Tài liệu Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng phân huỷ rơm rạ thành phân hữu cơ (kl06217)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN LÊ THỊ THÙY DUNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY RƠM RẠ THÀNH PHÂN HỮU CƠ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học 1. TS. PHƢƠNG PHÚ CÔNG 2. PGS. TS ĐINH THỊ KIM NHUNG HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài này, em nhận được sự giúp đỡ tận tình của thầy cô giáo, gia đình và bạn bè. Khi hoàn thành khóa luận em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Phương Phú Công và PGS. TS Đinh Thị Kim Nhung người đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn tất cả các thầy cô giáo và cán bộ trong tổ Thực vật - Vi sinh, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giúp đỡ em trong thời gian làm khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn trong nhóm vi sinh đã giúp đỡ tôi trong thời gian qua. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Lê Thị Thùy Dung LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ” là do tôi thực hiện, không sao chép lại của ai. Tất cả các số liệu đều thu thập từ thực nghiệm, qua xử lí thống kê, không có số liệu sao chép không trùng với kết quả của tác giả nào đã công bố. Trong đề tài tôi có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, tôi xin phép tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận tốt nghiệp của mình. Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Lê Thị Thùy Dung DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CFU : Colony forming unit CMC : Cacboxyl methyl cellulose d : Đường kính lỗ thạch D : Đường kính vòng phân giải ĐC : Đối chứng G : Gram HCVS : Hữu cơ vi sinh M : Nấm mốc mẫu làm giàu MPA : Meat peptone agar MT : Môi trường NM : Nấm mốc PTN : Phòng thí nghiệm RBBR : Remazol Brilliant Blue R STT : Số thứ tự TN : Thí nghiệm U :Ủ UBND : Ủy ban nhân dân Un : Nấm mốc mẫu ủ Uv : Vi khuẩn mẫu ủ Ux : Xạ khuẩn mẫu ủ V : Vi khuẩn mẫu làm giàu VK : Vi khuẩn VQG : Vườn quốc gia VSV : Vi sinh vật X : Xạ khuẩn mẫu làm giàu XK : Xạ khuẩn MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................................... 1 2. Mục tiêu của đề tài ......................................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................................... 2 3.1. Phân lập VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ ........................... 2 3.2. Tuyển chọn tổ hợp VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ ........... 2 3.3. Thử nghiệm ủ rơm rạ quy mô PTN với các chủng VSV tuyển chọn ..................... 2 4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài........................................................................... 2 4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài .................................................................................... 2 4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài .................................................................................... 2 5. Điểm mới của đề tài ....................................................................................................... 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 3 1.1. Hệ vi sinh vật đất ........................................................................................................ 3 1.1.1. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất .................................................................... 3 1.1.2. Vi sinh vật có khả năng phân hủy lignocellulose ................................................ 4 1.2. Thực trạng sử dụng rơm rạ tại Việt Nam .................................................................... 7 1.2.1. Sử dụng rơm để trồng nấm rơm ........................................................................... 8 1.2.2. Sử dụng rơm rạ để sản xuất phân hữu cơ vi sinh ................................................. 9 1.2.3. Một số ứng dụng khác trong sử dụng rơm rạ ở nước ta....................................... 9 1.3. Sự phân bố và cấu trúc của cellulose trong tự nhiên ................................................. 9 1.3.1. Sự phân bố của cellulose trong tự nhiên .............................................................. 9 1.3.2. Cellulose ............................................................................................................ 10 1.3.3. Hemicellulose .................................................................................................... 11 1.3.4. Lignin ................................................................................................................. 12 1.3.5. Cơ chế chuyển hóa lignocellulose ..................................................................... 13 1.4. Các bước của quy trình chế tạo chế phẩm vi sinh phân hủy rác thải hữu cơ ............ 16 1.5. Lịch sử phát triển phân bón vi sinh........................................................................... 17 1.5.1. Trên thế giới ....................................................................................................... 17 1.5.2. Ở Việt Nam ........................................................................................................ 17 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 19 2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................... 19 2.2. Hóa chất, thiết bị ....................................................................................................... 19 2.2.1. Hóa chất ............................................................................................................. 19 2.2.2. Thiết bị ............................................................................................................... 19 2.3. Các loại môi trường nuôi cấy.................................................................................... 19 2.3.1. Môi trường phân lập và giữ giống vi khuẩn MPA............................................. 19 2.3.2. Môi trường phân lập và giữ giống xạ khuẩn Gauze I ........................................ 20 2.3.4. Môi trường phân lập và giữ giống nấm mốc Crapeckdox ................................. 20 2.3.5. Môi trường phân lập và giữ giống nấm men Hansen ........................................ 20 2.3.6. Môi trường thử hoạt tính sinh tổng hợp enzyme của các chủng VSV ............... 20 2.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 21 2.4.1. Phương pháp vi sinh học.................................................................................... 21 2.4.2. Phương pháp toán học trong thống kê và xử lý số liệu...................................... 24 2.6. Địa điểm thực hiện đề tài .......................................................................................... 25 2.7. Thời gian thực hiện đề tài ......................................................................................... 25 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 26 3.1. Phân lập VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ ............................. 26 3.1.1. Kết quả lấy mẫu ................................................................................................ 26 3.1.2. Thí nghiệm với khối ủ mẫu lớn ......................................................................... 29 3.1.3. Kết quả phân lập ................................................................................................ 31 3.2. Tuyển chọn tổ hợp vi sinh vật có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ .... 33 3.3. Thử nghiệm ủ rơm rạ quy mô PTN với các chủng VSV tuyển chọn ....................... 41 3.3.1. Kết quả kiểm tra tính đối kháng của các chủng VSV tuyển chọn ..................... 41 3.3.2. Kết quả xác định hàm lượng giống ban đầu bổ sung vào khối ủ ....................... 43 3.3.3. Thử nghiệm ủ rơm rạ quy mô phòng thí nghiệm ............................................... 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 47 1. Kết luận ........................................................................................................................ 47 2. Kiến nghị...................................................................................................................... 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 48 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cấu trúc của phân tử cellulose ............................................................................. 11 Hình 3.1. Thí nghiệm ủ mẫu khối lớn .................................................................................. 30 Hình 3.2. Biểu đồ biểu diễn sự biến thiên nhiệt độ của U1 và U2 ...................................... 30 Hình 3.3. VSV phân lập trên môi trường thạch đĩa ............................................................. 32 Hình 3.4. Hoạt tính một số VSV tuyển chọn trên MT cơ chất bột giấy .............................. 38 Hình 3.5. Hoạt tính một số chủng VSV tuyển chọn trên MT cơ chất CMC........................ 39 Hình 3.6. Hoạt tính một số chủng VSV tuyển chọn trên MT cơ chất xylan, RBBR ........... 39 Hình 3.7. Khuẩn lạc các chủng VSV tuyển chọn trên môi trường thạch đĩa ....................... 40 Hình 3.8. Kết quả kiểm tra tính đối kháng của 10 chủng VSV tuyển chọn......................... 42 Hình 3.9. Biểu đồ biểu diễn sự biến thiên nhiệt độ của các đống ủ ..................................... 44 Hình 3.10. Biểu đồ biểu diễn độ giảm khối lượng của các đống ủ ...................................... 46 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Môi trường thử hoạt tính ..................................................................................... 20 Bảng 3.1. Kết quả lấy mẫu ................................................................................................... 26 Bảng 3.2. Hàm lượng nitơ bổ sung ...................................................................................... 27 Bảng 3.3. Độ giảm trọng lượng cơ chất, m(g), sau 4 tuần ủ làm giàu ở nhiệt độ phòng .. 28 Bảng 3.4. Tỉ lệ phối trộn tiến hành thí nghiệm ủ mẫu ......................................................... 29 Bảng 3.5. Kết quả phân lập .................................................................................................. 32 Bảng 3.6. Theo dõi hoạt tính của các chủng có hoạt tính lignocelluase ............................. 34 Bảng 3.7. Hoạt tính enzyme ngoại bào của 10 chủng VSV tuyển chọn .............................. 37 Bảng 3.8. Hàm lượng vi khuẩn bổ sung .............................................................................. 43 Bảng 3.9. Hàm lượng xạ khuẩn, nấm mốc bổ sung ............................................................. 43 Bảng 3.10. Tỉ lệ phối trộn các thành phần ủ rơm rạ ............................................................ 44 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Hàng năm, tại vùng nông thôn miền Bắc sau thu hoạch lúa sinh ra một lượng rơm rạ khổng lồ. Với phế phẩm giàu cellulose này, một lượng rất ít được sử dụng để trồng nấm hay làm thức ăn gia súc, phần lớn được xử lý theo phương pháp truyền thống là đốt trực tiếp trên đồng ruộng, điều này gây ra nhiều hậu quả như góp phần làm ô nhiễm không khí, phá hủy hệ sinh thái đất và đất ngày càng bạc màu. Người dân đốt rơm tại ruộng và ngay cả trên đường, không những gây lãng phí mà còn gây khói bụi, gây ô nhiễm môi trường do khói đốt rơm rạ có tỉ lệ tro bụi cao, các khí CO, CO2, NO2, SO2… gây ảnh hưởng tới sức khỏe của người dân xung quanh. Việc đốt rơm rạ trong những ngày nắng nóng còn gây nguy cơ cháy nổ cao và gây nguy cơ tai nạn giao thông khi khói bụi trở nên mù mịt. Trong khi đó lượng rơm rạ thải ra sau mỗi vụ thu hoạch rất lớn. Trước thực trạng đó, một giải pháp hữu hiệu để xử lý các phụ phẩm nông nghiệp nhằm tận thu nguồn nguyên liệu này là sử dụng những phế phẩm bỏ đi trong nông nghiệp như rơm rạ để ủ phân hữu cơ. Việc này giúp cho bà con nông dân không những tiết kiệm chi phí mua phân hóa học mà còn giúp cải tạo đất, đảm bảo sức khỏe cho người sử dụng và hạn chế tác động xấu đến môi trường. Phân hữu cơ có thể đem bón cho đất trước khi gieo trồng làm tăng lượng dinh dưỡng hữu cơ bổ sung cho đất, nâng cao độ phì nhiêu của đất, làm cho đất tơi, xốp, tăng lượng oxy hòa tan trong đất. Ngoài ra, phân hữu cơ sau khi ủ có thể tiêu diệt được các nguồn bệnh tàn dư trong nguyên liệu ủ nên không mang tác nhân gây bệnh cho cây trồng. Từ những yêu cầu thực tiễn của ngành nông nghiệp, tôi tiến hành đề tài: “Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ”. 1 2. Mục tiêu của đề tài Phân lập, tuyển chọn được tổ hợp vi sinh vật có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Phân lập VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ 3.2. Tuyển chọn tổ hợp VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ 3.3. Thử nghiệm ủ rơm rạ quy mô PTN với các chủng VSV tuyển chọn 4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài Đề tài nhằm phân lập tuyển chọn được các chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phân giải lignocellulose. Góp một phần nhỏ bổ sung cho các nghiên cứu về chế phẩm vi sinh vật sử dụng trong sản xuất phân bón nói riêng và ứng dụng trong đời sống nói chung phù hợp với điều kiện kinh tế Việt Nam. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Tận dụng nguồn nguyên liệu rơm rạ sau mỗi vụ thu hoạch, tuyển chọn được tổ hợp vi sinh vật hữu hiệu để ủ phân hữu cơ góp phần làm giảm lượng rác thải nông nghiệp tránh ô nhiễm môi trường, nâng cao hiệu quả canh tác nông nghiệp. 5. Điểm mới của đề tài Đây là những kết quả nghiên cứu đầu tiên khảo sát sự có mặt của một số chủng VSV có khả năng sinh enzyme lignocellulase trong đất tại 3 địa điểm: Khu vực đất nông nghiệp huyện Mê Linh (Hà Nội), VQG Ba Vì (Hà Nội), VQG Tam Đảo (Vĩnh Phúc). 2 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Hệ vi sinh vật đất 1.1.1. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất Vi sinh vật phân bố ở khắp mọi nơi trên trái đất, nhưng phân bố nhiều nhất là ở trong môi trường đất. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất còn gọi là hệ sinh vật đất. Bởi vì trong môi trường đất nói chung và trong đất trồng nói riêng cung cấp một nguồn thức ăn phong phú cho vi sinh vật. Các chất vô cơ có trong đất là nguồn thức ăn cho nhóm vi sinh vật tự dưỡng, chúng chuyển hóa các hợp chất này, ví dụ chuyển hóa các hợp chất của S, P, Fe… Các chất hữu cơ là nguồn thức ăn cho vi sinh vật tự dưỡng, ví dụ vi sinh vật phân giải cellulose, vi sinh vật phân giải protein… Các chất dinh dưỡng phân bố không đồng đều trong đất, cho nên ở các tầng đất khác nhau, sự phân bố của vi sinh vật cũng khác nhau vì nó phụ thuộc vào hàm lượng chất dinh dưỡng. Mức độ thoáng khí của đất cũng là một điều kiện ảnh hưởng đến sự phân bố của vi sinh vật. Các nhóm hiếu khí phát triển nhiều ở những nơi có nồng độ oxi cao, hàm lượng oxi thấp hơn thường phân bố nhiều loại vi sinh vật kị khí. Độ ẩm và nhiệt độ trong đất cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật đất. Đại đa số các loài vi khuẩn có ích đều phát triển mạnh mẽ ở độ ẩm từ 60% ÷ 80%. Độ ẩm quá thấp hoặc quá cao đều ức chế vi sinh vật. Chỉ có nấm mốc và xạ khuẩn là phát triển được ở những điều kiện khô. Nếu độ ẩm thấp dưới 20% vi khuẩn phát triển kém nhưng xạ khuẩn lại phát triển mạnh. Đất vùng nhiệt đới có độ ẩm 70% ÷ 80% và nhiệt độ 20 ÷ 300C, đó là điều kiện thích hợp với đa số vi sinh vật. Bởi vậy trong mỗi gram đất trồng thường có hàng triệu đến hàng tỉ tế bào 3 vi sinh vật bao gồm nhiều nhóm khác nhau về vị trí phân loại cũng như hoạt tính sinh lý, sinh hóa. Các nhóm vi sinh vật chính trong đất là: Vi khuẩn, vi nấm, vi tảo, động vật nguyên sinh trong đó vi khuẩn là nhóm chiếm nhiều nhất về số lượng. Trung bình trong đất vi khuẩn chiếm khoảng 90% tổng số, xạ khuẩn 8%, vi nấm 1% còn lại 1% là tảo và động vật nguyên sinh. Tỉ lệ này thay đổi tùy theo loại đất khác nhau cũng như khu vực địa lý khác nhau, tầng đất, thời vụ, chế độ canh tác… Ở những nơi có đầy đủ chất dinh dưỡng, độ thoáng khí tốt, nhiệt độ, độ ẩm và pH thích hợp thì vi sinh vật phát triển nhiều về số lượng và thành phần sự phát triển của vi sinh vật lại chính là nhân tố làm cho đất thêm phì nhiêu [3]. 1.1.2. Vi sinh vật có khả năng phân hủy lignocellulose 1.1.2.1. Vi sinh vật phân hủy cellulose Trong tự nhiên, khu hệ vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose vô cùng phong phú bao gồm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn. a) Nấm sợi Trong rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulase thì nấm sợi thuộc nhóm có khả năng tổng hợp cellulase mạnh nhất. Chúng là những vi sinh vật thuộc nhóm hạ đẳng, không có diệp lục, chúng chủ yếu sống hoại sinh ở trong đất và tiết ra môi trường một lượng lớn enzyme chuyển hoá các tàn dư của thực vật thành những chất dinh dưỡng cung cấp cho cây và làm cho đất trở nên màu mỡ hơn [9]. Trong thực tế không có một loại nấm hay vi sinh vật nào có khả năng sinh tổng hợp đầy đủ cả một phức hệ enzyme cần cho quá trình chuyển hoá cellulose đến sản phẩm cuối cùng mà mỗi loài chỉ có thể sinh tổng hợp một vài loại enzyme. Các loại nấm đáng chú ý nhất là: Alternaria tenuis, 4 Aspergillus wentii, Aspergillus fumigatus, Trichoderma reesei, Fusarium solani, Penicillium pinophinum,, Aspergillus niger... [8]. Các nấm ưa nhiệt cũng được chú ý vì chúng có thể tổng hợp các enzyme bền nhiệt hơn, chúng sinh trưởng và phân giải nhanh cellulose nhưng hoạt tính cellulase của dịch lọc lại thấp. Nấm có khả năng sinh trưởng và sản xuất cellulase cực đại ở phạm vi pH bằng 3,5 - 6,6 [9]. b) Vi khuẩn Từ thế kỷ XIX, các nhà khoa học đã nghiên cứu và nhận thấy một số vi sinh vật kị khí có khả năng phân giải cellulose. Những năm đầu thế kỷ XX (1903) G.Van Iterson phân lập được các vi khuẩn hiếu khí cũng có khả năng này. Trong các vi khuẩn hiếu khí phân giải cellulose, niêm vi khuẩn chiếm một vị trí quan trọng, chúng thường có hình que nhỏ bé hơi uốn cong, có thành tế bào mỏng, bắt màu thuốc nhuộm kém, chủ yếu ở các giống Cytophaga, Sporocytophaga và Sorangium. Niêm vi khuẩn nhận năng lượng khi oxy hoá các sản phẩm của sự phân giải cellulose thành CO2 và H2O [9]. Ngoài ra còn thấy các loài thuộc giống Cellvibrio cũng có khả năng phân huỷ cellulose. Trong điều kiện kị khí, các loài ưa ấm hoặc ưa nhiệt thuộc giống Clostridium và Bacillus tiến hành phân giải cellulose. Chúng phát triển yếu trên môi trường chứa đường đơn. Khi phân giải cellulose thành glucose và xenlobiose, chúng sử dụng các đường này như nguồn năng lượng và nguồn cacbon cũng thường kèm theo việc tạo thành các axit hữu cơ CO2 và H2O. Trong dạ cỏ của các động vật ăn cỏ có một hệ vi sinh vật đặc biệt. Chúng có khả năng phân giải cellulose thành các sản phẩm. Các vi sinh vật đó thường là: Ruminococcus albus, Ruminococcus flavofaciens, Butyrivibrio fibrisolvens, Cillobacterium cellulosolvens, Bacteroides amylophillus, Bacteroides ruminicola, Clostridium perfringens, Clostridium butycium... [9]. 5 c) Xạ khuẩn Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn đặc biệt, tế bào đặc trưng bởi sự phân nhánh, đa số sống trong đất gram dương và hiếu khí. Dựa vào đặc điểm về nhiệt độ sinh trưởng, người ta chia xạ khuẩn thành hai dạng: Xạ khuẩn ưa ấm : phát triển tốt ở nhiệt độ 25 – 300C Xạ khuẩn ưa nhiệt : phát triển tốt ở nhiệt độ 50 – 700C Xạ khuẩn có mặt ở khắp mọi nơi đặc biệt trong đất. Cellulase của xạ khuẩn là enzyme ngoại bào [7]. Hungater phân lập được loài Micromonospora có khả năng thuỷ phân cellulose. Các xạ khuẩn khác nhau có nhu cầu khác nhau về dinh dưỡng. Nhiều nhóm đòi hỏi nguồn dinh dưỡng cao. Các môi trường có dịch chiết nấm men, pepton, dịch thuỷ phân cazêin thường thuận lợi cho sinh trưởng. Xạ khuẩn thường sinh sản bằng cách đứt đoạn hay phân chia tế bào bình thường. Bào tử của xạ khuẩn thường có hình cầu hay hình bầu dục chứa axitdipicolinic, canxi và một số ít magiê là chất quyết định tính kháng nhiệt của chúng. Các xạ khuẩn khác nhau có nhu cầu khác nhau về dinh dưỡng. Việc hình thành cuống bào tử diễn ra mạnh hơn khi thêm các nguyên tố vi lượng [9]. Veigia và cộng sự đã phân lập được 36 chủng xạ khuẩn từ bùn ở vịnh Lacoruva (Tây Ban Nha), trong đó có 19 chủng có khả năng tổng hợp cellulose và sinh trưởng tốt trong môi trường chứa 3,5% NaCl. Mandels và cộng tác viên nghiên cứu khả năng tổng hợp enzyme cellulase của hai chủng Streptomyces antibioticus và Streptomyces sp. với cơ chất là CMC, nhiệt độ tối thích là 370C và pH tối thích là 5,9 [9]. 1.1.2.2. Vi sinh vật phân hủy hemicellulose Hemicellulase là enzyme ít người nghiên cứu ngoại trừ xylanase vì xylan là một loại hemicellulose phổ biến trong tự nhiên. Các tác giả cho rằng 6 nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp cả cellulase đồng thời tổng hợp cả hemicellulase. Khả năng này thường thấy ở vi khuẩn dạ cỏ như Bacillus, Bacteriodes, Butyvibrio và các loại thuộc chi Clostridium. Ngoài vi khuẩn thì nhiều loại nấm sợi cũng có khả năng tổng hợp xylanase. Các loại nấm này bao gồm: Mycothecium verrucaria, Aspergillus oryzae, A.niger, A.wentti, Aspergillus terreus, T.reesei, Chaetomium trilaterates, Penicilium...[11]. 1.1.2.3. Vi sinh vật phân hủy lignin Đối với lignin, là loại có chất khó chuyển hoá nhất thời gian phân huỷ rất chậm kéo dài hàng tháng đến hàng năm. Các vi sinh vật phân giải lignin thường là các loại nấm mục xốp như: Paocylimyces, Allescheria, Pseussis, Chaetomium, Stachybotrys, Lemzites… Ngoài ra còn có các loại nấm trắng như: Corrolus versicolor, Polyrus anceps, Phanerochaeter chrysosporium, Sporotrichum pulverulentum, Aspergillus fumigatus... [12]. 1.2. Thực trạng sử dụng rơm rạ tại Việt Nam Ở nước ta sản xuất lúa hàng năm đã tạo ra hàng chục triệu tấn rơm rạ. Riêng tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long mỗi năm cũng có tới 15 triệu tấn rơm. Tuy nhiên, loại phế thải nông nghiệp này thường được nông dân đốt gây lãng phí và làm ô nhiễm môi trường. Hiện nay, cùng với việc ứng dụng các tiến bộ khoa học vào sản xuất, nhiều loại máy móc được đưa vào gặt và tuốt lúa. Sau khi gặt xong nông dân đã tuốt lúa ngay tại đồng ruộng nên giảm được nhiều công sức trong việc vận chuyển lúa chưa tuốt về nhà tuốt. Vì thế, rơm rạ phần lớn để lại ngoài đồng ruộng chỉ một phần nhỏ được nông dân đưa về nhà để làm thức ăn cho gia súc về mùa đông. Phần rơm rạ ngoài đồng lại được người dân đốt thành tro. Đây là một việc làm gây hại cho môi trường và ảnh hưởng trực tiếp tới sức khoẻ của người dân. Theo các chuyên gia y tế, mù bụi ro đốt rơm rạ (đã từng xảy ra vào tháng 6/2009 tại Hà Nội) gây ô nhiễm 7 không khí rất có hại đối với sức khỏe con người, nhất là đối với trẻ em, người già và người mắc bệnh đường hô hấp. Việc đốt rơm rạ là điều nên tránh và đã có khuyến nghị bà con sử dụng rơm rạ cho việc trồng nấm rơm, dự trữ làm thức ăn gia súc, ủ gốc trồng màu… Trong trường hợp khó vận chuyển và cất giữ có thể vận động tập thể mua máy đóng bánh rơm của một số xí nghiệp đã khuyến cáo rất có hiệu quả trong việc ép rơm rạ thành bánh giúp cho việc vận chuyển và bảo quản rơm rạ được dễ dàng. Từ đó có thể sử dụng rơm rạ cho nhiều mục đích khác. Máy ép rơm đã được sản xuất và đưa vào sử dụng ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Thành phố Hồ Chí Minh... Việc dùng rơm rạ cho mục đích làm giấy, sản xuất ethanol được áp dụng rất ít ở nước ta. 1.2.1. Sử dụng rơm để trồng nấm rơm Nấm rơm là thực phẩm rất được người dân các nước châu Á ưa chuộng và được trồng phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, nấm rơm được trồng trên nhiều loại nguyên liệu khác nhau như lục bình, bã mía, rơm rạ,… Nhưng nguyên liệu phổ biến nhất hiện nay mà người trồng nấm sử dụng vẫn là rơm rạ. Các địa phương phía Nam phát triển nấm rơm nhiều nhất là Phú Yên, ở đây đã trồng nấm rơm theo quy trình mới, hiệu quả kinh tế cao của Trung tâm Công nghệ sinh học Việt Nam lần đầu tiên được triển khai đại trà tại huyện Sơn Hòa bước đầu đã được nông dân đón nhận. Tại miền Bắc, nhiều địa phương cũng thành công với việc trồng nấm rơm như: xã Nghĩa Thái, huyện Nghĩa Hưng (Nam Ðịnh), xã Khánh Trung, huyện Yên Khánh (Ninh Bình), với sự hỗ trợ của Trung tâm Công nghệ Sinh học thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam. UBND tỉnh Ninh Bình đã có quyết định số 1297, phê duyệt dự án "Xây dựng trung tâm sản xuất giống và chế biến nấm xuất khẩu Hương Nam…”. 8 1.2.2. Sử dụng rơm rạ để sản xuất phân hữu cơ vi sinh Hiện nay tại nhiều tỉnh thành trong cả nước đã ứng dụng công nghệ vi sinh phân hủy rơm rạ để làm phân bón. Chẳng hạn, tại tỉnh Quảng Nam, người dân đã ứng dụng công nghệ vi sinh phân hủy rơm rạ để làm phân bón ở Hội An. Kết quả sử dụng phân hữu cơ vi sinh từ phế phẩm nông nghiệp đã cho thấy cây phát triển tốt hơn so với mẫu đối chứng về mật độ gieo trồng, bộ lá xanh, mượt, cây cao, chắc khoẻ và đặc biệt là đã hạn chế được nấm bệnh cho cây trồng. Hàng năm, nông dân đổ xuống đồng ruộng lượng lớn phân hoá học, thuốc bảo vệ thực vật làm cho cấu trúc đất bị thay đổi. Nếu cứ tiếp tục như vậy, đồng ruộng sẽ mất dần độ phì nhiêu, môi trường ô nhiễm, sức khoẻ con người bị ảnh hưởng. Do vậy, việc sử dụng rơm, rạ làm phân bón hữu cơ có ý nghĩa rất lớn về mặt kinh tế, xã hội. 1.2.3. Một số ứng dụng khác trong sử dụng rơm rạ ở nước ta Ngoài dùng rơm rạ trồng nấm rơm, sản xuất phân bón hữu cơ, rơm rạ cũng có thể được sử dụng để làm vật liệu xây dựng, đệm lót, tránh va đập cho các sản phẩm nông nghiệp và gốm sứ… trong quá trình vận chuyển. Tại xã Mỹ Yên, Long Hiệp (huyện Bến Lức, Long An), rơm đang được các chủ vựa thu mua từ những cánh đồng lúa mùa ở các xã Long Khê, Long Định, Phước Lý, Phước Toàn, Phước Vân… (thuộc các huyện Bến Lức, Cần Đước, Cần Giuộc) để cung cấp cho các vựa dưa, trái cây, xí nghiệp thuỷ tinh, các trang trại nuôi bò, xuất khẩu… 1.3. Sự phân bố và cấu trúc của cellulose trong tự nhiên 1.3.1. Sự phân bố của cellulose trong tự nhiên Sinh khối thực vật của trái đất ước tính khoảng 1,8.1012 tấn. Trong đó cellulose chiếm khoảng 4.1010 tấn. Sản lượng cellulose được tổng hợp hàng năm trong tự nhiên lớn hơn bất kỳ chất hữu cơ nào khác. 9 Dưới dạng phế thải, cellulose có trong các phế liệu nông nghiệp chăn nuôi, công nghiệp, đồ hộp, công nghiệp chế biến gỗ, trong chất thải sinh hoạt từ nhà bếp, đường phố... Sự phân bố đa dạng với khối lượng lớn ở khắp nơi của cellulose có trong rác thải là một khó khăn và trở ngại cho việc bảo vệ môi trường, do đó để thu gom và xử lý triệt để lượng chất thải hữu cơ này đòi hỏi phải có những biện pháp và công nghệ phù hợp với từng khu vực, từng vùng [6], [7], [9], [11]. 1.3.2. Cellulose Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật. Thông thường, cellulose của tế bào thực vật chiếm 50% tổng số hydratcacbon có trên trái đất của chúng ta. Người ta nhận thấy rằng trong thiên nhiên hầu như không gặp cellulose ở dạng tinh khiết mà nó thường tồn tại ở dạng kết hợp với những chất khác như hemicellulose, lignin, pectin... các chất này liên kết với nhau tạo nên màng tế bào thực vật và có tên gọi chung là lignocellulose. Trong đó, cellulose và hemicellulose chiếm tỉ lệ cao nhất. Hai chất này được bao bọc bởi một lượng lignin. Các thành phần này thường có tỉ lệ khác nhau trong các loại cây khác nhau tạo ra các đặc tính hoá lý riêng cho từng loại thực vật. Về mặt cấu tạo hoá học, cellulose là một polime mạch thẳng, có thành phần cấu trúc cơ bản là các D-glucopiranose. Các gốc này nối với nhau nhờ liên kết β-1,4-glucozit. Mức độ polime hoá của phân tử cellulose thay đổi nhiều (từ vài trăm đến 15000) trung bình là 3000. Các đơn phân glucoza trong cellulose thì có cấu trúc dạng ghế bành (hình 1.1). Trong công thức phối cảnh, biểu diễn glucoza số chẵn, quay góc 180o so với glucose số lẻ và các nhóm hydroxyl đều nằm trên mặt phẳng nằm ngang [9], [11]. 10 H H H CH2OH O OH O H HO HO H H H O H OH H H CH2OH O Hình 1.1. Cấu trúc của phân tử cellulose Dùng phương pháp phân tích của Rơngen, người ta đã chứng minh được rằng phân tử cellulose có dạng sợi. Các sợi này của cellulose lại gắn với nhau nhờ liên kết hydro tạo thành từng bó nhỏ gọi là các microfibrin. Microfibrin có cấu trúc không đồng nhất và thường có hai vùng β. Vùng kết tinh có cấu trúc trật tự rất cao vì thế nó rất bền vững với tác động bên ngoài. Vùng vô định hình có cấu trúc trật tự không chặt do đó kém bền vững hơn. Do có cấu trúc như thế, vùng vô định hình của cellulose có thể hấp thụ nước và trương lên. Trong khi đó vùng kết tinh, mạng lưới liên kết hydrogen ngăn cản sự trương này. Ở vùng kết tinh, enzyme chỉ tác dụng lên bề mặt các sợi [7]. Cellulose là một hợp chất cao phân tử có cấu trúc rất bền vững. Nó không tan trong nước, không được tiêu hoá trong đường tiêu hoá của người và động vật có dạ dày một túi. Tuy nhiên, trong dạ dày của động vật nhai lại và trong đất có tồn tại rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh cellulase, là enzyme thuỷ phân cellulose [9]. 1.3.3. Hemicellulose Trong tế bào thực vật, hemicellulose đứng thứ hai về khối lượng. Hemicellulose là nhóm polisacarit có phân tử lượng nhỏ hơn rất nhiều so với 11 cellulose. Thông thường chúng chỉ có 150 gốc đường. Các gốc đường được nối với nhau bằng liên kết β-1.4, β-1.5, β-1.6 glucozit. Chúng tạo thành mạch ngắn và phân nhánh. Do đó, so với cellulose thì hemicellulose có cấu trúc không chặt chẽ bằng, chúng dễ dàng bị phân giải khi bị axit loãng tác dụng. Đôi khi hemicellulose còn bị phân giải trong nước nóng và chúng dễ dàng bị phân giải bởi enzyme hemicellulase. Hemicellulose tồn tại chủ yếu ở các phần như hạt, bẹ ngô, cám, rơm, rạ, trấu. Trong các loại hemicellulose thì xylan là loại có nhiều trong tự nhiên. Trong đó nhiều nhất là ở rơm rạ (chiếm hơn 30%), kế đến là cây lá rộng (20 - 30%). ở cây lá kim, xylan ít hơn nhiều (7 - 17%) [7], [8], [11]. 1.3.4. Lignin Lignin là hợp chất cao phân tử ngưng tụ từ ba loại rượu chủ yếu: rượu trans-P-cumarylic, trans-conyferylic và trans-cynapylic. Tuy nhiên, tỉ lệ ba loại rượu nói trên trong lignin của các loại thực vật khác nhau không giống nhau. Trong lignin các đơn phân này thường liên kết với nhau bằng liên kết C-O và C-C. Trong đó kiểu liên kết aryl-glyxecol, aryl-aryl hoặc diaryl ete là phổ biến [7]. Lignin của cây gỗ gồm 8% conyferylic, 14% cumarylic và 6% cynapylic. Trong thực vật, lignin tập trung ở các mô hoá gỗ và vai trò như chất liên kết tế bào, do đó mà làm tăng độ bền cơ học, tăng khả năng chống thấm, ngăn chặn các chất độc gây bệnh và các vi sinh vật gây bệnh cũng như các tác dụng khác từ bên ngoài. Lignin không hoà tan trong nước, trong các dung môi hữu cơ đậm đặc kể cả axit. Chỉ có tác dụng với kiềm bisunfit natri và axit sunfurơ, lignin mới mới lại bị phân giải từng phần. Lignin rất bền đối với tác dụng của các enzyme. Do đó trong cây lignin chỉ được tạo ra mà không tham gia vào sự trao đổi chất. 12