoạt tính của các enzym nhưng không giết chết hoặc đình chỉ hoàn toàn. Thuộc nguyên tắc này có 5 biện pháp chính thường được sử dụng: Ứng dụng quá trình lạnh là phương pháp có tên gọi khác là ― Lưu trữ thực phẩm ở trạng thái lạnh hay đông lạnh‖. Clarence Birdseye, nhà phát minh người Mỹ, chế tạo hệ thống làm lạnh nhanh. Với một cái quạt điện, vài thanh đá lớn và ít nước muối ông đã hoàn thành hệ thống làm đông lạnh nhanh của mình. Hệ thống có thể làm đóng băng các hộp dẻo thức ăn dưới áp suất cao. Năm 1929 , tủ cấp đông rau cải đầu tiên trên thế giới ra mắt người tiêu dùng. Thực phẩm được lưu trữ ở những nhà lạnh ở nhiệt độ 00C sẽ bảo quản trong vài tháng còn thực phẩm giữ ở trạng thái đông lạnh tức là ở những căn phòng mà nhiệt độ được giảm từ từ cho đến khi đạt tới -100C đến -200C ( nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ đóng băng của nước đá ). Ở nhiệt độ này có thể bảo quản từ 6 tháng đến vài năm. Ở nhiệt độ thấp sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật tạm ngừng, hoạt động của các enzym bị đình chỉ, các quá trình sinh hóa trong thực phẩm bị ức chế, nhưng nếu đem khối nguyên liệu trở về nhiệt độ thường thì mọi hoạt động có thể được phục hồi, bởi lẽ vi sinh vật không bị giết chết ( nhất là nấm mốc), nó chỉ giữ ở trạng thái tiềm sinh mà thôi. Do vậy thực phẩm đông lạnh sau khi lấy ra khỏi nơi bảo quản cần được sử dụng sớm, trước khi khối nguyên liệu tan giá. Bảo quản thực phẩm bằng cách phơi hay sấy khô cũng là một biện pháp để bảo quản thực phẩm. Phần lớn vi khuẩn chỉ sinh trưởng và phát triển được trong điều kiện tối thiểu là 15%. Khi đem phơi hoặc sấy khô thực phẩm tức là làm cho độ ẩm tối thiểu 15%. Khi đem phơi hay sấy khô thực phẩm ,tức là làm cho độ ẩm của nguyên liệu nhỏ hơn độ ẩm tối thiểu, khiến cho các vi sinh vật gây nhiễm không thể phát triển được. Nếu sấy hoặc phơi không kỹ, hoặc sau khi phơi, sấy bao gói không tốt để nguyên liệu bị ẩm trở lại thì thực phẩm sẽ bị hư hỏng. Biện pháp này thường được áp dụng đối với các loại hải sản và nấm ăn. Bảo quản thực phẩm bằng cách tạo áp suất thẩm thấu và áp suất nén cao Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang 4 Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 phương pháp dựa trên nguyên tắc chênh lệch áp suất. Cụ thể tạo áp suất thẩm thấu cao là khi môi trường bên ngoài có áp suất cao hơn bên trong tế bào vi sinh vật sẽ xảy ra hiện tượng ―co nguyên sinh‖ có nghĩa là nước trong tế bào vi sinh vật bị rút ra ngoài, nguyên sinh chất bị đông đặc rồi tách khỏi màng tế bào dần dần chết đi. Để tạo áp suất thẩm thấu cao cho môi trường cần chú ý chọn những tác nhân không gây độc, bởi vì phải sử dụng một nồng độ khá cao mới đủ ngưỡng bảo quản. Thường thường người ta dùng muối ăn (NaCl) và đường kính (saccharose). Ngoài ra hiện nay ở Mỹ, người ta đang nói nhiều về loại nước cam, sau 12 tuần giữ lạnh vẫn có hương vị như nước cam tươi, hay chuối không bị thâm đen sau một thời gian dài. Bí quyết đằng sau những sản phẩm này chính là công nghệ bảo quản áp suất cao. Thực phẩm đóng gói chân không sẽ được nhúng vào trong các thùng nước. Sau đó các thùng này sẽ được đóng kín lại và bơm thêm nước vào. Khi áp suất của nước tăng lên, thực phẩm sẽ bị nén lại. Quá trình này sẽ giúp tiêu diệt các loại vi khuẩn, enzym và nấm mốc bằng cách bẻ gãy các cấu trúc phân tử và làm vỡ thành tế bào của chúng. Sau khi dừng nén áp suất, thực phẩm sẽ quay trở lại kích thước và hình dạng ban đầu. Công nghệ này thực sự góp phần cải thiện chất lượng mùi vị của thực phẩm chế biến. Qua nhiều cuộc kiểm tra, các chuyên gia thẩm định mùi vị đều đánh giá thực phẩm bảo quản bằng cao áp có mùi vị ngon hơn so với bảo quản bằng phụ gia. Hạn chế của công nghệ này là chi phí quá cao và sản phẩm sau xử lý vẫn cần phải giữ lạnh. Ngoài ra, công nghệ này không đạt hiệu quả cao đối với các sản phẩm rau và nó có thể làm phai màu thực phẩm nếu áp suất quá cao. Vì thế, hiện nay các nhà chế biến chỉ ứng dụng công nghệ này đối với các thực phẩm đắt tiền như thịt gà tây, hàu và đồ ăn sẵn như thịt gà nướng. Người ta còn bảo quản thực phẩm bằng acid vì đa số các loại vi sinh vật gây nhiễm cho thực phẩm đều hoạt động tốt ở khoảng pH trên 4,5 , khi pH hại xuống mức này chúng ngừng phát triển. Ngâm thực phẩm vào acid tức là tạo ra xung quanh khối nguyên liệu một môi trường có pH thấp dưới 4,5. Loại axit thường dùng nhất là axit acetic. Biện pháp này được dùng để ngâm chua các loại củ quả ăn thay rau (dưa chuột, su hào, củ cải, nấm mỡ…). Riêng đối với các dạng nguyên liệu có hàm lượng cellulose cao người ta thường dùng hai loại axit khác là axit tractic và Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang 5 Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 axit lactic. Một trong những nguyên nhân gây hư hỏng thực phẩm là do tác dụng của oxy có trong không khí, khi phân tử O2 tiếp xúc với nguyên liệu sẽ tham gia vào các phản ứng oxy hóa khử làm cho một số thành phần có trong nguyên liệu bị phân giải và biến tính. Để khắc phục tình trạng này người ta tìm ra biện pháp bảo quản thực phẩm bằng khí trơ và khí cacbonic, tức là ngăn cách khối nguyên liệu với không khí bằng cách dùng một khối lượng khí trơ N2 được hóa lỏng ở -1270C. Cũng có thể dùng một biện pháp thứ hai là điều chỉnh tỷ lệ của bầu không khí trong kho chứa thực phẩm bằng cách giảm thấp lượng O2 và tăng lượng CO2. Khi hạ tỷ lệ O2/ CO2 đã cùng lúc tạo ra hai hiệu quả là tránh hiện tượng phân hủy nguyên liệu và ức chế sự sinh trưởng và sự phát triển của bọn vi sinh vật hiếu khí. Cùng với các biện pháp bảo quản thực phẩm khác còn sử dụng cách bảo quản thực phẩm bằng cách tạo điều kiện cho một quá trình lên men có lợi. Biện pháp này đơn giản, rẻ tiền vì không tốn nhiên liệu để sấy, không cần đến các hoá chất đắt tiền và đặc biệt là không gây hại đối với người tiêu dùng, do vậy đang được áp dụng rộng rãi để bảo quản rau, quả, nấm ăn, thịt động vật. Mới nhất hiện nay, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã tìm ra một phương pháp sinh học an toàn, đó là sử dụng bacteriocin để bảo quản thực phẩm. Phương pháp này giải quyết được khá nhiều nhược điểm của các phương pháp đã được trình bày ở trên ở chỗ: dễ sử dụng, tiết kiệm chi phí bảo quản, không làm biến đổi tính chất của thực phẩm và đặc biệt là không ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng thực phẩm đó. Then chốt của phương pháp sinh học này là việc ứng dụng của một số protein có ở vi khuẩn cụ thể là bacteriocin được sản xuất và phân lập từ nhiều nguồn khác nhau cụ thể là vi khuẩn lactic với khả năng ức chế và tiêu diệt những loại vi khuẩn gây bệnh có trong thực phẩm. 1.1.2. Ở Việt Nam Ở nước ta hiện nay ngoài các phương pháp bảo quản thông thường như vận chuyển thực phẩm tươi, làm lạnh, lên men thực phẩm nhưng vẫn nổi trội hơn cả là phương pháp bảo quản bằng hóa chất đang được người dân và các nhà sản xuất Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang 6 Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 dùng rất phổ biến. Nhu cầu thực phẩm công nghệ ngày càng tăng. Để các loại thực phẩm lâu hư, các nhà sản xuất đều phải dùng chất bảo quản (nằm trong danh mục cho phép của Bộ y tế). Tuy nhiên, đây vẫn là chất hóa học và việc sử dụng vượt mức cho phép đều độc hại, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người dùng. Việc sử dụng các hóa chất và phụ gia trong xử lý, chế biến thực phẩm đã và đang trở thành một vấn đề đáng chú ý. Sức khỏe và thực phẩm có mối quan hệ gắn bó hữu cơ mật thiết với nhau, và chất lượng thực phẩm cũng ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe của con người. Trước những vấn đề bất cập như vậy, trong nước ta hiện nay cũng đang phát triển một số nghiên cứu và đang dần triển khai những phương pháp bảo quản mới như sử dụng phương pháp chiếu xạ ở Trung tâm chiếu xạ - Viện Năng lượng Nguyên tử Việt Nam (ở phía Bắc) và Trung tâm Nghiên cứu và triển khai công nghệ bức xạ (ở phía Nam) thực hiện việc chiếu xạ thực phẩm, tại Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ bức xạ. Mỗi năm, có khoảng 5.000 tấn thực phẩm và 2.000 mét khối dụng cụ y tế các loại đã được đưa vào để chiếu phóng xạ với liều lượng cho phép để diệt khuẩn, hay sử dụng màng sinh học để bảo quản thực phẩm, nghiên cứu các phương pháp sinh học mới mà thế giới đang quan tâm đó là sử dụng bacteriocin. Theo báo cáo khoa học công nghệ mới đây thì các nhà nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) vừa hoàn thiện quy trình sản xuất và sử dụng chất diệt khuẩn sinh học nisin và enterocin để ứng dụng trong bảo quản nông sản thực phẩm vừa cho hiệu quả bảo quản cao, lại an toàn cho người sử dụng. Đây là chính là hướng nghiên cứu mới hiện nay mà trên thế giới đang nghiên cứu để bảo quản thực phẩm tốt hơn. Bacteriocin được sử dụng trong thực phẩm lên men từ vi khuẩn trong những thế kỷ qua để giữ gìn giá trị dinh dưỡng của thức ăn và thức uống qua một thời gian bảo quản lâu (Deegan v.v…, 2006). Mặc dù có một vài phương pháp khác bacteriocin, nó có thời gian bảo quản lâu hơn và khả năng diệt khuẩn cao hơn, nhưng ngày nay con người càng ý thức nhiều về sức khỏe nên họ tránh dùng những thức ăn được bảo quản bằng chất hóa học. Bacteriocin của vi khuẩn lactic không gây ảnh hưởng đến hiệu suất lên men, những vi khuẩn sinh ra nó, người sử dụng thực phẩm và có ý nghĩa lớn về mặt kinh tế. Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang 7 Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 1.2. Tổng quan về bacteriocin 1.2.1 . Đặc điểm chung về bacteriocin Để hạn chế sử dụng quá nhiều thuốc kháng sinh hóa học trong thực phẩm trong quá trình bảo quản thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, một sự lựa chọn hợp lý là ứng dụng một số protein của vi khuẩn như thuốc kháng sinh. Trong số đó, sự sản xuất bacteriocin từ vi khuẩn lactic đã thu hút nhiều sự cố ý. Bacteriocin bản chất là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Ngoài ra không gây ra phản ứng dị ứng trong con người và vấn đề về sức khỏe, bị phân hủy nhanh bởi enzym protease, lipase. Bacteriocin được Gratia tìm thấy đầu tiên năm 1925 trong quá trình nghiên cứu tìm cách tiêu diệt vi khuẩn, kết quả của công trình này đã thúc đẩy sự nghiên cứu về chất kháng sinh và chất kháng khuẩn sinh ra từ vi khuẩn. Ông gọi chất phát hiện ra đầu tiên là colicin vì nó có khả năng tiêu diệt E.coli. Hình 1. Cấu trúc của nisin Hiện nay có nhiều tài liệu ghi bacteriocin chính là antibiotic (modern food microbiology – sixth edition, James) hoặc xếp nó vào peptid antibiotic vì nó có bản chất là polypeptide, có khả năng kháng khuẩn. Gần đây, những nghiên cứu về bacteriocin chủ yếu tập trung vào vi khuẩn Gram âm, trong đó điển hình là colicin. Tuy nhiên, những nghiên cứu về bacteriocin được tổng hợp bởi vi khuẩn Gram Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang 8 Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 dương cũng đang được tiến hành nghiên cứu trong đó có vi khuẩn lactic. 1.2.2 . Phân loại bacteriocin Có một lượng lớn những bacteriocin được sản xuất từ vi khuẩn lactic và được phân loại theo những đặc tính hóa sinh và di truyền học. Chia chúng thành 4 nhóm trong đó nhóm III, IV chưa được nghiên cứu nhiều, chủ yếu là nhắc đến các ứng dụng của nhóm I, II. Nhóm I lantibiotic nhỏ(<5 kDa) là những peptid ổn định nhiệt, hoạt động theo những cấu trúc màng tế bào. Lantibiotic bacteriocin thì thoạt nhiên được chia cắt vào trong hai lớp phụ được dựa vào những sự giống nhau cấu trúc. Lớp phụ Ia bao gồm một cách tương đối hình thon dài, nói chung nó hoạt động bằng việc tạo những lỗ trong màng tế bào chất của các loài nhạy cảm. Nisin cũng thuộc vào nhóm này. Lớp phụ Ib là những peptid đặc trưng hình cầu, chúng thường hoạt động trong những phản ứng lên men quan trọng của vi khuẩn nhạy cảm(Deegan v.v…,2006). Hình 2. Cấu trúc của colicin Nhóm II non – lantibiotic có trọng lượng phân tử biến thiên nhưng thông thường nhỏ(<10 kDa), ổn định nhiệt, chứa những amino acid thông thường. Nhóm này được chia cắt vào trong ba nhóm nhỏ. Nhóm IIa là những peptid thường kháng Listeria, đặc trưng là Leucocin A, PA-1 pediocin(Venema v.v…,1997) và sakacin. Nhóm IIb hình thành bởi một phức chất của hai peptid riêng biệt. Những peptid này có ít hoặc không có hoạt động nào và nó không có sự giống nhau giữa các peptid bổ sung. Trong nhóm này điển hình là lactococcin G, plantaricin EF và plantaricin JK. Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang 9 Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 Nhóm IIc bao gồm các peptid nhỏ, ổn định nhiệt. Trong lớp phụ này được tìm thấy ở những bacteriocin divergicin A và acidocin B. Nhóm III là các peptid lớn, với trọng lượng phân tử quá 30 kDa. Đại diện cho lớp này là helveticin J (Joerger và Klaenhammer, 1986) và helveticin V (Vaugham v.v…,1992), acidofilicin A và lactacin A,B. Ngoài ra đối với bacteriocin của vi khuẩn lactic (LAB) có thể chia theo nhóm dựa vào cấu trúc, cũng có thể dựa vào kiểu hoạt động. Một vài bacteriocin của lớp I như nisin, nó có hai kiểu hoạt động, chúng có thể kết hợp với lớp lipid I như xe chuyên chở peptidoglycan subunits từ tế bào chất vào thành tế bào, vì thế ngăn cản sự tổng hợp thành tế bào dẫn đến tế bào chết. Bảng 1. Bảng phân loại bacteriocin Nhóm I - Nhóm II Chuỗi ngắn - Chuỗi dài kích thước nhỏ - dưới 6 kDa, thường có các axit Bền nhiệt - Lưỡng cực - Điện tích dương - Nhóm IV Chuỗi dài (>15 - Dạng vòng Bền nhiệt kDa) - Kém bền nhiệt Điện tích dương - Kém bền nhiệt - Có cấu trúc amin lạ - Nhóm III - Có cấu trúc domain domain Ngoài ra, chúng có thể sử dụng lớp lipid II như cắt phân tử để bắt đầu quá trình gắn vào màng và hình thành kênh dẫn đến chết tế bào nhanh chóng. Lantibiotic có hai chuỗi peptid như lacticin 3147, chúng có thể có hai hoạt động này do cả hai peptid tham gia. Nhưng ngược lại, mersacidin có duy nhất một hoạt động gắn vào lipid II nhưng không hình thành kênh. Thông thường những peptid lớp II có cấu trúc Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang 10 Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 amphiphilic helical được cài vào tế bào gốc của màng dẫn đến sự khử cực và chết. Bacteriocin của nhóm III như lysostaphin có thể tác động trực tiếp vào thành tế bào vi khuẩn Gram dương dẫn đến chết và làm tan tế bào gốc. Hình 3. Kiểu hoạt động của bacteriocin của vi khuẩn lactic (LAB) 1.2.3 . Một số tính chất của bacteriocin 1.2.3.1. Độ bền nhiệt Hiện nay, một số nghiên cứu cho thấy các loại bacteriocin của những loài khác nhau thì khả năng chịu nhiệt cũng khác nhau. Mỗi loài có khả năng chịu nhiệt ở một khoảng nhất định nhưng chủ yếu chúng thuộc nhóm I, II. Chủng ST28MS và ST26MS được sản xuất bởi Lactobaccillus plantarum không giảm khả năng hoạt động chống vi khuẩn sau 90 phút tại 1000C hay 20 phút tại 1210C (Torodov and Dicks, 2005). Hay đặc điểm tính chịu nhiệt có thể liên quan đến cấu trúc phân tử của bacteriocin. 1.2.3.2. Độ bền pH Cũng như độ bền nhiệt, một số bacteriocin có thể hoạt động tốt dưới những khoảng pH nhất định. Chủng ST28MS và ST26MS (Torodov and Dicks, 2005) ngoài có độ bền nhiệt cao, chúng lại có thể hoạt động ổn định trong 2 giờ tại những giá trị pH từ 2-12. Những đặc tính này đều dựa vào bản chất thành phần cấu trúc của bacteriocin đó. Độ bền nhiệt độ và pH rất quan trọng trong quá trình bảo quản nguyên liệu thực phẩm. Tùy vào trạng thái, nhiệt độ thực phẩm mà chúng ta có thể lựa chọn loại bacteriocin bổ sung vào sao cho phù hợp với mục đích sản xuất. 1.2.3.3. Độ bền với các enzym Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang 11 Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 Bảng 2. Tính chất hóa lý của một số bacteriocin của vi khuẩn Gram dƣơng (Torodov and Dicks, 2005) 1. Tên bacteriocin Nhiệt độ cho phép Khoảng pH bền Enzym thủy phân 1. 600C/30 phút 2-7 Chymotrypsin, Megacin A-216 Pepsin, Trypsin 2. Clostocin A 1000C/30 phút 4-9 Trypsin, Chymotrypsin, Pronase P, Rnase, Dnase 3. Clostocin B 800C/10 phút 4-9 Trypsin Chymotrypsin, Pronase P, Rnase, Dnase 4. Clostocin C 800C/10 phút 4-9 Trypsin, Chymotrypsin, Pronase P Rnase, Dnase 5. Clostocin D 1000C/30 phút 4-9 Trypsin Chymotrypsin, Pronase P, Rnase, Dnase 6. Boticin E-S5 1000C/10 phút 1,1-9,5 Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Pronase P, Rnase, Dnase 7. Boticin P 600C/30 phút 6,5-7,5 Trypsin, Rnase, Dnase, Alkaline phosphotase, Phospholipases C,D 8. Butyricin 7423 1000C/10 phút 2-12 Trypsin 1000C/30 phút 2-12 Trypsin 9. Perfreingocin 11105 Mỗi loại bacteriocin có thành phần cấu trúc các amino acid khác nhau nên sẽ Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang 12