Tài liệu Phân lập và khảo sát môi trƣờng nuôi cấy nấm aspergillus fumigatus sinh tổng hợp phytase cao

  • Số trang: 68 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 125 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Tham gia: 10/11/2015

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐAI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY NẤM Aspergillus fumigatus SINH TỔNG HỢP PHYTASE CAO Giáo viên hướng dẫn Ts. Dƣơng Thị Hƣơng Giang Th.S. Tạ Duy Tiên Cần Thơ – 12/2012 Sinh viên thực hiện Nguyễn Văn Tính Lớp:DA0866T1 MSSV: 3082635 Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012 Trường ĐHCT PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN TS. DƢƠNG THỊ HƢƠNG GIANG SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN VĂN TÍNH ThS. TẠ DUY TIÊN DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. Cần Thơ, ngày tháng năm 2012 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012 Trường ĐHCT LỜI CẢM TẠ Sau gần 4,5 năm học tập và nghiên cứu tại Viện NC và PT Công nghệ Sinh học, nay em đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp Đại Học chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học. Để có đƣợc thành quả nhƣ ngày hôm nay, em đã nhận đƣợc rất nhiều sự hỗ trợ, động viên và giúp đỡ tận tình của cha mẹ, quý thầy cô, các anh chị và các bạn. Với lòng biết ơn sâu sắc này em xin gửi lời cám ơn chân thành đến: Cha mẹ những ngƣời đã luôn hết lòng ủng hộ con, giúp con có thể vững vàng và tự tin trong học tập cũng nhƣ trong cuộc sống. Ts. Dƣơng Thị Hƣơng Giang ngƣời đã hƣớng dẫn cả về chuyên môn cũng nhƣ là đƣa ra những định hƣớng về nghiên cứu khoa học, ngƣời đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài tốt nghiệp này. Ths. Tạ Duy Tiên và CN. Nguyễn Thị Xuân Dung cũng đã hƣớng dẫn tận tình về chuyên môn và truyễn đạt nhiều kinh nghiệm để giúp em hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Các anh, chị quản lý các phòng thí nghiệm Thực Phẩm và Vi sinh vật thuộc Viện NC-PT Công nghệ Sinh học là những ngƣời đã hỗ trợ trực tiếp trong việc hƣớng dẫn thực hiện các quy trình tiến hành thí nghiệm và cách thức sử dụng trang thiết bị phục vụ cho đề tài. Các bạn sinh viên lớp Công Nghệ Sinh học Tiên Tiến Khóa 35 và lớp Vi sinh vật Khóa 36 cùng làm việc trong phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme đã tận tình giúp đỡ và động viên trong suốt thời gian qua. PGs-Ts Nguyễn Hữu Hiệp cố vấn học tập và tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học Tiên Tiến Khóa 34 đã quan tâm và chia sẻ và giúp đỡ em vƣợt qua những khó khăn trong thời gian vừa qua. XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN Nguyễn Văn Tính Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012 Trường ĐHCT TÓM LƢỢC Ba chủng nấm mốc ET3, ET7 và ET8 được phân lập từ năm mẫu đất lúa ở Cần Thơ, Sóc Trăng và Vĩnh Long thể hiện khả năng sinh phytase cao trên môi trường chọn lọc M2. Trong đó, chủng ET3 có khả năng phát triển tốt ở nhiệt độ được chọn để định danh bằng phương pháp quan sát hình thái và sinh học phân tử. Căn cứ trên kết quả giải trình tự vùng 18S rRNA gene, ET3 được xác định là chủng A. fumigatus. Kết quả khảo sát các điều kiện nuôi cấy cho thấy với mật số bào tử chủng vào môi trường là 108 bào tử/ml, pH dung dịch khoáng bổ sung là bốn và nhiệt độ nuôi cấy 35oC và sau thời gian nuôi cấy hai ngày thì chủng A. fumigatus vừa phân lập cho hoạt tính cao nhất trên nguồn cơ chất phytate là bột mì. Từ kết quả trên quy trình nuôi cấy chủng nấm mốc A. fumigatus để sinh tổng hợp phytase cao và thu nhận chế phẩm phytase thô đã được thiết lập. Từ khóa: nấm Aspergillus fumigatus, phytase ngoại bào, phytate. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012 Trường ĐHCT MỤC LỤC KÝ TÊN HỘI ĐỒNG ..................................................................................................... CẢM TẠ .......................................................................................................................... TÓM LƢỢC ...................................................................................................................i MỤC LỤC .................................................................................................................... ii DANH SÁCH BẢNG ...................................................................................................vi DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................. vii TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................................... viii CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU ...................................................................................... ... 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu đề tài ....................................................................................................... 2 CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ..................................................................... 3 2.1. Giới thiệu chung về phytic acid và muối phytate ............................................... 3 2.1.1. Cấu tạo phân tử ............................................................................................ 3 2.1.2. Ảnh hƣởng của phytate đến sự hấp thụ dinh dƣỡng ở ngƣời và động vật ... 4 2.1.3. Nguồn phytate trong tự nhiên ...................................................................... 5 2.2. Sơ lƣợc về enzyme phytase .................................................................................. 5 2.2.1. Phân loại và danh pháp ................................................................................ 5 2.2.2. Cơ chế phản ứng.......................................................................................... 7 2.2.3. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa ........................................................................ 8 2.2.4. Nguồn sản sinh phytase trong tự nhiên ...................................................... 10 2.2.5. Ứng dụng .................................................................................................... 11 2.3. Sơ lƣợc về nấm mốc Aspergillus fumigatus ...................................................... 12 2.3.1. Phân loại ..................................................................................................... 12 2.3.2. Đặc điểm cấu tạo hệ sợi và cơ quan sinh sản của A. fumigatus ................. 12 2.3.3. Đặc điểm khuẩn lạc của A. fumigatus ........................................................ 14 2.3.4. Các yếu tố ảnh hƣởng lên quá trình sinh tổng hợp phytase ....................... 14 2.4. Một số nghiên cứu về enzyme phytase từ A. fumigatus .................................. 16 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012 Trường ĐHCT CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 17 3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu ...................................................................................... 17 3.1.1. Thời gian và địa điểm................................................................................. 17 3.1.2. Nguyên liệu ................................................................................................ 17 3.1.3. Thiết bị -dụng cụ và hóa chất ..................................................................... 17 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 18 3.2.1. Phân lập những dòng nấm mốc có khả năng sinh phytase......................... 18 3.2.2. Định danh dòng nấm mốc A. fumigatus ..................................................... 19 3.2.3. Chuẩn bị mốc giống và môi trƣờng nuôi cấy sinh tổng hợp phytase ......... 20 3.2.4. Trích ly phytase thô từ sinh khối nấm mốc A. fumigatus ........................... 20 3.2.5. Phƣơng pháp xác định hoạt tính phytase .................................................... 21 3.3. Khảo sát điều kiện môi trƣờng nuôi cấy. .......................................................... 23 3.3.1. Khảo sát sự ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy và cơ chất phytate ............ 23 3.3.2. Khảo sát sự ảnh hƣởng của mật số bào tử .................................................. 23 3.3.3. Khảo sát sự ảnh hƣởng của pH .................................................................. 24 3.3.4. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nhiệt độ........................................................... 24 3.3.5. Khảo sát sự ảnh hƣởng tƣơng tác của nhiệt độ và pH ............................... 24 3.3.6.Phƣơng pháp phân tích và xử lý số liệu ...................................................... 25 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................. 26 4.1. Phân lập những dòng nấm mốc có khả năng sinh phytase ............................ 26 4.2. Định danh dòng nấm mốc A. fumigatus ............................................................ 28 4.2.1. Quan sát dƣới kính hiển vi quang học........................................................ 28 4.2.2. Định danh bằng phƣơng pháp phân tử ....................................................... 29 4.3. Ảnh hƣởng của các điều liện nuôi cấy lên khả năng sinh phytase ................. 29 4.3.1. Ảnh hƣởng tƣơng tác của cơ chất và thời gian nuôi cấy............................ 29 4.3.2. Ảnh hƣởng của mật số bào tử .................................................................. 31 4.3.3. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng .................................................................. 32 4.3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ môi trƣờng ........................................................ 33 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012 Trường ĐHCT 4.3.5. Ảnh hƣởng tƣơng tác của pH và nhiệt độ .................................................. 34 4.3.6. Quy trình nuôi cấy chủng A. fumigatus sinh phytase cao và thu nhận chế phẩm phytase thô ...................................................................................... 35 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................. 37 5.1. Kết luận ................................................................................................................ 37 5.2. Đề nghị .................................................................................................................. 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 38 PHỤ LỤC ....................................................................................................................... PHỤ LỤC 1: CÁC PHƢƠNG PHÁP SINH HÓA – VI SINH 1. Phƣơng pháp nuôi cấy nấm A. fumigatus để thu sinh khối. 2. Các bƣớc chuẩn bị môi trƣờng Agar khoai tây gây giống và giữ giống (PGAPotato Glucose Agar). 3. Phƣơng pháp trữ nấm mốc 4. Các bƣớc chuẩn bị môi trƣờng bán rắn nuôi cấy nấm để thu dịch trích enzymes thô. PHỤ LỤC 2: SỐ LIỆU VÀ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ. 1. Số liệu về xây dựng đƣờng chuẩn phosphate (KH2PO4) (mM). 2. Kết quả phân tích thống kê các thí nghiệm PHỤ LỤC 3: SỐ LIỆU THÔ CỦA CÁC THÍ NGHIỆM. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Nhiệt độ tối ƣu của các chủng vi sinh ............................................................... 9 Bảng 2. Các địa điểm thu mẫu đất lúa .......................................................................... 19 Bảng 3. Xây dựng đƣờng chuẩn phosphate .................................................................. 21 Bảng 4. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng nấm mốc có khả năng sinh phytase .......... 27 Bảng 5. Giá trị OD của dung dịch KH2PO4 chuẩn. ............................................Phụ lục2 Bảng 6. Kết quả thống kê sự ảnh hƣởng tƣơng tác của nguồn cơ chất phytate và thời gian ......................................................................................................Phụ lục 2 Bảng 7. Kết quả thống kê sự ảnh hƣởng mật số bào tử đến khả năng sinh tổng hợp phytase của nấm A. fumigatus. ............................................................Phụ lục 2 Bảng 8. Kết quả thống kê sự ảnh hƣởng của pH dung dịch khoáng bổ sung đến khả năng sinh tổng hợp phytase của chủng nấm A. fumigatus ..................Phụ lục 2 Bảng 9. Sự ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp phytase của chủng A. fumigatus..............................................................................................Phụ lục 2 Bảng 10. Kết quả thống kê sự ảnh hƣởng tƣơng tác của pH và nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp phytase của nấm A. fumigatus. .....................................Phụ lục 2 Bảng 11. Số liệu thô hoạt tính phytase theo nguồn phytate và thời gian ủ. ......Phụ lục 3 Bảng 12. Số liệu thô hoạt tính phytase theo mật số bào tử ...............................Phụ lục 3 Bảng 13. Số liệu thô Hoạt tính phytase theo pH dung dịch khoáng bổ sung ...Phụ lục 3 Bảng 14. Số liệu thô hoạt tính phytase theo nhiệt độ ........................................Phụ lục 3 Bảng 15. Số liệu thô hoạt tính phytase theo pH và nhiệt độ ............................Phụ lục 3 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Cấu trúc hóa học của phytic acid ....................................................................... 3 Hình 2. Mô hình phytic acid với 5 nhóm xích đạo và 1 trục .......................................... 3 Hình 3. Histidine acid phosphatase ................................................................................ 6 Hình 4. Purple acid phosphatse ...................................................................................... 6 Hình 5. β-propeller phytase ............................................................................................ 7 Hình 6. Phản ứng xúc tác của phytase... ......................................................................... 8 Hình 7. Khuẩn ty dinh dƣỡng và khuẩn ty sinh sản của A. fumigatus ........................ 13 Hình 8. Cấu tạo cơ quan sinh sản của Aspergillus fumigatus ...................................... 13 Hình 9. Khuẩn lạc của A. fumigatus ............................................................................. 14 Hình 10. Qui trình thu nhận phytase thô từ A. fumigatus ............................................. 20 Hình 11. Khả năng tạo halo của 3 chủng nấm mốc ET3, ET7, ET8 trên M2 ở 30oC 26 Hình 12. Khả năng tạo halo của 3 chủng nấm mốc ở 45oC......................................... 27 Hình 13. Khuẩn ty dinh dƣỡng của chủng nấm mốc ET3 ........................................... 28 Hình 14. Khuẩn ty sinh sản của chủng nấm mốc ET 3 ............................................... 28 Hình 15. Kết quả định danh dòng nấm mốc ET3 dựa vào trình tự ITS ....................... 29 Hình 16. Biểu đồ hoạt tính phytase của A. fumigatus theo thời gian và nguồn phytate bổ sung. ........................................................................................................ 30 Hình 17. Biểu đồ hoạt tính phytase của A. fumigatus theo mật số bào tử ................... 32 Hình 18. Biểu đồ hoạt tính phytase của A. fumigatus theo pH môi trƣờng ............... 32 Hình 19. Biểu đồ hoạt tính phytase của A. fumigatus theo nhiệt độ ........................... 33 Hình 20. Biểu đồ Hoạt tính phytase của A. fumigatus theo pH và nhiệt độ ................ 35 Hình 21. Quy trình nuôi cấy và thu nhận phytase thô của chủng A. fumigatus .......... 36 Hình 22. Biểu đồ đƣờng chuẩn phosphate (KH2PO4) ......................................Phụ lục 2 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012 Trường ĐHCT CÁC TỪ VIẾT TẮT ATP Adenosine-5'-triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate PGA Potato glucose agar RNA Ribonucleic acid Chuyên ngành Công nghệ Sinh học viii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012 Trường ĐHCT CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Phosphorus (P) là nguồn dinh dưỡng thiết yếu cho sinh vật bởi vì nó là thành phần cấu trúc quan trọng của nhiều đại phân tử sinh học như DNA, RNA, protein và màng phospholipid của tế bào và các phân tử cao năng lượng như ATP và NADPH (Jahnke, 2000). Dạng tồn tại chính của phosphorus trong thực vật là phytate (muối của phytic acid). Người và các động vật ăn cỏ dạ dày đơn không thể sử dụng phosphorus ở dạng này vì thiếu enzyme phytase (Holm et al., 2002). Do đó, phần lớn phytic acid trong thức ăn sẽ không được hấp thụ mà thải qua phân ra ngoài môi trường dẫn đến ô nhiễm phosphorus hữu cơ cho nguồn nước, đặc biệt ở những khu vực chăn nuôi lợn và gia cầm ở quy mô lớn (Sharpley et al., 1993; Parry, 1998). Ngoài ra, phytate còn được xem là yếu tố kháng dinh dưỡng khi nó tương tác với các chất khoáng, protein và vitamin dẫn đến làm giảm giá trị dinh dưỡng của những thực phẩm hay thức ăn chăn nuôi có nguồn gốc từ ngũ cốc và các cây họ đậu (Fredlund et al., 2006; Lopez et al., 2002). Việc bổ sung enzyme phytase vào thức ăn để giúp tiêu hóa tốt phytate là giải pháp hiệu quả cho các vấn đề trên. Thực sự, enzyme phytase có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân phytate thành đường inositol và muối của ortho-phosphoric acid, khi đó phosphorus trở nên dễ hấp thu hơn. Nelson (1967) đã chứng minh phytase có thể giúp tăng tiêu hóa phosphorus trong thức ăn của gia cầm. Sau đó, theo Nguyễn Thu Quyên và cs. (2011) việc bổ sung phytase vào khẩu phần ăn cho gà Broiler có ảnh hưởng tích cực đến khả năng khoáng hóa xương cũng như cải thiện khả năng tiêu hóa Ca, P của gà Broiler. Ngoài ra, các dưỡng chất khác khi tạo phức với phytate cũng trở nên dễ tiêu hoá hơn, từ đó làm tăng giá trị dinh dưỡng của thức ăn và giảm ô nhiễm môi trường. Enzyme phytase được tìm thấy ở thực vật, động vật và vi sinh vật. Tuy nhiên, vi sinh vật được xem là nguồn sản xuất phytase chính cho việc nghiên cứu và ứng dụng của enzyme phytase. Nhiều nghiên cứu cho thấy enzyme này có ở vi khuẩn (Basillus subtilis, Escherichia coli), nấm men (Sacharomyces cerevisiae) và nấm mốc. Trong đó, nấm mốc được xem là nguồn sản xuất phytase dồi dào và phong phú với nhiều loài trong chi Aspergillus như A. ficuum, A. carbonarius, A. oryzae, A. niger, và A. fumigatus (Liu et al., 1999; Shimizu, 1993; Volfova et al., 1994). So với phytase từ các loài khác trong chi Aspergillus thì phytase từ A. fumigatus có nhiều đặc tính nổi Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012 Trường ĐHCT trội hơn như tính đặc hiệu với cơ chất rộng, vùng pH tối ưu 2,5 và 5,5, có khả năng hồi tính cao sau khi biến tính ở nhiệt độ cao (Pasamontes et al., 1997; Wyss et al., 1998). Với những ưu điểm này, phytase từ A. fumigatus được các nhà khoa học chú ý và nghiên cứu trong những năm gần đây. Tuy nhiên, ở Việt Nam có ít tài liệu nghiên cứu về enzyme từ loài nấm mốc này. Do đó, với tính cấp thiết trong nghiên cứu và ứng dụng, đề tài “Phân lập và khảo sát môi trường nuôi cấy nấm Aspergillus fumigatus sinh tổng hợp phytase cao” được thực hiện với mong muốn sử dụng có hiệu quả enzyme phytase từ loài nấm mốc này. 1.2. Mục tiêu đề tài - Phân lập được chủng nấm mốc A. fumigatus với khả năng sinh enzyme phytase có hoạt tính cao. - Xác định các điều kiện môi trường nuôi cấy thích hợp để thu nhận enzyme phytase có hoạt tính cao từ chủng A. fumigatus vừa phân lập. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012 Trường ĐHCT CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về phytic acid và muối phytate 2.1.1. Cấu tạo phân tử Phytic acid có công thức phân tử là C6H18O24P6. Khối lượng phân tử là 660,04 g/mol. Hình 1. Cấu trúc hóa học của phytic acid ( Nguồn: Weaver và Kannan, 2002) Phân tử phytic acid hay myo-inositol(1,2,3,4,5,6) hexakisphosphate gồm 6 nhóm phosphate liên kết với vòng inositol. Phytic acid là một đa phối tử có thể liên kết với nhiều nguyên tử kim loại. Mỗi nhóm phosphate bị ester hóa với một nhóm –OH của vòng inositol, các nhóm này tùy vào pH của môi trường có thể phân ly cho proton, có tổng cộng 12 proton trên các nhóm phosphate của phytic acid. Tính acid của các proton này biến đổi từ acid rất mạnh đến acid rất yếu (pKa có thể đến 9,4). Hình 2. Mô hình phytic acid với 5 nhóm xích đạo và 1 trục (Nguồn: Bohn, et al., 2008) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012 Trường ĐHCT Trong phổ pH từ 0,5 đến 10,5 phytic acid có cấu hình không gian bền vững với một trục và năm nhóm xích đạo. Ngược lại, ở giá trị pH cao hơn phân tử phytic acid sẽ hổ biến sang cấu hình ngược với năm trục và một nhóm xích đạo (Volkmann et al., 2002). Phytate là muối của phytic acid inositol hexakisphosphate (IP6). Inositol penta(IP5), tetra- (IP4) và triphosphate (IP3) cũng được gọi là phytate. 2.1.2. Ảnh hƣởng của phytate đến sự hấp thụ dinh dƣỡng ở ngƣời và động vật 2.1.2.1. Ảnh hưởng lên sự hấp thụ chất khoáng Ở người và động vật dạ dày đơn, sự hiện diện của phytate trong khẩu phần ăn làm giảm sự hấp thụ các chất khoáng như kẽm, sắt, magnesium, calcium (Ca), đồng, manganese (Konietzny và Greiner, 2003; Lopez et al., 2002). Nguyên nhân là do phân tử phytate hình thành phức hệ không tan với những ion kim loại trên. Những phức hệ này không được hấp thụ bởi hệ tiêu hóa người. 2.1.2.2. Ảnh hưởng lên sự tiêu hóa protein Phytate có thể hình thành phức với một vài protein và cản trở sự thủy phân protein. Theo Cheryan (1980) thì sự tương tác của phytate và protein phụ thuộc vào pH. Nếu giá trị pH thấp hơn điểm đẳng điện của protein thì những nhóm phosphate của phytate hình thành liên kết ion với những nhóm cation của các amino acid mang tính kiềm như arginine, histidine, lysine (Cosgrove, 1966). Sự hình thành những phức hệ này sẽ làm thay đổi cấu trúc của protein từ đó ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cũng như sự hòa tan và tiêu hóa protein. 2.1.2.3. Ảnh hưởng lên sự biến dưỡng carbohydrate Ở người, phytate làm giảm sự chuyển hóa đường máu (Lee et al., 2006) bởi vì phytate có thể trực tiếp tạo phức với carbohydrate bằng liên kết hydro hoặc gián tiếp liên kết với những protein có gắn carbohydrate này (Rickard và Thompson, 1997). Kết quả là làm giảm sự hòa tan của carbohydrate và gây bất lợi đến sự biến dưỡng và hấp thụ glucose. 2.1.2.4. Ảnh hưởng lên sự biến dưỡng lipid Lipophytin là một phức chất hình thành từ lipid và những dẫn xuất muối phytate, cùng với những chất dinh dưỡng khác (Vohra và Satanarayana, 2003). Theo Leeson Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012 Trường ĐHCT (1993) muối calcium phytate có thể hạn chế đáng kể quá trình sử dụng năng lượng từ các nguồn lipid dự trữ. 2.1.3. Nguồn phytate trong tự nhiên Trong tự nhiên phytic acid tồn tại chủ yếu dưới dạng muối phytate. Phytate chứa khoảng 60-90 tổng lượng phosphorus trong thực vật (Reddy et al., 1982). Phytate hiện diện chủ yếu trong hạt ngũ cốc và cây họ đậu, hạt có dầu, phấn hoa và hạnh nhân. Lượng phytate cao nhất trong các loại ngũ cốc, bắp (0,83 - 2,22 ) và trong các loại hạt đậu (5,92 - 9,15 ). Vì vậy, phytate là thành phần phổ biến của những thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật như bánh mì (1,5-7,5 mg phytic acid/g) (Rosa et al, 1999). Phytate được hình thành trong quá trình trưởng thành và giai đoạn miên trạng ở hạt và nó chiếm 60-90 tổng lượng phosphate trong hạt (Loewus, 2002). 2.2. Sơ lƣợc về enzyme phytase 2.2.1. Phân loại và danh pháp Phytase là nhóm enzyme có khả năng thủy phân liên kết ester giữa gốc phosphate và vòng inositol. Dựa trên vị trí carbon bắt đầu quá trình khử phosphorus này của phytate, phytase được chia ra thành 3 nhóm: 3-phytases (myo- inositolhexakisphosphate-3-phosphohydrolase, EC 3.1.3.8), 6-phytases (myo-inositol hexakisphosphate 6-phosphohydrolase, EC 3.1.3.26) và 5-phytases (myo-inositol hexakisphosphate 5-phosphohydrolase, EC 3.1.3.72). 3-phytase có nguồn gốc từ nấm mốc và vi khuẩn. Enzyme này phân cắt gốc phosphate ở vị trí C1 và C3 (Sajidan et al., 2004), trong khi đó 6-phytase thường được tìm thấy ở hạt lúa và những hạt có dầu ở thực vật bậc cao. 5-Phytase được tìm thấy ở đậu, cỏ linh lăng, đậu Hà lan và vi khuẩn Selenomonas ruminantium sống trong đường ruột ở động vật nhai lại (Chu et al., 2004). Dựa trên pH tối ưu thì phytase được chia thành hai loại chính là acid phytase và alkaline phytase. Trong đó acid phytase gồm có những enzyme thuộc vào histidine acid phosphatase (HAP), purple acid phosphatase (PAP) và protein tyrosine phosphatase (PTP) giống như lớp phosphatase. Alkaline phytase chỉ có β-propeller phytase (BPP) từ Bacillus (Kevoruo, et al., 1998). 2.2.1.1. Histidine acid phosphatase (EC 3.1.3.8) Các HAP được tìm thấy nhiều ở nấm mốc, vi khuẩn và thực vật (Wyss et al., Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012 Trường ĐHCT 1999). Chúng có tâm hoạt động với kiểu trình tự N-termnal là RHGXRXP mang tính bảo tồn cao và kiểu C-terminal là HD, đây là đặc điểm riêng của lớp enzyme này (Etten et al., 1991). Nguyên tắc xúc tác của lớp enzyme này bao gồm hai bước: đầu tiên là sự tấn công thân hạch trên nguyên tử phosphorus bởi gốc histidine trong tâm hoạt động, sau đó là sự thủy phân hợp chất trung gian phospho-histidine (Vicent et al., 1992). Hình 3. Histidine acid phosphatase (Nguồn: Edward và Abul, 2003) 2.2.1.2. Purple acid phosphatase (PAP) Hình 4. Purple acid phosphatase (Nguồn: http://www.rcc.uq.edu.au,) Loại phytase này được phân lập từ lá mầm của đậu nành đang nảy mầm (Hegeman và Crabau, 2001). Theo Schenk et al. (2000) PAP có nguồn gốc từ nhiều loại sinh vật khác nhau như thực vật, động vật, nấm mốc và vi khuẩn. Tâm hoạt động Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012 Trường ĐHCT của lớp enzyme này cần một hoặc nhiều ion kim loại làm cofactor để giúp enzyme hoạt động. Loại enzyme này có 5 kiểu peptide phổ biến (DxG/GDx2Y/GNH(E,D)Vx2H/GHXH) chứa 7 gốc acid amin có khả năng liên kết với ion kim loại. 2.2.1.3. β-propeller phytase (BPP) BPP được phân lập từ Bacillus và một số loài vi khuẩn khác. Loại phytase này cần ion kim loại cho hoạt tính xúc tác và sự bền nhiệt. Phân tử enzyme BPP có cấu trúc sáu mặt phẳng β xếp thành dạng cánh quạt β-propeller và liên kết với một chân vịt gồm 6 cánh (Ha et at., 2000; Shin et at., 2001). Ion calcium tạo một môi trường tĩnh điện phù hợp trong domain gắn cơ chất, hổ trợ cho phân tử myo-inositol hexakisphosphate tương tác với tâm hoạt động của enzyme. Các nghiên cứu động học về enzyme này cho thấy sự xúc tác phản ứng thủy phân calcium-phytate tối ưu trong khoảng pH 7-8 (Oh et at., 2001). Hình 5. β-propeller phytase (Nguồn: Edward và Abul, 2003) 2.2.2. Cơ chế phản ứng Phytase thủy phân phytic acid và muối phytate giải phóng ra các gốc phosphate (PO4-3), inositol, nguyên tố khoáng, protein, amino acid, tinh bột và liposome. Với phytic acid thì phytase có thể phân cắt cho ra các nhóm phosphate với tỉ lệ khác nhau. Tất cả các phytase có nguồn gốc từ nấm đều có thể giải phóng 5 hoặc 6 gốc phosphate, sản phẩm cuối cùng là myo-inositol 2-monophosphate. 3-phytase khởi đầu thủy giải ở vị trí D-3 với sản phẩm thứ cấp là (1,2,4,5,6)P5. Trong khi đó 6-phytase khởi đầu thủy giải ở L-6 tạo thành L-Inositol (1,2,3,4,5)P5 là sản phẩm thứ cấp thứ nhất. Còn alkaline phytase từ phấn hoa Lily bắt đầu thủy giải ở D-5 và qua 2 bước khử phosphorus tạo Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012 Trường ĐHCT thành Innositol (1,2,3)P3 là sản phẩm cuối cùng. Hình 6. Phản ứng xúc tác của phytase (Nguồn: Yao et al., 2011) 2.2.3. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa 2.2.3.1. pH tối ưu Acid phytase có pH tối ưu là 5. Nhiều nghiên cứu cho thấy đa phần các phytase là acid phytase có pH tối ưu trong khoảng 4,5-6,0. Còn pH tối ưu của alkaline phytase là 8,0 từ những nghiên cứu về phytase từ hạt đậu (Scott, 1991), phấn hoa lily (Baldi et al., 1988), và cây hương bồ (Hara et al., 1985). Phytase từ vi khuẩn có pH tối ưu trong khoảng 6,5 - 7,5, theo Powar và Jagannathan (1982) thì phytase từ Bacillus có pH tối ưu 6,0-8,0. Các phytase có nguồn gốc thực vật có pH tối ưu trong khoảng 4,0 - 7,5. Tuy nhiên, theo Kerovuo (2000) đa số phytase thực vật pH tối ưu trong khoảng pH 4,0 - 5,6. Giá trị pH tối ưu của các phytase nấm men tùy thuộc vào nhiệt độ (Nakamura et al., 2000) và thường nằm trong khoảng 4,0 – 5,0. Không giống như tất cả các phytase từ nấm khác, phytase từ A. fumigatus có phổ pH tối ưu khá rộng 4,0-7,3 (Wyss et al., 1999). 2.2.3.2. Nhiệt độ tối ưu Nhiệt độ tối ưu cho phytase nói chung từ 35-77oC. Nhiệt độ tối ưu của phytase từ thực vật thấp hơn so với phytase vi sinh vật. Nhìn chung các phytase có khả năng chịu nhiệt cao, đặc biệt trong trường hợp của phytase từ A. fumigatus có độ bền nhiệt rất cao. Nghiên cứu của Pasamontes et al. (1997) cho thấy phytase từ loài nấm mốc này có thể chịu được nhiệt độ lên đến 100oC trong 20 phút mà hoạt tính xúc tác vẫn còn giữ được 90 so với hoạt tính ban đầu. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012 Trường ĐHCT Bảng 1. Nhiệt độ tối ƣu của các chủng vi sinh vật (Vohra et al., 2004) Phân loại Vi khuẩn Nấm men Nấm mốc Chủng Nhiệt độ tối ƣu (0C) Aerobacter aerogenes 25 Bacillus sp. DS11 70 Bacillus subtilis 55 Entergobacter sp. 4 50 Escherichia coli 55 Klebsiella aerogenes 60 Lactobacillus amylovorus 45 Pseudomonas sp. 40 Selenomonas ruminantium 50-55 Arxula adeninivorans 75-80 Hanseniaspora valbyensis 60 Pichia anomala 60 P. rhodanensis 70-75 Schwanniomyces occidentalis 75-80 Aspergillus careus 40 A. cacbonarius 53 A. niger 92 55 A. niger NRRL 3135 58 A. fumigatus 55 2.2.3.3. Ảnh hưởng của cơ chất Phytase có phổ cơ chất đặc hiệu rộng bao gồm phytate, adenosine monophosphate (AMP) adenosine diphosphate (ADP), adenosine triphosphate (ATP), guanosine monophosphate (GMP), guanosin triphosphate (GTP), nicotilamide-adenine dinucleotide phosphate, p-nitrophenyl phosphate, phenyl phosphate, 1-naphthyl phosphate, 2-naphthyl-phosphate, fructose 1,6-diphosphate, fructose 6-phosphate, glucose 1-phosphate, glucose 6-phosphate, galactose 1-phosphate, a-glycerophosphate, Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2012 Trường ĐHCT b-glycerophosphate, pyridoxalphosphate, o-phospho-l-serine và pyrophosphate. Trong đó, các phytase có tính đặc hiệu cao với phytate như aicd phytase từ E. coli (Greiner et al., 1993), A. niger, A. terreus (Wyss et al., 1999) và alkaline phytase từ B. Subtilis (Powar and Jaganathan, 1982), phấn hoa lily (Barientos et al., 1994) (phytase source). Các phytase từ A. fumigatus, E. nidulans, và M. thermophia thể hiện sự đặc hiệu cơ chất rộng, trong khi các phytase từ A. niger, A. terrus CBS, và E.coli có tính đặc hiệu cao hơn đối với phytic acid (Wyss et al., 1999). Nồng độ cơ chất quá cao sẽ gây ức chế enzyme. Ullah và Cummin (1998) cho biết nồng độ myo-inositol-P6 vượt qua mức 2 nmol/L sẽ gây hiện tượng ức chế. 2.2.4. Nguồn sản sinh phytase trong tự nhiên 2.2.4.1. Phytase từ vi sinh vật Nguồn cung cấp phytase ứng dụng chủ yếu là từ vi sinh vật. Đa số các phytase từ vi khuẩn là những phytase nội bào. Ngược lại, phần lớn các phytase ngoại bào được tìm thấy ở nấm sợi trong đó có 28 nguồn sản xuất phytase là từ chi Aspergillus. Loài Aspergillus niger được xem là nguồn sản xuất phytase tốt nhất (Gargova et al., 1997). Phytase cũng được tìm thấy ở các vi khuẩn như Pseudomonas sp. (Richardson và Hadobas, 1997), Bacillus subtilis (Powar và Jaganathan, 1982), Bacillus sp. DS11 (Kim et al., 1998), Klebsiella sp. (Tambe et al., 1994; Greiner et al., 1997), E. coli (Greiner et al., 1993) and Enterobacter (Yoon et al., 1996). Trong đó chỉ có phytase những loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus và Enterobacteria là những phytase ngoại bào. Ngoài ra, nấm men cũng là nguồn sản sinh phytase. S. Cerevisiae (Nakamura et al., 2000) and Schwanniomyces castellii (Lambrechts et al., 1992) có khả năng sản xuất cả phytase ngoại bào và nội bào. 2.2.4.2. Phytase từ thực vật Phytase xuất hiện hầu hết ở hạt và phấn hoa ở thực vật bậc cao như ngũ cốc, cây họ đậu, hạt cây có dầu. Phytase có nhiệm vụ phân giải phytate trong quá trình nảy mầm nhằm cung cấp phosphate, chất khoáng và đường myo-inositol giúp cây sinh trưởng và phát triển (Reddy et al., 1989). Hoạt tính phytase cao nhất được báo cáo ở ngũ cốc như lúa mạch đen, lúa mạch và lúa mì. 2.3.4.3. Phytase từ mô động vật Báo cáo đầu tiên về phytase từ động vật được tìm thấy từ gan và máu của bò con Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
- Xem thêm -