Tài liệu Phân lập và sàng lọc vi sinh vật biển sinh enzym có khả năng cắt mạch fucoidan

  • Số trang: 58 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 102 |
  • Lượt tải: 0
nhattuvisu

Đã đăng 27125 tài liệu

Mô tả:

y c u -tr a c k .c TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CHẾ B IẾN  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC VI SINH VẬT BIỂN SINH ENZYM CÓ KHẢ NĂNG CẮT MẠCH FUCOIDAN Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: Lớp: PGS .TS . NGÔ ĐĂNG NGHĨA TS . TRẦN THỊ THANH VÂN TRẦN NGUYỄN HÀ VY 48 CNS H NHA TRANG, NĂM 2010 .d o m o w o .d o w w w C lic k to bu y bu to k lic C w z w N O W ! h a n g e Vi e N PD ! XC er O W F- w m h a n g e Vi e w PD XC er F- c u -tr a c k .c y .c .d o m w o o c u -tr a c k w w .d o C lic k to bu y bu to k lic C w w w N O W ! h a n g e Vi e N PD ! XC er O W F- w m h a n g e Vi e w PD XC er F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y to k lic .c LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Ngô Đăng Nghĩagiám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường và TS. Trần Thị Thanh Vântrưởng phòng hóa phân tích và triển khai công nghệ Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đồ án này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn toàn thể ban lãnh đạo, các cán bộ của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tạo mọi điều kiện hỗ trợ và giúp đỡ tôi để tôi có đủ điều kiện thực hiện đồ án. Tôi xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, phòng đào tạo Đại học và sau Đại học cùng các thầy cô Trường đại học Nha Trang đã tận tình chỉ dạy và hướng dẫn trong suốt quá trình học và làm đồ án. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã quan tâm, chia sẻ những khó khăn, động viên để tôi hoàn thành đồ án này. Trần Nguyễn Hà Vy Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to i w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y to k lic .c MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT MỞ ĐẦU.................................................................................................................. 1 PHẦN 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 5 1.1. Tổng quan về rong biển ................................................................................. 5 1.1.1. Giới thiệu chung về rong biển ........................................................................ 5 1.1.2. Phân loại rong biển ........................................................................................ 6 1.1.3. Phân bố và ứng dụng rong Nâu trên thế giới ................................................. 6 1.1.4. Rong Mơ Việt Nam ....................................................................................... 7 1.2. Tổng quan về enzyme ..................................................................................... 8 1.2.1. Khái niệm chung về enzyme .......................................................................... 8 1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme ................................................. 9 1.2.3. Tính chất của enzyme ................................................................................... 11 1.3. Giới thiệu về Fucoidan ................................................................................. 14 1.3.1. Fucoidan ....................................................................................................... 14 1.3.2. Hoạt tính sinh học của Fucoidan .................................................................. 16 1.3.3. Ứng dụng của fucoidan và oligosacharit của nó .......................................... 19 1.3.3.1. Một số ứng dụng của Fucoidan tự nhiên ................................................... 19 Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to ii w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y to k lic .c 1.3.3.2. Một số ứng dụng của oligosaccharit từ một fucoidan ............................... 20 1.3.3.3. Một số sản phẩm Fucoidan trên thế giới ................................................... 20 1.4. Enzyme có khả năng phân cắt fucoidan ...................................................... 21 1.4.1. Enzyme fucoidanase .................................................................................... 21 1.4.2. Một số nghiên cứu về fucoidanase trên đối tượng vi sinh vật ..................... 21 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ...................................................... 23 2.1. Chủng giống ................................................................................................... 23 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 23 2.2.1. Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật ............................................... 23 2.2.2. Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật ............................................ 25 2.2.3. Thử nghiệm họat tính enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan ............................... 26 2.2.4. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan .................................................................................................................. 28 2.2.4.1. Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến việc thu nhận sinh khối tế bào ........... 28 2.2.4.2. Ảnh hưởng của các loại đệm lên hoạt tính enzyme ................................ 28 2.2.4.3. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme ................................................. 28 2.2.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên họat tính enzyme ......................................... 28 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 29 3.1. Phân lập các chủng vi sinh vật biển theo định hƣớng sinh enzyme cắt ngắn mạch fucoidan ....................................................................................................... 29 3.2. Sàng lọc vi sinh vật biển theo định hƣớng sinh enzyme cắt ngắn mạch fucoidan ................................................................................................................. 32 3.3. Khảo sát điều kiện tách chiết enzyme.......................................................... 35 3.3.1. Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến việc thu nhận sinh khối tế bào ............... 35 Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to iii w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y to k lic .c 3.3.2. Ảnh hưởng của các loại đệm lên hoạtt tính enzyme .................................... 36 3.3.3. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme ..................................................... 36 3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme ............................................. 38 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 40 4.1. Kết luận .......................................................................................................... 40 4.2. Kiến nghị ........................................................................................................ 41 PHỤ LỤC .............................................................................................................. 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 44 Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to iv w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y to k lic .c DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số ứng dụng của fucoidan chiết từ rong nâu. ................................. 19 Bảng 1.2: Ứng dụng của ologosacarit từ fucoidan. ................................................ 20 Bảng 1.3: Vi sinh vật biển và enzym của chúng .................................................... 22 Bảng 2.1: Thành phần hóa học của một số loại fucoidan....................................... 23 Bảng 3.1: Các chủng vi khuẩn biển đã phân lập được. .......................................... 30 Bảng 3.2: Hoạt tính enzyme khi lên mem vi sinh vật trên môi trường lỏng chứa fucoidan từ rong S. mcclurei................................................................................... 33 Bảng 3.3: Hoạt tính enzyme khi ly tâm với tốc độ khác nhau. .............................. 35 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của các loại đệm lên hoạt tính enzyme. .............................. 36 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme. ............................................ 37 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme. ..................................... 38 Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to v w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y to k lic .c DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Một số loài rong có chứa fucoidan. ........................................................ 15 Hình 1.2: Cấu trúc fucoidan chiết từ rong Fucus vesiculosus ................................ 16 Hình 2.1: Sơ đồ phân lập vi sinh vật biển. ............................................................ 24 Hình 2.2: Xử lý mẫu rong trước khi phân lập. ....................................................... 25 Hình 2.3: Sơ đồ nuôi cấy và tách chiết enzyme từ vi sinh vật. .............................. 26 Hình 2.4: Đường chuẩn fucose. .............................................................................. 27 Hình 3.1: Lên men vi sinh vật để tạo enzym fucoidanase ...................................... 32 Hình 3.2: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme. .............................................. 37 Hình 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme. ...................................... 38 Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to vi w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y to k lic .c BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT AMPA α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate DNA Deoxyribonucleic acid Ex Extract Fuc Fucose Gal Galactose HGF Human Hepatocyte Growth Factor HIV Human immunodeficiency virus IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry CE Control enzym CS Control substrate Man Mannose NITRA Nha Trang Institute of Technology Rearcher and Application Rha Rhamnose RNA Ribonucleic acid Xyl Xylose Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to vii w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y to k lic .c MỞ ĐẦU Với hơn 3200 km chiều dài bờ biển, nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, Việt Nam có hệ sinh thái động-thực vật thủy sinh là vô cùng đa dạng và phong phú. Trong đó hệ thực vật tảo biển chiếm một lượng sinh khối lớn với khoảng 1000 loài được dự đoán, 639 loài đã xác định bao gồm 151 loài rong lục, 269 loài rong đỏ, 143 loài rong nâu và 76 loài rong lam [13]. Ngay từ xa xưa nhiều loài rong tảo đã được con người sử dụng làm thức ăn cho người và gia súc, một số nước tại vùng biển Châu Á, Châu Mỹ một số loài rong còn được sử dụng để làm thuốc. Câu chuyện về tỉ lệ người chết thấp và tỉ lệ người cao tuổi sống khỏe mạnh (trên 100 tuổi) khác thường ở đảo Tonga (Nam Thái Bình Dương) vẫn hấp dẫn các nhà khoa học khi những người dân đảo này cho biết họ sống được như vậy là nhờ rong nâu, loài thực vật mà họ đã thu hoạch và sử dụng hơn 3000 năm nay. Người Tonga tin rằng rong nâu chính là nguồn dược liệu giúp họ tăng tuổi thọ, sức khỏe và sinh lực. Vì một trong những lí do này mà các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu vào đối tượng rong nâu và tìm ra được rất nhiều chất có hoạt tính sinh học cao như là kháng khuẩn, kháng khối u, tăng cường khả năng miễn dịch....Đăc biệt là fucoidan được tìm thấy trong rong nâu là chất có rất nhiều hoạt tính sinh học quý giá. Ngoài fucoidan trong rong nâu còn có nhiều hợp chất có giá trị kinh tế như: laminaran, mannitol, gibberelin, cytokinin, auxin, iod, khoáng, axit béo … và nhiều loại vitamin. Việt Nam có hơn 120 loài rong nâu với sản lượng ước tính trên 10000 tấn khô/năm, nhưng đa số người dân thường thu hoạch rong này để làm phân bón và thức ăn chăn nuôi. Thấy được tiềm năng này Viện Nghiên Cứu và Ứng Dụng Công Nghệ Nha Trang đã triển khai nghiên cứu và sản xuất thành công fucoidan là một hướng nghiên cứu thiết yếu cho khoa học và có giá trị thực tiễn [1],[2]. Fucoidan, một sulphat polysaccharide sinh học được chiết từ rong nâu, đặc biệt được quan tâm nghiên cứu nhờ nhiều hoạt tính dược lý đặc biệt như chống đông tụ, chống viêm nhiễm, điều tiết miễn dịch, ức chế sự phát triển ư bướu, kháng Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 1 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y to k lic .c ung thư và kháng virus kể cả virus HIV … và hơn nữa nguồn cung cấp chủ yếu là rong nâu tự nhiên có trữ lượng lớn tại các vùng biển nước ta. Tuy nhiên mối quan hệ giữa hoạt tính sinh học và cấu trúc của chúng vẫn chưa được giải thích rõ ràng do cấu trúc phức tạp và không theo quy luật của fucoidan từ các nguồn gốc loài rong khác nhau mà nó được chiết ra. Trong mạch phân tử của chúng chứa chủ yếu các gốc fucose được sulphat hóa ở các vị trí khác nhau và liên kết với nhau thông qua một số liên kết như (1-3) (1-4), (1-2) glycosit ít theo quy luật. Ngoài ra trong phân tử còn có mặt một số đường đơn khác như: galactose, manose, xylose, glucose và các mạch nhánh có chứa gốc fucosyl, galatosyl …Chính vì vậy việc nghiên cứu ảnh hưởng của từng yếu tố cấu trúc lên hoạt tính sinh học của fucoidan là một thách thức không nhỏ đối với các nhà khoa học. Điều này chỉ được giải quyết hiệu quả nhất khi sử dụng các loại enzyme có khả năng cắt mạch fucoidan như là một công cụ để nghiên cứu cấu trúc cũng như tương quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan. Cho đến nay các nhà nghiên cứu đã tìm ra 2 loại ezyme O-glycosyl hydrolase có hoạt tính với fucoidan đó là fucoidanase và α-L-fucosidase. Hoạt tính của α-L-fucoisidase được mô tả dễ dàng như là sự giải phóng L-fucose khỏi đoạn cuối của một phân tử polysaccharide, thì việc xác định hoạt tính của fucoidanase được giải thích bởi hai kiểu bẻ gãy liên kết glycosit. Fucoidanase có thể bẻ gãy các liên kết glusosit bên trong phân tử polysaccharide làm giảm nhanh chóng trọng lượng phân tử (endo-fucoidanase) hoặc ở phía rìa ngoài của phân tử để lấy đi một số phân tử oligosaccharide làm cho trọng lượng phân tử giảm từ từ (exo-fucoidanase) [23],[46]. Do fucoidan được chiết từ các loài rong khác nhau thì khác nhau nên các nghiên cứu về cơ chế tác động của fucoidanase còn rất hạn chế và khó để so sánh các kết quả thực nghiệm với nhau. Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 2 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y to k lic .c Các nhà khoa học Pháp và Nhật đã công bố tìm thấy một số loại fucoidanase từ một số loại động vật thân mềm biển như: bào ngư Haliotis sp, điệp Pectenmaximus, động vật thân mềm Pectinidae Patinopecten Yessoensis. Các enzyme này có khả năng thủy phân fucoidan một cách rất hiệu quả để tạo thành các oligosaccharide [7],[8]. Tuy nhiên việc tiềm kiếm enzyme từ động vật thân mềm biển chỉ có ý nghĩa về mặt nghiên cứu nhưng khó có thể đưa vào ứng dụng ở quy mô sản xuất công nghiệp. Vì vậy, người ta đặc biệt quan tâm đến enzyme cắt mạch fucoidan có nguồn gốc vi sinh vật là vì các lí do sau: thứ nhất tốc độ sinh trưởng và sinh sản của vi sinh vật rất nhanh, enzyme của vi sinh vật có hoạt tính rất cao, thứ hai có thể kiểm soát được điều kiện nuôi cấy để vi sinh vật sinh tổng hợp các chất theo định hướng của chúng ta, thứ ba nuôi cấy vi sinh vật ta có thể thu toàn bộ sinh khối vi sinh một cách dễ dàng và ít tốn diện tích nuôi cấy. Một số nhóm các nhà khoa học Nhật Bản [9],[10] đã phân lập được vi khuẩn có khả năng cắt mạch fucoidan từ trầm tích biển và nước biển. Trong vài thập kỉ trở lại đây có nhiều nghiên cứu thú vị về enzyme fucoidanase phân lập từ vi sinh vật biển được công bố. Chẳng hạn, Sakai và cộng sự [43],[44] đã phân lập từ biển Nhật Bản vi khuẩn Flavobateriacea có thể phân cắt nhiều loại fucoidan khác nhau được chiết từ các loài rong Laminariales, Kiellmaniella crassifolia, Lessonia nigrescens và Undaria pinatifida. Cho đến năm 2004, chúng tôi chưa tìm thấy một công bố nào trong nước đề cập một cách toàn diện polysaccharide từ rong nâu Việt Nam cũng như việc cắt mạch chúng thành oligosaccharide sử dụng enzyme từ vi sinh vật biển [1],[2]. Để giúp cho việc nghiên cứu cơ chế tác dụng của fucoidan lên tế bào sinh vật và tiến tới sử dụng chúng để làm dược liệu thì việc xác định cấu trúc hóa học của chúng là điều kiện tiên quyết. Các phương pháp sử dụng hóa lý hiện nay (thủy phân, đề-sulphat hóa, đề-actyl hóa) trước khi phân tích thường đòi hỏi điều kiện acid hoặc kiềm mạnh ở nhiệt độ cao, do đó có thể làm thay đổi cấu trúc của polysaccharide [7],[8],[9],[11]. Các phương pháp enzyme đặc hiệu có thể được sử dụng để điều chế các oligosaccharide thích hợp cho các nghiên cứu sinh học cũng như các mẫu đơn giản hóa, từ đó có thể suy luận ra cấu trúc của fucoidan ban đầu. Ngoài ra việc cắt ngắn mạch fucoidan bằng enzyme vi sinh vật còn tạo ra các tổ hợp oligosaccharide Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 3 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y to k lic .c mới có hoạt tính sinh học đặc hiệu và hiệu lực cao hơn so với fcoidan ban đầu, đây là xu hướng phát triển trên thế giới [22]. Chính vì vậy, trong khuôn khổ đồ án tốt nghiệp này tôi chọn đề tài nghiên cứu là “Phân lập và sàng lọc vi sinh vật biển sinh enzyme có khả năng cắt mạch fucoidan”. Nội dung luận văn bao gồm:  Phân lập vi sinh vật biển theo định hướng phân cắt fucoidan.  Sàng lọc vi sinh vật biển sinh enzyme cắt mạch fucoidan.  Khảo sát sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme fucoidanase. Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 4 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y to k lic .c PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về rong biển 1.1.1. Giới thiệu chung về rong biển Rong biển là kho chứa gồm: thực phẩm, thuốc chữa bệnh, nguyên liệu cho công nghiệp, nông nghiệp. Đã bao đời nay trên thế giới trong đó có Việt Nam đã và đang sử dụng rong biển là thực phẩm trực tiếp trong bữa ăn hằng ngày. Rong biển (marine algae) là một loại thực vật bậc thấp sống ở biển hoặc vùng nước lợ ven biển. Sự có mặt trong thủy vực của chúng đóng hai vai trò quan trọng là mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn và còn là nguồn cung cấp thức ăn cho các loài động vật ven biển [6]. Rong biển có kích thước và hình dạng rất phong phú, chúng có kích thước hiển vi hoặc có khi dài hàng chục mét, hình dạng của chúng có thể là hình cầu, hình sợi, hình phiến lá hay hình thù rất đặc biệt. Hằng năm đại dương cung cấp cho con người khoảng 200 tỷ tấn rong. Trong 90% cacbon trên Trái Đất được tổng hợp hằng năm nhờ quang hợp trong môi trường lỏng, trong đó 20% từ rong biển [33],[38]. Giá trị công nghiệp của rong biển là cung cấp các chất keo như: agar, alginat, carrageenan... dùng cho thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, công nghệ sinh học... Các polysaccharide từ rong biển được coi là những chất hữu cơ không được thay thế trong nhiều lĩnh vực công nghiệp khi được sử dụng như là chất tạo đông, làm đặc, chất ổn nhũ và chất ổn định. Các oligosaccharide có tác dụng kháng nấm bệnh, ức chế quá trình phát triển của tế bào ung thư, tế bào HIV...nhiều hợp chất hữu cơ trong rong biển có tác dụng điều hòa kích thích sinh trưởng đối với cây trồng nên đã được sản xuất thành phân bón hữu cơ [6]. Giá trị dinh dưỡng của rong biển là cung cấp đầy đủ các chất khoáng, các acid amin cần thiết, các loại vitamin, các carbohydrat đặc trưng và các chất có hoạt tính sinh học có lợi cho cơ thể và có khả năng phòng bệnh tật. Vì vậy, ngày nay rong biển được xếp vào loại thực phẩm chức năng và ngày càng được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 5 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y to k lic .c Theo Algorythme (2000) sản lượng thu hoạch rong biển kinh tế thế giới đạt 8 triệu tấn. Doanh thu hằng năm từ kinh tế rong biển trên thế giới ước tính vào khoảng trên 8 tỷ USD [38]. 1.1.2. Phân loại rong biển Tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh sản mà rong biển được chia làm 9 ngành sau đây: 1) Ngành rong lục (Chlorophyta) 2) Ngành rong nâu (Phaeophyta) 3) Ngành rong đỏ (Rhodophyta) 4) Ngành rong trần (Englenophyta) 5) Ngành rong giáp (Pyrophyta) 6) Ngành rong khuê (Bacillareonphyta) 7) Ngành rong kim (Chrysophyta) 8) Ngành rong vàng (Xantophyta) 9) Ngành rong lam (Cynophyta) Rong đỏ và rong nâu là hai đối tượng được nghiên cứu với sản lượng lớn và được ứng dụng nhiều trong nghành công nghiệp và đời sống. Đối với rong lục thì loại tảo clorella được xếp vào loại tảo kì diệu, có tốc độ sinh khối cực nhanh, đang được nghiên cứu phục vụ cho đời sống con người [6]. 1.1.3. Phân bố và ứng dụng rong nâu trên thế giới Rong nâu (Phaeophyta) phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, Ấn Độ, kế tiếp là Chile, Achentina, Brazil, Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ Đào Nha. Trong đó, bộ Fucales, đối tượng phổ biến và kinh tế nhất của rong nâu đại diện là họ Sargassaceae với hai giống Sargassum và Turbinaria phân bố chủ yếu ở vùng cận nhiệt đới. Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 6 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y to k lic .c Phân bố về số loài rong biển tuy đã được tổng kết sơ bộ. Tuy nhiên, tuỳ theo diện tích lãnh hải, điều kiện môi trường phát triển, kỹ thuật nuôi trồng khác nhau của các nước mà sản lượng rong biển trên thế giới khác với phân bố các loài rong. Sản lượng rong nâu lớn nhất thế giới tập trung tại Trung Quốc với trên 667.000 tấn khô, tập trung vào 3 chi Laminaria, Udaria, Ascophyllum. Hàn Quốc khoảng 96.000 tấn với 3 chi Udaria, Hizakia, Laminaria. Nhật Bản khoảng 51.000 tấn Laminaria, Udaria, Cladosiphon, Na Uy khoảng 40.000 tấn, Chile khoảng 27.000 tấn. Ngành rong nâu có khoảng 190 chi, trên 900 loài phần lớn sống ở biển, số chi, loài tìm thấy trong nước lợ và nước ngọt không nhiều lắm. Rong có màu nâu đậm, nâu vàng. Màu sắc khác nhau ở các loài phụ thuộc vào thành phần và tỉ lệ của các loại sắc tố có trong rong. Rong nâu được coi là nguồn polysaccharide có ứng dụng rộng lớn nhờ các đặc điểm cấu trúc và tính chất đặc thù của chúng như: axit alginic, fucoidan, laminaran. Trước tiên axit alginic và các muối của chúng được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, công nghệ sinh học và y học. Laminaran được biết đến như là những chất kháng ung thư, chất bảo vệ phóng xạ và chất đông lạnh. Fucoidan và những chất chuyển hóa phân tử thấp như mannitol, các axit tự do, polyphenol, các hợp chất iod, các vitamin và các acid béo được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và nghiên cứu y sinh học. 1.1.4. Rong Mơ Việt Nam Ở Việt Nam, các loài rong Mơ thuộc chi Sargassum, họ Sargassaceae, bộ Fucales, ngành rong nâu là nguồn lợi rong biển tự nhiên lớn nhất, chúng phân bố khá phổ biến ở ven biển và hải đảo phía Nam Việt Nam (từ Đà Nẵng đến Vũng Tàu và huyện Hà Tiên). Đây là nhóm rong có kích thước cá thể rất lớn, dài 6-8m, sinh lượng 12kg rong tươi/m2, hình dạng rất giống thực vật bậc cao. Chúng có khả năng phân bố rộng mọc trên các bờ biển đá, san hô chết…thích hợp từ khoảng phía trên mực triều thấp cho đến vài ba mét sâu. Từ lâu rong mơ được nhân dân ta sử dụng làm phân Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 7 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y to k lic .c bón, nấu lấy nước uống để chữa bệnh hoặc làm thức ăn cho gia súc, ngày nay rong mơ được dùng để chiết các polysaccharide dùng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Sinh lượng trung bình từ 2000-4000g/m2, có nơi đến 7000g/m2 như ở Hòn Chồng, Nha Trang [6]. 1.2. Tổng quan về enzyme [3],[5] 1.2.1. Khái niệm chung về enzyme Định nghĩa - Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein. - Enzyme có trong tế bào của mọi sinh vật. - Enzyme không những làm nhiệm vụ xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật (phản ứng của các quá trình trao đổi chất trong cơ thể sinh vật) gọi là in vivo mà còn xúc tác phản ứng ngoài cơ thể gọi là in vitro. - Cơ thể thiếu enzyme thì mọi quá trình chuyển hóa sẽ bị đình chỉ, sinh vật không thể sống, sinh sản, phát triển bình thường được. Sự sống của sinh vật sẽ không tồn tại. Phân loại enzyme Hội Nghị Sinh Hóa quốc tế lần thứ 5 tiến hành phân loại enzyme thành 6 nhóm lớn. - Nhóm 1: Oxydroreductase: xúc tác phản ứng oxy hóa khử. Ví dụ: Dehydrogenase, oxydase, peroxydase… - Nhóm 2: Transferase: xúc tác cho phản ứng chuyển vị một nhóm nào đó từ chất này sang chất khác. Ví dụ: Photpho – transferase. Amoniac – transferase. Metyl – transferase, Cacboxyl – transferase. - Nhóm 3: Hydrolase: xúc tác phản ứng thủy phân. Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 8 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y to k lic .c Ví dụ: Esterase: xúc tác thủy phân liên kiết este. Glucosidase: thủy phân liên kết glucoside trong glucid và glucoid. Peptidase: thủy phân liên kết peptid trong protein. Amidase: phản ứng thủy phân các amin. - Nhóm 4: Lyase: enzyme xúc tác quá trình phân cắt một nhóm nào đó ra khỏi hợp chất mà không cần có sự tham gia của nước. Ví dụ: Decacbonxylase. - Nhóm 5: Izomerase: xúc tác sự đồng phân chuyển hóa, chuyển dạng đồng phân này sang dạng đồng phân khác. - Nhóm 6: Ligase: xúc tác sự tổng hợp các chất hữu cơ nhờ năng lượng ATP và các chất tương tự. Ví dụ: Aspagagin – synthetase: enzyme tổng hợp Aspagagin. 1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của enzyme. Thường thì enzyme hoạt động trong khoảng nhiệt độ nhất định, khi tăng nhiệt độ quá giới hạn( thường 600C), phân tử protein trong enzyme bắt đầu biến tính, hoạt tính xúc tác sẽ giảm nhanh, vận tốc phản ứng giảm theo. Nhiệt độ mà tại đó v = vmax gọi nhiệt độ tối ưu top. Mỗi enzyme có một top. Trong phản ứng do enzyme xúc tác, chừng nào enzyme chưa bị biến tính thì vận tốc phản ứng tăng lên gấp 2 khi nhiệt độ tăng 100C. Ở nhiệt độ thấp, hoạt tính enzyme giảm, ở 00C hoạt tính enzyme không còn đáng kể, khi tăng nhiệt độ lên thì hoạt tính enzyme tăng trở lại, vì vậy ứng dụng bảo quản enzyme ở nhiệt độ lạnh( -200C đến -300C). Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 9 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y to k lic .c Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme Enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trường. Bất cứ sự thay đổi nhỏ nào của pH cũng làm thay đổi trạng thái ion hóa của enzyme và cơ chất. Do đó pH tác dụng rất lớn đến vận tốc phản ứng của enzyme. Mỗi enzyme có một pH mà tại đó vận tốc phản ứng của enzyme đạt cực đại. Người ta gọi đó là pH tối ưu của enzyme. Thông thường pHop của enzyme nằm ở vùng acid yếu hay kiềm yếu hay trung tính. Đặc biệt có một số enzyme có pHop nằm ở vùng rất acid như pepsin có pHop ≈ 1.5 - 2.5 hoặc rất kiềm như tripsin ≈ 8 – 9. Lý do pH ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của enzyme. Enzyme có nhóm định chức ion hóa (-) hoặc (+) như –COOH, -NH2, -OH do đó pH môi trường thay đổi sẽ làm thay đổi trạng thái ion hóa của các nhóm chức này, vì vậy làm thay đổi điện tích của enzyme, khi đó ái lực giữa enzyme và cơ chất giảm. Trong một số trường hợp các ion H+ và OH- có thể tham gia trực tiếp vào phản ứng làm pH môi trường thay đổi, điện tích H+ và OH- thay đổi, vận tốc phản ứng giảm xuống. Sau khi enzyme kết hợp với cơ chất sẽ tạo hợp chất trung gian ES. Sự biến đổi từ chất trung gian đến sản phẩm thì ứng với một dạng ion hóa đặc biệt của phức ES. Do đó nếu pH môi trường thay đổi sẽ ảnh hưởng đến dạng ion hóa của phức ES làm vận tốc phản ứng giảm. Ảnh hưởng của sự oxy hóa và bức xạ Một số enzyme trong cấu tạo có nhóm –SH, nhóm này rất quan trọng đối với phản ứng của enzyme. Nó là nhóm định chức ở trung tâm hoạt động và giữ cho enzyme có cấu hình thích hợp. Tuy nhiên –SH rất dễ bị oxy hóa bởi không khí tạo cầu S-S làm cho cấu hình của enzyme không còn phù hợp nữa, enzyme mất hoạt tính. Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 10 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y to k lic .c Enzyme còn bị ảnh hưởng bởi tia bức xạ, đặc biệt rất nhạy cảm với bức xạ có độ dài sóng thấp (năng lượng cao). Tia UV ảnh hưởng đến hiệu ứng của DNA, ảnh hưởng đến sự tổng hợp enzyme, dẫn đến hiệu ứng enzyme bị ảnh hưởng và vận tốc phản ứng thay đổi. 1.2.3. Tính chất của enzyme Tính chất lý hóa chung - Enzyme có cấu tạo là protein do đó chúng có đầy đủ tính chất của protein: dễ biến tính, dễ kết tủa, dễ mất hoạt tính sinh học… - Enzyme không thẩm tích qua màng bán thấm. - Enzyme không chịu được nhiệt độ cao, dễ biến tính bởi nhiệt độ cao và có thể mất hoạt tính xúc tác. - Tan trong nước, dung môi có cực khác, dung dịch muối loãng, glycerin. - Khối lượng phân tử lớn. Cƣờng lực xúc tác và cơ chế tác dụng của enzyme Cường lực xúc tác - Enzyme có cường lực xúc tác mạnh hơn rất nhiều so với xúc tác vô cơ. Ví dụ: phản ứng thủy phân H2O2: H2O2  H2O + O2. - Khi không có xúc tác thí năng lượng cần để hoạt hóa H2O2 là 18000 calo/phân tử gam. - Khi có xúc tác vô cơ (platin) năng lượng này là 11700 calo/ptg. - Khi có xúc tác là enzyme catalase năng lượng này là 5500 calo/ptg. - Người ta có thể khẳng định rằng enzyme tham gia vào vai trò chất xúc tác, có tác dụng làm giảm năng lượng hoạt hóa và làm cho phản ứng xảy ra nhanh chóng, dễ dàng. Cơ chế xúc tác của enzyme Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 11 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c
- Xem thêm -