Tài liệu Phân lập và tuyển chọn các chủng vsv hữu ích phục vụ cho việc sản xuất chế phẩm probiotic trong chăn nuôi

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009 ====================================================== MỞ ĐẦU Trong dinh dưỡng động vật, việc tăng cường sức khoẻ hệ thống tiêu hoá của vật nuôi thông qua những tác động tới hệ vi sinh vật đường ruột được coi là một giải pháp rất hữu hiệu. Hệ vi sinh vật đường ruột của vật nuôi rất phong phú về chủng loại và số lượng, những biến động về cơ cấu, số lượng các loài vi sinh vật đường ruột là một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến những rối loạn trong tiêu hoá và hấp thu. Bởi vậy, việc sử dụng các biện pháp kỹ thuật thông qua thức ăn và nuôi dưỡng nhằm tạo nên một thế cân bằng tối ưu giữa các loài vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ đã và đang là hướng nghiên cứu được các nhà nghiên cứu trong và ngoài nước quan tâm. Có nhiều biện pháp để cải thiện quan hệ cân bằng giữa các nhóm vi khuẩn có lợi và có hại trong đường tiêu hoá của gia súc, gia cầm. Biện pháp cổ điển được ứng dụng rộng rãi từ những năm 1950 của thế kỷ trước là sử dụng kháng sinh liều thấp. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi ngày càng bị hạn chế (kể từ ngày 01 tháng 01 năm 2006, các nước thuộc EU cấm hoàn toàn việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi Hector Cervanter, 2006), nên nhu cầu tìm ra các giải pháp thay thế kháng sinh ngày càng trở thành cấp bách. Một trong những giải pháp hữu hiệu nhất hiện nay là probiotic. Probiotic - theo Fuller (1992)- là chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích trong thức ăn nhằm cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ. Các sản phẩm probiotic nhập khẩu dùng trong chăn nuôi có mặt trên thị trường Việt Nam nhiều nhưng các đáp ứng tích cực cho vật nuôi chưa được rõ ràng. Các nhà khoa học cho rằng có thể là các vi sinh vật đó không phù hợp với hệ vi sinh vật đường ruột của vật chủ bản địa. Mặt khác, các nghiên cứu sản xuất các chế phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi ở nước ta còn rất hạn chế. Chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích phục vụ cho việc sản xuất các chế phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi” với định hướng đưa ra được các giải pháp công nghệ để sản xuất các chế phẩm nói trên bằng các nguyên liệu trong nước. Đề tài này được thực hiện thành công sẽ mở ra triển vọng trong việc sản =========================================================== 1 Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009 ====================================================== xuất các sản phẩm sinh học chất lượng cao, đáp ứng với yêu cầu ngày càng cao của ngành chăn nuôi hữu cơ (hoàn toàn dựa vào các nguyên liệu từ thiên nhiên) theo hướng công nghiệp ở nước ta, hạn chế nhập khẩu. =========================================================== 2 Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009 ====================================================== Chương 1 – TỔNG QUAN 1.1. Lịch sử và định nghĩa probiotic 1.1.1. Lịch sử probiotic Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry Tisser (1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của những đứa trẻ mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh [53]. Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, đạt giải Nobel – đã chứng minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dăc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life (1908) [53]. Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic [26]. Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi khuẩn lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh [27]. Cùng năm đó, các nhà nghiên cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm bệnh táo bón thường xuyên. Các nhà khoa học đại học Havard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất ra được [26]. Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men – đặt tên là “Yakult” từ sữa được cho là hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất. Khái niệm chung probiotics được chấp nhận ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản phẩm lên men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập niên 80 [27]. =========================================================== 3 Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009 ====================================================== Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc Lactobacillus được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những nguồn thực phẩm chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi. 1.1.2. Định nghĩa probiotic Theo ngôn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Thuật ngữ probiotic được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ “những vi sinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” (Fuller, 1989). Từ đó đến nay thuật ngữ probiotic đã được cả thế giới sử dụng để chỉ những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được đưa vào cơ thể động vật thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ. Kể từ khi xuất hiện, khái niệm probiotic vẫn chưa có một định nghĩa thống nhất. Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học: (i) theo Fuller (1989), probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi cho vật chủ”; (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ”. 1.2. Hệ vi sinh vật đường ruột và tác động của hệ vi sinh vật đến sức khỏe của vật nuôi Bên cạnh sự hấp thụ các chất dinh dưỡng, đường tiêu hóa còn đóng vai trò quan trọng như là cơ quan miễn dịch lớn nhất trong cơ thể. Do đó, nó là hệ thống bảo vệ và là hàng rào quan trọng chống lại các tác nhân gây bệnh xâm nhiễm. Thêm vào các cơ chế bảo vệ nói chung, hệ thống miễn dịch, với các phản ứng đặc hiệu và không đặc hiệu, giúp chống lại các vi sinh vật gây bệnh. Khu hệ vi sinh vật đường ruột cũng được coi là một trong các yếu tố chống lại các tác nhân gây bệnh [36]. Khi còn ở trong bào thai, đường tiêu hoá của vật nuôi ở trạng thái vô trùng, nhưng chỉ vài giờ sau khi sinh các vi sinh vật đã bắt đầu cư trú và trở thành những “cư dân” bình thường trong đường tiêu hoá (WHO, 2001). Theo thời gian, do tiếp =========================================================== 4 Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009 ====================================================== xúc trực tiếp với môi trường, đặc biệt là qua thức ăn và nước uống, số lượng và tính đa dạng sinh học của các vi sinh vật cộng sinh không ngừng tăng lên. Số lượng tế bào vi sinh vật cư trú trong đường tiêu hóa của vật nuôi có thể cao gấp mười lần số lượng tế bào cấu tạo nên cơ thể chúng (Fonty, 1995). Số lượng loài có thể lên tới từ 400-500 (Tannock, 1999). Tuy nhiên, mật độ vi sinh vật ở các phân đoạn khác nhau của đường tiêu hóa (dạ dày; tá tràng; ruột non và ruột già) ở loài động vật dạ dày đơn rất khác nhau (khoảng 101-103; 101-104; 105-108 và 109-1012 cfu/ml chất chứa tương ứng) (Jans, 2005). Sức khỏe của vật nuôi phụ thuộc vào 3 yếu tố chính: trạng thái sinh lý của vật chủ, khẩu phần thức ăn và hệ vi sinh vật. Các yếu tố này chịu tác động của môi trường, của các stress và tác động qua lại lẫn nhau. Trong số các nhân tố trên, hệ vi sinh vật đường tiêu hóa đóng vai trò trung tâm, chỉ một biến động bất lợi của một trong hai yếu tố còn lại cũng ảnh hưởng xấu tới hệ vi sinh vật (Conway, 1994). Sự cộng sinh của các loài vi sinh vật trong đường tiêu hoá của vật nuôi (chủ yếu là trong ruột) tạo nên một hệ sinh thái mở và mối cân bằng của quần thể vi sinh vật được xác lập chỉ một thời gian rất ngắn sau khi sinh (Jans, 2005). Có nhiều quan điểm khác nhau về mối tương quan cân bằng của hệ vi sinh vật ruột. Theo Jans (2005), để đánh giá trạng thái cân bằng, các vi sinh vật ruột được chia thành 3 nhóm (1) nhóm chủ yếu (main flora) gồm các loài vi khuẩn kị khí (Clostridium; Lactobacillus; Bifidobacteria; Bacteroides, Eubacteria); (2) nhóm vệ tinh (Satellite flora), gồm chủ yếu là Enterococcus và E. coli, và (3) nhóm còn lại (Residual flora) gồm các vi sinh vật có hại như Proteus, Staphylococcus và Pseudomonas… Một quần thể vi sinh vật được coi là cân bằng khi tỷ lệ của các nhóm dao động trong khoảng 90; 1,0 và 0,01% tương ứng. Trạng thái mà các nhóm này hình thành một tỷ lệ 90:1:0,01 được gọi là trạng thái “eubiosis” (tiếng Hy Lạp có nghĩa là sự chung sống có lợi giữa các vi khuẩn với nhau và với vật chủ). Ở trạng thái “eubiosis”, vật chủ cung cấp các điều kiện sống lý tưởng như nhiệt độ ổn định, pH trung tính, dinh dưỡng và sự đào thải các chất chuyển hóa. Đổi lại, hệ vi sinh vật sẽ mang lại lợi ích cho vật chủ thông qua tăng cường tiêu hóa các chất dinh dưỡng, =========================================================== 5 Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009 ====================================================== giải độc, tổng hợp các vitamin nhóm B và vitamin K, loại trừ các vi sinh vật có hại, tăng cường đáp ứng miễn dịch của vật chủ. Sự cân bằng của hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa bị tác động bởi một số nhân tố vô sinh và hữu sinh như: sinh lý vật chủ, khẩu phần thức ăn và cơ cấu nội tại của bản thân hệ vi sinh vật. Thức ăn là nền dinh dưỡng cơ bản của vi sinh vật, bởi vậy sự thay đổi thành phần khẩu phần, thức ăn không đảm bảo vệ sinh, phương pháp cho ăn không hợp lý... đều làm tổn hại đến trạng thái cân bằng hệ vi sinh vật ruột. Tương tự như vậy, các chất bài tiết của hệ tiêu hóa (dịch mật, các enzym, chất đệm và chất nhầy...) cũng như kiểu và tần số nhu động ruột cũng tác động trực tiếp đến hệ vi sinh vật. Kiểu và tần số nhu động ruột bị tác động rất lớn bởi các stress (sinh đẻ, cai sữa, dồn chuồng, vận chuyển...). Khi quan hệ cân bằng của hệ vi sinh vật ruột bị phá vỡ sẽ tạo nên trạng thái “dysbiosis” (trạng thái “chung sống có hại”). Biểu hiện của trạng thái “dysbiosis” ở vật chủ thường là thể tạng kém, sinh trưởng chậm và mắc các bệnh đường tiêu hóa như tiêu chảy, viêm ruột hoại tử... (tóm tắt trạng thái eubiosis và dysbiosis có trong bảng 1). Để cải thiện quan hệ cân bằng của hệ vi sinh vật ruột ở vật nuôi, một phương pháp thường được áp dụng là bổ sung vào khẩu phần thức ăn một số loại kháng sinh liều thấp như những chất kích thích sinh trưởng. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi một cách không có kiểm soát đã và đang gây ra những hậu quả đáng lo ngại về vệ sinh an toàn thực phẩm và đặc biệt là gây nên tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng của các vi khuẩn gây bệnh trên người và vật nuôi. Hiện nay, khối liên minh châu Âu (EU) đã cấm sử dụng kháng sinh để bổ sung vào thức ăn như chất kích thích sinh trưởng từ ngày 01 tháng 01 năm 2006. Việc cấm sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi cũng đặt ra những thách thức lớn về kỹ thuật, đặc biệt đối với chăn nuôi gia súc, gia cầm non hoặc trong điều kiện vệ sinh kém và vật nuôi chịu nhiều stress. Để vượt qua những thách thức đó, đã có rất nhiều những nghiên cứu nhằm tìm ra tác nhân để thay thế kháng sinh nhưng an toàn với vật nuôi. Một trong những tác nhân tìm ra đó là probiotic. =========================================================== 6 Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009 ====================================================== Bảng 1: Tóm tắt trạng thái Eubiosis và Dysbiosis cùng các đặc điểm đặc trưng của chúng Trạng thái Eubiosis Trạng thái Dysbiosis - Sự cùng tồn tại giữa vật chủ và hệ vi - Sự không cùng tồn tại giữa vật chủ và sinh vật đường ruột – Sự cộng sinh hệ vi sinh vật đường ruột. - Sự bảo vệ bề mặt của đường tiêu hóa - Sự phá hủy biểu mô đường ruột, làm chống lại các vi sinh vật xâm nhiễm. cho thành đường ruột mỏng đi dẫn đến giảm sự hấp thụ các chất dinh dưỡng. - Kích thích hệ miễn dịch của vật chủ. - Sinh ra các cơ chất gây độc (NH3, chất độc…) - Tiêu hóa các chất dinh dưỡng. - Tổng hợp protein. - Tổng hợp các vitamin - Phân hủy, tăng sản sinh khí gas (CH4, H2S, CO2). - Làm yếu hệ thống miễn dịch - Làm tăng chu trình tế bào, cần nhiều năng lượng 1.3. Vai trò và cơ chế hoạt động của probiotic 1.3.1. Vai trò của probiotic Từ khi kháng sinh bị cấm sử dụng như chất kích thích sinh trưởng trong thức ăn chăn nuôi ở một số nước thuộc khối liên minh châu Âu (bắt đầu là Thụy Điển vào năm 1986) thì probiotic được coi là một trong những nguồn thay thế có triển vọng nhất vì có nhiều đặc tính ưu việt. Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả, Patterson (2003) đã tổng kết các ảnh hưởng có lợi của probiotic đối với đời sống động vật thể hiện ở các khía cạnh sau: - Thay đổi cấu trúc quần thể vi sinh vật đường ruột theo chiều hướng có lợi cho vật chủ. - Tăng cường khả năng miễn dịch. =========================================================== 7 Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009 ====================================================== - Giảm phản ứng viêm. - Ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh. - Tăng sản xuất các axit béo bay hơi. - Tăng cường quá trình sinh tổng hợp các vitamin nhóm B. - Tăng hấp thu chất khoáng. - Làm giảm cholesterol huyết thanh. - Làm tăng năng suất vật nuôi. - Giảm hàm lượng amoniac và urê trong chất thải. Ngoài ra probiotic còn rất an toàn với động vật và thân thiện với môi trường. Vì là chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích, việc sử dụng probiotic sẽ không tạo ra các chất tồn dư trong các sản phẩm chăn nuôi có hại cho sức khỏe người tiêu dùng. 1.3.2. Cơ chế tác động Có rất nhiều cách giải thích khác nhau về cơ chế tác động, nhưng phần lớn các tài liệu về probiotic đề cập đến ba khía cạnh sau: (i) cạnh tranh loại trừ; (ii) đối kháng vi khuẩn và (iii) điều chỉnh miễn dịch (Steiner, 2006). Minh họa cơ chế hoạt động của probiotic thông qua hình 1. Cạnh tranh loại trừ là đặc tính đấu tranh sinh tồn điển hình của các vi sinh vật. Hình thức cạnh tranh loại trừ thường thấy ở các vi sinh vật ruột là cạnh tranh vị trí bám dính. Các vi sinh vật probiotic cư ngụ và nhân lên trong ruột, khóa chặt các vị trí thụ cảm và ngăn cản sự bám dính của các vi sinh vật khác như E. coli, Salmonella... Một số nấm men probiotic (Saccharomyces cereviese; S.boulardii) không chỉ tranh vị trí bám dính của các vi khuẩn khác mà còn gắn kết các vi khuẩn có roi (phần lớn là những vi khuẩn có hại) thông qua các cơ quan thụ cảm mannose và đẩy chúng ra khỏi vị trí bám dính ở niêm mạc ruột (Czerucka và Rampal, 2002). Tuy nhiên, cạnh tranh dinh dưỡng là phương thức cạnh tranh khốc liệt nhất vì sự sinh sôi với số lượng lớn của một loài vi sinh vật nào đó là một đe dọa nghiêm trọng đối với các loài khác về nguồn cơ chất cho phát triển. =========================================================== 8 Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009 ====================================================== Đồng thời với cạnh tranh loại trừ, các vi sinh vật probiotic còn sản sinh các chất kìm hãm vi khuẩn như lactoferrin, lysozym, hydrogen peroxide cũng như một số axit hữu cơ khác. Các chất này gây tác động bất lợi lên vi khuẩn có hại chủ yếu là do sự giảm thấp pH trong ruột (Conway, 1996). Phản ứng miễn dịch được kích thích và hoạt tính kháng thể của vật chủ tăng lên Màng chắn: nơi các sinh vật probiotic chiếm giữ các thụ cảm trên bề mặt ruột, độc tố được loại trừ Cạnh tranh chất dinh dưỡng: các sinh vật probiotic cạnh tranh với các vi sinh vật gây bệnh các chất dinh dưỡng quan trọng. Cạnh tranh loại trừ: các sinh vật probiotic khóa chặt các vị trí thụ cảm do đó loại trừ được các vi sinh vật gây bệnh Gây bệnh: các vi sinh vật gây bệnh và chất độc của chúng bám vào niêm mạc và các thụ cảm trên ruột và phá hủy chúng Các vi sinh vật probiotic cư ngụ và nhân lên trong ruột, ngăn cản sự bám dính và phát triển của các vi sinh vật gây bệnh Hình 1. Minh hoạ cơ chế tác động của probiotic Ruột là cơ quan miễn dịch lớn nhất ở động vật có vú. Giữa hệ vi sinh vật ruột và hệ thống miễn dịch có mối tương tác đặc thù. Năng lực miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào của hệ thống miễn dịch đường ruột bị ảnh hưởng rất lớn bởi sự cân bằng của hệ vi sinh vật ruột (Cebra, 1999). Thông qua tương tác với hệ thống miễn dịch ruột, các probiotic có thể điều chỉnh cả miễn dịch thụ động và chủ động hoặc cả hai. Tác động điều chỉnh miễn dịch đặc hiệu của probiotic phụ thuộc vào chủng =========================================================== 9 Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009 ====================================================== giống hoặc các loài vi khuẩn probiotic (Dugas và ctv, 1999). Tuy nhiên, cơ chế tác động của probiotic đối với việc nâng cao chức năng miễn dịch vẫn còn chưa được hiểu biết đầy đủ. 1.4. Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic 1.4.1. Lựa chọn các chủng probiotic Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật với tiêu chuẩn đầu tiên là phải an toàn cho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót và chiếm lĩnh (colonization) trong đường tiêu hóa vật chủ. Các tiêu chuẩn lựa chọn này được hợp lý hóa thông qua các thí nghiệm in vitro, từ đó sẽ tuyển chọn được các chủng có tiềm năng như là nguồn probiotic [22]. Các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chủ yếu sau: • Tính bám dính trên bề mặt đường tiêu hóa hoặc các tế bào biểu mô: Các chủng probiotic phải bám dính được vào thành ruột non, khu trú tốt trong đường tiêu hoá và sinh sôi nảy nở. Khả năng bám dính được xem là một yêu cầu quan trọng để tăng khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ biểu mô và tăng khả năng miễn dịch của vật chủ. Đặc tính này làm tăng khả năng cạnh tranh của các chủng probiotic với các vi sinh vật bất lợi khác. • Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh: Lựa chọn được các chủng có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn là đặc tính quan trọng nhất trong phát triển probiotic. Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh như E. coli, Salmonella và Campylobacteria. Hoạt tính kháng khuẩn của chúng có thể theo nhiều cơ chế khác nhau như: + Sản sinh ra các chất Bacteriocin. + Làm giảm độ pH bởi tạo ra axit lactic. + Tạo ra H2O2. + Làm giảm độc tố theo các cơ chế khác nhau. + Khả năng làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh trên bề mặt. =========================================================== 10 Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009 ====================================================== + Cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh. • Khả năng tồn tại trong môi trường axit dạ dày: Khoang miệng và dạ dày của vật chủ là nơi có môi trường axit pH từ 2-3 và có mặt các enzym tiêu hoá (amylaza, proteaza, lysozym…). Các chủng vi sinh vật được coi như là nguồn probiotic phải tồn tại được trong điều kiện này. Hiện nay các công ty đã khuyến cáo dùng vỏ bọc (microcapsute) với chế phẩm probiotic nhằm tăng khả năng sống của vi khuẩn probiotic khi đi qua khoang miệng và dạ dày. • Khả năng chịu muối mật: Thông thường, muối mật trong dịch tiêu hoá của động vật dao động 1-3% [48]. Để tồn tại và phát triển, các chủng probiotic phải có khả năng tồn tại và phát triển với nồng độ muối mật ≥ 2%, ngoài ra một số chủng probiotic (Nấm men, Bacillus và Lactobacillus) có khả năng sinh enzym tiêu hoá như: amylaza, xenlulaza và proteaza, lipaza và phytaza có vai trò làm tăng khả năng tiêu hoá thức ăn và hấp thu chất dinh dưỡng của vật chủ. 1.4.2. Các chủng vi sinh vật dùng phổ biến trong probiotic Ø Vi khuẩn lactic: gồm 2 chi vi khuẩn chủ yếu là Lactobacillus và Bifidobacterium. Các loài thuộc chi Lactobacillus: L. acidophilus, L. amylovorus, L. brevis, L. casei, L. casei subsp. rhamnosus (Lactobacillus GG), L. caucasicus, L. crispatus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus (L. bulgaricus), L. fermentum (L. fermenti), L. gasseri, L. helveticus, L. johnsonii, L. lactis, L. leichmannii, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus Các loài thuộc chi Bifidobacterium: B. adolescentis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. lactis (B. animalis), B. licheniformis, B. longum Ø Một số vi sinh vật probiotic khác không phải vi khuẩn lactic Lactobacillus và Bifidobacterium: Bacillus subtilis, Enterococcus faecium, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces cerevisiae. =========================================================== 11 Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009 ====================================================== 1.4.3. Công thức chế phẩm probiotic Như đã trình bày ở phần 1.4.2 có 3 đối tượng chủ yếu cho nghiên cứu phát triển chế phẩm là vi khuẩn lactic, vi khuẩn Bacillus và nấm men. Vai trò cũng như cơ chế tác động của chúng lên vật chủ rất khác nhau [36], cụ thể có trong bảng sau: Bảng 2: Tóm tắt cơ chế tác động chủ yếu của các chủng probiotic lên vật chủ Vi khuẩn lactic Vi khuẩn Bacillus Nấm men - Sinh bacteriocin - Sinh enzym phân - Sinh axit hữu cơ, kích - Cạnh tranh vị trí bám. giải các cơ chất như thích tiêu hoá - Sinh các peptit, kích thích hệ tinh bột, xenluloza; - Hấp thu chất độc và thống miễn dịch của vật chủ. kích thích tiêu hoá. cạnh tranh dinh dưỡng, - Cạnh tranh dinh dưỡng và vị trí vị trí bám trên biểu mô bám vào biểu mô. với vi sinh vật gây - Sinh các axit hữu cơ, tăng hiệu bệnh. quả hấp thu chất dinh dưỡng. Tuỳ thuộc vào từng loại sản phẩm mà có thành phần vi sinh vật khác nhau. 1.4.4. Yêu cầu an toàn đối với các chủng vi sinh vật probiotic Việc nghiên cứu, phát triển chế phẩm probiotic và sử dụng trong chăn nuôi bắt đầu từ khâu nghiên cứu sản xuất và tiêu thụ, sử dụng trên đàn gia súc, gia cầm [9]. Như vậy các chủng vi sinh vật đã qua nhiều khâu tiếp xúc với con người, môi trường trước khi vào cơ thể động vật. Điều này cho thấy là yêu cầu an toàn đối với chủng vi sinh vật là vấn đề quan trọng nhất đối với vật nuôi, con người và môi trường. Đối với động vật cần có thời gian thử nghiệm từ 1-3 tháng, kiểm tra các chỉ tiêu tăng trọng, phản ứng cơ thể, theo dõi các bệnh tiêu hoá, bệnh nhiếm khuẩn và các phản ứng phụ. Ngoài ra cần có những thông số phân tích sinh hoá về máu và đánh giá chỉ số coliform trong phân. Đối với con người không cần thiết phải thử nghiệm như trên động vật nhưng cần chú ý các phản ứng phụ như dị ứng với da, mũi, mắt (Arturo et al, 2006). Với môi trường cần đảm bảo là vi sinh vật không có =========================================================== 12 Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009 ====================================================== hại đối với con người và động vật, không mang gen lạ. Nói chung các chủng vi sinh vật probiotic có nguồn gốc tự nhiên (từ hệ vi sinh vật đường ruột vật nuôi) là các chủng được khuyến cáo sử dụng. Tổ chức FAO (2002) đưa ra hướng dẫn với việc tuyển chọn các chủng probiotic, ngoài các đặc tính probiotic và đảm bảo an toàn thì các chủng này phải được cụ thể hoá các thông tin về nguồn gốc chủng, tên phân loại đến chi và loài. Đối với vấn đề an toàn probiotic, cộng đồng Châu Âu đã lập một Uỷ ban khoa học về dinh dưỡng động vật (SCAN: scientific committee for animal nutrition) đưa ra những quy định đánh giá an toàn đối với sản phẩm và những khuyến cáo cho vấn đề này qua các điều luật và kỹ thuật online ((SCAN, 2000). Tổ chức FAO (2002) khuyến cáo các chủng probiotic không những cần được phân loại chính xác mà còn phải được cung cấp và lưu giữ tại các bảo tàng vi sinh vật đạt tiêu chuẩn quốc tế. Quy trình sản xuất phải theo tiêu chuẩn GMP (Good Manufacturing Practices). 1.4.5. Phân loại vi sinh vật Yêu cầu tiên quyết là các chủng vi sinh vật probiotic phải được định danh chính xác đến chi (genus) và loài (species) (FAO, 2002). Hiện nay, trên thị trường có nhiều loại KIT định danh vi sinh vật khác nhau như API 50CH, API-20E... Tuy nhiên các KIT này được phát triển dựa trên các đặc tính sinh lý và sinh hoá của các vi sinh vật đã biết, vì vậy với yêu cầu định danh chính xác cần kết hợp các đặc tính phân loại về hình thái, sinh lý sinh hoá và sinh học phân tử. Phương pháp định danh dựa theo sinh học phân tử hiện nay chủ yếu vẫn là dựa theo kỹ thuật giải trình tự đoạn gen mã hoá cho ARN riboxom 16S (đối với vi khuẩn) và đoạn D1D2 của gen mã hoá cho ARN riboxom 28S hoặc vùng ITS (đối với nấm men). Trong những điều kiện cho phép thì người ta tiến hành kỹ thuật lai ADN với các chủng chuẩn để khẳng định vị trí phân loại của chủng nghiên cứu tới loài. 1.5. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và Việt nam 1.5.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic trên thế giới =========================================================== 13 Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009 ====================================================== Việc sử dụng thực phẩm có probiotic (hoặc như 1 thành phần tự nhiên của thực phẩm hoặc thực phẩm đã lên men) đã được biết đến từ lâu, nhưng việc nghiên cứu hệ vi sinh vật đường ruột và sử dụng probiotic mới thực sự phát triển từ những năm 80 của thể kỷ 20 (Patterson và ctv, 2003). Những nghiên cứu phân loại và đặc điểm của quần thể vi sinh vật đường ruột ở người và động vật được tiến hành bởi Savage (1987); Vahjen và ctv (1998); Apajalahti và ctv (1998); Vander Wielen và ctv (2000) đã cho thấy nếu như trong ruột non của người Bacteroides và Bifidobacterium chiếm ưu thế thì ở gà là Ruminococcus và Streptococcus. Bằng kỹ thuật phân tử, các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng chỉ có khoảng 20 đến 50% số loài vi sinh vật đường ruột ở động vật được phân lập, nuôi cấy như nguồn probiotic (Patterson và ctv, 2003). Apajialahti và ctv (1998); Netherwood và ctv (1999); Gong và ctv (2002); Zhu và ctv (2002) đã sử dụng kỹ thuật phân tử để nghiên cứu sự thay đổi cấu trúc quần thể và đặc điểm sinh học của hệ vi sinh vật đường ruột ở động vật dưới tác động của probiotic. Tuy nhiên, cho đến nay những nhân tố nào góp phần tạo nên 1 hệ vi sinh vật cân bằng hoặc làm rối loạn sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột cũng chưa được hiểu biết đầy đủ (Patterson và ctv, 2003). Đã có rất nhiều nghiên cứu về vai trò của probiotic đối với đời sống động vật như tác động của probiotic đối với hệ thống miễn dịch ở niêm mạc ruột (Schat và Myer, 1991; Hersbberg và Mayer, 2000); đối với sự thay đổi của niêm mạc ruột non ở vật nuôi (Glick, 1995; Fontaine và ctv, 1996; Dai và ctv, 2000; McCracken và Lorenz, 2001). Những ảnh hưởng có lợi của probiotic thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau nhưng những hiểu biết của con người về cơ chế tác động của probiotic còn rất hạn chế. Có một số tác giả cho rằng hiệu quả của probiotic trong việc ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh trong đường tiêu hóa của động vật có ý nghĩa rất quan trọng. Sự kìm hãm được thực hiện theo những cách sau: cạnh tranh chất dinh dưỡng, sản xuất độc tố và các sản phẩm trao đổi (các axit béo bay hơi, các chất giống kháng sinh...), cạnh tranh vị trí bám dính ở niêm mạc ruột và kích thích hệ thống miễn dịch ruột (Fuller, 1989; Gibson và Fuller, 2000; Rolfe, 2000; S.C. =========================================================== 14 Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009 ====================================================== Knight và cs, 2009). Trong khoảng 20 năm trở lại đây, nhờ ứng dụng những tiến bộ kỹ thuật trong lĩnh vực sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật giải trình tự axit nucleic trong nghiên cứu phân loại và định danh các chủng vi sinh vật, công nghệ sản xuất các sản phẩm probiotic phục vụ chăn nuôi ngày càng trở nên dễ dàng và phổ biến hơn ở nhiều nước trên thế giới. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu về sử dụng các sản phẩm probiotic trong chăn nuôi rất khác nhau, đôi khi trái ngược nhau. Nhiều nghiên cứu bổ sung chế phẩm probiotic trên lợn và gà cho thấy có đáp ứng tích cực (Henrich và ctv, 2006): tăng cường khả năng miễn dịch ở lợn con; tăng tỷ lệ tiêu hóa các chất dinh dưỡng; tăng hiệu quả sử dụng thức ăn...). Bên cạnh đó cũng có nhiều nghiên cứu đã chứng tỏ hiệu quả không rõ rệt của việc bổ sung các chế phẩm probiotic trên lợn (Breston và ctv, 1995): không quan sát thấy ảnh hưởng tích cực của probiotic (Lactobacillus) bổ sung trong khẩu phần cho lợn cái và đực thiến ở giai đoạn lợn choai và vỗ béo; Navas-Sanchez và ctv (1995): khuyến cáo rằng đối với lợn con sau cai sữa không nên sử dụng các chế phẩm probiotic; Galassi và ctv (2001): không thấy có sự khác nhau về tỷ lệ tiêu hóa thức ăn và hiệu quả sử dụng năng lượng ở các nhóm lợn thí nghiệm và đối chứng được ăn thức ăn có và không có bổ sung probiotic... Có rất nhiều ý kiến khác nhau khi giải thích sự khác biệt của các kết quả nghiên cứu, nhưng ý kiến được nhiều nhà khoa học thống nhất là các chế phẩm probiotic tạo nên các đáp ứng tích cực ở gia súc và gia cầm chỉ khi nó có đầy đủ các đặc tính probiotic, sự thiếu một hoặc nhiều các đặc tính của probiotic có thể là nguyên nhân chủ yếu của các đáp ứng âm tính. 1.5.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic ở Việt nam Ở nước ta hiện nay, việc nghiên cứu sản xuất probiotic phục vụ cho đời sống dân sinh nói chung và chăn nuôi nói riêng còn rất mới mẻ và bắt đầu được quan tâm trong khoảng một thập kỷ gần đây. Lê Thanh Bình và ctv (1999) đã sản xuất chế =========================================================== 15 Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009 ====================================================== phẩm PRO99 gồm hai chủng vi khuẩn lactic và nuôi thử nghiệm trên gà Broiler cho thấy quần thể vi sinh vật đường ruột thay đổi theo chiều hướng tích cực, các vi khuẩn lactic tăng, E.coli giảm rõ rệt ở nhóm gà được ăn thức ăn có thức ăn bổ sung PRO99. Khối lượng cơ thể lúc 50 ngày tuổi của gà ở nhóm được ăn thức ăn có bổ sung PRO99 cao hơn so với đối chứng 10,6%. Phạm Ngọc Lan và ctv (2003) đã phân lập được hai trong số 789 chủng vi khuẩn lactic trong ruột gà. Bằng các phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử, nhóm tác giả đã xác định được các chủng CH123 và CH156 có những tính chất probiotic gần với Lactobacillus agillis và Lactobacillus salivarius (có khả năng đề kháng được với 40% axit mật; sinh trưởng được ở môi trường pH = 4,0 và nồng độ NaCl = 6%, có hoạt tính kháng với Salmonella, E.coli) có khả năng sử dụng như nguồn probiotic ứng dụng trong chăn nuôi. Nguyễn Thị Hồng Hà và ctv (2003) đã sử dụng hai chủng Bifidobacterium bifidum và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm probiotic, bước đầu đã nghiên cứu được công nghệ sản xuất bằng phương pháp sấy phun. Chế phẩm sau 6 tháng vẫn có số tế bào vi khuẩn sống ở mức 106 CFU/g và có khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella. Nguyễn Thùy Châu (2003) thông báo đã lựa chọn được chủng nấm men Candida ultilis CM 125 cho sinh khối cao trên môi trường rỉ mật, bước đầu đã đưa ra quy trình công nghệ sản xuất sinh khối loại nấm men này. Nguyễn La Anh và ctv (2003) đã phân lập được chủng vi khuẩn lactic BC 5.1 từ nước bắp cải muối chua và đã xác định được rằng chủng vi khuẩn này có tính chất probiotic và có thể sử dụng trong chế biến thực phẩm Biochie dạng dung dịch (từ vi khuẩn Bacillus và Lactobacillus) với mật độ 10 8 CFU/ml có tác dụng cải thiện môi trường nước nuôi tôm, cá. Lê Tấn Hưng, Võ Thị Hồng Hạnh và ctv (2003) đã nghiên cứu sản xuất hai chế phẩm probiotic BIO I và BIO II. Chế phẩm BIO II gồm các nhóm vi khuẩn Lactobacillus, Bacillus và nấm men Sacharomyces phối hợp với các enzym α-amylaza và proteaza dùng trong xử lý môi trường nước nuôi tôm, cá và chế phẩm BIO I dùng trong chăn nuôi. Hiện nay chế phẩm BIO II đã được ứng dụng rộng rãi nhưng chế phẩm BIO I hiệu quả sử dụng chưa cao. =========================================================== 16 Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009 ====================================================== Sau đây là thông tin một số sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường: Bảng 3: Tóm tắt một số thông tin của một vài sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường Vi sinh vật sử dụng và mật độ (CFU/g) Sản phẩm Nước sản xuất Vi khuẩn Lactic BioGuard Việt Nam 107 E.lac Hàn Quốc 2 x 107 BioSix Việt Nam Lactacids Việt Nam 107 Adepro Việt Nam 107 Lactizym Việt Nam 6 x 105 Ferment Trung Quốc 109 Lacto-Sacc Mỹ Bacillus 4 x 107 105 2,5 x 108 Nấm men 105 4,6 x 106 =========================================================== 17 Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009 ====================================================== Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu 2.1.1. Nguồn vi sinh vật - Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích từ các nguồn khác nhau: chất chứa trong đường tiêu hóa của lợn, gà; các nguồn khác nhau trong tự nhiên (đất, các thực phẩm lên men…) - Các vi sinh vật kiểm định: E.coli, Shigella sp., Salmonella sp… từ Bảo tàng giống Vi sinh vật (VTCC) - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội 2.1.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng 2.1.2.1. Hóa chất Glucoza; MgSO4.7H2O; NaCl; K2HPO4; CaCO3; FeCl3.6H2O; Pepton; cao nấm men; cao malt; Tween 80; cao thịt; KI; I2 và các hóa chất khác của hãng Merck, Sigma… 2.1.2.2. Máy móc và dụng cụ Các máy móc, dụng cụ được sử dụng có tại Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật (VTCC) – Viện Vi Vinh Vật – Đại học Quốc gia Hà Nội. Bao gồm: Kính hiển vi quang học (Olympus, Nhật Bản) Nồi lên men (Hanil R&D- Hàn Quốc) Máy sấy phun (Changzou SPD-5, Trung quốc) Máy ly tâm lạnh C30P (Sigma, Đức) Máy điện di ADN, máy phát hiện ADN trên gel (Biorad, Mỹ) Máy đo pH (Horiba, Nhật Bản) Máy lắc ổn nhiệt (Metler, Thụy Sĩ) Máy PCR Mastercycler gradient (Eppendorf, Đức) Máy đo quang phổ Ultrospec 3000 pro (Anh) Tủ cấy vô trùng (Nuaire, Mỹ) =========================================================== 18 Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009 ====================================================== Cân điện tử (Precisa, Thụy Sĩ) 2.1.3. Môi trường nghiên cứu 2.1.3.1. Môi trường MRS (g/l): Đường glucoza 20,0 K2HPO4 2,0 CaCO3 5,0 CH3COONa 5,0 Cao thịt 10,0 Triamoni xitrat 2,0 Pepton 10,0 MgSO4.7H2O 0,58 Cao nấm men 5,0 MnSO4.4H2O 0,28 Tween 80 1 ml Nước cất vừa đủ pH= 7,0; khử trùng ở 121oC/15 phút 1000 ml Thạch 15,0 10 Môi trường dịch thể bỏ thạch và CaCO3 2.1.3.2. Môi trường LB (g/l): Bacto-Tryptone 10 NaCl Cao nấm men 5 Nước cất vừa đủ 1000 ml pH= 7,0; khử trùng ở 121oC/15 phút 2.1.3.3. Môi trường thạch thường (g/l): Thạch 15,0 NaCl Pepton 5,0 Nước cất vừa đủ Cao thịt 2,0 1,0 1000ml pH= 7,0; khử trùng ở 121oC/15 phút 2.1.3.4. Môi trường YM (g/l): Glucoza 10,0 Cao nấm men 3,0 Pepton 5,0 Thạch 15,0 Cao malt 3,0 Nước cất vừa đủ 1000 ml pH= 7,0; khử trùng ở 121oC/15 phút =========================================================== 19 Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009 ====================================================== 2.1.3.5. Môi trường Mueller Hinton (g/l): Cao thịt 2,0 Tinh bột 1,5 Axit casein Hydrolysate 17,5 Thạch 15,0 Nước cất vừa đủ 1000 ml pH= 7,3; khử trùng ở 121oC/15 phút 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Các phương pháp định tính và định lượng 2.2.1.1. Định tính axit lactic Đánh giá khả năng sinh axit của các chủng vi sinh vật bằng phương pháp đục lỗ. Phương pháp như sau: lấy phần dịch nuôi cấy các chủng phân lập được ly tâm lạnh 12000 vòng/phút lấy dịch trong. Nhỏ phần dịch trong vào các giếng trên đĩa thạch đã có CaCO3, để ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Khả năng sinh axit của các chủng vi khuẩn được tính đánh giá thông qua đường kính vòng trong phân giải CaCO3. ∆D = D-d (mm) với D: đường kính vòng trong phân giải CaCO3 (mm). d: đường kính lỗ thạch (mm). 2.2.1.2. Định lượng axit lactic theo Therner [61]: Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng hấp phụ màu của dịch axit lactic mà vi khuẩn sinh ra với phenolphtalein. Ta xác định được hàm lượng axit lactic của mẫu. Tiến hành: Lấy 10ml dịch lên men đã li tâm bỏ sinh khối, bổ sung 20ml nước cất và thêm 2 giọt phenolphtalein (nồng độ 1% trong cồn 900). Sau đó chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây thì dừng lại. Ghi lại thể tích NaOH (ml) đã dùng. Độ axit được tính như sau: % axit lactic = VNaOHtiêu tốn x 0,009 (g/l) =========================================================== 20