BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐAI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY
NẤM Aspergillus fumigatus
SINH TỔNG HỢP PHYTASE CAO
Giáo viên hướng dẫn
Ts. Dƣơng Thị Hƣơng Giang
Th.S. Tạ Duy Tiên
Cần Thơ – 12/2012
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Văn Tính
Lớp:DA0866T1
MSSV: 3082635
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012
Trường ĐHCT
PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
TS. DƢƠNG THỊ HƢƠNG GIANG
SINH VIÊN THỰC HIỆN
NGUYỄN VĂN TÍNH
ThS. TẠ DUY TIÊN
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Cần Thơ, ngày tháng năm 2012
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012
Trường ĐHCT
LỜI CẢM TẠ
Sau gần 4,5 năm học tập và nghiên cứu tại Viện NC và PT Công nghệ Sinh học,
nay em đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp Đại Học chuyên ngành Công Nghệ Sinh
Học. Để có đƣợc thành quả nhƣ ngày hôm nay, em đã nhận đƣợc rất nhiều sự hỗ trợ,
động viên và giúp đỡ tận tình của cha mẹ, quý thầy cô, các anh chị và các bạn. Với
lòng biết ơn sâu sắc này em xin gửi lời cám ơn chân thành đến:
Cha mẹ những ngƣời đã luôn hết lòng ủng hộ con, giúp con có thể vững vàng và
tự tin trong học tập cũng nhƣ trong cuộc sống.
Ts. Dƣơng Thị Hƣơng Giang ngƣời đã hƣớng dẫn cả về chuyên môn cũng nhƣ là
đƣa ra những định hƣớng về nghiên cứu khoa học, ngƣời đã tận tình chỉ bảo, truyền
đạt kiến thức và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài tốt nghiệp này.
Ths. Tạ Duy Tiên và CN. Nguyễn Thị Xuân Dung cũng đã hƣớng dẫn tận tình về
chuyên môn và truyễn đạt nhiều kinh nghiệm để giúp em hoàn thành luận văn tốt
nghiệp này.
Các anh, chị quản lý các phòng thí nghiệm Thực Phẩm và Vi sinh vật thuộc Viện
NC-PT Công nghệ Sinh học là những ngƣời đã hỗ trợ trực tiếp trong việc hƣớng dẫn
thực hiện các quy trình tiến hành thí nghiệm và cách thức sử dụng trang thiết bị phục
vụ cho đề tài.
Các bạn sinh viên lớp Công Nghệ Sinh học Tiên Tiến Khóa 35 và lớp Vi sinh vật
Khóa 36 cùng làm việc trong phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme đã tận tình giúp đỡ
và động viên trong suốt thời gian qua.
PGs-Ts Nguyễn Hữu Hiệp cố vấn học tập và tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học
Tiên Tiến Khóa 34 đã quan tâm và chia sẻ và giúp đỡ em vƣợt qua những khó khăn
trong thời gian vừa qua.
XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN
Nguyễn Văn Tính
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012
Trường ĐHCT
TÓM LƢỢC
Ba chủng nấm mốc ET3, ET7 và ET8 được phân lập từ năm mẫu đất lúa ở Cần
Thơ, Sóc Trăng và Vĩnh Long thể hiện khả năng sinh phytase cao trên môi trường
chọn lọc M2. Trong đó, chủng ET3 có khả năng phát triển tốt ở nhiệt độ được chọn để
định danh bằng phương pháp quan sát hình thái và sinh học phân tử. Căn cứ trên kết
quả giải trình tự vùng 18S rRNA gene, ET3 được xác định là chủng A. fumigatus. Kết
quả khảo sát các điều kiện nuôi cấy cho thấy với mật số bào tử chủng vào môi trường
là 108 bào tử/ml, pH dung dịch khoáng bổ sung là bốn và nhiệt độ nuôi cấy 35oC và
sau thời gian nuôi cấy hai ngày thì chủng A. fumigatus vừa phân lập cho hoạt tính
cao nhất trên nguồn cơ chất phytate là bột mì. Từ kết quả trên quy trình nuôi cấy
chủng nấm mốc A. fumigatus để sinh tổng hợp phytase cao và thu nhận chế phẩm
phytase thô đã được thiết lập.
Từ khóa: nấm Aspergillus fumigatus, phytase ngoại bào, phytate.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
i
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012
Trường ĐHCT
MỤC LỤC
KÝ TÊN HỘI ĐỒNG .....................................................................................................
CẢM TẠ ..........................................................................................................................
TÓM LƢỢC ...................................................................................................................i
MỤC LỤC .................................................................................................................... ii
DANH SÁCH BẢNG ...................................................................................................vi
DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................. vii
TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................................... viii
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU ...................................................................................... ... 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu đề tài ....................................................................................................... 2
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ..................................................................... 3
2.1. Giới thiệu chung về phytic acid và muối phytate ............................................... 3
2.1.1. Cấu tạo phân tử ............................................................................................ 3
2.1.2. Ảnh hƣởng của phytate đến sự hấp thụ dinh dƣỡng ở ngƣời và động vật ... 4
2.1.3. Nguồn phytate trong tự nhiên ...................................................................... 5
2.2. Sơ lƣợc về enzyme phytase .................................................................................. 5
2.2.1. Phân loại và danh pháp ................................................................................ 5
2.2.2. Cơ chế phản ứng.......................................................................................... 7
2.2.3. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa ........................................................................ 8
2.2.4. Nguồn sản sinh phytase trong tự nhiên ...................................................... 10
2.2.5. Ứng dụng .................................................................................................... 11
2.3. Sơ lƣợc về nấm mốc Aspergillus fumigatus ...................................................... 12
2.3.1. Phân loại ..................................................................................................... 12
2.3.2. Đặc điểm cấu tạo hệ sợi và cơ quan sinh sản của A. fumigatus ................. 12
2.3.3. Đặc điểm khuẩn lạc của A. fumigatus ........................................................ 14
2.3.4. Các yếu tố ảnh hƣởng lên quá trình sinh tổng hợp phytase ....................... 14
2.4. Một số nghiên cứu về enzyme phytase từ A. fumigatus .................................. 16
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
iii
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012
Trường ĐHCT
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 17
3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu ...................................................................................... 17
3.1.1. Thời gian và địa điểm................................................................................. 17
3.1.2. Nguyên liệu ................................................................................................ 17
3.1.3. Thiết bị -dụng cụ và hóa chất ..................................................................... 17
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 18
3.2.1. Phân lập những dòng nấm mốc có khả năng sinh phytase......................... 18
3.2.2. Định danh dòng nấm mốc A. fumigatus ..................................................... 19
3.2.3. Chuẩn bị mốc giống và môi trƣờng nuôi cấy sinh tổng hợp phytase ......... 20
3.2.4. Trích ly phytase thô từ sinh khối nấm mốc A. fumigatus ........................... 20
3.2.5. Phƣơng pháp xác định hoạt tính phytase .................................................... 21
3.3. Khảo sát điều kiện môi trƣờng nuôi cấy. .......................................................... 23
3.3.1. Khảo sát sự ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy và cơ chất phytate ............ 23
3.3.2. Khảo sát sự ảnh hƣởng của mật số bào tử .................................................. 23
3.3.3. Khảo sát sự ảnh hƣởng của pH .................................................................. 24
3.3.4. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nhiệt độ........................................................... 24
3.3.5. Khảo sát sự ảnh hƣởng tƣơng tác của nhiệt độ và pH ............................... 24
3.3.6.Phƣơng pháp phân tích và xử lý số liệu ...................................................... 25
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................. 26
4.1. Phân lập những dòng nấm mốc có khả năng sinh phytase ............................ 26
4.2. Định danh dòng nấm mốc A. fumigatus ............................................................ 28
4.2.1. Quan sát dƣới kính hiển vi quang học........................................................ 28
4.2.2. Định danh bằng phƣơng pháp phân tử ....................................................... 29
4.3. Ảnh hƣởng của các điều liện nuôi cấy lên khả năng sinh phytase ................. 29
4.3.1. Ảnh hƣởng tƣơng tác của cơ chất và thời gian nuôi cấy............................ 29
4.3.2. Ảnh hƣởng của mật số bào tử .................................................................. 31
4.3.3. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng .................................................................. 32
4.3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ môi trƣờng ........................................................ 33
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
iv
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012
Trường ĐHCT
4.3.5. Ảnh hƣởng tƣơng tác của pH và nhiệt độ .................................................. 34
4.3.6. Quy trình nuôi cấy chủng A. fumigatus sinh phytase cao và thu nhận chế
phẩm phytase thô ...................................................................................... 35
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................. 37
5.1. Kết luận ................................................................................................................ 37
5.2. Đề nghị .................................................................................................................. 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 38
PHỤ LỤC .......................................................................................................................
PHỤ LỤC 1: CÁC PHƢƠNG PHÁP SINH HÓA – VI SINH
1. Phƣơng pháp nuôi cấy nấm A. fumigatus để thu sinh khối.
2. Các bƣớc chuẩn bị môi trƣờng Agar khoai tây gây giống và giữ giống (PGAPotato Glucose Agar).
3. Phƣơng pháp trữ nấm mốc
4. Các bƣớc chuẩn bị môi trƣờng bán rắn nuôi cấy nấm để thu dịch trích enzymes
thô.
PHỤ LỤC 2: SỐ LIỆU VÀ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ.
1. Số liệu về xây dựng đƣờng chuẩn phosphate (KH2PO4) (mM).
2. Kết quả phân tích thống kê các thí nghiệm
PHỤ LỤC 3: SỐ LIỆU THÔ CỦA CÁC THÍ NGHIỆM.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
v
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012
Trường ĐHCT
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1. Nhiệt độ tối ƣu của các chủng vi sinh ............................................................... 9
Bảng 2. Các địa điểm thu mẫu đất lúa .......................................................................... 19
Bảng 3. Xây dựng đƣờng chuẩn phosphate .................................................................. 21
Bảng 4. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng nấm mốc có khả năng sinh phytase .......... 27
Bảng 5. Giá trị OD của dung dịch KH2PO4 chuẩn. ............................................Phụ lục2
Bảng 6. Kết quả thống kê sự ảnh hƣởng tƣơng tác của nguồn cơ chất phytate và thời
gian ......................................................................................................Phụ lục 2
Bảng 7. Kết quả thống kê sự ảnh hƣởng mật số bào tử đến khả năng sinh tổng hợp
phytase của nấm A. fumigatus. ............................................................Phụ lục 2
Bảng 8. Kết quả thống kê sự ảnh hƣởng của pH dung dịch khoáng bổ sung đến khả
năng sinh tổng hợp phytase của chủng nấm A. fumigatus ..................Phụ lục 2
Bảng 9. Sự ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp phytase của chủng A.
fumigatus..............................................................................................Phụ lục 2
Bảng 10. Kết quả thống kê sự ảnh hƣởng tƣơng tác của pH và nhiệt độ đến khả năng
sinh tổng hợp phytase của nấm A. fumigatus. .....................................Phụ lục 2
Bảng 11. Số liệu thô hoạt tính phytase theo nguồn phytate và thời gian ủ. ......Phụ lục 3
Bảng 12. Số liệu thô hoạt tính phytase theo mật số bào tử ...............................Phụ lục 3
Bảng 13. Số liệu thô Hoạt tính phytase theo pH dung dịch khoáng bổ sung ...Phụ lục 3
Bảng 14. Số liệu thô hoạt tính phytase theo nhiệt độ ........................................Phụ lục 3
Bảng 15. Số liệu thô hoạt tính phytase theo pH và nhiệt độ ............................Phụ lục 3
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
vi
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012
Trường ĐHCT
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1. Cấu trúc hóa học của phytic acid ....................................................................... 3
Hình 2. Mô hình phytic acid với 5 nhóm xích đạo và 1 trục .......................................... 3
Hình 3. Histidine acid phosphatase ................................................................................ 6
Hình 4. Purple acid phosphatse ...................................................................................... 6
Hình 5. β-propeller phytase ............................................................................................ 7
Hình 6. Phản ứng xúc tác của phytase... ......................................................................... 8
Hình 7. Khuẩn ty dinh dƣỡng và khuẩn ty sinh sản của A. fumigatus ........................ 13
Hình 8. Cấu tạo cơ quan sinh sản của Aspergillus fumigatus ...................................... 13
Hình 9. Khuẩn lạc của A. fumigatus ............................................................................. 14
Hình 10. Qui trình thu nhận phytase thô từ A. fumigatus ............................................. 20
Hình 11. Khả năng tạo halo của 3 chủng nấm mốc ET3, ET7, ET8 trên M2 ở 30oC 26
Hình 12. Khả năng tạo halo của 3 chủng nấm mốc ở 45oC......................................... 27
Hình 13. Khuẩn ty dinh dƣỡng của chủng nấm mốc ET3 ........................................... 28
Hình 14. Khuẩn ty sinh sản của chủng nấm mốc ET 3 ............................................... 28
Hình 15. Kết quả định danh dòng nấm mốc ET3 dựa vào trình tự ITS ....................... 29
Hình 16. Biểu đồ hoạt tính phytase của A. fumigatus theo thời gian và nguồn phytate
bổ sung. ........................................................................................................ 30
Hình 17. Biểu đồ hoạt tính phytase của A. fumigatus theo mật số bào tử ................... 32
Hình 18. Biểu đồ hoạt tính phytase của A. fumigatus theo pH môi trƣờng ............... 32
Hình 19. Biểu đồ hoạt tính phytase của A. fumigatus theo nhiệt độ ........................... 33
Hình 20. Biểu đồ Hoạt tính phytase của A. fumigatus theo pH và nhiệt độ ................ 35
Hình 21. Quy trình nuôi cấy và thu nhận phytase thô của chủng A. fumigatus .......... 36
Hình 22. Biểu đồ đƣờng chuẩn phosphate (KH2PO4) ......................................Phụ lục 2
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
vii
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012
Trường ĐHCT
CÁC TỪ VIẾT TẮT
ATP
Adenosine-5'-triphosphate
DNA
Deoxyribonucleic acid
NADPH
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
PGA
Potato glucose agar
RNA
Ribonucleic acid
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
viii
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012
Trường ĐHCT
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Phosphorus (P) là nguồn dinh dưỡng thiết yếu cho sinh vật bởi vì nó là thành
phần cấu trúc quan trọng của nhiều đại phân tử sinh học như DNA, RNA, protein và
màng phospholipid của tế bào và các phân tử cao năng lượng như ATP và NADPH
(Jahnke, 2000). Dạng tồn tại chính của phosphorus trong thực vật là phytate (muối của
phytic acid). Người và các động vật ăn cỏ dạ dày đơn không thể sử dụng phosphorus
ở dạng này vì thiếu enzyme phytase (Holm et al., 2002). Do đó, phần lớn phytic acid
trong thức ăn sẽ không được hấp thụ mà thải qua phân ra ngoài môi trường dẫn đến ô
nhiễm phosphorus hữu cơ cho nguồn nước, đặc biệt ở những khu vực chăn nuôi lợn và
gia cầm ở quy mô lớn (Sharpley et al., 1993; Parry, 1998). Ngoài ra, phytate còn được
xem là yếu tố kháng dinh dưỡng khi nó tương tác với các chất khoáng, protein và
vitamin dẫn đến làm giảm giá trị dinh dưỡng của những thực phẩm hay thức ăn chăn
nuôi có nguồn gốc từ ngũ cốc và các cây họ đậu (Fredlund et al., 2006; Lopez et al.,
2002).
Việc bổ sung enzyme phytase vào thức ăn để giúp tiêu hóa tốt phytate là giải
pháp hiệu quả cho các vấn đề trên. Thực sự, enzyme phytase có khả năng xúc tác phản
ứng thủy phân phytate thành đường inositol và muối của ortho-phosphoric acid, khi đó
phosphorus trở nên dễ hấp thu hơn. Nelson (1967) đã chứng minh phytase có thể giúp
tăng tiêu hóa phosphorus trong thức ăn của gia cầm. Sau đó, theo Nguyễn Thu Quyên
và cs. (2011) việc bổ sung phytase vào khẩu phần ăn cho gà Broiler có ảnh hưởng tích
cực đến khả năng khoáng hóa xương cũng như cải thiện khả năng tiêu hóa Ca, P của
gà Broiler. Ngoài ra, các dưỡng chất khác khi tạo phức với phytate cũng trở nên dễ
tiêu hoá hơn, từ đó làm tăng giá trị dinh dưỡng của thức ăn và giảm ô nhiễm môi
trường. Enzyme phytase được tìm thấy ở thực vật, động vật và vi sinh vật. Tuy nhiên,
vi sinh vật được xem là nguồn sản xuất phytase chính cho việc nghiên cứu và ứng
dụng của enzyme phytase. Nhiều nghiên cứu cho thấy enzyme này có ở vi khuẩn
(Basillus subtilis, Escherichia coli), nấm men (Sacharomyces cerevisiae) và nấm mốc.
Trong đó, nấm mốc được xem là nguồn sản xuất phytase dồi dào và phong phú với
nhiều loài trong chi Aspergillus như A. ficuum, A. carbonarius, A. oryzae, A. niger, và
A. fumigatus (Liu et al., 1999; Shimizu, 1993; Volfova et al., 1994). So với phytase từ
các loài khác trong chi Aspergillus thì phytase từ A. fumigatus có nhiều đặc tính nổi
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
1
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012
Trường ĐHCT
trội hơn như tính đặc hiệu với cơ chất rộng, vùng pH tối ưu 2,5 và 5,5, có khả năng hồi
tính cao sau khi biến tính ở nhiệt độ cao (Pasamontes et al., 1997; Wyss et al., 1998).
Với những ưu điểm này, phytase từ A. fumigatus được các nhà khoa học chú ý và
nghiên cứu trong những năm gần đây. Tuy nhiên, ở Việt Nam có ít tài liệu nghiên cứu
về enzyme từ loài nấm mốc này. Do đó, với tính cấp thiết trong nghiên cứu và ứng
dụng, đề tài “Phân lập và khảo sát môi trường nuôi cấy nấm Aspergillus fumigatus
sinh tổng hợp phytase cao” được thực hiện với mong muốn sử dụng có hiệu quả
enzyme phytase từ loài nấm mốc này.
1.2. Mục tiêu đề tài
- Phân lập được chủng nấm mốc A. fumigatus với khả năng sinh enzyme phytase
có hoạt tính cao.
- Xác định các điều kiện môi trường nuôi cấy thích hợp để thu nhận enzyme
phytase có hoạt tính cao từ chủng A. fumigatus vừa phân lập.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
2
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012
Trường ĐHCT
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về phytic acid và muối phytate
2.1.1. Cấu tạo phân tử
Phytic acid có công thức phân tử là C6H18O24P6. Khối lượng phân tử là 660,04
g/mol.
Hình 1. Cấu trúc hóa học của phytic acid
( Nguồn: Weaver và Kannan, 2002)
Phân tử phytic acid hay myo-inositol(1,2,3,4,5,6) hexakisphosphate gồm 6 nhóm
phosphate liên kết với vòng inositol. Phytic acid là một đa phối tử có thể liên kết với
nhiều nguyên tử kim loại. Mỗi nhóm phosphate bị ester hóa với một nhóm –OH của
vòng inositol, các nhóm này tùy vào pH của môi trường có thể phân ly cho proton, có
tổng cộng 12 proton trên các nhóm phosphate của phytic acid. Tính acid của các
proton này biến đổi từ acid rất mạnh đến acid rất yếu (pKa có thể đến 9,4).
Hình 2. Mô hình phytic acid với 5 nhóm xích đạo và 1 trục
(Nguồn: Bohn, et al., 2008)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
3
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012
Trường ĐHCT
Trong phổ pH từ 0,5 đến 10,5 phytic acid có cấu hình không gian bền vững với
một trục và năm nhóm xích đạo. Ngược lại, ở giá trị pH cao hơn phân tử phytic acid sẽ
hổ biến sang cấu hình ngược với năm trục và một nhóm xích đạo (Volkmann et al.,
2002).
Phytate là muối của phytic acid inositol hexakisphosphate (IP6). Inositol penta(IP5), tetra- (IP4) và triphosphate (IP3) cũng được gọi là phytate.
2.1.2. Ảnh hƣởng của phytate đến sự hấp thụ dinh dƣỡng ở ngƣời và động vật
2.1.2.1. Ảnh hưởng lên sự hấp thụ chất khoáng
Ở người và động vật dạ dày đơn, sự hiện diện của phytate trong khẩu phần ăn
làm giảm sự hấp thụ các chất khoáng như kẽm, sắt, magnesium, calcium (Ca), đồng,
manganese (Konietzny và Greiner, 2003; Lopez et al., 2002). Nguyên nhân là do phân
tử phytate hình thành phức hệ không tan với những ion kim loại trên. Những phức hệ
này không được hấp thụ bởi hệ tiêu hóa người.
2.1.2.2. Ảnh hưởng lên sự tiêu hóa protein
Phytate có thể hình thành phức với một vài protein và cản trở sự thủy phân
protein. Theo Cheryan (1980) thì sự tương tác của phytate và protein phụ thuộc vào
pH. Nếu giá trị pH thấp hơn điểm đẳng điện của protein thì những nhóm phosphate
của phytate hình thành liên kết ion với những nhóm cation của các amino acid mang
tính kiềm như arginine, histidine, lysine (Cosgrove, 1966). Sự hình thành những phức
hệ này sẽ làm thay đổi cấu trúc của protein từ đó ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme
cũng như sự hòa tan và tiêu hóa protein.
2.1.2.3. Ảnh hưởng lên sự biến dưỡng carbohydrate
Ở người, phytate làm giảm sự chuyển hóa đường máu (Lee et al., 2006) bởi vì
phytate có thể trực tiếp tạo phức với carbohydrate bằng liên kết hydro hoặc gián tiếp
liên kết với những protein có gắn carbohydrate này (Rickard và Thompson, 1997). Kết
quả là làm giảm sự hòa tan của carbohydrate và gây bất lợi đến sự biến dưỡng và hấp
thụ glucose.
2.1.2.4. Ảnh hưởng lên sự biến dưỡng lipid
Lipophytin là một phức chất hình thành từ lipid và những dẫn xuất muối phytate,
cùng với những chất dinh dưỡng khác (Vohra và Satanarayana, 2003). Theo Leeson
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
4
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012
Trường ĐHCT
(1993) muối calcium phytate có thể hạn chế đáng kể quá trình sử dụng năng lượng từ
các nguồn lipid dự trữ.
2.1.3. Nguồn phytate trong tự nhiên
Trong tự nhiên phytic acid tồn tại chủ yếu dưới dạng muối phytate. Phytate chứa
khoảng 60-90
tổng lượng phosphorus trong thực vật (Reddy et al., 1982). Phytate
hiện diện chủ yếu trong hạt ngũ cốc và cây họ đậu, hạt có dầu, phấn hoa và hạnh nhân.
Lượng phytate cao nhất trong các loại ngũ cốc, bắp (0,83 - 2,22 ) và trong các loại
hạt đậu (5,92 - 9,15 ). Vì vậy, phytate là thành phần phổ biến của những thực phẩm
có nguồn gốc từ thực vật như bánh mì (1,5-7,5 mg phytic acid/g) (Rosa et al, 1999).
Phytate được hình thành trong quá trình trưởng thành và giai đoạn miên trạng ở hạt và
nó chiếm 60-90
tổng lượng phosphate trong hạt (Loewus, 2002).
2.2. Sơ lƣợc về enzyme phytase
2.2.1. Phân loại và danh pháp
Phytase là nhóm enzyme có khả năng thủy phân liên kết ester giữa gốc phosphate
và vòng inositol. Dựa trên vị trí carbon bắt đầu quá trình khử phosphorus này của
phytate,
phytase
được
chia
ra
thành
3
nhóm:
3-phytases
(myo-
inositolhexakisphosphate-3-phosphohydrolase, EC 3.1.3.8), 6-phytases (myo-inositol
hexakisphosphate 6-phosphohydrolase, EC 3.1.3.26) và 5-phytases (myo-inositol
hexakisphosphate 5-phosphohydrolase, EC 3.1.3.72).
3-phytase có nguồn gốc từ nấm mốc và vi khuẩn. Enzyme này phân cắt gốc
phosphate ở vị trí C1 và C3 (Sajidan et al., 2004), trong khi đó 6-phytase thường được
tìm thấy ở hạt lúa và những hạt có dầu ở thực vật bậc cao. 5-Phytase được tìm thấy ở
đậu, cỏ linh lăng, đậu Hà lan và vi khuẩn Selenomonas ruminantium sống trong đường
ruột ở động vật nhai lại (Chu et al., 2004).
Dựa trên pH tối ưu thì phytase được chia thành hai loại chính là acid phytase và
alkaline phytase. Trong đó acid phytase gồm có những enzyme thuộc vào histidine
acid phosphatase (HAP), purple acid phosphatase (PAP) và protein tyrosine
phosphatase (PTP) giống như lớp phosphatase. Alkaline phytase chỉ có β-propeller
phytase (BPP) từ Bacillus (Kevoruo, et al., 1998).
2.2.1.1. Histidine acid phosphatase (EC 3.1.3.8)
Các HAP được tìm thấy nhiều ở nấm mốc, vi khuẩn và thực vật (Wyss et al.,
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
5
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012
Trường ĐHCT
1999). Chúng có tâm hoạt động với kiểu trình tự N-termnal là RHGXRXP mang tính
bảo tồn cao và kiểu C-terminal là HD, đây là đặc điểm riêng của lớp enzyme này
(Etten et al., 1991).
Nguyên tắc xúc tác của lớp enzyme này bao gồm hai bước: đầu tiên là sự tấn
công thân hạch trên nguyên tử phosphorus bởi gốc histidine trong tâm hoạt động, sau
đó là sự thủy phân hợp chất trung gian phospho-histidine (Vicent et al., 1992).
Hình 3. Histidine acid phosphatase
(Nguồn: Edward và Abul, 2003)
2.2.1.2. Purple acid phosphatase (PAP)
Hình 4. Purple acid phosphatase
(Nguồn: http://www.rcc.uq.edu.au,)
Loại phytase này được phân lập từ lá mầm của đậu nành đang nảy mầm
(Hegeman và Crabau, 2001). Theo Schenk et al. (2000) PAP có nguồn gốc từ nhiều
loại sinh vật khác nhau như thực vật, động vật, nấm mốc và vi khuẩn. Tâm hoạt động
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
6
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012
Trường ĐHCT
của lớp enzyme này cần một hoặc nhiều ion kim loại làm cofactor để giúp enzyme
hoạt động. Loại enzyme này có 5 kiểu peptide phổ biến (DxG/GDx2Y/GNH(E,D)Vx2H/GHXH) chứa 7 gốc acid amin có khả năng liên kết với ion kim
loại.
2.2.1.3. β-propeller phytase (BPP)
BPP được phân lập từ Bacillus và một số loài vi khuẩn khác. Loại phytase này
cần ion kim loại cho hoạt tính xúc tác và sự bền nhiệt. Phân tử enzyme BPP có cấu
trúc sáu mặt phẳng β xếp thành dạng cánh quạt β-propeller và liên kết với một chân
vịt gồm 6 cánh (Ha et at., 2000; Shin et at., 2001). Ion calcium tạo một môi trường
tĩnh điện phù hợp trong domain gắn cơ chất, hổ trợ cho phân tử myo-inositol
hexakisphosphate tương tác với tâm hoạt động của enzyme. Các nghiên cứu động học
về enzyme này cho thấy sự xúc tác phản ứng thủy phân calcium-phytate tối ưu trong
khoảng pH 7-8 (Oh et at., 2001).
Hình 5. β-propeller phytase
(Nguồn: Edward và Abul, 2003)
2.2.2. Cơ chế phản ứng
Phytase thủy phân phytic acid và muối phytate giải phóng ra các gốc phosphate
(PO4-3), inositol, nguyên tố khoáng, protein, amino acid, tinh bột và liposome. Với
phytic acid thì phytase có thể phân cắt cho ra các nhóm phosphate với tỉ lệ khác nhau.
Tất cả các phytase có nguồn gốc từ nấm đều có thể giải phóng 5 hoặc 6 gốc phosphate,
sản phẩm cuối cùng là myo-inositol 2-monophosphate. 3-phytase khởi đầu thủy giải ở
vị trí D-3 với sản phẩm thứ cấp là (1,2,4,5,6)P5. Trong khi đó 6-phytase khởi đầu thủy
giải ở L-6 tạo thành L-Inositol (1,2,3,4,5)P5 là sản phẩm thứ cấp thứ nhất. Còn alkaline
phytase từ phấn hoa Lily bắt đầu thủy giải ở D-5 và qua 2 bước khử phosphorus tạo
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
7
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012
Trường ĐHCT
thành Innositol (1,2,3)P3 là sản phẩm cuối cùng.
Hình 6. Phản ứng xúc tác của phytase
(Nguồn: Yao et al., 2011)
2.2.3. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa
2.2.3.1. pH tối ưu
Acid phytase có pH tối ưu là 5. Nhiều nghiên cứu cho thấy đa phần các phytase
là acid phytase có pH tối ưu trong khoảng 4,5-6,0. Còn pH tối ưu của alkaline phytase
là 8,0 từ những nghiên cứu về phytase từ hạt đậu (Scott, 1991), phấn hoa lily (Baldi et
al., 1988), và cây hương bồ (Hara et al., 1985). Phytase từ vi khuẩn có pH tối ưu trong
khoảng 6,5 - 7,5, theo Powar và Jagannathan (1982) thì phytase từ Bacillus có pH tối
ưu 6,0-8,0. Các phytase có nguồn gốc thực vật có pH tối ưu trong khoảng 4,0 - 7,5.
Tuy nhiên, theo Kerovuo (2000) đa số phytase thực vật pH tối ưu trong khoảng pH 4,0
- 5,6. Giá trị pH tối ưu của các phytase nấm men tùy thuộc vào nhiệt độ (Nakamura et
al., 2000) và thường nằm trong khoảng 4,0 – 5,0. Không giống như tất cả các phytase
từ nấm khác, phytase từ A. fumigatus có phổ pH tối ưu khá rộng 4,0-7,3 (Wyss et al.,
1999).
2.2.3.2. Nhiệt độ tối ưu
Nhiệt độ tối ưu cho phytase nói chung từ 35-77oC. Nhiệt độ tối ưu của phytase từ
thực vật thấp hơn so với phytase vi sinh vật. Nhìn chung các phytase có khả năng chịu
nhiệt cao, đặc biệt trong trường hợp của phytase từ A. fumigatus có độ bền nhiệt rất
cao. Nghiên cứu của Pasamontes et al. (1997) cho thấy phytase từ loài nấm mốc này
có thể chịu được nhiệt độ lên đến 100oC trong 20 phút mà hoạt tính xúc tác vẫn còn
giữ được 90
so với hoạt tính ban đầu.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
8
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012
Trường ĐHCT
Bảng 1. Nhiệt độ tối ƣu của các chủng vi sinh vật (Vohra et al., 2004)
Phân loại
Vi khuẩn
Nấm
men
Nấm
mốc
Chủng
Nhiệt độ tối
ƣu (0C)
Aerobacter aerogenes
25
Bacillus sp. DS11
70
Bacillus subtilis
55
Entergobacter sp. 4
50
Escherichia coli
55
Klebsiella aerogenes
60
Lactobacillus amylovorus
45
Pseudomonas sp.
40
Selenomonas ruminantium
50-55
Arxula adeninivorans
75-80
Hanseniaspora valbyensis
60
Pichia anomala
60
P. rhodanensis
70-75
Schwanniomyces occidentalis
75-80
Aspergillus careus
40
A. cacbonarius
53
A. niger 92
55
A. niger NRRL 3135
58
A. fumigatus
55
2.2.3.3. Ảnh hưởng của cơ chất
Phytase có phổ cơ chất đặc hiệu rộng bao gồm phytate, adenosine
monophosphate (AMP) adenosine diphosphate (ADP), adenosine triphosphate (ATP),
guanosine monophosphate (GMP), guanosin triphosphate (GTP), nicotilamide-adenine
dinucleotide phosphate, p-nitrophenyl phosphate, phenyl phosphate, 1-naphthyl
phosphate, 2-naphthyl-phosphate, fructose 1,6-diphosphate, fructose 6-phosphate,
glucose 1-phosphate, glucose 6-phosphate, galactose 1-phosphate, a-glycerophosphate,
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
9
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012
Trường ĐHCT
b-glycerophosphate, pyridoxalphosphate, o-phospho-l-serine và pyrophosphate. Trong
đó, các phytase có tính đặc hiệu cao với phytate như aicd phytase từ E. coli (Greiner et
al., 1993), A. niger, A. terreus (Wyss et al., 1999) và alkaline phytase từ B. Subtilis
(Powar and Jaganathan, 1982), phấn hoa lily (Barientos et al., 1994) (phytase source).
Các phytase từ A. fumigatus, E. nidulans, và M. thermophia thể hiện sự đặc hiệu
cơ chất rộng, trong khi các phytase từ A. niger, A. terrus CBS, và E.coli có tính đặc
hiệu cao hơn đối với phytic acid (Wyss et al., 1999). Nồng độ cơ chất quá cao sẽ gây
ức chế enzyme. Ullah và Cummin (1998) cho biết nồng độ myo-inositol-P6 vượt qua
mức 2 nmol/L sẽ gây hiện tượng ức chế.
2.2.4. Nguồn sản sinh phytase trong tự nhiên
2.2.4.1. Phytase từ vi sinh vật
Nguồn cung cấp phytase ứng dụng chủ yếu là từ vi sinh vật. Đa số các phytase từ
vi khuẩn là những phytase nội bào. Ngược lại, phần lớn các phytase ngoại bào được
tìm thấy ở nấm sợi trong đó có 28 nguồn sản xuất phytase là từ chi Aspergillus. Loài
Aspergillus niger được xem là nguồn sản xuất phytase tốt nhất (Gargova et al., 1997).
Phytase cũng được tìm thấy ở các vi khuẩn như Pseudomonas sp. (Richardson và
Hadobas, 1997), Bacillus subtilis (Powar và Jaganathan, 1982), Bacillus sp. DS11
(Kim et al., 1998), Klebsiella sp. (Tambe et al., 1994; Greiner et al., 1997), E. coli
(Greiner et al., 1993) and Enterobacter (Yoon et al., 1996). Trong đó chỉ có phytase
những loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus và Enterobacteria là những phytase ngoại bào.
Ngoài ra, nấm men cũng là nguồn sản sinh phytase. S. Cerevisiae (Nakamura et al.,
2000) and Schwanniomyces castellii (Lambrechts et al., 1992) có khả năng sản xuất cả
phytase ngoại bào và nội bào.
2.2.4.2. Phytase từ thực vật
Phytase xuất hiện hầu hết ở hạt và phấn hoa ở thực vật bậc cao như ngũ cốc, cây
họ đậu, hạt cây có dầu. Phytase có nhiệm vụ phân giải phytate trong quá trình nảy
mầm nhằm cung cấp phosphate, chất khoáng và đường myo-inositol giúp cây sinh
trưởng và phát triển (Reddy et al., 1989). Hoạt tính phytase cao nhất được báo cáo ở
ngũ cốc như lúa mạch đen, lúa mạch và lúa mì.
2.3.4.3. Phytase từ mô động vật
Báo cáo đầu tiên về phytase từ động vật được tìm thấy từ gan và máu của bò con
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
10
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
- Xem thêm -