Tài liệu Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin từ tu hài (lutraria philippinarum)

  • Số trang: 64 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 133 |
  • Lượt tải: 0
nhattuvisu

Đã đăng 27125 tài liệu

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG VŨ THỊ XUÂN PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN BIỂN SINH BACTERIOCIN TỪ TU HÀI (Lutraria philippinarum) ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nha Trang, tháng 07 năm 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG ========== VŨ THỊ XUÂN PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN BIỂN SINH BACTERIOCIN TỪ TU HÀI (Lutraria philippinarum) ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hƣớng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN VĂN DUY Nha Trang, tháng 07 năm 2012 i LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường. Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy Nguyễn Văn Duy, Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn đến chị Nguyễn Minh Nhật, cán bộ quản lý phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, đã tạo mọi điều kiện về thời gian để tôi hoàn thành đề tài. Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và thực hiện đồ án vừa qua. Nha Trang, tháng 7 năm 2012 Sinh viên Vũ Thị Xuân ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... i MỤC LỤC............................................................................................................... ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. vi LỜI MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN.................................................................................... 3 1.1.Tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản ................................................... 3 1.1.1.Tình hình dịch bệnh ............................................................................. 3 1.1.2.Các biện pháp phòng trừ ...................................................................... 7 1.2.Tình hình nuôi trồng và đặc điểm sinh học của tu hài ........................................ 8 1.2.1.Tình hình nuôi tu hài ............................................................................ 9 1.2.2.Đặc điểm sinh học ................................................................................ 9 1.3.Tổng quan về bacteriocin ................................................................................. 11 1.3.1.Đặc điểm chung của bacteriocin ......................................................... 11 1.3.2.Phân loại bacteriocin .......................................................................... 12 1.3.2.1.Bacterioin của vi khuẩn Gram âm .............................................. 14 1.3.2.2.Bacteriocin của vi khuẩn Gram dƣơng ....................................... 15 1.3.2.3.Bacteriocin của cổ khuẩn ........................................................... 16 1.3.3.Di truyền bacteriocin .......................................................................... 16 1.3.4.Sinh tổng hợp bacteriocin ................................................................... 19 1.4.Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn biển sinh bacteriocin ................................... 20 1.5.Tiềm năng ứng dụng của bacteriocin biển ........................................................ 23 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 26 2.1. Vật liệu ........................................................................................................... 26 2.1.1. Mẫu tu hài ......................................................................................... 26 2.1.2. Chủng vi sinh vật chỉ thị.................................................................... 26 2.1.3. Môi trƣờng và hóa chất chuyên dụng ................................................ 27 iii 2.1.4. Thiết bị chuyên dụng......................................................................... 27 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................ 28 2.2.1. Phân lập vi khuẩn biển ...................................................................... 28 2.2.2. Xác định đặc điểm hình thái .............................................................. 29 2.2.2.1. Hình thái khuẩn lạc ................................................................... 29 2.2.2.2. Nhuộm Gram ............................................................................ 30 2.2.3. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn ................................... 32 2.2.3.1. Thu dịch chiết tế bào ................................................................. 32 2.2.3.2. Khảo sát sơ bộ khả năng sinh chất kháng khuẩn ........................ 32 2.2.4. Xác định hoạt tính sinh bacteriocin ................................................... 33 2.2.5. Định danh vi khuẩn ........................................................................... 34 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 36 3.1. Phân lập tổng số vi khuẩn hiếu khí từ tu hài .................................................... 36 3.2. Sàng lọc vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn ................................................... 37 3.3. Tuyển chọn chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin ........................................... 38 3.4. Một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin ......... 42 3.4.1. Hình thái khuẩn lạc ........................................................................... 42 3.4.2. Nhuộm Gram .................................................................................... 45 3.5. Định danh vi khuẩn ........................................................................................ 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 50 Kết luận Kiến nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO iv DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Bacteriocin của vi khuẩn và cổ khuẩn................................................... 13 Bảng 2.1. Thu mẫu Tu hài phân lập vi khuẩn biển ................................................ 26 Bảng 3.1. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn biển từ tu hài .............................. 37 Bảng 3.2. Hoạt tính kháng một số vi khuẩn chỉ thị của các chủng vi khuẩn biển .. 37 Bảng 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết tế bào hai chủng X1.4 và X1.5 tƣơng ứng bằng đƣờng kính vòng kháng khuẩn đối với chủng chỉ thị B1.1 .......... 41 v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Tu hài Lutraria philippinarum.................................................................... 10 Hình 1.2.Tổ chức di truyền của bacteriocin ................................................................ 17 Hình 1.3. Số lƣợng bài báo nghiên cứu về bacteriocin trong mỗi thời kỳ 10 năm từ 1950-2010 đƣợc trích dẫn trên Pubmed. .................................................................... 20 Hình 2.1. Mẫu tu hài đƣợc dùng để phân lập vi khuẩn biển ........................................ 26 Hình 2.2. Trình tự pha loãng mẫu phân lập ................................................................ 29 Hình 2.3. Phƣơng pháp cố định phiến vết .................................................................. 30 Hình 2.4. Phƣơng pháp nhuộm Gram......................................................................... 31 Hình 2.5. Minh họa vùng kháng khuẩn của bacteriocin trên đĩa thạch ........................ 33 Hình 3.1. Vi khuẩn biển phân lập từ tu hài ở nồng độ pha loãng 10 -7 sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C ................................................................................................................. 36 Hình 3.2. Hoạt tính kháng vi khuẩn chỉ thị B1.1 của các chủng vi khuẩn biển ........... 38 Hình 3.3. Khả năng kháng của dịch chiết tế bào của chủng X1.5 và X1.4 trƣớc và sau khi trung hòa pH ........................................................................................................ 39 Hình 3.4. Xác định bản chất protein của chất kháng khuẩn trong dịch chiết tế bào cuả chủng X1.5 và X1.4 ................................................................................................... 40 Hình 3.5. Kiểm tra độ bền nhiệt của dịch bacteriocin thô cuả chủng X1.5 và X1.4 .... 42 Hình 3.6. Hình thái khuẩn lạc chủng X1.4 cấy ria và điểm......................................... 43 Hình 3.7. Hình thái khuẩn lạc chủng X1.5 cấy ria và điểm......................................... 43 Hình 3.8. Hình thái khuẩn lạc chủng X1.9 cấy ria và điểm......................................... 44 Hình 3.9. Hình thái khuẩn lạc chủng X1.11 cấy ria và điểm ....................................... 44 Hình 3.10. Tế bào của chủng chủng X1.4 sau khi nhuộm Gram ................................. 45 Hình 3.11. Tế bào của chủng chủng X1.5 sau khi nhuộm Gram ................................. 46 Hình 3.12. Tế bào của chủng chủng X1.9 sau khi nhuộm Gram ................................. 46 Hình 3.13. Tế bào của chủng chủng X1.11 sau khi nhuộm Gram ............................... 47 Hình 3.14. Trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng X1.5 .......................................... 48 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Viết đầy đủ 1 BLIS Bacteriocin-Like Inhibitory Substance 2 CFU Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) 3 FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations 4 IHHNV 5 IHN Infectious Hematopoietic Necrosis 6 NCBI National Center for Bioinformatic Information 7 OD 8 RSIV Red Seabream Iridovirus 9 TSA Trypticase Soy Agar 10 TSB Trypticase Soy Broth 11 TSV Taura Sydrome in Penaeus Vannamei 12 VHS Viral Haemorrhagis Septicamia 13 VNN Viral Nervous Necrosis 14 WSSV 15 YHV Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Optical Density (Mật độ quang) White Spot Syndrome Virus Yellow Head Disease 1 LỜI MỞ ĐẦU Việt Nam có bờ biển dài hơn 3.260 km, với diện tích vùng biển rộng hơn 1 triệu km2, gấp 3 lần diện tích đất liền. Nuôi trồng thủy sản hiện là một trong những lĩnh vực sản xuất thực phẩm phát triển mạnh nhất ở nƣớc ta. Hoạt động nuôi trồng thủy sản đang tạo ra nguồn thu nhập chính cho ngƣ dân các vùng ven biển nƣớc ta nhờ có điều kiện tự nhiên phù hợp cho nuôi trồng một số loài hải sản chủ lực và nhờ có nguồn thu lớn từ xuất khẩu. Tuy nhiên, dịch bệnh thƣờng xuyên xảy ra đã gây thiệt hại kinh tế hàng triệu đô la Mỹ mỗi năm. Trong số các tác nhân gây bệnh thì vi khuẩn điển hình là các loài Vibrio, đƣợc coi là một trong những nguyên nhân chính. Hơn nữa, cùng với hiện tƣợng biến đổi khí hậu toàn cầu, những quan ngại đối các vi khuẩn gây bệnh ngày càng tăng lên, bởi vì ở nhiệt độ cao hơn thì khả năng gây bệnh và truyền nhiễm cũng tăng theo. Để giải quyết vấn đề này, ngƣ dân thƣờng xuyên sử dụng các chất kháng sinh để điều trị các bệnh do vi khuẩn (Cabello, 2006). Tuy nhiên chất kháng sinh dƣờng nhƣ đã mất hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản do việc lạm dụng quá mức. Việc sử dụng các chất kháng sinh không chỉ làm tăng khả năng kháng bệnh của vi khuẩn, phá vỡ hệ vi sinh bình thƣờng và gây ra hiện tƣợng mất cân bằng vi sinh (microdysbiosis) mà còn làm tích lũy các gốc kháng sinh trong sản phẩm thủy sản có hại cho sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Vì vậy, các giải pháp thay thế thân thiện với con ngƣời và môi trƣờng đang đƣợc quan tâm nghiên cứu và ứng dụng nhƣ sử dụng vaccine. Nhƣng việc sử dụng vaccine thƣờng tốn chi phí sản xuất, chi phí nhân công và gây stress mạnh cho động vật nuôi (Corripio-Myar et al, 2007; Smith, 2007). Hơn nữa vẫn chƣa có vaccine ngừa bệnh cho tôm và nhuyễn thể (Subasinghe, 2009). Vấn đề đặt ra là cần tìm một chất kháng sinh thế hệ mới có hiệu quả tốt trong phòng và trị bệnh, an toàn, thân thiện với sức khỏe con ngƣời và môi trƣờng. Những nghiên cứu gần đây cho thấy bacteriocin là chất kháng sinh thế hệ mới đáp ứng đủ các yêu cầu mong muốn do bản chất là protein an toàn và thân thiện với môi trƣờng, phổ kháng khuẩn hẹp giúp hạn chế sự kháng thuốc của vi khuẩn. Tuy nhiên 2 các nghiên cứu gần đây mới chỉ tập trung nghiên cứu về bacteriocin của vi khuẩn lactic nhằm ứng dụng bảo quản thực phẩm. Hệ vi sinh vật biển đa dạng và phong phú là tiềm năng lớn cho các nghiên cứu các hoạt chất sinh học đặc biệt là các hợp chất kháng khuẩn. Tuy nhiên, các nghiên cứu về vi sinh vật biển sản xuất bacteriocin hoặc các hợp chất tƣơng tự bacteriocin (Bacteriocin-Like Inhibitory Substances, BLIS) đặc biệt là các vi sinh vật biển sống bám trên động vật biển lại rất ít. Cho đến nay, những nghiên cứu nhƣ vậy vẫn hoàn toàn bỏ ngỏ ở Việt Nam. Vì những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin từ tu hài (Lutraria philippinarum)” với các nội dung chính: - Phân lập vi khuẩn biển từ tu hài - Sàng lọc vi khuẩn có khả năng kháng khuẩn - Xác định hoạt tính bacteriocin của các chủng phân lập 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản Theo Tổ chức Lƣơng thực và Nông nghiệp Liên hợp quốc, nuôi trồng thủy sản đang phát triển nhanh chóng hơn so với tất cả các ngành sản xuất thực phẩm động vật khác (Romero et al, 2012). Đóng góp vào nguồn cung toàn cầu của một số loài cá, động vật giáp xác và động vật thân mềm đã tăng từ 3,9% tổng sản lƣợng tính theo trọng lƣợng trong 1970 đến 33% trong năm 2005. Ƣớc tính ngành thủy sản và nuôi trồng thủy sản cung cấp cho thế giới với khoảng 110 triệu tấn thủy sản mỗi năm(FAO, State of World Fisheries and Aquaculture 2010), tính trên bình quân đầu ngƣời là tƣơng đƣơng 16,7 kg trên một ngƣời. Cung cấp này, 47% có nguồn gốc từ sản xuất nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên, sản xuất nuôi trồng thủy sản đã và đang gặp khó khăn bởi tình hình dịch bệnh diễn ra rất phức tạp và không thể đoán trƣớc tỉ lệ chết của thủy sản nuôi (Romero et al, 2012). 1.1.1. Tình hình dịch bệnh Nuôi trồng thủy sản đang trở thành một ngành công nghiệp tập trung, với số lƣợng ít hơn, nhƣng quy mô lớn hơn nhiều các trang trại nuôi thủy sản. Các bệnh truyền nhiễm gây nguy hiểm và có thể gây thiệt hại nặng nề cho ngƣời nuôi và các vấn đề nghiêm trọng đến sức khỏe vật nuôi thủy sản. Hơn nữa, cùng với hiện tƣợng biến đổi khí hậu toàn cầu, những quan ngại đối các dịch bệnh trên quy mô lớn ngày càng tăng lên, bởi vì ở nhiệt độ cao hơn thì khả năng gây bệnh và truyền nhiễm cũng tăng theo. Dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản bao gồm: dịch bệnh do nấm và ký sinh trùng, bệnh do virus và bệnh do vi khuẩn. Nấm là nguyên nhân gây nên nhiều bệnh ở cá nhƣ: Bệnh nấm thủy mi – gây ra do do 4 giống nấm Leptolegnia, Aphanomyces, Saprolegnia và Achlya; Bệnh nấm mang - gây ra bởi Branchiomyces. Các loại nấm gây hại nhiều đối với nhiều loại cá nuôi giai đoạn cá con, cá thịt và trứng cá. Nấm gây bệnh trên cá làm cho cá bị ngứa ngáy, lở loét, kém ăn. 4 Ký sinh trùng cũng là tác nhân gây bệnh trên cá biển nuôi. Nguyễn Thị Muội và Đỗ Thị Hòa (1978 -1980) đã phát hiện đƣợc 80 loài ký sinh trùng ký sinh trên cá biển. Nhiều loại ký sinh trùng nhƣ: ký sinh trùng đơn bào (Amyloodinium), ký sinh trùng bánh xe (Trichodiniosis), và các loại sán lá đơn chủ (Monogeneansis, Neobenedenia girellae, Benedenia epinepheli và Benedenia sp.) cũng là nguyên nhân gây ra một số bệnh ở cá nuôi. Mặc dù không gây tổn thất lớn nhƣng nó làm cho cá chậm lớn, giảm chất lƣợng thịt cá, tạo cơ hội cho vi khuẩn và virus tấn công (Đỗ Thị Hòa et al, 2004). Virus là tác nhân gây bệnh nguy hiểm trên cá biển nuôi lồng bè. Các tác nhân virus gây bệnh thƣờng gặp chủ yếu ở tôm nuôi nhƣ bệnh đốm trắng ( WSSV), bệnh đầu vàng (YHV), bệnh hoại tử cơ quan tạo máu (IHHNV), hội chứng Taura (TSV)… Ở trên cá biển nuôi, tác nhân virus gây bệnh đƣợc ghi nhận nhiều là virus gây bệnh tử hoại thần kinh (VNN). Bệnh này gây ra trên nhiều loài cá biển và phân bố rộng rãi ở nhiều vùng địa lý khác nhau (Takana et al, 2003). Bệnh này đã đƣợc phát hiện trên các loại cá mú (Epinephelus spp.) cá chẽm (Lates calcarifer) và cá bớp (Rachycentron canadum) nuôi ở Khánh Hòa, Việt Nam (Trần Vĩ Hích et al, 2008). Một số bệnh do virus cũng gây thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi cá biển trên thế giới nhƣ virus IHN gây hoại tử cơ quan tạo máu ở cá hồi vân, iridovirus gây ra hiện tƣợng hoại tử mang và da ở cá tầm trắng. Ngoài ra, một số bệnh khác do virus cũng đã đƣợc ghi nhận ở các loài cá khác nhƣ bệnh nhiễm trùng xuất huyết do vi rút do virus VHS gây nên ở cá hồi, cá trích, cá bơn; bệnh do RSIV ở cá vƣợc, cá tráp và cá mú song. Hiện nay, bệnh do vi khuẩn gây thiệt hại rất lớn cho nghề ƣơng nuôi cá thƣơng phẩm. Nhiều bệnh trên cá nuôi lồng bè trên biển do vi khuẩn đã đƣợc ghi nhận nhƣ: bệnh đốm trắng ở thận trên cá giò nuôi thƣơng phẩm, bệnh Vibriosis, bệnh mòn vây cụt đuôi và bệnh xuất huyết nhiễm trùng máu ở cá mú, cá giò, cá chẽm (Đỗ Thị Hòa et al, 2008). Theo thống kê Ở Khánh Hòa, có khoảng 30% hộ nuôi cá biển bị chịu tác hại của bệnh do vi khuẩn. Bệnh có thể xảy ra ở nhiều loài cá biển nuôi nhƣ cá mú, cá chẽm, cá hồng, đặc biệt giai đoạn cá nhỏ (5 - 20cm), cá 5 nuôi lồng thƣờng chịu tác hại nặng hơn giai đoạn cá lớn với tỷ lệ chết có thể đạt 50100%, đây là bệnh không có mùa vụ rõ ràng (Đỗ Thị Hòa, 2008). Các vi khuẩn gây bệnh trên cá biển đã đƣợc biết nhƣ : Vibrio spp., Aeromonas spp., Flexibacter sp., Pseudomonas fluorescents, Pseudomonas putida, Photobacterium damsela, (Đỗ Thị Hòa, 2008). Trong đó, nhóm vi khuẩn Vibrio spp. gây bệnh đang đƣợc chú ý hơn cả vì tốc độ lây lan và mức độ ảnh hƣởng nghiêm trọng của chúng trong nghề nuôi trồng thủy sản hiện nay. Vibrio – vi khuẩn gây bệnh điển hình ở động vật thủy sản. Bệnh vibriosis là tên gọi chung cho các bệnh khác nhau ở động vật thủy sản do vi khuẩn Vibrio spp. gây ra. Trong bệnh vibriosis, vi khuẩn Vibrio có thể là tác nhân sơ cấp hoặc tác nhân thứ cấp (tác nhân cơ hội, ký sinh trùng ký sinh hay các tác động môi trƣờng nhƣ cơ học, hóa học) có thể đóng các vai trò quan trọng trong các dịch bệnh vibriosis ở động vật thủy sản (Đỗ Thị Hòa et al, 2004). Vibrio là tác nhân gây bệnh nguy hiểm đối với động vật thủy sản. V. anguillarum, V.salmonicida, và V.vulnificus là ba trong số những loài gây bệnh chính cho vài loài cá. Số lƣợng chết gây ra bởi Vibrio trên cá và các loài sò hến là rất phổ biến trong giai đoạn ấu trùng sớm và có thể xuất hiện đột ngột, đôi khi dẫn đến chết toàn bộ (Thompson et al, 2004). Trong những năm gần đây, nghề nuôi cá lồng trên biển phát triển mạnh, bệnh vibiosis đã trở thành các bệnh thƣờng gặp và gây nhiều tác hại cho nghề nuôi thủy sản (Đỗ Thị Hòa et al, 2004). Bệnh do Vibrio gây ra có thể quan sát đƣợc ở khắp mọi nơi có nghề nuôi động vật thủy sản nƣớc lợ và nƣớc mặn, sự phân bố của bệnh này rộng khắp thế giới, tập trung ở châu Á, Phi và Mỹ. Nhiều loài cá biển có giá trị kinh tế cao đang đƣợc nuôi phổ biến ở nhiều quốc gia châu Á, nhƣ cá mú (Epinephelus spp.), cá chẽm (Lates calcarifer) thƣờng bị bệnh này, đặc biệt là hình thức nuôi lồng bè trên biển. Bệnh thƣờng thể hiện các dấu hiệu: trên thân xuất hiện các đốm đỏ nhỏ, tại đó vẩy cá bị tróc và rụng đi, sau một thời gian tạo nên các vết loét nhỏ, sâu. Giải phẫu bên trong cho thấy hiện tƣợng xuất huyết nội tạng, và xuất huyết trong cơ của cá. Cá bị bệnh có thể gây chết hàng 6 loạt khi bị cấp tính, gây chết rải rác khi ở các thể thứ cấp tính (Đỗ Thị Hòa et al, 2004). Từ cá bệnh ở Việt Nam ngƣời ta đã phân lập đƣợc một số loài vi khuẩn nhƣ Vibrio parahaemolyticus, V. alginolyticus, và V. anguillarum (Phan Thị Vân et al, 2000). Ngoài ra có những báo cáo khác về bệnh do Vibrio ở cá nhƣ vi khuẩn V. anguillarum, V. vulnificus gây bệnh nhiễm khuẩn máu ở cá trình, V. salmonicida gây bệnh ở cá vùng nƣớc lạnh (Đỗ Thị et al, 2004). Nghiên cứu bệnh ở động vật thân mềm cho đến nay còn rất hạn chế, chƣa có nhiều nghiên cứu về lĩnh vực này. Bệnh và địch hại đối với động vật thân mềm đƣợc quan tâm ở hai giai đoạn: Ấu trùng và trƣởng thành trong quá trình ƣơng nuôi. Ký sinh trùng là đối tƣợng rất nguy hiểm, ngoài ra Vi khuẩn cũng gây bệnh cho ấu trùng động vật thân mềm. Nghiên cứu của Davis (1954) phát hiện ra loại vi khuẩn Sirolpidium zoophhorum gây hại cho giai đoạn ấu trùng động vật nhuyễn thể. Nghiên cứu của Gaillo (1954) cho thấy, hai loại vi khuẩn của Vibrio và một loại giả đơn bào khuẩn que Pseudomonas trong quá trình đồng hoá và dị hoá chúng tiết ra chất độc, khi hàm lƣợng chất độc đạt tới nồng độ cao nhất. Sẽ làm ấu trùng nhuyễn thể hai mảnh vỏ ngừng sinh trƣởng thậm chí làm ấu trùng chết hàng loạt (Đào Minh Đông, 2004). Địch hại của Tu hài là một số loài cua biển và cá sống ở tầng đáy. Chúng tấn công và ăn Tu hài rất mạnh. Trong quá trình nuôi thƣơng phẩm Tu hài nếu không sử dụng các biện pháp để bảo vệ Tu hài thì tỷ lệ thu hồi sẽ thấp. Trong sản xuất giống nhân tạo qua quan sát trên kính hiển vi thấy ấu trùng Tu hài thƣờng gặp phải một số bệnh: nguyên sinh động vật và bệnh nấm. Nguyên sinh động vật chúng tấn công vào trong cơ thể ấu trùng và gây chết hàng loạt, nhất là giai đoạn ấu trùng Spat. Trong quá trình ƣơng nếu bể ƣơng không thay nƣớc thƣờng xuyên và kịp thời thì nấm phát triển rất nhanh, làm bẩn môi trƣờng nƣớc và làm ấu trùng chết hàng loạt (Lê Xân, 2001). Thời gian gần đây từ tháng 8 năm 2011 đến nay, theo thu nhận từ ngƣời dân nuôi tu hài cho thấy tu hài mắc bệnh không co đƣợc vòi, vòi bị sƣng, rìa vỏ bị thâm đen, tu hài chết ở các độ tuổi và kích cỡ khác nhau. Theo kết quả xét nghiệm của 7 Trung tân chẩn đoán thú y Trung ƣơng ngày 30/5/2012 thì tất cả các mẫu xét nghiệm đều dƣơng tính với vi khuẩn Vibrio spp. và nội ký sinh Perkinsus spp.. 1.1.2. Các biện pháp phòng trừ Động vật thủy sản sống trong nƣớc nên vấn đề phòng và trị bệnh không giống gia súc trên cạn. Mỗi khi trong ao động vật thủy sản bị bệnh, không thể chữa từng con mà phải chữa bệnh theo quần đàn, thuốc dùng phải tính cho tổng số cá thể trong ao nuôi nên tốn kém nhiều, các loại thuốc chữa bệnh ngoài da cho động vật thủy sản thƣờng phun trực tiếp xuống nƣớc, nên chỉ áp dụng với ao có diện tích nhỏ, còn các thủy vực có diện tích mặt nƣớc lớn không sử dụng đƣợc phƣơng pháp này. Các thuốc chữa bệnh bên trong cơ thể động vật thủy sản phải trộn vào thức ăn, nhƣng những con bị bệnh lại không ăn, những con khỏe lại ăn rất nhiều, nên dù có sử dụng loại thuốc đúng nhƣng hiệu quả cũng không cao và những con khỏe mạnh cũng phải dùng thuốc làm ảnh hƣởng tới sinh trƣởng của chúng. Có một số thuốc khi chữa bệnh cho động vật thủy sản có thể tiêu diệt đƣợc nguyên nhân gây bệnh (vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng) nhƣng kèm theo phản ứng phụ nặng nề với động vật nuôi và môi trƣờng nuôi...Vì vậy các nhà nuôi trồng thủy sản luôn đặt vấn đề phòng bệnh cho động vật thủy sản lên hàng đầu và nguyên tắc là: ”phòng bệnh là chính, chữa bệnh khi cần thiết” (Đỗ Thị Hòa, 2004). Các biện pháp phòng trừ đang đƣợc áp dụng trong nuôi trồng thủy sản nhƣ ngăn chặn sự xâm nhập và kìm hãm sự phát triển của tác nhân gây bệnh, quản lý môi trƣờng nuôi thích hợp và nâng cao sức đề kháng của động vật thủy sản nuôi (Đỗ Thị Hòa, 2004). Biện pháp phòng và trị bệnh do nấm hiện nay thƣờng dùng muối ăn (NaCl) nồng độ 2 - 3%, sulfate đồng (CuSO4) nồng độ 0,5g/m3 nƣớc để tắm cho cá nuôi. Biện pháp phòng ngừa các bệnh do ký sinh trùng thƣờng là giữ vệ sinh ao cá nhất là ao ƣơng, cải tạo ao nuôi kỹ càng, thả cá với mật độ vừa phải và tẩy giun sán định kỳ cho cá nuôi bằng thuốc. 8 Hiện nay chƣa có biện pháp chữa trị cho bệnh bởi virus trên cá nuôi nên để giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh virus thì phải đảm bảo nguồn giống sạch virus và hạn chế nhập, xuất khẩu các loại cá có nguy cơ nhiễm virus đã biết. Vấn đề cấp bách hiên nay đối với ngƣời nuôi là thâm canh nuôi trồng thủy sản đã dẫn đến ngày càng tăng các vấn đề với bệnh do vi khuẩn. Các bệnh chủ yếu do Aeromonas, Vibrio, Cytophaga, Streptococcus, Pasteurella, Mycobacterium, và Edwardsiella chi (Bảng 1.1). Để giải quyết vấn đề này, nông dân thƣờng xuyên sử dụng các chất kháng sinh để điều trị các bệnh do vi khuẩn (Cabello, 2006). Tuy nhiên chất kháng sinh dƣờng nhƣ đã mất hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản do việc lạm dụng quá mức. Việc sử dụng các chất kháng sinh không chỉ làm tăng khả năng kháng bệnh của vi khuẩn, phá vỡ hệ vi sinh bình thƣờng và gây ra hiện tƣợng mất cân bằng vi sinh (microdysbiosis) mà còn làm tích lũy các gốc kháng sinh trong sản phẩm thủy sản có hại cho sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Vì vậy, các giải pháp thay thế thân thiện với môi trƣờng nhƣ sử dụng vaccine. Nhƣng việc sử dụng vaccine thƣờng tốn chi phí sản xuất, chi phí nhân công và gây stress mạnh cho động vật nuôi (Corripio-Myar et al, 2007; Smith, 2007). Hơn nữa vẫn chƣa có vaccine ngừa bệnh cho tôm và nhuyễn thể (Subasinghe, 2009). Do vậy, sử dụng các vi khuẩn sinh bacteriocin có thể là giải pháp thay thế rất phù hợp với vai trò kép bởi vì bacteriocin sẽ là một chất kháng sinh thế hệ mới an toàn và thân thiện với sức khỏe con ngƣời và môi trƣờng, trong khi đó các vi khuẩn đóng vai trò của probiotic. 1.2. Tình hình nuôi trồng và đặc điểm sinh học của tu hài Việt Nam có bờ biển kéo dài hơn 3200km, có khoảng 112 cửa sông và 1,7 triệu ha mặt nƣớc nuôi trồng thủy sản. Trong đó diện tích bãi triều khoảng 666,00ha (Phạm Thƣợc, 2005) tạo nên tiềm năng lớn cho nghề nuôi các đối tƣợng hải sản, đặc biệt là loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ (Bivalvia). Nhuyễn thể hai mảnh vỏ đang trở thành ngành có tiềm năng kinh tế, với giá trị xuất khẩu đứng thứ ba trong ngành thủy sản Việt Nam. Trong những năm gần đây nghề nuôi thƣơng phẩm tu hài (Lutraria philippinarum) - một loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ đặc sản – đang phát triển mạnh đem lại lợi ích kinh tế cao cho hộ nuôi. 9 1.2.1. Tình hình nuôi tu hài Tu hài phân bố chủ yếu ở vùng biển Hải Phòng-Quảng Ninh nhƣ các vùng Vạn Bội, vịnh Lan Hạ, Cát Dứa, Lão Vọng, Cống Kê, Cáp Quan, Vạn Dong, Soi Gianh, Đầu Bê, Cửa Vạn và Lạch Miều. Hai khu vực tập trung chủ yếu là từ đông đảo Cát Bà đến Hòn Đá Mài và từ Đảo Cống Tây đến Cây Khế Đông (Phạm Thƣợc, 2005). Năm 2001, Phòng Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn huyện Cát Hải đã phối hợp với ngƣ dân thử nghiệm nuôi thƣơng phẩm Tu hài ở hai địa điểm: Vụng Chùa Đá thuộc đảo Trà Bản và đảo Đồng Chén thuộc xã đảo Bản Sen – Vân Đồn. Thử nghiệm nuôi thƣơng phẩm với hình thức nuôi trên bãi triều tự nhiên và nuôi khay. Kết quả sau thời gian nuôi 120 ngày với cỡ giống thả ban đầu 2,5 – 3cm tăng lên 4,5 – 5cm với khối lƣợng đạt 20 – 25g/con, tỷ lệ sống đạt 80% (Đào Minh Đông, 2004). Dần dần mô hình này đƣợc nhân rộng ra và trở thành đối tƣợng nuôi chủ lực, chuyển đổi cơ cấu sản xuất và góp phần xoá đói giảm nghèo cho ngƣ dân ven biển, tạo điều kiện đẩy mạnh kinh tế vùng. Năm 2007 cả hai vùng có trên 250 hộ nuôi Tu hài sử dụng trên 550,20ha diện tích mặt nƣớc, trong đó khu vực Cát Bà có diện tích khoảng 33ha. Cả hai vùng có khoảng 12.424 ô lồng nuôi cá, có thể nuôi treo kết hợp với đối tƣợng nhuyễn thể trong đó có Tu hài. Ở Cát Bà có khoảng 476 bè nuôi cá với 6724 ô lồng (Sở thuỷ sản Hải Phòng, 2007). Việc ngƣ dân nuôi kết hợp cá lồng và treo nhuyễn thể là hƣớng đi đúng nhằm tận dụng diện tích mặt nƣớc, tăng thu nhập cho ngƣời nuôi đồng thời bảo vệ đƣợc môi trƣờng sinh thái. Tu hài đã đƣợc di giống vào nuôi và phát triển nguồn lợi tại. Trong 2 năm 2004 và 2005 tu hài đã đƣợc di giống vào nuôi tại khu bảo tồn biển vịnh Nha Trang (Phạm Thƣợc, 2005). Cho đến nay thì tu hài đã đƣợc mở rộng vùng nuôi tại Khánh Hòa ra cả vịnh Cam Ranh và vịnh Vân Phong. 1.2.2. Đặc điểm sinh học Tu hài (Lutraria philippinarum) là loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ có khối lƣợng cá thể có thể đạt đến 150 – 160 g/con, vỏ mỏng, tỷ lệ phần “thịt” lớn, thơm ngon. Tu hài phân bố ở vùng biển ấm nhƣ Philippin, Ôxtrâylia, Việt Nam,… nhƣng 10 cũng chỉ ở một số phạm vi rất hẹp. Tu hài có giá trị kinh tế cao so với tất cả các loài nhuyễn thể hai vỏ và nhiều loài hải sản khác phân bố ở Việt Nam. Thịt tu hài chứa tới 11,63% đạm, 0,42% đƣờng, 1,22% muối khoáng, đặc biệt có tới 18 loại axit amin không thay thế. Thịt tu hài thơm ngon nhất vào mùa sinh sản từ tháng 12 đến tháng 2 (Lê Xân et al, 2001). Tu hài là đối tƣợng thân mềm hai mảnh vỏ có vị trí phân loại nhƣ sau: Ngành động vật thân mềm: Mulusca Lớp hai mảnh vỏ: Bivalvia Bộ biện mang: Eulamellibranchia Họ vọp: Mactridae Loài Tu hài: Lutraria rhynchaena (Jonas, 1844) Hay : Lutraria philippinarum (Reeve, 1858) Tên tiếng Anh: Gweo- Duck (Otter Clam) Tên tiếng Việt: Tu hài Nguồn : Phạm Thƣợc (2005) Hình 1.1. Tu hài Lutraria philippinarum Tu hài có cơ thể đƣợc bảo vệ bởi hai tấm vỏ khá đều nhau, chiều dài thân dài hơn chiều dài cơ thể, hai vỏ dính liền nhau ở phần lƣng bởi dây nề. Vỏ đƣợc cấu tạo bằng đá vôi, màu sắc thay đổi theo môi trƣờng sống. Vỏ không có khả năng khép chặt nhƣ vỏ trai, hầu, vẹm ...Các gờ sinh trƣởng khá rõ nét, vết màng áo sâu và rõ. Màng áo ngoài gồm 2 tấm giáp liền với vỏ và bao phủ toàn bộ cơ thể, mở ra ở phần 11 bụng. Phần cuối phát triển tạo thành 2 vòi ống hút và xả. Mép màng áo dày có khả năng vận chuyển cát khi đào hang. Ống xiphông khá phát triển – do đặc điểm sống đáy, tu hài đào hang sống vùi dƣới đáy cát, cát sỏi hoặc mảnh vụn vỏ hầu, hà, san hô. Vì vậy mọi trao đổi chất của Tu hài đều thông qua 2 ống xiphông này. Tu hài đào hang sâu tới 40 – 50cm, di chuyển theo chiều sâu của hang, chỉ thò hai ống xiphông lên lấy thức ăn và hô hấp. Chất đáy cho tu hài cƣ trú là đáy cát sỏi lẫn vỏ hầu, hà ... không thấy Tu hài sống ở đáy bùn hoặc thuần cát. Tu hài là loài ƣa độ muối cao và ổn định (từ 24 – 33 0/00), thích hợp nhất là từ 29 – 32 0/00. Tu hài sống chủ yếu ở nơi có nền đáy là cát thô, lẫn sỏi, đá nhỏ, vùng rạn san hô và một vài nơi có nền đáy là cát pha bùn. Tu hài phân bố tập trung thành bãi ở đới trung, hạ triều cho tới vùng ngập nƣớc dƣới triều độ sâu tới 10m. Chúng sống vùi trong nền đáy ở độ sâu 20 – 50cm (Nguyễn Xuân Dục, 2005). Khi điều kiện môi trƣờng thay đổi, đặc biệt ở những vùng chịu ảnh hƣởng của nƣớc ngọt, Tu hài sẽ trồi lên mặt bãi và di chuyển bằng cách: 2 ống xiphông căng duỗi ra phía trƣớc, chân thò ra uốn cong và bật mạnh xuống nền đáy đẩy mạnh Tu hài lên khỏi mặt bãi. Nhờ dòng nƣớc chúng di chuyển đến nơi ở mới. Cũng giống nhƣ các loài động vật nhuyễn thể khác, Tu hài là loài mang tấm ăn lọc. Tu hài không có khả năng lựa chọn thức ăn theo mùi vị và chất lƣợng, nƣớc cùng với thức ăn theo ống xiphông hút vào xoang màng áo qua các kẽ mang, thức ăn có kích thƣớc thích hợp đƣợc giữ lại nhờ các tấm mang. Sau đó thức ăn đƣợc chuyển xuống xúc biện và đƣa xuống dạ dày. Phần thức ăn không tiêu hóa, đƣợc tống ra ngoài qua hậu môn vào xoang áo và thoát ra ngoài qua ống xiphông thoát. Thức ăn là các loài tảo phù du, trong đó chủ yếu là các loài tảo Silic nhƣ: Coscinodicus, Navicula, Nitszchia, Cyclotella ..., các mảnh vụn hữu cơ và các vi sinh vật khác (Nguyễn Xuân Dục, 2005). 1.3. Tổng quan về bacteriocin 1.3.1. Đặc điểm chung của bacteriocin Bacteriocin đã đƣợc phát hiện cách đây gần trăm năm từ nghiên cứu của Gratia về khả năng của Escherichia coli kháng lại E.coli có tên gọi là colicin để xác 12 định đƣợc loài vi khuẩn đã sinh ra (Gratia, 1925). Thuật ngữ bacteriocin không xuất hiện cho đến những năm 1950 (Desriac et al, 2010). Bacteriocin là những hợp chất có bản chất protein do vi khuẩn sinh tổng hợp và có khả năng ức chế sự phát triển của các giống vi khuẩn khác có liên hệ gần với giống sản xuất (Tagg, 1976). Bacteriocin đƣợc sản xuất ở hầu hết các dòng vi khuẩn và có thể là tất cả các thành viên của cổ khuẩn (Bakkal, 2012). Một họ bacteriocin rất đa dạng về kích thƣớc protein, vi khuẩn kháng mục tiêu, phƣơng thức hoạt động, sự phóng thích, cơ chế miễn dịch và có thể đƣợc chia thành hai nhóm chính: nhóm sản xuất bởi vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng (Heng et al. 2007). Hơn nữa một số nhỏ bacteriocin từ các loại cổ khuẩn cũng đang đƣợc nghiên cứu đặc điểm (Suphan Bakkal, 2012). Một số loài vi khuẩn sản xuất độc tố có thể biểu hiện nhiều tính năng giống nhƣ bacteriocin, nhƣng chƣa đƣợc đầy đủ đặc trƣng, những độc tố này đƣợc gọi là các chất ức chế giống nhƣ bacteriocin hoặc BLIS (Messi et al, 2003). Bacteriocin khác biệt với kháng sinh truyền thống ở những điểm chủ yếu nhƣ bacteriocin đƣợc tổng hợp nhờ ribosome, phổ kháng khuẩn hẹp thƣờng chỉ có khả năng tiêu diệt những chủng vi khuẩn có liên hệ gần với chủng sản xuất (Riley và Wertz, 2002b), tế bào chủ miễn dịch với chúng (Trần Thị Tƣởng An, 2007). 1.3.2. Phân loại bacteriocin Đến nay, khoảng 200 bacteriocin đã đƣợc nghiên cứu về các đặc điểm (Bactibase, 2007). Phân loại bacteriocin vẫn chƣa đƣợc thống nhất và đang là vấn đề gây tranh cãi. Mặc dù đến những năm 1993, phân loại bacteriocin đƣợc xác định bởi Klaenhammer vẫn đƣợc sử dụng nhiều nhất (Klaenhammer, 1993). Năm 2005, Cotter et al đề xuất sửa đổi (Cotter, 2005) và tranh luận bởi Heng và Tagg trong năm 2006 (Tagg, 2006). Theo cập nhật mới nhất của Bakkal và cộng sự (2012) thì bacteriocin đƣợc chia thành ba nhóm chính là nhóm sinh ra từ vi khuẩn Gram âm, nhóm sinh ra từ vi khuẩn Gram dƣơng và nhóm sinh từ cổ khuẩn (Bakkal, 2012). Dƣới đây là miêu tả ngắn về những lớp bacteriocin từ vi khuẩn và cổ khuẩn và những loại bacteriocin của mỗi lớp (Bảng 1.1).
- Xem thêm -