Tài liệu Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh axit lactic cao từ thực phẩm lên men truyền thống (kl06030)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN HOÀNG THỊ THANH MÙI PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU VI KHUẨN LACTIC SINH AXIT LACTIC CAO TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN TRUYỀN THỐNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS. TRẦN THỊ THÚY HÀ NỘI, 2014 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN HOÀNG THỊ THANH MÙI PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU VI KHUẨN LACTIC SINH AXIT LACTIC CAO TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN TRUYỀN THỐNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS. TRẦN THỊ THÚY HÀ NỘI, 2014 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến TS. Trần Thị Thúy đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo cũng nhƣ truyền dạy những kinh nghiệm quý báu, ngƣời đã quan tâm và giúp đỡ em nhiệt thành trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài. Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung - Tổ trƣởng bộ môn Vi sinh, Khoa Sinh-KTNN-Trƣờng Đại học Sƣ Phạm Hà Nội 2, đã dạy cho em những bài học đầu tiên về Vi sinh, qua đó truyền cảm hứng cũng nhƣ niềm đam mê đƣợc thử sức với lĩnh vực này. Em cảm ơn cô đã tạo điều kiện cho em có đƣợc môi trƣờng làm việc tốt và giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và các cán bộ phòng thí nghiệm CNSH - Vi sinh, khoa Sinh học - Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu tại tổ bộ môn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ, động viên, cũng nhƣ những góp ý quý báu của các anh/chị và các bạn cùng làm việc trên phòng thí nghiệm. Cuối cùng tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những ngƣời đã tiếp thêm niềm tin, yêu thƣơng- mẹ và em trai - đã tƣ vấn, giúp đỡ con rất nhiều, cảm ơn những ngƣời bạn thân đã động viên tôi trong suốt quá trình. Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2014 Sinh viên Hoàng Thị Thanh Mùi LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả nghiên cứu, số liệu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực và không trùng với các tác giả khác. Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2014 Sinh viên Hoàng Thị Thanh Mùi CÁC TỪ VIẾT TẮT CFU : Colony Forming Unit Cs : Cộng sự ĐC : Đối chứng EM : Effective microorganism G+ : Gram dƣơng G- : Gram âm GRAS : Generally Regarded As Safe GYP : Glucose-Yeast extract-Peptone OD : Optical Density (mật độ quang) MRS : de Man - Rogosa - Sharpe Nxb : Nhà xuất bản STT : Số thứ tự VK : Vi khuẩn VSV : Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH DANH MỤC HÌNH Hình 1.1.Các kiểu lên men lactic ................................................................................... 6 Hình 1.2. Cấu trúc axit lactic ......................................................................................... 6 Hình 1.3. Hai loại đồng phân của axit lactic ................................................................... 7 Hình 2.4. Chuẩn độ bằng buret (a) và màu dung dịch sau chuẩn độ bằng dung dịch NaOH với sự có mặt của thuốc thử phnolphthalein (b) ............................... 15 Hình 2.5. Đồ thị chuẩn về mối tƣơng quan giữa số lƣợng tế bào/ml dịch nuôi và OD600 của chủng T6 ................................................................................ 17 Hình 2.6. Đồ thị chuẩn về mối tƣơng quan giữa số lƣợng tế bào/ml dịch nuôi và OD600 của chủng TH2 ........................................................................... 18 Hình 3.7. Phân lập vi khuẩn lactic trên đĩa Petri môi trƣờng MRS .............................. 20 Hình 3.8. Kiểm tra hoạt tính catalase của chủng vi khuẩn lactic TH2 (a) và thí nghiệm đối chứng trên vi khuẩn E. coli ................................................. 28 Hình 3.9. Chủng TH2 và T6 đƣợc nuôi trong ống Durham sau 48 giờ ........................ 28 Hình 3.10. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự sinh trƣởng, phát triển và sinh axit tổng số của chủng TH2 ........................................................................ 32 Hình 3.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh trƣởng, phát triển và sinh axit tổng số của chủng T6 ................................................................................... 33 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng MRS ....................................................................... 12 Bảng 2.2. Thành phần môi trƣờng GYP ....................................................................... 12 Bảng 3.3. Một số đặc điểm sinh học của 33 chủng vi khuẩn lactic .............................. 21 Bảng 3.4. Sự sinh trƣởng, phát triển và sinh tổng hợp axit lactic của 10 chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn .............................................................................. 25 Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn .......................................................................................... 26 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của pH ban đầu đến sinh trƣởng, phát triển và sinh axit tổng số của chủng TH2 ................................................................................ 30 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của pH ban đầu đến sinh trƣởng, phát triển và sinh axit tổng số của chủng T6 ........................................................................................... 31 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của một số môi trƣờng tự nhiên và môi trƣờng bán tổng hợp đến sinh trƣởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 ................................................................................................................. 34 Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của một số môi trƣờng cải tiến đến sinh trƣởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 ......................................... 36 Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của tỷ lệ nƣớc chiết bắp cải và môi trƣờng MRS đến sinh trƣởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6......... 37 MỤC LỤC MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………. 1 1. Lý do chọn đề tài .................................................................................................... 1 2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................... 2 3. Nhiệm vụ nghiên cứu .............................................................................................. 2 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu .......................................................................... 2 5. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................ 2 6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ................................................................................ 3 7. Những đóng góp mới của đề tài ............................................................................. 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 4 1.1. Vi khuẩn lactic ....................................................................................................... 4 1.1.1. Lƣợc sử nghiên cứu vi khuẩn lactic ...................................................................... 4 1.1.2. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic ...................................................................... 4 1.1.3. Các kiểu lên men lactic ở vi khuẩn lactic .............................................................. 5 1.2. Axit lactic ............................................................................................................... 6 1.3. Ứng dụng của vi khuẩn lactic ................................................................................ 7 1.3.1. Sử dụng vi khuẩn lactic để sản xuất axit lactic ..................................................... 7 1.3.2. Sử dụng vi khuẩn lactic trong nông nghiệp và môi trƣờng ................................... 8 1.3.3. Sử dụng vi khuẩn lactic trong công nghiệp chế biến bảo quản rau quả, thịt và thức ăn gia súc ...................................................................................................... 9 1.3.4. Sử dụng vi khuẩn lactic trong y học .................................................................... 10 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 11 2.1. Vật liệu và thiết bị ................................................................................................ 11 2.1.1. Vi sinh vật ............................................................................................................ 11 2.1.2. Máy móc, thiết bị ................................................................................................. 11 2.1.3. Hóa chất ............................................................................................................... 11 2.1.4. Môi trƣờng ........................................................................................................... 12 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 13 2.2.1. Phƣơng pháp làm mẫu phân lập ........................................................................ 13 2.2.2. Phân lập vi khuẩn lactic ..................................................................................... 13 2.2.3. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic sinh axit lactic cao ............................... 14 2.2.4. Xác định axit tổng số ......................................................................................... 14 2.2.5. Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn .................................................................... 15 2.2.5.1. Quan sát tế bào trên tiêu bản nhuộm đơn ......................................................... 15 2.2.5.2. Quan sát tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram ...................................................... 16 2.2.6. Bảo quản chủng giống ....................................................................................... 16 2.2.6.1. Bảo quản trên thạch nghiêng ........................................................................... 16 2.2.6.2. Bảo quản trong dung dịch 30% glycerin .......................................................... 16 2.2.6.3. Phƣơng pháp ria thuần chủng chủng giống ...................................................... 16 2.2.7. Phƣơng pháp xây dựng đồ thị chuẩn về mối tƣơng quan giữa số lƣợng tế bào vi khuẩn trong dịch nuôi cấy với giá trị OD600 ............................................ 16 2.2.8. Các phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý sinh hóa và khả năng sinh axit lactic của chủng đƣợc tuyển chọn ............................................................... 18 2.2.8.1. Phƣơng pháp xác định hoạt tính catalase ........................................................ 18 2.2.8.2. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh khí từ glucose ...................................... 18 2.2.8.3. Xác định ảnh hƣởng của các yếu tố lý hóa và môi trƣờng nuôi cấy tới sự sinh trƣởng, phát triển và sinh axit lactic ......................................................... 19 2.2.9. Phƣơng pháp thống kê và xử lí kết quả CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...................................... 20 3.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống và sơ tuyển các chủng sinh axit lactic cao ...................................................................................... 20 3.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh axit lactic cao .............................. 24 3.3. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn lactic TH2 và T6 .... 25 3.4. Ảnh hƣởng của một số yếu tố lý hóa đến sinh trƣởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 ................................................................... 29 3.4.1. Ảnh hƣởng của pH ban đầu đến sinh trƣởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 ................................................................................ 29 3.4.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh trƣởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 ......................................................................... 32 3.5. Ảnh hƣởng của một số môi trƣờng thay thế lên khả năng sinh trƣởng, phát triển và sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 ...................................................... 34 3.5.1. Ảnh hƣởng của một số môi trƣờng tự nhiên và môi trƣờng tổng hợp lên sự sinh trƣởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6………….. ...................................................................................................... 34 3.5.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nƣớc chiết giá đỗ và bắp cải cải tiến đến sinh trƣởng phát triển và sinh axit tổng số của chủng TH2 và T6 ............................. 35 3.5.3. Ảnh hƣởng của tỉ lệ nƣớc chiết bắp cải trộn với MRS đến sinh trƣởng, phát triển và hiệu suất sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 ........................................ KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 39 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Vi khuẩn (VK) lactic là nhóm vi sinh vật (VSV) có lịch sử và ứng dụng lâu đời. VK lactic đƣợc xem là an toàn (GRAS - Generally recognised as safe) và là loại VSV thực phẩm (food grade). Ứng dụng đầu tiên của VK lactic là trong ngành công nghiệp sản xuất axit lactic, một nguồn nguyên liệu rất cần thiết cho nhiều ngành. Axit lactic có tác dụng làm mềm và nở da (công nghiệp thuộc da), làm thuốc nhuộm (công nghiệp dệt), làm dung môi trong sơn (công nghiệp in ấn, sơn), làm tiền chất để tổng hợp chất dẻo sinh học PLA (poly lactic axit) và nhiều ứng dụng khác. Chất dẻo sinh học có thể phân hủy đang là xu hƣớng nghiên cứu và phát triển hiện nay. Các loại nhựa sinh học đang dần thay thế các loại nhựa có nguồn gốc dầu mỏ. PLA là sản phẩm nhựa trong suốt, phân hủy sinh học, đƣợc tổng hợp từ axit lactic. Đây là nguồn nguyên liệu mới thân thiện với môi trƣờng. Axit lactic có mặt trong hoa quả, các sản phẩm lên men lactic, nƣớc giải khát, ngoài tạo hƣơng còn kích thích sự tiết dịch vị, tăng nhu động ruột, thúc đẩy quá trình tiêu hóa. Axit lactic giảm mùi thực phẩm và độ ngấy sau bữa ăn nhiều năng lƣợng. Axit lactic giúp hòa tan các vitamin, khoáng chất. Muối lactate với các nguyên tố vi lƣợng cũng thƣờng đƣợc dùng làm dƣợc phẩm, bổ sung cho cơ thể dƣới dạng dễ hấp thu. Loại muối này còn đƣợc dùng trong công nghệ bảo quản thực phẩm: giò lụa, chả, xúc xích, mì sợi… thay cho hàn the. Với liều lƣợng phù hợp trong các sản phẩm đƣỡng da, axit lactic có tác dụng làm cho da mềm, mịn (giữ ẩm và trẻ hóa làn da), làm trắng da (do tính tẩy nhẹ của axit hữu cơ, trung hòa độ nhờn), đồng thời ngăn chặn sự xâm nhập của VK gây viêm nhiễm. Axit lactic tạo môi trƣờng toan, ức chế các VSV khác. Ở ngƣời, động vật, axit lactic có mặt ở ruột, âm đạo. Các sản phẩm lên men lactic cũng làm tăng cƣờng miễn dịch đƣờng ruột, giảm cholesterol, chống các tác nhân gây ung thƣ. Việt Nam từ xa xƣa đã có rất nhiều sản phẩm lên men truyền thống độc đáo và có giá trị thực tiễn cao. Do khả năng sinh nhiều loại chất ức chế VSV (axit lactic, 1 diacetyl, bacteriocin…), lên men lactic đã trở thành một giải pháp bảo quản thực phẩm hữu hiệu trong dân gian dƣới các hình thức: muối dƣa, muối cà, sản xuất nem chua, tôm chua,... Đây là nguồn VSV sinh axit lactic an toàn, cho axit lactic cao, dễ sản xuất, giá thành rẻ, tận dụng đƣợc nguồn nguyên liệu tự nhiên. Việc tuyển chọn những chủng VK lactic từ các sản phẩm lên men truyền thống có khả năng sinh axit lactic cao là một hƣớng nghiên cứu có triển vọng, phù hợp với công nghệ chế biến thực phẩm an toàn hiện nay. Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi đã chọn thực hiện đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh axit lactic cao từ thực phẩm lên men truyền thống”. 2. Mục đích nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu 1 - 2 chủng VK lactic sinh axit lactic cao từ thực phẩm lên men truyền thống để phục vụ công nghiệp chế biến thực phẩm. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu 3.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống và sơ tuyển các chủng sinh axit lactic cao 3.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh axit lactic cao 3.3. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn lactic TH2 và T6 3.4. Ảnh hƣởng của một số yếu tố lý hóa đến sinh trƣởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 3.5. Ảnh hƣởng của một số môi trƣờng thay thế lên khả năng sinh trƣởng, phát triển và sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu VK lactic đƣợc phân lập và tuyển chọn từ thực phẩm lên men truyền thống. 5. Phƣơng pháp nghiên cứu 5.1. Phƣơng pháp vi sinh học Phân lập VK lactic; làm tiêu bản, quan sát hình thái VK dƣới kính hiển vi, nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa và khả năng sinh axit lactic của chủng VK tuyển chọn; xác định số lƣợng tế bào VK trong dịch nuôi; bảo quản chủng giống 2 VSV. 5.2. Phƣơng pháp hóa sinh Chuẩn độ, xác định hàm lƣợng axit lactic trong dịch lên men. 5.3. Phƣơng pháp thống kê xác suất Phân tích và thống kê các số liệu thu đƣợc theo excel 2007. 6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 6.1. Ý nghĩa thực khoa học Dựa trên các nghiên cứu về VK lactic và các phƣơng pháp tăng hiệu suất lên men lactic trƣớc đây. 6.2. Ý nghĩa thực tiễn Tuyển chọn đƣợc 1 - 2 chủng VK lactic sinh axit lactic cao để phục vụ công nghiệp chế biến thực phẩm cũng nhƣ y học và dinh dƣỡng. 7. Những đóng góp mới của đề tài Tuyển chọn đƣợc 1 - 2 chủng VK lactic sinh axit lactic cao để phục vụ công nghiệp chế biến thực phẩm cũng nhƣ y học và dinh dƣỡng. 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vi khuẩn lactic 1.1.1. Lược sử nghiên cứu vi khuẩn lactic Con ngƣời từ lâu đã biết chế biến các loại thức ăn chua (sữa chua, phomát, muối dƣa, muối cà…), ủ chua thức ăn cho gia súc để tăng thời gian bảo quản cũng nhƣ tăng hƣơng vị cho sản phẩm. Cho đến những năm 80 của thế kỉ 18, VK lactic mới đƣợc giới khoa học phát hiện và bắt đầu chú ý nghiên cứu. Năm 1780, nhà hóa học Thụy Điển Carl Wilhelm Scheele lần đầu tiên tách đƣợc axit lactic từ sữa bò lên men chua gọi là “axit sữa”… Nhƣng mãi đến năm 1857, Louis Pasteur mới chứng minh đƣợc việc làm chua sữa là kết quả hoạt động của một nhóm VK đặc biệt là VK lactic [7]. Năm 1878, Joseph Lister phân lập thành công VK lactic đầu tiên và đặt tên là Bacterium lactic (nay gọi là Streptococus lactic) [7]. Đến nay, các nhà khoa học đã phân lập và nghiên cứu nhiều loại VK lactic từ nhiều nguồn cơ chất khác nhau trong tự nhiên: trong phân, rác, xác động thực vật, trong các sản phẩm muối chua [15]… thậm chí trong niêm mạc đƣờng tiêu hóa, âm đạo của ngƣời và động vật [22], [24]. Ngoài ra, một số loài VK lactic sống kí sinh trên cơ thể thực vật, hút các chất tiết từ mô cây [23], [24]. 1.1.2. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic VK lactic là tên gọi chung của những VK sinh axit lactic nhƣ là sản phẩm chính trong quá trình chuyển hóa cacbonhydrat [7]. Do đặc tính chung này, các VK lactic đƣợc xếp chung vào họ Lactobacteriaceace mặc dù chúng không đồng nhất về mặt hình thái (bao gồm cả các VK dạng que ngắn, que dài, lẫn các VK hình cầu) [1]. VK lactic đƣợc đặc trƣng bởi khả năng sinh axit lactic từ các loại đƣờng khác nhau, đặc biệt là đƣờng lactose. Hầu hết các VSV sinh axit lactic đều thuộc về họ Lactobacteriaceae và đƣợc xếp vào 13 chi: Carnobacterium, Enterococcus, Lactosphaera, Lactococcus, Melissococcus, Oenococus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weissella, Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc 4 [24]. Chúng có tế bào dạng hình cầu hoặc hình que, thành tế bào Gram dƣơng, không di động, không sinh nội bào tử. Tuy nhiên, hiện nay ngƣời ta tìm thấy một số giống trong họ VK lactic có khả năng sinh nội bào tử. VK lactic không khử nitrate, phản ứng catalase âm tính, kỵ khí tùy nghi, một vài loài kị khí bắt buộc sống trong hệ tiêu hóa của con ngƣời. VK lactic là những VK đa khuyết dƣỡng. Để sinh trƣởng bình thƣờng ngoài nguồn cacbon, chúng cần nitơ, một phần dƣới dạng các axit amin, một số vitamin, nhiều yếu tố sinh trƣởng và khoáng vi lƣợng khác nhau… Chúng không thể phát triển đƣợc trong môi trƣờng đơn giản chỉ gồm có đƣờng glucose và các khoáng chất. Vì thế, ngƣời ta thƣờng phải bổ sung vào môi trƣờng một số dịch chiết giàu dinh dƣỡng nhƣ: cao nấm men, cao thịt, các loại nƣớc chiết rau, củ, quả…. VK lactic đƣợc tìm thấy khắp nơi trong tự nhiên: dƣới da, trong hệ tiêu hóa, trên bề mặt hoa quả và đặc biệt là các sản phẩm lên men truyền thống… 1.1.3. Các kiểu lên men lactic ở vi khuẩn lactic Có hai kiểu lên men lactic là lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình. Lên men lactic đồng hình tạo ra axit lactic là sản phẩm trao đổi chất chính (chiếm > 90%). Trong khi đó, lên men lactic dị hình ngoài tạo ra axit lactic (50-60% lƣợng sản phẩm trao đổi chất) còn tạo ra ethanol, axit acetic, glycerol và một số hợp chất khác. Do vậy, lên men lactic đồng hình có ý nghĩa về mặt ứng dụng trong công nghiệp sản xuất axit lactic [4] . 5 Hình 1.1.Các kiểu lên men lactic 1.2. Axit lactic Axit lactic là chất hữu cơ không màu, mùi nhẹ, tan trong nƣớc và cồn. Công thức hóa học của axit lactic là CH3CHOHCOOH (Hình 1.2 [25]). Đây là axit alpha hydroxy (AHA), trong dung dịch, nó có thể mất một proton từ nhóm axit tạo ra ion lactate CH3CHOHCOO-. Khối lƣợng phân tử của axit lactic là 90,08g. Nhiệt độ sôi là 1220C, điểm tan 10C. Hình 1.2. Cấu trúc axit lactic Axit lactic còn có tên gọi khác là 1- hydroxyethanol cacboxylic hay axit 2 hydroxypropanoic. Trong cấu tạo phân tử của chúng có một cacbon bất đối xứng nên chúng có hai đồng phân quang học: D - axit lactic và L - axit lactic. Hai đồng 6 phân quang học này có tính chất hóa lý giống nhau, nhƣng chỉ khác là khả năng làm quay mặt phẳng phân cực của ánh sáng. Do đó tính chất sinh học của chúng hoàn toàn khác nhau. Loại L - axit lactic ở dạng tinh thể, tan trong nƣớc, cồn etylic, eter, không tan trong CHCl3. Nhiệt độ nóng chảy là 280C, góc quay cực ở 150 là 2,670. Loại D - axit lactic ở dạng tinh thể, tan trong nƣớc, cồn. Nhiệt độ nóng chảy là 280C, nhiệt độ sôi là 1030C, góc quay cực ở 150 là -2,260. Nếu D - axit lactic và L - axit lactic có trong một hỗn hợp theo tỉ lệ 50 : 50 ngƣời ta gọi là hỗn hợp Raxemic. Hỗn hợp này đƣợc kí hiệu là DL - axit lactic. Trong quá trình lên men không khi nào có một hỗn hợp có tỉ lệ lí tƣởng này mà chỉ có khi tiến hành tổng hợp hữu cơ. DL - axit lactic là dịch lỏng dạng siro, có khả năng tan trong nƣớc, trong cồn, không tan trong CHCl3, nhiệt độ nóng chảy 16,70C, nhiệt độ sôi 1220C [9]. Tùy thuộc vào loài và điều kiện nuôi cấy, VK lactic sản xuất hai loại đồng phân quang học: D (-) và L (+) lactic. Ở ngƣời, cả 2 loại đồng phân này đều đƣợc hấp thu trong đƣờng ruột. Hình 1. 3. Hai loại đồng phân của axit lactic 1.3. Ứng dụng của vi khuẩn lactic VK lactic đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: công nghiệp, nông nghiệp, y dƣợc, và nhiều nhất là trong chế biến và bảo quản thực phẩm. Trong những năm gần đây, VK lactic đƣợc quan tâm nghiên cứu nhƣ là nguồn VSV hữu ích bổ sung vào chế phẩm probiotics cho ngƣời và vật nuôi. 1.3.1. Sử dụng vi khuẩn lactic để sản xuất axit lactic Năm 1881, con ngƣời đã bắt đầu ứng dụng VK lactic để sản xuất axit lactic 7 trên quy mô công nghiệp. Lên men lactic là quá trình trao đổi chất và năng lƣợng chủ yếu của nhiều nhóm VK lactic. Quá trình lên men này chuyển hóa đƣờng lactose hoặc glucose, galactose thành nguồn năng lƣợng ATP phục vụ cho mọi hoạt động sống của VK lactic. Axit lactic là sản phẩm phụ của quá trình lên men, đƣợc VK tiết ra bên ngoài tế bào [1]. Axit lactic đƣợc con ngƣời sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau bởi những ƣu điểm sau: - Tăng cƣờng khả năng tiêu hóa protein sữa. - Kích thích sự tiết dịch vị. - Tăng nhanh cử động đầy thức ăn đi xuống dạ dày. - Ức chế sinh trƣởng, phát triển của một số VSV gây bệnh trong đƣờng tiêu hóa. - Là nguồn năng lƣợng cho quá trình hô hấp tế bào khi cần thiết. Chính những ƣu điểm trên đã phần nào chứng minh hiệu quả của việc ứng dụng VK lactic trong công nghiệp chế biến sữa, phomat, xúc xích, dƣa chua; thịt, tôm, cá muối chua; trong ủ chua thức ăn xanh; làm probiotics. Axit lactic đƣợc sử dụng trong công nghiệp thuộc da (làm mềm và làm nở da), trong công nghiệp dệt (làm thuốc nhuộm), trong công nghiệp mỹ phẩm (làm nguyên liệu tạo các sản phẩm dƣỡng tóc, giảm sự lão hóa của tóc), trong in ấn, sơn và chế tạo chất dẻo... Muối lactate với các nguyên tố khoáng thƣờng đƣợc dùng làm dƣợc phẩm nhằm bổ sung cho cơ thể dƣới dạng dễ hấp thụ: lactate sắt đƣợc dùng để bổ sung sắt cho những bệnh nhân thiếu máu; lactate canxi bổ sung canxi cho những bệnh nhân loãng xƣơng… Ngoài ra, axit lactic còn đƣợc dùng để làm hạ pH đƣờng ruột xuống 4 - 5. Do đó, ức chế sự phát triển của VSV gây thối và E. coli (loại VSV thích nghi ở pH 6 - 7). 1.3.2. Sử dụng vi khuẩn lactic trong nông nghiệp và môi trường VK lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium - loại nấm gây bệnh điển hình trong đất. Nấm Fusarium khi phát triển quanh vùng rễ cây sẽ làm cây yếu đi tạo điều kiên cho các bệnh cơ hội gây bệnh cho cây trồng [2]. 8 Chế phẩm EM (Effective microorganism) hay chế phẩm vi sinh hữu hiệu, bao gồm 80 chủng VSV trong đó có sự góp phần của VK lactic. Hiệu quả của chế phẩm này là cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trƣờng [2]. 1.3.3. Sử dụng vi khuẩn lactic trong công nghiệp chế biến bảo quản rau quả, thịt và thức ăn gia súc VK lactic là những VSV có nhiều đặc tính tốt nhƣ: sử dụng đƣợc nhiều nguồn cacbon khác nhau, có khả năng sinh axit và nhiều chất ức chế khác nhau, phát triển đƣợc ở nhiệt độ khá rộng và chịu mặn... nên chúng đƣợc sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm. Quá trình lên men lactic của VSV sinh ra các axit hữu cơ (axit lactic, axit acetic...) do đó làm giảm pH môi trƣờng. Dƣới tác động của pH thấp, hầu hết các VSV gây bệnh, gây hỏng thối thực phẩm nhƣ E. coli, Pseudomonas sp., Sarcina sp., Samonella sp., B. cereus, P. vulgaris, B. mensenterium, Clostridium hay Archromobacter … [10], [12] đều bị tiêu diệt. Bacteriocin là một phát hiện có giá trị trong bảo quản thực phẩm nói chung, trong thực phẩm lên men nói riêng. Bacteriocin là những peptide hay protein, đƣợc tổng hợp ở riboxom của VK có khả năng ức chế các VSV có quan hệ về chủng loài gần với chủng sinh ra bacteriocin. Sữa chua là sản phẩm sữa lên men lactic nhờ một hoặc vài chủng VK lactic khác nhau. Hai chủng: Streptococcus thermophilus và Lactobacillus bulgaricus là hai chủng VK lactic thƣờng đƣợc sử dụng trong lên men sữa chua. Sử dụng lên men lactic để chế biến các sản phẩm rau, quả, thịt, cá, sữa là một phƣơng pháp bảo quản thực phẩm phổ biến hiện nay. Lên men lactic không những giúp kéo dài thời gian bảo quản các sản phẩm thực phẩm để cung cấp cho ngƣời tiêu dùng ở những khu vực xa xôi, khi thời tiết xấu, khan hiếm rau tƣơi, lúc giáp vụ,… mà còn tạo ra sự đa dạng về sản phẩm thực phẩm với màu sắc, độ rắn chắc và hƣơng vị mong muốn nhƣ: phomát, xúc xích, nem chua... [3]. Lên men lactic đƣợc sử dụng rộng rãi trong sản xuất các thực phẩm muối chua truyền thống nhƣ: nem chua, tôm chua, thịt chua, rau quả muối chua… ở khắp nơi 9 trên thế giới. Từ các sản phẩm đặc trƣng nhƣ kim chi Hàn Quốc, nem chua Việt Nam, nham của Thái Lan đến các sản phẩm rau quả muối chua nhƣ cải bắp Sauerkraut của Đức, rau dƣa muối chua vùng Đông Nam Á… [11], [19]. Đây là loại thực phẩm đƣợc sản xuất thủ công, mang sắc thái kinh nghiệm và bản sắc riêng của từng dân tộc. Ngoài ra, lên men lactic còn đƣợc sử dụng để ủ chua thức ăn xanh cho gia súc, dự trữ một nguồn thức ăn giàu dinh dƣỡng cho gia súc trong suốt mùa khô, mùa đông lạnh. 1.3.4. Sử dụng vi khuẩn lactic trong y học Gần đây, ngƣời ta đã phát hiện một vai trò lớn của VK lactic đối với sức khỏe con ngƣời cũng nhƣ các động vật nuôi. Một số VK lactic sinh “kháng sinh” đƣợc sử dụng làm chế phẩm “men tiêu hóa sống” probiotics để chữa một số bệnh rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy và phục hồi cân bằng hệ VSV đƣờng ruột. Trong đó, nổi bật là Lacidophilus, khi đƣợc bổ sung vào đƣờng tiêu hóa, chúng phát triển tại ruột già, ức chế một số VK gây bệnh đƣờng ruột. Nhờ vào khả năng sinh axit lactic và bacteriocin trong đƣờng ruột, Lactobacillus cải thiện đƣợc tình trạng tiêu chảy, tăng nhu động ruột, chữa đƣợc chứng táo bón. Các chế phẩm chứa Lactobacillus đều cho thấy hiệu quả trong chữa trị các bệnh rối loạn và viêm nhiễm, bao gồm: viêm ruột kết, đầy hơi, ung bƣớu, làm hạ cholesterol trong máu, đau đầu, viêm âm đạo không điển hình và cải thiện đƣợc tình trạng không sử dụng đƣợc lactose. 10