Tài liệu Phân lập, tuyển chọn và sử dụng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trong bảo quản cá giò tươi nguyên liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LƯU THỊ THÚY PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTIC SINH BACTERIOCIN TRONG BẢO QUẢN CÁ GIÒ TƯƠI NGUYÊN LIỆU LUẬN VĂN THẠC SĨ Nha Trang - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LƯU THỊ THÚY PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTIC SINH BACTERIOCIN TRONG BẢO QUẢN CÁ GIÒ TƯƠI NGUYÊN LIỆU Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch Mã số: 60 54 10 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. NGUYỄN VĂN DUY TS. VŨ NGỌC BỘI Nha Trang - 2012 -i- LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Tác giả luận văn - ii - LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS.Nguyễn Văn Duy – Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nha Trang và TS. Vũ Ngọc Bội – Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình làm đề tài, hai thầy đã cung cấp và truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu giúp tôi hoàn thành luận văn này. Cảm ơn sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo phòng thí nghiệm Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nha Trang, gia đình và bạn bè luôn luôn chia sẽ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu. - iii - MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH viii LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 4 1.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic......................................................................................4 1.1.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic ...............................................................4 1.1.2 Phân loại..........................................................................................................5 1.1.3 Nhu cầu dinh dưỡng và các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic ..............................................................................................................7 1.1.4 Ứng dụng.........................................................................................................8 1.2 Bacteriocin ..........................................................................................................11 1.2.1 Phân loại bacteriocin .....................................................................................12 1.2.2 Một số tính chất của bacteriocin ...................................................................14 1.3 Cá Giò ..................................................................................................................16 1.4 Biến đổi chất lượng nguyên liệu thủy sản sau khi chết .......................................18 1.4.1 Hệ vi sinh vật trong cá tươi...........................................................................18 1.4.2 Biến đổi chất lượng của nguyên liệu thủy sản sau khi chết ..........................19 1.5 Các phương pháp bảo quản cá .............................................................................24 1.6 Tình hình nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trong bảo quản thực phẩm..........................................................................................................28 1.6.1 Trên thế giới .................................................................................................28 1.6.2 Trong nước ....................................................................................................29 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Đối tượng nghiên cứu ..........................................................................................31 2.1.1 Nước dưa .......................................................................................................31 2.1.2 Chủng vi khuẩn chỉ thị ..................................................................................31 - iv - 2.1.3 Cá giò ............................................................................................................32 2.1.4 Thiết bị chuyên dụng.....................................................................................32 2.1.5 Hóa chất, môi trường ....................................................................................33 2.2 Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................33 2.2.1 Phân lập vi khuẩn lactic ................................................................................33 2.2.2 Xác định đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn lactic ......................................33 2.2.3 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin ...............................34 2.2.4 Xác định cơ chế kháng khuẩn của chủng phân lập .......................................34 2.2.5 Xác định mức độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic ........................................35 2.2.6 Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp của vi khuẩn lactic ..........................35 2.2.7 Xác định phổ ức chế của vi khuẩn lactic sinh bacteriocin ............................36 2.2.8 Xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic trên cá Giò nguyên liệu ........36 2.2.9 Xác định tổng vi khuẩn hiếu khí ...................................................................37 2.2.10 Thí nghiệm kiểm tra khả năng kháng Salmonella, Vibrio của vi khuẩn lactic trong quá trình bảo quản...............................................................................37 2.2.11 Thí nghiệm bảo quản cá Giò bằng vi khuẩn lactic......................................37 2.2.12 Đánh giá chất lượng của cá .........................................................................38 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Phân lập vi khuẩn lactic từ nước dưa muối lên men truyền thống .....................40 3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin............................................41 3.3 Phổ ức chế của 5 chủng vi khuẩn lactic đã tuyển chọn ......................................43 3.4 Xử lý dịch chiết tế bào với enzym proteinase K và α-Chymotrypsin ................49 3.5 Cơ chế kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô của chủng vi khuẩn lactic T13............50 3.6 Đặc điểm sinh trưởng và sinh bacteriocin của chủng T13 trên môi trường MRS.......51 3.7 Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp ...............................................................53 3.7.1 Ảnh hưởng cuả nguồn cacbon đến sinh trưởng phát triển của vi khuẩn lactic T13................................................................................................................53 3.7.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ lên sinh trưởng của vi khuẩn lactic T13 ..................54 3.7.3 Ảnh hưởng của pH đối với sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic T13.............55 3.7.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của vi khuẩn lactic T13 ...............56 3.8 Khả năng sinh trưởng và sinh bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic T13 trên da cá giò..............................................................................................................57 -v- 3.8.1 Tổng số vi khuẩn lactic trên da cá giò nguyên liệu tươi ...............................57 3.8.2 Sự phát triển của tổng vi khuẩn hiếu khí trên da cá sau khi được nhúng vào dịch vi khuẩn lactic T13 ..................................................................................58 3.9 Thử nghiệm sử dụng vi khuẩn lactic T13 trong bảo quản cá giò tươi nguyên liệu.................................................................................................................59 3.9.1 Kết quả đánh giá cảm quan ...........................................................................59 3.9.2 Kết quả đánh giá chỉ tiêu hóa học .................................................................61 3.9.3 Kết quả kiểm tra vi sinh vật ..........................................................................62 3.10 Qui trình bảo quản cá giò nguyên liệu tươi bằng vi khuẩn lactic T13 ..............67 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69 KẾT LUẬN................................................................................................................69 KIẾN NGHỊ ...............................................................................................................69 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC 2 PHỤ LỤC 3 PHỤ LỤC 4 - vi - BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Stt Ký hiệu Nghĩa Colony forming unit 1 CFU 2 LAB (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) Lactic acid bacteria (Vi khuẩn lactic) 3 MRS de Man, Rogosa and Shatpe (Môi trường nuôi cấy Lactobacillus) 4 PCA Plate Count Agar (Môi trường nuôi cấy vi khuẩn tổng số) 5 OD Optical Density (Mật độ quang) 6 TSA Trypton soy agar (Môi trường rắn nuôi cấy vi khuẩn tổng số) 7 TSB Trypton soy broth (Môi trường lỏng nuôi cấy vi khuẩn tổng số) - vii - DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Bảng phân loại bacteriocin........................................................................... 14 Bảng 1.2 Tính chất hóa lý của một số bacteriocin của vi khuẩn Gram dương ............ 15 Bảng 2.1 Bảng chỉ tiêu cảm quan của cá giò................................................................ 39 Bảng 3.1 Bảng khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch ngoại bào từ vi khuẩn lactic.............................................................................................................................. 41 Bảng 3.2 Đường kính vòng kháng khuẩn của 5 chủng lactic T4, T13, T12, T8, O16 với các chủng chỉ thị............................................................................................. 45 - viii - DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh tế bào của một số chủng vi khuẩn lactic...........................................8 Hình 1.2 Cấu trúc một số bacteriocin............................................................................13 Hình 1.3 Cơ chế hoạt động của các loại bacteriocin của vi khuẩn lactic ......................14 Hình 1.4 Ảnh cá giò.......................................................................................................18 Hình 2.1 Ảnh nước dưa chua.........................................................................................31 Hình 2.2 Ảnh Cá giò nguyên liệu tươi ..........................................................................32 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định phổ ức chế của vi khuẩn lactic đối với một số vi khuẩn gây bệnh ..............................................................................................36 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian bảo quản cá giò...........................38 Hình 3.1 Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic T13 trên môi trường thạch MRS....................40 Hình 3.2 Tế bào của chủng vi khuẩn lactic T13 sau khi nhuộm Gram được quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại X-100..................................................................40 Hình 3.3 Các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nước dưa thể hiện tính kháng với chủng chỉ thị Salmonella Sal 1 trên môi trường XL .....................................................42 Hình 3.4 Hình ảnh vòng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic với chủng chỉ thị Vibrio C1 (A) và Bacillus B1.1 (B)....................................................................42 Hình 3.5 (A) Vòng kháng khuẩn của 5 chủng vi khuẩn lactic với chủng Salmonella Sal1 và Bacillus (B1.1, B2.3) .....................................................................46 Hình 3.5 (B) Vòng kháng khuẩn của 5 chủng vi khuẩn lactic với chủng E. Coli (H10b, L2.1, TN3, TN4.1, TN4.2, TN5.2 )...................................................................47 Hình 3.5 (C) Vòng kháng khuẩn của 5 chủng vi khuẩn lactic với chủng chỉ thị E. coli GA, Vibrio (C1, V3.3, CR6, CR7), S. aureus....................................................48 Hình 3.6 Hình ảnh vòng kháng khuẩn của dịch bacteriocin từ chủng T13 khi xử lý với proteinase K (A) và với α-chymotrypsin (B). .....................................................49 Hình 3.7 Ảnh hưởng của dịch bacteriocin thô của vi khuẩn lactic T13 lên sự sinh trưởng của Bacillus B1.1 ...............................................................................................50 Hình 3.8 Mối quan hệ giữa sự sinh trưởng tính theo mật độ quang và khả năng sinh bacteriocin tính theo đường kính vòng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn lactic T13 nuôi trên môi trường MRS, ở pH 6,8 và nhiệt độ 37OC...............................52 - ix - Hình 3.9 Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T13 đối với Bacillus B1.1 trên môi trường thạch mềm TSA bổ sung xanh metylen ở nhiệt độ 370C. ..........................53 Hình 3.10 Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sinh trưởng của vi khuẩn lactic T13 ......54 Hình 3.11 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng của vi khuẩn lactic T13 ...........55 Hình 3.12 Ảnh hưởng của pH môi trường lên sinh trưởng của vi khuẩn lactic T13 ....56 Hình 3.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lacticT13 ........................................................................................................................57 Hình 3.14 Khả năng sinh trưởng và sinh bacteriocin của tổng vi khuẩn lactic trên da cá giò theo thời gian..................................................................................................57 Hình 3.15 Sinh trưởng của tổng vi khuẩn hiếu khí trên da cá giò.................................59 Hình 3.16 Biểu đồ đánh giá cảm quan về chất lượng cá giò theo thời gian bảo quản ............. 61 Hình 3.17 Đồ thị biểu diễn hàm lượng NH3 theo thời gian bảo quản ...........................62 Hình 3.18 Vi khuẩn Salmonella trên cá giò sau khi gây nhiễm ở ngày thứ 5..............63 Hình 3.19 Đồ thị so sánh mật độ tế bào của vi khuẩn Salmonella trên mẫu cá giò bảo quản với vi khuẩn lactic và mẫu đối chứng ............................................................63 Hình 3.20 Tổng số vi khuẩn Vibrio trên cá giò sau khi gây nhiễm ở ngày thứ 5 .........64 Hình 3.21 Đồ thị so sánh mật độ tế bào của vi khuẩn Vibrio trên mẫu cá giò bảo quản với vi khuẩn lactic và mẫu đối chứng...................................................................64 Hình 3.22Tổng vi khuẩn hiếu khí sau 5 ngày bảo quản ................................................65 Hình 3.23 Đồ thị biểu diễn tổng số vi khuẩn hiếu khí theo thời gian bảo quản............65 Hình 3.24 Ảnh cá giò sau 5 ngày bảo quản...................................................................67 Hình 3.25 Sơ đồ qui trình bảo quản cá giò nguyên liệu tươi ........................................68 -1- LỜI MỞ ĐẦU Mục tiêu và tính cấp thiết của đề tài Nguyên liệu thủy sản nói chung và cá giò nguyên liệu nói riêng là loại nguyên liệu dễ bị hư hỏng nếu không được bảo quản một cách hợp lý. Hiện các loại nguyên liệu thủy sản chủ yếu được bảo quản theo phương pháp ướp đá nhưng để bảo quản trong thời gian dài thì cần phải có đủ lượng đá để giữ nhiệt độ trong lòng khối nguyên liệu ≤40C. Thêm vào đó khi bảo quản nguyên liệu thủy sản theo phương pháp ướp đá thường phải có dụng cụ chứa đựng lớn. Nhưng thực tế cho thấy việc bảo quản nguyên liệu thủy sản sau đánh bắt và thu hoạch của người dân còn nhiều hạn chế như thiếu lượng đá, thiếu dụng cụ chứa đựng, điều kiện vệ sinh nơi bảo quản còn hạn chế… Vì thế chất lượng nguyên liệu thủy sản bảo quản của người dân thường rất hạn chế. Để giữ nguyên liệu thủy sản lâu dài người dân thường lạm dụng các loại hóa chất độc hại như hàn the, urê, trong bảo quản nguyên liệu thủy sản gây nên tình trạnh mất an toàn thực phẩm. Do đó hiện nay vấn đề “ an toàn vệ sinh thực phẩm” đang là vấn đề được toàn xã hội quan tâm. Vì vậy việc nghiên cứu, tìm kiếm phương pháp bảo quản nguyên liệu an toàn với người sử dụng là yêu cầu rất cấp thiết. Nhiều nhà khoa học đang quan tâm nghiên cứu thay thế những chất bảo quản hóa học bằng các phương pháp sinh học không gây mất an toàn cho người tiêu dùng tiêu dùng thực phẩm. Một trong các hướng là nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin. Bacteriocin là một loại protein có trọng lượng phân tử nhỏ do vi khuẩn sinh ra để chống lại các vi khuẩn khác có trong môi trường sống của chúng. Trong số này, vi khuẩn lactic được công nhận là an toàn để sử dụng trong quá trình lên men thực phẩm truyền thống [18]. Trong quá trình sống ngoài việc sinh ra bacteriocin, vi khuẩn này còn sinh ra acid lactic và acid lactic cũng là tác nhân ức chế sinh trưởng của nhiều lọai vi khuẩn. Vì thế từ ngàn xưa con người đã sử dụng phương pháp lên men lactic như một biện pháp bảo quản sản phẩm hữu hiệu. Cá giò (Rachycenton canadum) hay còn gọi là cá bớp là lọai cá biển có thịt ngon và giá thành cao. Hiện cá giò là đối tượng nuôi có giá trị kinh tế cả trong thị trường nội địa và quốc tế. Nên hiện nay cá giò được nuôi khá phổ biến ở nhiều tỉnh ven biển như Quảng Ninh, Hải Phòng, Nghệ An, Hà Tĩnh, Huế, Phú Yên, Khánh Hòa, Vũng Tàu và Kiên Giang. Hiện nay cá giò được tiêu thụ ở các thành phố lớn trong nước và xuất khẩu ra nước ngoài ở dạng cá tươi hoặc chế biến đông lạnh. Do vậy việc nghiên cứu -2- bảo quản nguyên liệu cá giò làm hạn chế hư hỏng có ý nghĩa kinh tế lớn. Hiện cá giò nguyên liệu tươi cũng giống như nhiều loại nguyên liệu thủy sản khác chỉ được bảo quản theo phương pháp ướp đá hoặc sử dụng các chất bảo quản không rõ nguồn gốc xuất xứ gây độc hại cho người sử dụng thậm chí có thể gây bệnh cho người. Vì thế, việc tiến hành nghiên cứu đề tài “Phân lập, tuyển chọn và sử dụng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trong bảo quản cá giò nguyên liệu tươi” với mục tiêu tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có kháng sinh bacteriocin và thử nghiệm sử dụng các vi khuẩn lactic này để bảo quản sinh học cá giò tươi nguyên liệu. Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu đã phân lập và tuyển chọn được bộ sưu tập các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin từ nước dưa chua. Nghiên cứu cơ chế kháng khuẩn và phổ ức chế của vi khuẩn lactic đối với một số vi khuẩn gây bệnh. Bên cạnh đó, chúng tôi cũng đã đánh giá được khả năng bảo quản chủng vi khuẩn lactic đối với cá giò tươi nguyên liệu. Từ kết quả nghiên cứu sẽ mở ra triển vọng lớn trong bảo quản thực phẩm và nguyên liệu thủy sản. Ý nghĩa thực tiễn Từ kết quả nghiên cứu cho thấy rằng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin có thể được sử dụng làm chất bảo quản sinh học để bảo quản thủy sản nói chung và cá giò nói riêng, đồng thời vẫn đảm bảo được tính an toàn thực phẩm. Bên cạnh đó vi khuẩn lactic này sẽ là một chất bảo quản sinh học giá thành rẻ góp phần làm giảm chi phí sản xuất cho các doanh nghiệp chế biến thủy sản và đảm bảo tính an toàn cho người tiêu dùng. Mục đích của đề tài Phân lập và tuyển chọn những chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin từ nước dưa muối nhằm thử nghiệm ứng dụng vào bảo quản cá giò tươi nguyên liệu. Nội dung nghiên cứu của đề tài 1. Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin. 2. Xác định phổ ức chế vi khuẩn gây bệnh thực phẩm của vi khuẩn lactic. 3. Xử lý dịch chiết tế bào với enzyme proteinaza K và α-Chymotrypsin. 4. Cơ chế kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô của chủng vi khuẩn lactic. 5. X ác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic trên môi trường MRS. 6. Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic sinh bacteriocin. -3- 7. X ác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic trên da cá giò nguyên liệu. 8. Đánh giá khả năng sử dụng vi khuẩn lactic trong bảo quản nguyên liệu cá giò tươi. -4- CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, có khả năng lên men đường thành acid lactic. Nhóm vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriacae. Nhóm vi khuẩn này có rất nhiều hình dạng khác nhau: hình que ngắn hoặc dài ở dạng đơn, đôi hoặc xếp thành chuỗi; hình cầu ở dạng đơn, đôi, xếp thành nhóm hoặc chuỗi. Khuẩn lạc của vi khẩn lactic tròn nhỏ, trong bóng, màu trắng đục hoặc màu vàng kem; hoặc đôi khi khuẩn lạc có kính thước to hơn, tròn lồi trắng đục. Đặc biệt khuẩn lạc có thể tỏa ra mùi chua của acid [5]. Vi khuẩn lactic có phổ kháng khuẩn khá rộng với nhiều cơ chế khác nhau. Một trong các cơ chế kháng khuẩn của vi khuẩn lactic là sự hình thành lactic acid. Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn sinh ra các phân tử có hoạt tính sinh học khác như diacetyl, reuterin và reutericyclin. Đặc biệt, vi khuẩn lactic có thể sản sinh ra các phân tử bacteriocin và những phân tử tương tự bacteriocin để chống lại hoạt động của các vi khuẩn gần gũi. Một vài chủng vi khuẩn lactic còn có thể tổng hợp những peptide kháng khuẩn khác. Những chất kháng sinh có bản chất protein này đang được ứng dụng để nâng cao chất lượng bảo quản và an toàn vệ sinh thực phẩm [12,17]. 1.1.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic [5] Về mặt hình thái vi khuẩn lactic có rất nhiều điểm khác nhau nhưng nhìn chung về mặt sinh lý chúng tương đối đồng nhất, gồm một số đặc điểm chung như sau: - Vi khuẩn Gram dương, bất động và không sinh bào tử. - Khả năng tổng hợp nhiều hợp chất của vi khuẩn này rất yếu. - Là loại vi khuẩn kị khí tùy nghi, có khả năng lên men kị khí cũng như hiếu khí. - Có khả năng chống chịu tốt trong môi trường acid. - Thu nhận năng lượng nhờ phân giải hydrocacbon và tiết ra lactic acid; chúng là nhóm lên men bắt buộc, không chứa cytochrome, catalase và men. - Vi khuẩn lactic có thể sống từ kị khí tới vi hiếu khí. Vi khuẩn lactic có nhu cầu về chất sinh trưởng rất phức tạp. Không một đại diện nào của nhóm này có thể phát triển trong môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucose. Đa số chúng cần hàng loạt các vitamin (lactoflavin, tiamin, pantotenic acid, nicotinic acid, folic acid, biotin) và các amino acid … -5- - Vi khuẩn lactic lên men được mono và disaccharide. Các vi khuẩn lactic không lên men được tinh bột và các polysaccharide khác. Ngoại trừ loài L.delbrueckii là đồng hóa được tinh bột. Một số khác chủ yếu là các vi khuẩn lên men lactic dị hình sử dụng được pentose và citric acid. Một số vi khuẩn lactic có hoạt tính protease: thủy phân được protein của sữa thành peptide và amino acid. Hoạt tính này ở các loài là khác nhau, thường trực khuẩn là cao nhất. - Vi khuẩn lactic có khả năng sinh ra chất kháng sinh để ức chế các vi khuẩn gây bệnh. 1.1.2 Phân loại Dựa vào khả năng lên men lactic từ các nguyên liệu chứa đường, người ta có thể chia thành hai nhóm vi khuẩn lactic: vi khuẩn lactic dị hình và vi khuẩn lactic đồng hình. - Vi khuẩn lactic dị hình Khi tiến hành lên men các dung dịch đường, các vi khuẩn lactic dị hình thường tạo ra lượng lactic acid không lớn lắm. Ngoài lactic acid, chúng còn tạo ra các sản phẩm khác như acetic acid, propionic acid, ethanol... Một số vi khuẩn lactic dị hình như sau: Lactobacillus pasterianus, thuộc loại trực khuẩn Gram (+), tế bào có kích thước rộng 0,5-1µm, dài 7,0-35 µm. Trong tự nhiên chúng tồn tại riêng lẻ không di động. Chúng sinh trưởng thích hợp ở nhiệt độ 29-330C, và pH 8,0. Lactobacillus brevis, thuộc loại trực khuẩn Gram (+), tế bào có kích thước rộng 0,7-1µm, dài 2,4 -4,0 µm. Trong tự nhiên chúng liên kết với nhau thành chuỗi, không di động. Trong quá trình phát triển chúng có thể sử dụng lactat canxi như nguồn cung cấp cacbon. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 300C. Vi khuẩn có nhiều trong sữa, trong dưa chua. Lactobacillus lycopessici là loại trực khuẩn Gram (+). Trong tự nhiên chúng tồn tại từng đôi một, có khả năng tạo bào tử. Trong quá trình lên men đường chúng tạo ra cồn, lactic acid, acetic acid và CO2. Streptococcus cumoris thuộc loại cầu khuẩn, trong tự nhiên chúng tồn tại thành từng chuỗi rất dài. Nhiệt độ thích hợp cho chúng phát triển là 300C. Chúng không phát triển ở nồng độ muối 4%. Khi lên men đường tạo ra acetic acid, diacetyl và CO2. Chúng có khả năng sinh ra chất kháng khuẩn. Streptococcus lactic thuộc chuỗi cầu khuẩn Gram (+), nhiệt độ phát triển từ 10450C, có khả năng chịu được nồng độ muối 4%. Khi lên men đường như glucose, maltose, lactose, xylose, arabinose, saccharoe, monnitol, salicin, chúng tạo ra lactic -6- acid, acetic acid CO2, và diacetyl. Chúng không khả năng lên men được raffinose, insulin, glycerol và sorbitol. Streptococcus falcalis thường sống thành chuỗi tế bào hình cầu, nhiệt độ sinh trưởng ở 10-450C. Chúng có khả năng chịu được nồng độ muối 5% và có khả năng lên men đường glucose, maltose, trehalose và silicin. - Vi khuẩn lactic đồng hình Vi khuẩn lactic đồng hình là nhũng vi khuẩn trong tế bào của chúng có chứa enzym aldolase và enzym triosophotphatizomerase. Khi lên men các loại đường chúng sinh ra chủ yếu là lactic acid. Một số vi khuẩn lactic điển hình: Lactobacillus axitophilus là trực khuẩn, có kích thước rộng 0,6-0,9µm, dài 1,56,0 µm. Trong tự nhiên chúng tồn tại riêng lẻ, đôi khi chúng tạo thành những chuỗi ngắn. Chúng thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+) và có khả năng chuyển động. chúng có khả năng lên men một số loại đường như glucose, maltose, galactose, lactose, mannose, saccharose để tạo ra lactic acid. Chúng hoàn toàn không có khả năng lên men xylose, glycerol, mannitol, sorbitol… Lactobacillus bulgaricus là loài thuộc trực khuẩn có kích thước rất dài liên kết với nhau tạo thành chuỗi. Chúng không có khả năng di chuyển. Chúng có khả năng lên men các loại đường như glucose, galactose, lactose. Nhưng không có khả năng lên men xylose, dextrin, mannitol, inulin… Lactobacillus casein là trực khuẩn nhỏ có kích thước ngắn, chúng có thể tạo thành chuỗi không chuyển động. Chúng có khả năng lên men các loại đường như glucose, galactose, lactose, fructose, maltose…Trong quá trình lên men chúng tạo ra D-lactic acid. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 38-400C. Lactobacillus causasiccus là loại trực khuẩn ngắn không có khả năng chuyển động. Chúng có khả năng lên men các loại đường như glucose, galactose, lactose, fructose, maltose, mannose, mannitol. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 48-500C. Lactobacillus leichmannii là trực khuẩn Gram (+). Kích thước tế bào 0,6-2 µm. Trong tự nhiên chúng có khả năng tạo thành chuỗi ngắn. Chúng có khả năng lên men các loại đường như glucose, galactose, lactose, fructose, maltose, saccharose. Trong quá trình lên men chúng tạo ra L-lactic acid. Nhiệt độ phát triển tối ưu 360C. -7- Lactobacillus delbruckii là trực khuẩn dài, kích thước 0,5-0,8 µm, 0,2-9,0 µm, không di động. Chúng có khả năng lên men các loại đường như glucose, galactose, maltose, fructose và dextrin. Lactobacillus helveticcus là loại trực khuẩn có kích thước 0,7-0,9 µm, 2,0-6,0 µm. Trong tự nhiên chúng có thể tồn tại riêng từng tế bào cũng như có thể tạo thành chuỗi tế bào. Nhiệt độ phát triển thích hợp là 40-420C. Chúng có khả năng lên men các loại đường như glucose, galactose, lactose, fructose, maltose, mannose. Vi khuẩn này được sử dụng nhiều trong sản xuất sữa chua và phomai cứng. Lactobacillus thermophilus là trực khuẩn Gram (+),có kích thước tế bào 0,5-3,0 µm, không có khả năng di động. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 300C, chịu được 65-750C. Vi khuẩn này được sử dụng nhiều trong sản xuất sữa chua, phomai. Lactobacillus plantarum là trực khuẩn Gram (+), có kích thước tế bào 0,7-1,0 µm, 3,0-8,0 µm. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 300C. Có khả năng chịu được nồng độ muối 5,5%. Vi khuẩn này được dùng nhiều trong chế biến sữa. 1.1.3 Nhu cầu dinh dưỡng và các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic [5] Một số lớn vi khuẩn lactic không thể sử dụng được các hợp chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự phát triển của mình chúng phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Chỉ một số ít loài vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp các chất hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ. Vì vậy để sinh trưởng và phát triển bình thường ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các acid amin, vi khuẩn lactic còn cần những hợp chất hữu cơ phức tạp chứa nitơ như các sản phẩm thủy phân protein từ thịt, casein, pepton… Nguồn cacbon tốt nhất là các loại đường mono và disaccharide, còn các polysaccharide thì hầu như không thể lên men. Tốc độ lên men các loại đường monosaccharide, disaccharide và oligosaccharide là khác nhau. Nếu khi nhân giống người ta dùng một loại đường thông thường thì vi khuẩn có thể thích nghi với loại đường đó và về sau chúng phát triển có hiệu quả trên môi trường chứa loại đường này mà không làm ảnh hưởng đến khả năng lên men đối với các nguồn cacbon khác. Các vi khuẩn lactic rất cần vitamin cho sự phát triển. Thường phải bổ sung vào môi trường các chất chứa vitamin như khoai tây, cà rốt, dịch tự phân nấm men và -8- nhiều chất khác. Vitamin đóng vai trò là coenzym trong quá trình trao đổi chất của tế bào. Rất ít vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp được vitamin. Để đảm bảo sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic cần rất nhiều các hợp chất vô cơ như đồng, sắt, natri, kali, lưu huỳnh, mangan. Đặc biệt là mangan vì mangan ngăn cản sự phân cắt của tế bào và nó cần thiết cho quá trình sống bình thường của của vi khuẩn sau này. Mặt khác một vài enzym có sự tham gia của các ion kim loại như Fe2+, Mg2+, Mn2 trong cấu trúc của trung tâm hoạt động. Ngoài acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn có nhu cầu rất lớn về các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển của chúng như: acid hữu cơ (acid acetic…) có tác động đến sự sinh trưởng của tế bào, các bazơ nitơ như adenine, guanine, urasin, thimin…sẽ thúc đẩy sự phát triển nhất định của vi khuẩn, các acid amin như Lasparagin, L-glutamin. Nhiệt độ, pH là một trong những nhân tố quan trọng nhất ảnh hưởng tới sinh trưởng của vi khuẩn lactic. Tùy thuộc vào nhiệt độ tối ưu cho lên men và cho sự sinh trưởng, vi khuẩn lactic được chia làm hai loại: loại ưa nhiệt và loại ưu ấm. Loại ưa nhiệt gồm có: Lactobaterium bulgaricus, L. thermophilus, L. delbruckii…phát triển tốt ở 45÷620C. Loại ưa ấm gồm có: L. causasicus, L. lactic, L. helveticus, L. acidophilus, L. bifidus phát triển tốt ở 370C÷450C, L. casein, L. plantarum, L. leichmanii, L. brevis, L. buchneri, L. pastorianus phát triển tốt ở 28÷320C, pH thích hợp từ 6,3÷6,5. Lactobacillus casei Streptococcus cremoris Lactobacillus salivarius Hình 1.1 Hình ảnh tế bào của một số chủng vi khuẩn lactic [35, 36, 37] 1.1.4 Ứng dụng Từ xa xưa, vi khuẩn lactic được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực. Chúng được dùng để sản xuất acid lactic theo cách lên men đồng hình. Nguyên liệu dùng để sản xuất lactic là rỉ mật, đường, tinh bột đã được đường hóa. Nồng độ đường sử dụng cho quá trình lên men lactic từ 8÷20%. Nếu nguyên liệu là rỉ mật phải làm trong để loại bỏ -9- các hợp chất chứa nitơ. Quá trình lên men lactic xảy ra rất tốt trong môi trường acid, tuy nhiên vi khuẩn lactic không có khả năng chịu được nồng độ acid quá cao. Khi nồng độ acid quá cao sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lactic vì vậy cần phải điều chỉnh độ pH của môi trường từ 6,3÷6,5. Trong thực tế sản xuất người ta thường xuyên bổ sung cacbonatcanxi để giữ pH của môi trường không thay đổi. Acid lactic thu được sẽ ở dạng muối canxilactat. Trong quá trình lên men lactic có nhiều vi khuẩn tham gia vì vậy sản phẩm thu được ngoài acid lactic còn có CO2 và một số sản phẩm phụ khác. Ứng dụng vi khuẩn lactic trong công nghệ thực phẩm [2] Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên. Chúng tham gia vào nhiều hoạt động sống của con người trong đó đặc biệt quan trọng là ứng dụng trong chế biến thực phẩm. Ứng dụng để sản xuất dưa chua Quá trình muối chua rau quả chính là quá trình hoạt động sống của vi khuẩn lactic và vi khuẩn acetic. Trong quá trình phát triển của chúng trong rau quả, khi lên men sẽ tạo thành acid lactic và acid acetic cùng một số loại acid hữu cơ khác. Các acid hữu cơ này làm giảm pH của dịch, chống lại hiện tượng gây thối rữa rau, quả. Mặt khác, nhờ có lượng acid hữu cơ được tạo thành sẽ làm tăng hương vị của khối ủ rau quả. Chính vì thế, người ta cho rằng muối chua rau quả là quá trình vừa mang ý nghĩa chế biến vừa mang ý nghĩa bảo quản. Ứng dụng trong sản xuất tôm chua Từ xưa con nguời đã biết ứng dụng rộng rãi vi khuẩn lactic trong sản xuất các sản phẩm lên men chua trong đó có sản phẩm tôm chua. Quá trình lên men lactic trong các sản phẩm lên men chua làm tăng giá trị dinh dưỡng, vừa có thể chữa bệnh đường ruột giúp ta ăn ngon miệng, dễ tiêu hoá mà còn có tác dụng bảo quản sản phẩm lâu hơn, lại vừa đảm bảo an toàn sinh học. Ứng dụng trong sản xuất tương Sản xuất tương theo phương pháp của người miền Bắc (Việt Nam) có giai đoạn ngả nước đậu sau khi rang. Quá trình ngả nước đậu xảy ra nhiều phản ứng sinh hóa khác nhau, trong đó có quá trình lên men lactic tạo pH thích hợp cho sản phẩm và làm tăng hương vị chua sản phẩm.