Tài liệu Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính keo tụ sinh học từ các ao nuôi tôm tại tỉnh trà vinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH KEO TỤ SINH HỌC TỪ CÁC AO NUÔI TÔM TẠI TỈNH TRÀ VINH Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS. PHẠM MINH NHỰT Sinh viên thực hiện : VÕ LAN HƯƠNG MSSV : 1411100330 Lớp : 14DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn khoa học của ThS. Phạm Minh Nhựt. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra, trong luận văn còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc. Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn của mình. Trường đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh không liên quan đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực hiện (nếu có) Sinh viên Võ Lan Hương LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành báo cáo này, trước tiên em xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, lãnh đạo phòng Đào tạo Đại học và Ban Chủ nhiệm Viện Khoa học ứng dụng HUTECH lời cảm ơn sâu sắc, niềm tự hào vì đã được học tập tại Trường trong những năm qua. Bên cạnh đó, để hoàn thành được bài báo cáo này, em xin chân thành cảm ơn ThS. Phạm Minh Nhựt đã luôn bên cạnh em, cảm ơn thầy đã tận tình chỉ dạy em, cho em thêm động lực và niềm tin để phấn đấu hoàn thành tốt nhất đề tài của mình. Em xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn làm công tác nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH đã giúp đỡ em nhiệt tình trong suốt quá trình thực tập tại trung tâm. Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình, người thân và các bạn bè em, đã quan tâm sâu sắc, chia sẻ khó khăn trong quá trình thực tập và hoàn thành báo cáo thật tốt. Trong quá trình hoàn thiện báo cáo không tránh khỏi những thiếu xót nhất định mà em chưa thể khắc phục nên em rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô để đề tài này được hoàn chỉnh hơn. Em xin chân thành cảm ơn. Sinh viên Võ Lan Hương MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................... v DANH MỤC CÁC BÀNG .................................................................................. vi DANH MỤC HÌNH ............................................................................................ vii MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................... 3 1.1 Giới thiệu về ngành nuôi trồng thủy sản...................................................... 3 1.2 Khó khăn của ngành nuôi trồng thủy sản.................................................... 4 1.2.1 Ảnh hưởng của dịch bệnh........................................................................... 4 1.2.1.1 Bệnh do virus ............................................................................................ 4 1.2.1.2 Bệnh do vi khuẩn....................................................................................... 7 1.2.2 Ảnh hưởng của môi trường nước ............................................................... 8 1.2.2.1 Ô nhiễm từ nguồn nitơ............................................................................... 8 1.2.2.2 Ô nhiễm từ lớp bùn hình thành .................................................................. 9 1.2.2.3 Ô nhiễm từ môi trường tự nhiên ................................................................ 9 1.2.2.4 Một số nguyên nhân khác .......................................................................... 9 1.3 Vai trò của chế phẩm vi sinh trong nuôi trồng thủy sản ............................. 9 1.3.1 Khái niệm ................................................................................................... 9 1.3.2 Thành phần ................................................................................................ 10 1.3.2.1 Vi khuẩn Gram dương ............................................................................... 10 1.3.2.2 Vi khuẩn Gram âm .................................................................................... 10 1.3.2.3 Nấm men ................................................................................................... 10 1.3.3 Vai trò ......................................................................................................... 10 1.3.3.1 Cạnh tranh vị trí gắn kết ........................................................................... 10 1.3.3.2 Sản xuất các chất ức chế ........................................................................... 10 1.3.3.3 Cạnh tranh các nguồn năng lượng ............................................................ 11 1.3.3.4 Tăng cường sự hấp thu dinh dưỡng ........................................................... 11 1.3.3.5 Ảnh hưởng đến hệ thống nước xanh .......................................................... 11 1.3.3.6 Nâng cao đáp ứng miễn dịch ..................................................................... 11 i 1.3.4 Ứng dụng chế phẩm vi sinh trong sử lý nước ............................................. 12 1.4 Vi khuẩn keo tụ sinh hoạt và vai trò trong nuôi trồng thủy sản ................. 12 1.4.1 Khái niệm keo tụ sinh hoạt ......................................................................... 12 1.4.2 Giai đoạn hình thành .................................................................................. 12 1.4.3 Vi khuẩn sản xuất keo tụ sinh học.............................................................. 12 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 14 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................ 14 2.1.1 Thời gian ..................................................................................................... 14 2.1.2 Địa điểm thu mẫu........................................................................................ 14 2.1.3 Địa điểm tiến hành nghiên cứu .................................................................. 14 2.2 Vật liệu .......................................................................................................... 14 2.2.1 Mẫu ............................................................................................................. 14 2.2.2 Hoá chất và môi trường .............................................................................. 14 2.2.2.1 Hóa chất ................................................................................................... 14 2.2.2.2 Môi trường ................................................................................................ 15 2.3 Dụng cụ và thiết bị ........................................................................................ 15 2.3.1 Dụng cụ....................................................................................................... 15 2.3.2 Thiết bị........................................................................................................ 15 2.4 Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 16 2.4.1 Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu........................................................... 16 2.4.2 Phương pháp phân lập................................................................................ 16 2.4.3 Phương pháp nhuộm Gram ........................................................................ 18 2.4.4 Phương pháp nhuộm bào tử ....................................................................... 18 2.4.5 Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật......................................... 20 2.4.5.1 Phương pháp cấy chuyển vi sinh vật ......................................................... 20 2.4.5.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu ............................................................... 20 2.4.6 Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật ....................... 20 2.4.7 Phương pháp đánh giá hoạt tính keo tụ sinh học ....................................... 21 2.4.8 Phương pháp định danh ............................................................................. 21 ii 2.4.8.1 Định danh bằng các phản ứng sinh hóa .................................................... 21 2.4.8.2 Định danh bằng sinh học phân tử.............................................................. 31 2.4.9 Phương pháp xử lý số liệu .......................................................................... 31 2.5 Bố trí thí nghiệm ........................................................................................... 31 2.5.1 Sơ đồ thí nghiệm ......................................................................................... 31 2.5.2 Quy trình phân lập ...................................................................................... 31 2.5.3 Sàn lọc hoạt tính keo tụ sinh học các chủng sau định danh sơ bộ ............. 32 2.5.4 Định danh các chủng vi khuẩn sau sàng lọc .............................................. 32 2.5.4.1 Định danh bằng các phản ứng sinh hóa .................................................... 32 2.5.4.2 Định danh bằng sinh học phân tử.............................................................. 33 2.5.5 Bước đầu khảo sát quy trình thu hồi hợp chất keo tụ sinh học từ vi khuẩn ............................................................................................................................. 34 2.5.5.1 Sơ đồ quy trình thu hồi .............................................................................. 34 2.5.5.2 Thuyết minh quy trình ............................................................................... 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 36 3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn từ các mẫu nước ao nuôi .................................. 36 3.2 Kết quả sàng lọc các chủng vi khuẩn phân lập có hoạt tính keo tụ sinh học ............................................................................................................................. 43 3.3 Kết quả định danh chủng 9.4........................................................................ 45 3.3.1 Định danh bằng các thử nghiệm sinh hóa.................................................. 45 3.3.2 Kết quả định danh chủng 9.4 bằng phương pháp giải trình tự rDNA 16S. ............................................................................................................................. 46 3.4 Kết quả bước đầu tách triết hoạt tính keo tụ sinh học từ chủng 9.4 .......... 48 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................... 50 4.1 Kết luận ......................................................................................................... 50 4.2 Kiến nghị ....................................................................................................... 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 50 PHỤ LỤC 1: THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG ............. 53 iii PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ TỈ LỆ HOẠT TÍNH KEO TỤ XỬ LÝ BẰNG CHƯƠNG TRÌNH SAS 9.0 ................................................................................ 55 PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỪ GENE ........................................... 61 iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TSA : Tryptic Soya Agar TSB : Trypto-casein soy broth COD : Chemical Oxygen Demand DO : Dessolved Oxygen BOD : Biochemical oxygen Demand TSS : Turbidity & suspendid solids DNA : Deoxyribonucleic acid PCR : Polymerase Chain Reaction NCBI : National Center for Biotechnology Information SAS : Statistical Analysis Systems RNA : Ribonucleic acid v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Kết quả phân lập vi khuẩn từ các mẫu nước ao nuôi ........................... 46 Bảng 3.4: Kết quả định danh sinh hóa của chủng vi khuẩn 9.4 ........................... 55 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Mẫu lấy từ ao nuôi tôm ở tỉnh Trà Vinh.................................................. 26 Hình 2.2: Mẫu để lắng trong bình chiết quả lê ........................................................ 27 Hình 2.3: Thử nghiệm Catalase .............................................................................. 31 Hình 2.4: Thử nghiệm Voges Proskauer ................................................................. 32 Hình 2.5: Thử nghiệm khả năng thủy phân tinh bột ................................................ 33 Hình 2.6: Thử nghiệm TSI ..................................................................................... 35 Hình 2.7: Thử nghiệm Citrate ................................................................................ 36 Hình 2.8: Thử nghiệm thủy phân Casein ................................................................ 37 Hình 2.9: Thử nghiệm Nitrate ................................................................................ 39 Hình 2.10: Môi trường TSB có bổ sung NaCl ........................................................ 40 Hình 2.11: Môi trường TSB ở 500C và 600C .......................................................... 40 Hình 2.12: Quy trình tinh sạch chất kết tụ sinh học ................................................ 44 Hình 3.1: Hoạt tính keo tụ sinh học của 22 chủng vi khuẩn phân lập ............................. 28 Hình 3.2: Kết quả định danh chủng 9.4 bằng phương pháp giải trình tự rDNA ............. 31 Hình 3.3: Kết quả tách chiết hoạt tính keo tụ sinh học từ chủng 9.4 ............................... 32 vii MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Qua nhiều năm, ngành nuôi tôm ở Việt Nam đã có những bước phát triển đáng kể đóng góp một phần không nhỏ trong việc phát triển kinh tế của đất nước. Tuy giá trị kinh tế của ngành nuôi trồng thủy sản mang lại khá lớn nhưng để phát triển lớn mạnh hơn nữa, ngành nuôi trồng thủy sản phải vượt qua không ít thách thức do thực tế với quy mô nuôi nhỏ lẻ, ít được đầu tư đồng bộ về cơ sở hạ tầng, kỹ thuật dẫn đến việc kiểm soát môi trường và dịch bệnh trong toàn vùng nuôi gặp nhiều khó khăn. Hơn nữa, những hiện tượng thời tiết cực đoan như nắng nóng kéo dài, mưa lớn, hạn hán, thay đổi cường độ và tần suất của bão…do tác động của biến đổi khí hậu xuất hiện ngày càng nhiều ảnh hưởng không nhỏ đến môi trường nước nuôi tôm dẫn đến sản lượng và chất lượng tôm nuôi giảm. Để khắc phục hiện tượng trên nhiều nghiên cứu đã được thực hiện như xử lý nước thải nuôi trong thủy sản bằng cụm vi tảo, ứng dụng men vi sinh, loại bỏ chất hữu cơ khỏi các vùng nước ven biển bị ô nhiễm bằng thực vật xử lý môi trường,…Trong đó công nghệ biofloc được ứng dụng rộng rãi hơn cả. Công nghệ biofloc được Giáo sư Yoram Avnimelech khởi xướng ở Israel và do Robins McIntosh thực hiện đầu tiên trong nuôi tôm thương phẩm ở Belize. Công nghệ này thích hợp trong việc sản xuất thủy hải sản do trong nước ao nuôi có chứa nhiều cacbon, nitơ, photpho và các chất dinh dưỡng khác, cũng như có các đặc điểm riêng như ít kim loại nặng, nồng độ nitơ, photpho, SS và nhu cầu oxy hóa học thấp hơn (COD) thích hợp cho vi khuẩn keo tụ sinh học phát triển. Vì vậy hướng sử dụng vi khuẩn keo tụ để chúng có thể chuyển cơ chất (các chất thải hữu cơ) trực tiếp thành sinh khối vi khuẩn được xem là giải pháp hiệu quả, yêu cầu đầu tiên đặt ra khi ứng dụng các vi khuẩn có khả năng sản xuất keo tụ sinh học là phải có được nguồn chủng vi khuẩn thích hợp với điều kiện địa phương, và điều kiện môi trường thích hợp cho sự phát triển cũng như hoạt tính của các chủng vi khuẩn này. Tuy nhiên, hiện nay các nghiên cứu trong nước về vấn đề này chưa được thực hiện nhiều. 1 Chính vì vậy, đề tài “Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính keo tụ sinh học từ các ao nuôi tôm tại tỉnh Trà Vinh” được thực hiện để giải quyết các vấn đề trên, tìm kiếm, phân lập, sàng lọc các chủng vi khuẩn bản địa có hoạt tính tạo keo tụ sinh học cao, có khả năng ứng dụng trong điều kiện Việt Nam. 2. Mục tiêu  Phân lập và tuyển chọn các chủng có hoạt tính tạo keo tụ sinh học cao.  Chủng vi khuẩn phải có tính an toàn và không gây bệnh. Có khả năng tồn tại lâu dài trong môi trường và chịu được các điều kiện khắc nghiệt, thích hợp với điều kiện địa phương và điều kiện môi trường thích hợp cho sự phát triển cũng như hoạt tính tạo keo tụ của các chủng vi khuẩn này. 3. Nội dung nghiên cứu  Phân lập các chủng vi khuẩn có hoạt tính keo tụ sinh học từ các ao nuôi tôm tại tỉnh Trà Vinh.  Xác định hoạt tính keo tụ sinh học.  Sàng lọc hoạt tính keo tụ sinh học của các chủng.  Định danh.  Tinh sạch chất kết tụ sinh học. 4. Phạm vi nghiên cứu Các ao nuôi tôm ở Hòa Minh, xã Long Hưng 1, huyện Châu Thành, thành phố Trà Vinh. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về ngành nuôi trồng thủy sản Trà Vinh là tỉnh ven biển thuộc vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) với tổng diện tích tự nhiên là 2.288,09 km2, dân số (năm 2010) là 1.005.856 người, mật độ dân số 440 người/km2. Ở vị trí nằm kẹp giữa 2 con sông lớn là sông Cổ Chiên và sông Hậu, một mặt giáp biển Đông (dài 65 km), có 2 cửa sông quan trọng là Cung Hầu và Định An, hệ thống sông, kênh, rạch chằng chịt với tổng chiều dài 578 km diện tích lưu vực tự nhiên là 21.265 ha và khoảng 98.597 ha ngập nước (từ 3-5 tháng/năm), có luồng cho tàu biển trọng tải lớn vào sông Hậu qua địa bàn huyện Duyên Hải đã được Thủ tướng phê duyệt. Vùng biển Trà Vinh rộng 45.536 hải lý vuông, nguồn lợi thủy sản rất phong phú với nhiều loài có giá trị kinh tế cao; trữ lượng (vùng cửa sông ven biển) trên 72.000 tấn, cho phép khai thác 50%, trữ lượng trong nội đồng từ 3.000-4.000 tấn, cho phép khai thác từ 2.000-2.500 tấn,... Là tỉnh có vị trí quan trọng đối với nghề tôm cá đồng bằng sông Cửu Long, ngành nuôi trồng thủy sản ở Trà Vinh là một ngành kinh tế thủy sản tổng hợp cả trong đất liền, ven biển và trên biển về các mặt khai thác, nuôi trồng, chế biến và hậu cần dịch vụ Nghề cá. Trong thời gian qua, thủy sản đạt được sự tăng trưởng đáng khích lệ và có đóng góp quan trọng vào sự phát triển kinh tế - xã hội chung của địa phương. Tốc độ tăng trưởng bình quân giai đoạn 2006-2010 đạt 4,5%/năm về sản lượng thủy sản (trong đó khai thác đạt 7,4%/năm); đạt 3,5%/năm về giá trị sản xuất; đạt 16,8%/năm về kim ngạch xuất khẩu. Tính đến năm 2010, tổng sản lượng thủy sản của tỉnh đạt 160.053 tấn (trong đó khai thác 77.276 tấn); tổng giá trị sản xuất đạt 2.931 tỷ đồng; kim ngạch xuất khẩu đạt 77,2 triệu USD. Hơn nữa, phát triển thủy sản còn tạo ra nhiều việc làm cho lao động địa phương, góp phần nâng cao thu nhập, cải thiện mức sống và giải quyết nhiều vấn đề xã hội bức xúc khác của địa phương. Tuy nhiên, sự phát triển ngành thủy sản của tỉnh trong thời gian qua chủ yếu vẫn dựa trên những tiềm năng, thế mạnh sẵn có do còn gặp phải nhiều khó khăn như ô nhiễm môi trường, dịch bệnh, thời tiết... là những yếu tố ngăn cản sự phát triển của ngành thủy sản trong thời kỳ tới. 3 1.2 Khó khăn của ngành nuôi trồng thủy sản Cũng như các ngành kinh tế khác ngành nuôi trồng thủy sản Trà Vinh đang gặp không ít những khó khăn như ảnh hưởng thời tiết và biến đổi khí hậu, mưa đến sớm nên độ mặn thấp, môi trường nuôi bị ô nhiễm nên dịch bệnh dễ xảy ra và khó khống chế làm ảnh hưởng đến sản lượng và chất lượng tôm. 1.2.1 Ảnh hưởng của dịch bệnh Trong năm 2017, tình hình dịch bệnh trên thủy sản nuôi cũng khá phức tạp, khoảng 190 ha nuôi tôm bị bệnh. Dịch bệnh trên tôm nuôi vẫn chưa được khống chế triệt để, tình hình dịch bệnh xảy ra rải rác suốt vụ nuôi, ở hầu hết vùng nuôi, gây thiệt hại lớn cho người nuôi, chủ yếu các bệnh do virus gây ra như: WSSV, MBV, YHV, TSV hay bệnh do vi khuẩn: bệnh phát sáng, bệnh gan thận mủ … 1.2.1.1 Bệnh do virus a. Whiter Spot Syndrome Virus - WSSV  Nguyên nhân: Do virus gây hội chứng đốm trắng (Whiter Spot Syndrome Virus) gây ra  Cách thức: Virus gây hội chứng đốm trắng khi xâm nhập vào tôm sẽ cư trú ở nhiều bộ phận của tôm như mô nội bì, mô dạ dày, mang, buồng trứng, tinh hoàn, hệ thống thần kinh, mắt, chân bơi và các bộ phận khác. Sau khi xâm nhập vào tế bào chủ, virus này tiến hành tự nhân bản dựa trên cơ sở vật chất và năng lượng của tế bào. Thông qua quá trình này, số lượng virus tăng lên rất nhanh, đồng thời làm thay đổi hoạt động bình thường của tế bào. Khi quan sát dưới kính hiển vi các tế bào bị nhiễm virus thường có nhân phình to. Virus phát triển đến giai đoạn phá vỡ nhân và giết chết tế bào, virus lan truyền ra môi trường nước, đi tìm ký chủ khác và lại tiếp tục xâm nhập, tấn công. (Trần Thị Việt Ngân, 2002 )  Tác hại: Tôm bị bệnh đốm trắng dễ dàng phát hiện ở tôm nhỏ và sắp trường thành, thường xuất hiện ở tầng mặt và dạt vào bờ, bỏ ăn, hoạt động kém, các phần phụ bị tổn thương, nắp mang phồng lên và vỏ có nhiều sinh vật bám. Khi tôm bị bệnh có dấu hiệu sức khỏe yếu đồng thời các đốm trắng xuất hiện, tỷ lệ tôm phát bệnh trong vòng 3 – 10 ngày lên đến 100% và tôm chết hầu hết ở ao nuôi. 4 b. Monodon Baculovirus MBV  Nguyên nhân: Tác nhân gây bệnh là virus type A Monodon Baculovirus  Cách thức: Vào giai đoạn đầu, sau khi tế bào vật chủ nhiễm MBV nhân tế bào vẫn bình thường, chỉ có biến đổi nhỏ ở tế bào chất. Sau đó nhân tế bào sưng lên, xuất hiện thể ẩn trong nhân. Tế bào chất mất dần chức năng và hình thành giọt mỡ. Cuối cùng, nhân tế bệnh tăng gấp 2 lần đường kính bình thường và tăng 6 lần về thể tích, bên trong có 1 đến nhiều thể ẩn. Virus hủy hoại tế bào và bong tróc vào trong ống gan tụy kèm theo hội nhiễm vi khuẩn. Phá hủy mô gan tụy và màng ống tiêu hóa.  Tác hại: Tôm chậm phát triển, ăn ít, có thể chuyển sang màu xanh xám, chết lên đến 100% sau 2 tuần khi có biểu hiện lâm sàng. Chủ yếu gây chết ở giai đoạn ấu trùng zoea, mysis và tôm giống nhỏ. Nhiễm tỷ lệ cao ở tôm nuôi ấu niên và trưởng thành nhưng rất ít gây chết. c. Yellow Head Virus - YHV  Nguyên nhân: Tác nhân gây bệnh là Yellow Head Virus.  Cách thức: YHV thường nhiễm bệnh ở các cơ quan bạch huyết, các mô liên kết, tuyến sinh dục, buồng trứng, tế bào biểu bì ruột… Bệnh YHV lây lan cả theo chiều ngang và chiều dọc. Lây lan theo chiều ngang khi tôm khỏe ăn thịt tôm nhiễm YHV, tôm nhiễm bệnh bài tiết ra môi trường nước hoặc một số tôm tự nhiên cũng sẽ nhiễm bệnh sẽ lây truyền cho các tôm trong ao nuôi. Khả năng lây lan theo chiều dọc từ bố mẹ sang con thông qua trứng bị nhiễm bệnh  Tác hại: Khi tôm bị nhiễm bệnh thì biểu hiện đầu tiên là tăng đột ngột lượng thức ăn trong một vài ngày sau đó giảm ăn, và đa phần tôm dừng hẳn sau đó vài ngày. Giai đoạn đầu tiên thấy xuất hiện nhiều cá thể bơi lờ đờ trên mặt nước sát bờ ao, những cá thể này thường xuất hiện màu vàng nhạt trên giáp đầu ngực, mang có màu trắng nhợt hoặc có những sọc vàng đến nâu. Sau đó vài ngày (2-3 ngày) số lượng cá thể tăng nhanh chóng, cuối cùng tôm dừng ăn hẳn và có dấu hiệu chết trong ao. Đối với bệnh YHV tôm có thể chết tích luỹ đến 100% trong 7-10 ngày. d. Taura Syndrome Virus TSV 5  Nguyên nhân: Tác nhân gây bệnh là Taura Syndrome Virus  Cách thức: Tôm bị hội chứng Taura thường diễn biến qua 3 thời kỳ của bệnh Thời kỳ cấp tính: Tôm postlarvae hay tôm lớn của loài P.vannamei khi bị bệnhcho thấy sự chuyển màu đỏ nhợt, đặc biệt là đuôi và các chân bơi, nên người nông dân Ecuador đã đặt tên cho bệnh này, khi xảy ra lần đầu, là bệnh đỏ đuôi - Tail Red Diseasse. Sự thay đổi màu là do sự phình to của sắc tố đỏ trong biểu mô vỏ. Sự dày mọng của các mép chân bơi, chân bò và đuôi tôm, là dấu hiệu đầu tiên của sự hoại tử cục bộ. Tôm bệnh còn có một số dấu hiệu khác như: mềm vỏ, ruột rỗng và thường chết khi lột xác. Khi dịch bệnh xảy ra, một số loài chim biển sẽ tấn công ao có tôm bệnh. Ở tôm he chân trắng (P.vannamei), giai đoạn cấp tính có tỷ lệ chết cao (40 – 90%). Trong khi đó loài P. stylirostris đã có sức đề kháng, chống lại sự cảm nhiễm của loại virus này. Thời kỳ chuyển tiếp: Dù giai đoạn chuyển tiếp của Taura Syndrome chỉ diễn ra trong trong thời gian ngắn, nhưng cũng thể hiện một số dấu hiệu: Có nhiều điểm bị thương tổn mầu nâu, đen trên vỏ kitin, màu đen là của sắc tố melanin, là sản phẩm cuối cùng của cơ chế hoạt động miễn dịch tự nhiên ở tôm. Ở thời kỳ này tôm bệnh có thể có, hay không có hiện tượng mềm vỏ và đổi màu đỏ của các phần phụ. Tôm bệnh ở thời kỳ này vẫn có thể bắt mồi bình thường. Thời kỳ mãn tính: Những con tôm bị bệnh do cảm nhiễm Taura Syndrome nhưng sống sót qua thời kỳ cấp tính và thời kỳ chuyển tiếp, thì sẽ bước sang thời kỳ mãn tính. Thời kỳ này có thể kéo dài cho đến cuối đời của những con tôm bị bệnh. Tôm bị bệnh ở thời kỳ mãn tính, sau vài lần lột xác, cơ thể trở lại bình thường, các dấu hiệu bệnh lý ở các thời kỳ trước biến mất, nhưng trong cơ thể tôm vẫn mang virus gây bệnh cho đến hết cuộc đời. Tuy nhiên, không có các dấu hiệu đặc thù để có thể dùng làm cơ sở sàng lọc những cá thể mang virus. Nếu các con tôm mang mầm bệnh thành thục, khi tham gia sinh sản có thể truyền virus gây bệnh Taura cho đàn ấu trùng. 6  Tác hại: Bệnh TSV thường xảy ra ở giai đoạn ấu niên, từ 14-40 ngày tuổi. Tôm lớn cũng có thể xuất hiện bệnh này nếu giai đoạn ấu niên chưa bị bệnh. Bệnh này có thể gây chết từ 40-90% tùy theo kích cỡ tôm bị bệnh. Bệnh TSV có thể lây nhiễm theo 2 trục ngang và dọc. Đặc biệt sự lây nhiễm theo trục dọc rất phổ biến, do những con tôm bị bệnh ở thời kỳ mãn tính, sau vài lần lột xác, những dấu hiệu của bệnh TSV biến mất, nhưng trong cơ thể vẫn mang mầm bệnh. Tôm he chân trắng lại có thể thành thục trong ao, nên rất khó tránh nguy cơ đưa những con tôm mang mầm bệnh vào tham gia sinh sản, chúng sẽ sản sinh ra các đàn tôm giống mang mầm bệnh. Nguồn nước chứa các chất thải từ tôm bệnh và những con chim ăn tôm chết đã trở thành nguồn lây bệnh từ nơi này tới nơi khác. 1.2.1.2 Bệnh do vi khuẩn a. Bệnh phát sáng  Nguyên nhân: Nhiễm vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio sp. chủ yếu và gây nguy hiểm nhất là Vibrio harveyi. Vibrio harveyi là vi khuẩn Gram âm, phát triển nhanh ở độ mặn 10-40ppt (mạnh nhất ở độ mặn 20-30 ppt). Các vi khuẩn này có khả năng kháng lại nhiều loại kháng sinh. Bệnh có thể nhiễm từ các trại giống, ao ương sang ao thịt. Trong sản xuất giống, mầm bệnh được lây lan chủ yếu bằng đường ruột từ tôm mẹ sang ấu trùng trong giai đoạn sinh sản.  Triệu chứng: Tôm yếu, bơi không định hướng, tấp mé bờ, phản ứng chậm chạp. Mang và thân tôm có màu sẫm, bẩn, thịt đục màu. Gan viêm và teo nhỏ, mất chức năng tiêu hóa cho tôm. Ăn giảm, không có thức ăn và phân trong ruột, phân tôm trong nhá ít. Đầu, thân tôm phát sáng màu trắng - xanh lục trong bóng tối. Quan sát bằng kính hiển vi thấy vi khuẩn phát sáng di chuyển trong cơ, máu tôm. Có đốm sáng rất nhỏ và nhiều trên phần cơ thịt của tôm. Tôm chậm lớn, có thể bị đóng rong ở mang và vỏ. Tôm chết đáy rải rác tuỳ vào mức độ nặng nhẹ của bệnh. Nếu nhiễm bệnh 100% đàn tôm trong giai đoạn 45 ngày nuôi đầu, có thể chết hàng loạt. Tôm ấu trùng nhiễm bệnh có màu trắng đục, nhiễm bệnh nạng thì lắng dưới đáy bể ương và chết hàng loạt. b. Hoại tử gan tụy 7  Nguyên nhân: Bệnh vi khuẩn hoại tử gan tụy Necrotizing Hepatopancreatitis Peru - NHP gây ra bởi loài vi khuẩn gây bệnh, cơ thể loại Rickettsia, kích thước tương đối nhỏ, đa hình thể, gam âm nội bào bắt buộc Phương thức lan truyền bệnh theo phương ngang qua nguồn nước ao bị ô nhiễm (trong phân) và hoặc cảm nhiễm qua đường miệng (ăn thịt đồng loại).  Triệu chứng: Các dấu hiệu lâm sàng về tổng quan có thể cho biết tôm nuôi nhiễm bệnh NHP: tuyến tiêu hóa (gan tụy) bị suy yếu từ nhợt nhạt đến trắng, quan sát có các dấu hiệu: lờ đờ, giảm hấp thụ thức ăn, hệ số chuyển đổi thức ăn cao, bỏ ăn, giảm tăng trưởng rõ, tỉ lệ trọng lượng chiều dài kém (“đuôi mỏng”), gầy mòn, vỏ mềm, thân nhũn, mang sậm hoặc đen, teo gan tụy. Kiểm tra ở mép ao, tôm bị nhiễm rỗng ruột và bề mặt nặng mùi do ngoại ký sinh gia tăng và các bệnh viêm nhiễm cơ hội khác (nghĩa là đốm đen). Bệnh do vi khuẩn liên quan đến vỏ bao gồm tổn thương loét biểu bì hoặc mòn phần phụ bị đen, và tế bào sắc tố phát triển dẫn đến xuất hiện rìa đen ở chân đuôi và chân bụng. Gan tụy bị teo và có một số đặc điểm sau: mềm và ướt, giữa đầy dịch, xanh xám và sọc đen (tế bào ống bị đen). Tỉ lệ chết tăng dần hơn 90% có thể xảy ra trong vòng 30 ngày khi bắt đầu có dấu hiệu lâm sàng nếu không được điều trị. c. Bệnh vi khuẩn dạng sợi  Nguyên nhân: Do vi khuẩn dạng sợi là Leucothrix mucor, Thiothrix sp., Cytophaga sp., Flovobacterium sp.  Triệu trứng: Tôm bệnh thường ở các giai đoạn Mysis và post larva. Bệnh nặng tôm đổi màu sang màu vàng, nâu, xanh lá cây. Tôm bơi lờ đờ, khó lột xác và chết hàng loạt. 1.2.2 Ảnh hưởng của môi trường nước Những nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường nước trong nuôi trồng tôm như: nguồn đạm từ thức ăn thừa, phân tôm, xác tảo chết tôm chết, các hóa chất tích tụ ở đáy ao nuôi tạo thành một lớp bùn hoặc do ô nhiễm nước mưa, lũ lụt… cuốn theo các chất thải hữu cơ từ chăn nuôi, sinh hoạt cùng một số nguyên nhân khác. 8 1.2.2.1 Ô nhiễm từ nguồn Nitơ Khi nuôi trồng người ta thường sử dụng 2 dạng thức ăn chính sau: thức ăn xanh và thức ăn tinh tuy nhiên kết quả quan sát đã cho thấy rằng trong hệ thống thâm canh tôm thì chỉ có 15 – 20% thức ăn được dùng vào phát triển mô động vật, có tới 15% tổng lượng thức ăn hao hụt do không ăn hết và thất thoát. Dẫn đến phần dư thừa bị lắng đọng và bị phân hủy bởi các vi sinh vật yếm khí tạo ra các chất độc hại như CH4, NO2, NH3…, làm giảm lượng oxy hòa tan. Ô nhiễm nitơ chính là nguyên tố chủ yếu chiếm tỷ lệ lớn (30 – 40%) hình thành từ thức ăn thừa. Nitơ dưới dạng protein được tôm hấp thu và bài tiết dưới dạng NH3. NH3 sẽ được nhóm vi khuẩn Nitrosomonas sp. và Nitrosococcus sp. chuyển hóa thành NO2-. Trong quy trình nuôi tôm, hàm lượng NH3 và NO2- luôn có xu hướng tăng rất nhanh và gây độc làm tôm chậm lớn, dễ nhiễm bệnh, chết. Ngoài ra NH3 và NO2- sẽ làm tảo trong ao nuôi phát triển đột biến, nhất là các loại tảo xấu, gây ra việc thiếu oxy trong nước ao nuôi trầm trọng vào ban đêm. Đặc biệt có thể làm sụp tảo nhanh chóng gây ra các ảnh hưởng nghiêm trọng cho tôm. 1.2.2.2 Ô nhiễm từ lớp bùn hình thành Hầu hết các chất trong nước nuôi tôm lắng đọng dưới đáy tạo thành một lớp bùn ô nhiễm. Thành phần lớp bùn chủ yếu là các chất hữu cơ như protein, lipid, các chất khoáng và vitamin, vỏ tôm lột xác,… Lớp bùn này luôn ở trong tình trạng ngập nước yếm khí làm các vi sinh vật yếm khí phát triển mạnh, phân hủy các hợp chất trên tạo thành các sản phẩm như H2S, NH3, CH4… ảnh hưởng đến độ pH của nước và kìm hãm sự phát triển của tôm. Hơn nữa tôm luôn có xu hướng tránh khỏi vùng này và tập trung vào những khu vực sạch sẽ hơn. Do việc tập trung vào một vùng sẽ làm giảm bớt diện tích cho ăn, cũng như tăng tính cạnh tranh trong khi ăn. Nếu như toàn bộ đáy ao bị dơ bẩn thì con tôm bị bắt buộc phải sống trong môi trường ô nhiễm. Lớp bùn dơ bẩn còn tác động lên nước trong ao nuôi làm giảm chất lượng nước. 1.2.2.3 Ô nhiễm từ môi trường tự nhiên 9 Khi mưa xuống nước chảy qua mặt đất đồng thời với dòng chảy đã hòa tan và cuốn theo nó các chất gây ô nhiễm nhu chất rắn, kim loại nặng, dầu mỡ, phân bón, thuốc trừ sâu,.. cùng với nước thải sinh hoạt từ các hộ dân cư, bệnh viện… hay do các sản phẩm của hoạt động sống của sinh vật và kể cả xác chết của chúng đã gây ảnh hưởng xấu đến chất lượn nước nuôi thủy sản và sức khỏe của vật nuôi. 1.2.2.4 Một số nguyên nhân khác Dư lượng của các chất kháng sinh, dược phẩm, thuốc trị liệu và kích thích tố hay vật chất lơ lửng trong ao nuôi nhuyễn thể hay từ lồng bè, kim loại nặng, hóa chất từ các vùng công nghiệp,… cũng là các nguyên nhân gây ô nhiễm nguồn nước. 1.3 Vai trò của chế phẩm vi sinh trong nuôi trồng thủy sản. 1.3.1 Khái niệm Chế phẩm vi sinh hay probiotics là hỗn hợp vi sinh vật có lợi cho tôm bằng cách biến đổi hệ vi sinh vật xung quanh hoặc liên quan đến vật chủ, bằng cách nâng cao khả năng sử dụng thức ăn hay nâng cao giá trị dinh dưỡng của thức ăn, nâng cao đáp ứng của vật nuôi với mầm bệnh hay cải thiện chất lượng môi trường xung quanh thông qua quá trình phân hủy các chất hữu cơ trong nước nhan hơn (Moriaty, 1999; Tinh et al, 2007). 1.3.2 Thành phần 1.3.2.1 Vi khuẩn Gram dương Các vi sinh vật Gram dương, hiếu khí và sinh bào tử được sử dụng nhằm mục đích nâng cao chất lượng nước ao nuôi do ức chế hệ vi sinh vật gây hại trong nước và làm giảm số mầm bệnh. Một lợi ích trực tiếp trong việc sử dụng trực khuẩn này là làm giảm việc sử dụng kháng sinh, hóa chất trong việc nuôi trồng thủy sản và nâng cao tỷ lệ sống của các loài nuôi trồng thủy sản ( Irianto và Austin, 2002 ). 1.3.2.2 Vi khuẩn Gram âm Có khả năng ức chế Saprolenia và A. Salmocinida trên các loài cá có vây và ngăn chặn các mầm bệnh trên tôm từ Vibrio spp, đồng thời có tác dụng làm giảm tỷ lệ chết trên cá hồi ( Irianto và Austin, 2002 ), cải thiện chất lượng của ấu trùng cua, hàu và cá bơn, cải thiện quá trình tiêu hóa protein ở cá bơn khi được cung cấp qua 10