ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
HOÀNG NGUYÊN
PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC
ĐIỂM SINH HÓA CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN
KỊ KHÍ, ƯA NHIỆT, SINH CELLULASE
CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH
MÃ NGÀNH: 60 42 30
HDKH: TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH
TP. HỒ CHÍ MINH, 06/2011
LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này được hoàn thành với sự quan tâm giúp đỡ rất nhiều của các
thầy cô, các anh chị và các bạn. Xin được tỏ lòng cảm ơn chân thành đến:
Thầy tiến sỹ Hoàng Quốc Khánh, phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh
học Nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam người đã tận tình hướng
dẫn và tạo điều kiện cho tôi thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận.
Anh Ngô Đức Duy, anh Nguyễn Duy Long, chị Đào Thị Thu Hiền cùng
toàn bộ các anh chị phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa
học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn trực tiếp hoàn thành khóa luận.
Thầy cô và các anh chị ở Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học
Công nghệ Việt Nam đã chỉ bảo trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Thầy cô bộ môn sinh hóa, cùng toàn thể các thầy cô khoa Sinh học
Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí
Minh cũng như các thầy cô trước đây đã tận tâm dạy dỗ và truyền đạt nhiều kiến
thức quí báu trong suốt nhiều năm học qua.
Các bạn lớp cao học khóa 18 đã quan tâm, giúp đỡ và chia sẻ niềm vui
nỗi buồn trong suốt quá trình học tập.
Cuối cùng con xin cảm ơn ba mẹ đã nuôi nấng, chăm sóc, luôn dạy
con điều hay lẽ phải và cho con ăn học thành người có ích cho xã hội. Em cũng
xin cảm ơn các anh chị đã luôn quan tâm, chăm sóc, khích lệ em trong những lúc
khó khăn nhất để em có thể vững bước trên đường đời.
TP Hồ Chí Minh, 06/2011
Hoàng Nguyên
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
LỜI MỞ ĐẦU
1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................... 1
1.1. Cấu trúc và thành phần của sinh khối cellulose ..................................... 1
1.1.1. Cấu trúc của cellulose .................................................................... 1
1.1.2. Thành phần của sinh khối thực vật ................................................ 2
1.2. Các chủng sinh vật sinh cellulase .......................................................... 3
1.2.1. Nấm mốc........................................................................................ 3
1.2.2. Vi khuẩn sản xuất cellulase ........................................................... 5
1.3. Đặc điểm vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt sinh cellulase ................................ 7
1.3.1. Đặc điểm chung ............................................................................ 7
1.3.1.1. Cơ chất ưu tiên ...................................................................... 7
1.3.1.2. Sự hình thành phức hợp cellulose-enzyme-microbe ............. 7
1.3.1.3. Sự hấp thu và biến dưỡng sản phẩm thủy phân cellulose ..... 8
1.3.1.4. Sự biến dưỡng lên men và sản phẩm sau cùng...................... 10
1.3.2. Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển hình ...... 10
1.4. Hệ thống enzym cellulase ..................................................................... 12
1.4.1. Thành phần của cellulase............................................................... 12
1.4.2. Cơ chế thủy giải cellulose.............................................................. 13
1.4.3. Ứng dụng enzyme cellulase........................................................... 14
1.4.4. Hệ thống cellulase không phức hợp............................................... 15
1.4.5. Cellulosome - Hệ thống cellulase phức hợp .................................. 16
1.4.5.1. Đặc điểm chung ..................................................................... 16
1.4.5.2. Cấu trúc cellulosome ............................................................. 18
1.4.5.3. Sự gắn kết cellulosome vào bề mặt tế bào ............................ 20
1.4.5.4. Sự sắp xếp của cellulosome .................................................. 22
1.4.5.5. Sự điều hòa nguồn carbon ..................................................... 24
1.5. Phương pháp phân lập vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase.............. 25
1.6. Phương pháp định danh sinh học phân tử .............................................. 26
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.................................................................. 29
2.1. Vật liệu..................................................................................................... 29
2.1.1. Nguồn phân lập .............................................................................. 29
2.1.2. Thiết bị dụng cụ ............................................................................. 29
2.1.2.1. Thiết bị thông dụng ............................................................... 29
2.1.2.2. Thiết bị phân lập vi khuẩn kị khí........................................... 29
2.1.2.3. Môi trường............................................................................. 30
2.1.2.4. Hóa chất .............................................................................. 31
2.1.2.5. Chủng vi khuẩn đối chứng............................................... 35
2.2. Phương pháp thực hiện ........................................................................... 35
2.1.1. Phương pháp tạo môi trường kị khí .............................................. 35
2.1.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn kị khí sinh cellulase ................... 36
2.2.2. Đặc tính sinh lí hình thái vi khuẩn................................................. 37
2.2.2.1. Đặc điểm khuẩn lạc .............................................................. 37
2.2.2.2. Phương pháp nhuộm Gram.................................................... 37
2.2.2.3. Phương pháp nhuộm bào tử .................................................. 38
2.2.3. Khảo sát khả năng sinh cellulase trên môi trường PCS................. 39
2.2.3.1. Khả năng sử dụng giấy lọc .................................................... 41
2.2.3.2. Khả năng sử dụng rơm rạ ...................................................... 41
2.2.3.3. Xác định hàm lượng protein ngoại bào ................................. 42
2.2.3.4. Định lượng hoạt tính cellulase tổng số.................................. 43
2.2.3.5. Bán định lượng hoạt tính endoglucanase .............................. 44
2.2.3.6. Hoạt
tính
endoglucanase
xác
định
In-situ
trên
gel
polyacrylamide.......................................................................................... 45
2.2.3.6.1. Lượng protein tối ưu thủy phân CMC .......................... 47
2.2.3.6.2. Sự khác biệt giữa dung dịch protein A và protein B..... 47
2.2.3.6.3. Khả năng thủy phân CMC của các chủng..................... 47
2.2.3.7. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh cellulase... 48
2.2.3.8. Tối ưu hóa hoạt tính cellulase ............................................... 48
2.2.3.8.1. Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase .................. 48
2.2.3.8.2. Ảnh hưởng pH lên hoạt tính cellulase........................... 48
2.2.4. Định danh vi khuẩn........................................................................ 49
2.2.4.1. Định danh nhanh bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc trưng
cho vi khuẩn Clostridium.......................................................................... 50
2.2.4.2. Phản ứng PCR với cặp mồi universal và xây dựng cây phân loại
loài
............................................................................................... 51
3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ......................................................................... 52
3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase................. 52
3.2. Đặc điểm hình thái các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase 54
3.2.1. Đặc điểm khuẩn lạc........................................................................ 54
3.2.2. Nhuộm Gram ................................................................................ 55
3.2.3. Nhuộm bào tử ................................................................................ 56
3.3. Khảo sát khả năng sinh cellulase trên môi trường PCS ......................... 57
3.3.1. Khả năng sử dụng giấy lọc ........................................................... 57
3.3.2. Khả năng sử dụng rơm rạ ............................................................. 58
3.3.3. Xác định hàm lượng protein ngoại bào ....................................... 59
3.3.4. Xác định hoạt tính cellulase tổng số ............................................ 60
3.3.5. Bán định lượng hoạt tính endoglucanase trên đĩa thạch CMC..... 62
3.3.6. Hoạt tính endoglucanase xác định In-situ trên gel polyacrylamide
...................................................................................................... 64
3.3.6.1. Nồng độ protein tối ưu cho khả năng thủy phân CMC ......... 64
3.3.6.2. Sự khác biệt giữa dung dịch protein B và protein A ............ 65
3.3.6.3. Khả năng thủy phân CMC của 6 chủng khảo sát .................. 68
3.4. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh cellulase ................... 71
3.5. Tối ưu hóa hoạt tính cellulase ................................................................ 73
3.5.1. Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase .................................. 73
3.5.2. Ảnh hưởnng pH lên hoạt tính cellulase ....................................... 74
3.6. Định danh vi khuẩn ............................................................................... 75
3.6.1. Định danh nhanh bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc trưng cho vi
khuẩn Clostridium ....................................................................... 76
3.6.2. PCR với cặp mồi universal và xây dựng cây phân loại ................ 77
4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................ 81
4.1. Kết luận .................................................................................................. 81
4.2. Kiến nghị ................................................................................................ 82
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2
PHỤ LỤC 3
PHỤ LỤC 4
PHỤ LỤC 5
PHỤ LỤC 6
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Khả năng sử dụng giấy lọc.............................................................. 57
Biểu đồ 3.2. Khả năng sử dụng rơm rạ ................................................................ 58
Biểu đồ 3.3. Nồng độ protein ngoại bào của các chủng ...................................... 59
Biểu đồ 3.4. Hoạt tính cellulase tổng số của các chủng ..................................... 61
Biểu đồ 3.5. Sự tương quan giữa lg(trọng lượng phân tử) protein thang chuẩn với
Rf.......................................................................................................................... 67
Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh cellulase...... 72
Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính celluase ............................... 73
Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính celluase ....................................... 85
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc cellulose trong vách tế bào thực vật ..................................... 3
Hình 1.2. Sự hấp thu carbohydrate và phosphoryl hóa bởi C.thermocellum ...... 9
Hình 1.3. Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển hình ........... 11
Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của hệ enzym cellulase của Trichoderma reesei.... 13
Hình 1.5. Cấu trúc cellulosome của C. thermocellum......................................... 18
Hình 1.6. Sự gắn kết cellulosome vào bề mặt tế bào .......................................... 21
Hình 1.7. Cấu trúc của phức hợp Coh-XDoc loại II của loài C. thermocellum .. 23
Hình 2.1. Quy trình thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi universal ................. 52
Hình 3.1. Vòng phân giải cellulose của mẫu DR5 và DM7 ............................... 53
Hình 3.2. Khuẩn lạc chủng DR5-1 ..................................................................... 54
Hình 3.3. Kết quả nhuộm Gram chủng TQ1-2.................................................... 55
Hình 3.4. Kết quả nhuộm bào tử chủng DR5-1 .................................................. 56
Hình 3.5. Vòng phân CMC của dung dịch protein B và protein A của TQ1-2 .. 62
Hình 3.6. Vạch phân giải CMC trên gel với lượng protein khác nhau của dung
dịch Protein B chủng TQ1-2 ................................................................................ 64
Hình 3.7a. Kết quả điện di SDS-PAGE các chủng DM5-1, DM7-1, DR5-1 ..... 66
Hình 3.7b. Kết quả điện di SDS-PAGE các chủng DM8-1, DT2-1, TQ1-2...... 66
Hình 3.8a. Vạch phân giải CMC của dung dịch Protein B và protein A chủng
DM5-1, DM7-1, DR5-1 ....................................................................................... 69
Hình 3.8b. Vạch phân giải CMC của dung dịch ProteinB và protein A chủng
DM8-1, DT2-1, TQ1-2......................................................................................... 69
Hình 3.9. Sản phẩm PCR cặp mồi S-G-Clos-0586-S-21 và S-G-Clos-1205-A-21.
.............................................................................................................................. 76
Hình 3.10. Sản phẩm PCR cặp mồi universal ..................................................... 77
Hình 3.11. Cây phân loại loài của các chủng khảo sát........................................ 80
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh lý của một số vi khuẩn thủy giải cellulose.................. 5
Bảng 1.2. Vi khuẩn sản xuất hệ thống cellulosome ......................................... 17
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc.............................................................. 54
Bảng 3.2. Nhuộm Gram và khảo sát các đặc điểm hình thái tế bào.................... 55
Bảng 3.3. Hoạt tính cellulase tổng số của các chủng ......................................... 61
Bảng 3.4. Hoạt tính endoglucanase trên đĩa thạch CMC .................................... 62
Bảng 3.5. Trọng lượng phân tử của các vạch protein trên SDS-PAGE .............. 68
Bảng 3.6. Trọng lượng phân tử của các vạch protein phân giải CMC trên gel... 70
1
Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18
Hoàng Nguyên
1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cấu trúc và thành phần của sinh khối cellulose
1.1.1. Cấu trúc của cellulose
Cellulose là polimer được cấu thành từ các đơn phân glucose được liên kết
bởi β-1,4 glycoside, là vật liệu chủ yếu của vách tế bào thực vật và là nguồn
carbohydrate phong phú nhất trong tự nhiên. Mức độ polimer hóa thường từ 100
đến 20.000. Các chuỗi cellulose gần nhau được liên kết với nhau tạo thành các tấm
cellulose qua liên kết hydrogen và liên kết Vander Waal tạo thành cấu trúc tinh
thể, phân tử dạng sợi, bền vững [43].
Khoảng 30 phân tử cellulose riêng lẻ được sắp xếp thành đơn vị lớn hơn gọi
là sợi cơ bản, sau đó được bó thành sợi lớn hơn gọi là vi sợi và được cấu trúc thành
những sợi cellulose. Sợi cellulose bền vững bởi các liên kết nội phân tử cũng như
liên kết hydrogen nội phân tử. Sự xắp xếp các chuỗi riêng lẻ bên trong những sợi
cơ bản đã được tìm hiểu từ sự phân tích tán xạ tia X [23].
Cấu trúc cellulose tinh thể bao gồm những cấu trúc cố định trong những vị
trí riêng biệt có quan hệ chặt chẽ với những vị trí khác. Chúng có khả năng ngăn
ngừa sự xâm nhập không chỉ enzym mà thậm chí những phân tử nhỏ như nước.
Bên cạnh cellulose cấu trúc tinh thể, những sai sót trong cấu trúc tinh thể đã dẫn
đến hình thành một nhóm sợi cellulose có cấu trúc vô định hình. Sợi cellulose còn
có những cấu trúc bất quy tắc khác như: những chỗ xoắn trong vi sợi, những lỗ
trống trên bề mặt, những lỗ, hốc nhỏ và một số mạch nhỏ. Tổng diện tích tiếp xúc
của sợi cellulose lớn hơn bề mặt tinh thể trong cấu trúc cùng kích thước. Sự không
đồng nhất trong cấu trúc làm cho sợi bị hydrate bởi nước khi nhúng vào môi
trường lỏng và cho phép sự xâm nhập bởi các phân tử lớn bao gồm các enzym
thủy phân cellulose [23].
Phân tử cellulose rất bền vững, với thời gian bán rã là 5-8 triệu năm cho sự
phân cắt liên kết β-1,4 glycoside tại 25oC. Trong khi, quá trình phân hủy sinh học
thường nhanh hơn và cung cấp dòng carbon cho khí quyển [43].
1
Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18
Hoàng Nguyên
1.1.2. Thành phần của sinh khối thực vật
Sinh khối thực vật chiếm giữ khoảng một nửa nguồn carbon trong sinh
quyển. Người ta ước tính rằng lượng carbon được thực vật đồng hóa hàng năm
khoảng 200 tỷ tấn [29]. Khoảng 70% sinh khối thực vật được cấu thành từ các đơn
vị đường chứa 5, 6 carbon [27]. Phân tử cellulose kết hợp thành những sợi có cấu
trúc tinh thể hình thành nên bộ khung cho vách tế bào thực vật. Sợi cellulose được
liên kết chéo với các polysaccharide khác gọi là hemicellulose để làm tăng độ bền
cho vách tế bào. Hemicellulose bao gồm xylan (đơn phân -D-xylose với liên kết 1,4-), glucomannan (đơn phân -D-mannose và -D-glucose với liên kết -1,4-),
xyloglucan (đơn phân -D- glucose với liên kết 1,4-, và -D-xylose và -D-glucose
với liên kết -1,6-), 1,3-1,4-glucan (đơn phân -D-glucose với liên kết -1,3- và -1,4-),
và số lượng nhỏ polysaccharide khác bao gồm -D-glucose, -D-xylose, -D-mannose
và đơn vị đường khác với các liên kết khác nhau. Bộ khung cellulose và
hemicellulose còn được liên kết với pectin (đơn phân -D-galacturonic acid với liên
kết chủ yếu -1,4-), với chức năng là chất gắn trong vách tế bào [23].
Thành phần và cấu trúc của vách tế bào có sự khác biệt lớn giữa các loài
thực vật, hàm lượng cellulose thông thường chiếm từ 35 đến 50% trọng lượng khô
thực vật. Trong một số trường hợp, sợi cellulose được gắn vào mạng lưới các sợi
sinh học khác, chủ yếu là hemicellulose chiếm khoảng 20 đến 35% và lignin chiếm
khoảng đến 30% trọng lượng khô thực vật [23].
Lignin, hiện diện cùng với cellulose trong nhiều loài thực vật giúp làm cứng
vách tế bào thực vật. Các loại thực vật khác nhau thì có thành phần lignin khác
nhau. Tuy nhiên, sự hiện diện của lignin ngăn cản sự chuyển đổi các
polysaccharide thành các đơn phân dưới tác động của enzym [6].
2
Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18
Hoàng Nguyên
Hình 1.1. Cấu trúc cellulose trong vách tế bào thực vật [46]
Sự sử dụng sinh khối cellulose phức tạp hơn so với cellulose thuần khiết
không chỉ bởi thành phần phức tạp của chúng mà còn bởi vì cấu trúc đa dạng của
tế bào thực vật. Tế bào thực vật rất khác nhau về kích thước và tổ chức. Một số
loại tế bào thực vật có vách mỏng, ít bị lignin hóa thì dễ dàng bị thủy phân bởi các
enzym thủy giải polysaccharide [23].
Sinh khối thực vật khó khăn trong việc thủy giải bởi vì: chúng liên kết với
hemicellulose, được bao bọc bởi lignin và có cấu trúc tinh thể có khả năng hình
thành sáu liên kết hydrogen: bốn liên kết nội phân tử và hai liên kết liên phân tử.
Do đó, trước khi thủy giải với enzym, việc tiền xử lý là cần thiết để gia tăng diện
tích bề mặt của cellulose bằng cách loại bỏ lớp lignin, hòa tan hemicellulose, phá
vỡ cấu trúc tinh thể và gia tăng cấu trúc lỗ trong tinh thể [11].
1.2. Các chủng sinh vật sinh cellulase
1.2.1. Nấm mốc
Nhiều vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose nhưng chỉ có một vài vi
sinh vật có khả năng phân hủy hiệu quả cellulose tinh thể [27]. Các sinh vật phân
hủy cellulose hiếu khí như vi khuẩn và nấm, sử dụng cellulose thông qua sản xuất
3
Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18
Hoàng Nguyên
số lượng lớn cellulase ngoại bào trong dịch nuôi cấy, mặc dù thỉnh thoảng cũng có
sự hiện diện trên bề mặt tế bào. Hầu hết các loài nấm đều có khả năng sử dụng
cellulose như là nguồn cơ chất cho sự phát triển. Nhiều loài nấm nguyên thủy, như
lớp nấm Chytridomycete kị khí, có khả năng thủy giải cellulose trong vùng ruột
của động vật nhai lại. Khả năng thủy giải cellulose cũng được tìm thấy ở nhiều
loài nấm kị khí khác [23].
Với xấp xỉ 700 loài nấm Zygomycete, nhưng chỉ một vài loài thuộc giống
Mucor cho thấy có hoạt tính thủy giải cellulose. Trái lại, ngành nấm Ascomycete,
Basidiomycete và Deuteromycete, mỗi ngành có hơn 15,000 loài, thủy giải mạnh
cellulose. Nhiều giống nấm thu hút nhiều sự nghiên cứu cho hoạt tính thủy giải
cellulose và gỗ như: Chaetomium và Helotium (Ascomycete); Coriolus,
Phanerochaete, Poria, Schizophyllum và Serpula (Basidiomycete); và Aspergillus,
Cladosporium, Fusarium, Geotrichum, Myrothecium, Paecilomyces, Penicillium
và Trichoderma (Deuteromycete) [23].
Nấm mốc thuộc giống Trichoderma và Aspergillus là hai loài sản xuất được
số lượng lớn cellulase và đã có nhiều sản phẩm thương mại dùng trong công
nghiệp. Trichoderma sản xuất ra lượng lớn endo-ß-glucanase và exo-ß-glucanase
nhưng với mức độ thấp ß-glucosidase, trong khi đó giống Aspergillus sản xuất số
lượng lớn endo-ß-glucanase và ß-glucosidase nhưng với số lượng thấp exo-ßglucanase [27].
Phức hợp cellulase của Trichoderma reesei có thể chuyển đổi hoàn toàn
cellulose tự nhiên cũng như các dẫn xuất của cellulose thành glucose. Sự phát triển
của các loại nấm cũng như sự sản xuất của các loại enzyme cellulase phụ thuộc
nhiều vào thành phần môi trường, nước, pH, nhiệt độ và ánh sáng, và không khí
môi trường xung quanh [34].
Chủng Aspergillus fumigatus cho thấy khả năng sử dụng cellulose tinh thể
như là nguồn carbon duy nhất. Chúng tạo ra nhiều loại cellulase ngoại bào, trong
đó có 6 vạch có hoạt tính endoglucanase khi điện di trên gel polyacrylamide. Hoạt
tính CMCase tối ưu tại 65°C và pH 2, cho thấy đây là loài vi sinh vật sản xuất
endoglucanase ưa nhiệt và acid [13].
4
Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18
Hoàng Nguyên
1.2.2. Vi khuẩn sản xuất cellulase
Trong số các loài vi khuẩn, khả năng thủy giải cellulose được tìm thấy ở hai
bộ: Actinomycetales hiếu khí và Clostridiales kị khí. Dựa vào các đặc điểm sinh lí,
vi khuẩn thủy giải cellulose có thể thấy bao gồm những nhóm sinh lí sau [23]:
o Vi khuẩn kị khí, gram dương (Clostridium, Ruminococcus, và
Caldicellulosiruptor)
o Vi khuẩn gram dương hiếu khí (Cellulomonas và Thermobifida)
o Vi khuẩn nhầy hiếu (Cytophaga, và Sporocytophaga)
Thông thường, chỉ một vài loài trong những giống trên có hoạt tính thủy giải
cellulose. Các vi khuẩn này khác nhau trong việc sử dụng oxy, nhiệt độ nuôi cấy,
nồng độ muối và cellulose trong môi trường tự nhiên. Việc phân loại các vi khuẩn
kị khí sử dụng cellulose là hết sức phức tạp bởi vì gần đây nhiều chủng vi khuẩn
không có khả năng thủy giải cellulose nhưng lại có hệ thống gen cellulosome
không được biểu hiện do sự sai hỏng của trình tự promoter như loài Clostridium
acetobutylicum [33].
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh lý của một số vi khuẩn thủy giải cellulose [23]
Tiêu
thụ
oxy
Hiếu
Khí
Giống
Loài tiêu biểu
Gram Kiểu
hình
To tối
ưu
Tạo
bào tử
Di động
Hệ thống
cellulase
Acidothermus
A. cellulolyticus
+
Que
-
-
Bacillus
B. pumilis
+
Que
C. cellovorans
+
Que
Nội
bào tử
-
Flagellar
Caldibacillus
Cellulomonasc
+
Que
-
Flagellar
-
Flagellar
-
Que
cong
Que
-
Cytophaga
C. flavigena, C.
uda
C. fulvus, C.
gilvus
C. hutchinsonii
-
Gliding
Erwinia
C. carotovora
-
Que
-
Flagellar
Không phức
hợp
Không phức
hợp
Không phức
hợp
Không phức
hợp
Không phức
hợp
Không phức
hợp
Không phức
hợp
Micromonospora
M. chalcae
+
Bào tử
-
Pseudomonas
-
Sporocytophaga
P. fluorescens var. cellulosa
S. myxococcoides -
que
Flagellar Không phức
hợp
Gliding Không phức
hợp
Rhodothermus
R. marinus
que
Ưa
nhiệt
Trung
bình
Ưa
nhiệt
Ưa
nhiệt
Trung
bình
Trung
bình
Trung
bình
Trung
bình
Trung
bình
Trung
bình
Ưa
nhiệt
Cellvibrio
Que
sợi
que
5
Bào tử
Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18
Kị
Khí
Hoàng Nguyên
Streptomyces
S. reticuli
+
Thermobifida
T. fusca
+
Acetivibrio
D. cellulolyticus
-
Anaerocellum
D. thermophilum
+
Butyrivibrio
B. fibrisolvens
+
Caldicellulosiruptor C.
saccharolyticum
Clostridium
C. thermocellum,
C. cellulolyticum
Que
sợi
Que
sợi
Que
cong
Que
-
Que
cong
Que
+
Que
Eubacterium
E. cellulosolvens
+
Que
Fervidobacterium
F. islandicum
-
Que
Fibrobacter
F. succinogenes
-
Que
Halocella
H. cellulolytica
-
Que
Ruminococcus
+
Cầu
Spirochaeta
R. albus, R.
flavefaciens
S. thermophila
+
Xoắn
Thermotoga
T. neapolitana
-
Que
Trung
bình
Ưa
nhiệt
Trung
bình
Ưa
nhiệt
Trung
bình
Ưa
nhiệt
Ưa
nhiệt,
trung
bình
Trung
bình
Ưa
nhiệt
Trung
bình
Trung
bình
Trung
bình
Ưa
nhiệt
Ưa
nhiệt
Bào tử
-
Bào tử
-
-
-
-
Flagellar Không phức
hợp
Flagellar Không phức
hợp
Flagellar Không phức
hợp
Flagellar Phức hợp
Nội
bào tử
Không phức
hợp
Không phức
hợp
Phức hợp
-
-
-
Que
-
-
-
Flagellar Không phức
hợp
Phức hợp
-
Phức hợp
Không phức
hợp
Các nhóm vi khuẩn kị khí và hiếu khí có sự khác nhau trong cơ chế thủy
giải cellulose. Hầu hết các vi khuẩn kị khí phân hủy cellulose thông qua hệ thống
cellulase phức hợp được tổ chức tốt như polycellulosome của Clostridium
thermocellum [33].
Mặc dù, các vi khuẩn kị khí tùy ý phân bố rộng rãi, giống Cellulomonas là
giống vi khuẩn kị khí tùy ý duy nhất có hoạt tính phân hủy cellulase. Các vi khuẩn
thủy giải cellulose hiếu khí trong đất thường được tìm thấy: Bacillus,
Micromonospora và Thermobifida [23].
Gần đây, chủng Bacillus subtilis DR được phân lập từ suối nước nóng tạo ra
một vài loại cellulase bền nhiệt. Nhiệt độ môi trường cao cho phép sản xuất ra loại
endocellulase CelDR bền nhiệt với nhiệt độ tối ưu lên đến 50°C và hoạt tính này
vẫn còn đến 70% tại 75°C sau khi ủ 30 phút. Chủng vi khuẩn này cho thấy có
6
Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18
Hoàng Nguyên
nhiều tiềm năng dùng trong công nghiệp lọc dầu bởi vì khả năng chịu được nhiệt
độ cao [27].
Chủng vi khuẩn ưa nhiệt thủy giải cellulose Brevibacillus sp. JXL có khả
năng sử dụng nhiều loại cơ chất như cellulose tinh thể, CMC, xylan, cellobiose,
glucose và xylose. Enzym của Brevibacillus sp. JXL có khả năng bền nhiệt rất cao,
vẫn giữ được 50% sau khi xử lý tại 100°C trong một giờ.
1.3. Đặc điểm vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt sinh cellulase
1.3.1. Đặc điểm chung
1.3.1.1. Cơ chất ưu tiên
Những loài vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose (Fibrobacter, Ruminococcus
và Clostridium) thường giới hạn trong phạm vi sử dụng carbohydrate, phát triển
trên cellulose và những sản phẩm thủy phân của chúng nhưng không phát triển
trên đường đơn, đường đôi, đường đa được cấu thành bởi các đơn phân khác
glucose. C. thermocellum phát triển chậm trên môi trường glucose và cả C.
thermocellum và R. albus dùng cellobiose ưu tiên hơn so với glucose. Một vài loài
vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose có thể sử dụng xylan [23].
Một vài báo cáo gần đây cho thấy các vi khuẩn kị khí phân giải cellulose
(Anaerocellum thermophilum, C. saccharolyticus và Halocella cellulolytica) có
phạm vi rộng trong việc sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau với các hợp chất
tinh bột, đường đơn, đường đa. Các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của
những loài thủy giải cellulose bao gồm: nitrogen, phospho, lưu huỳnh, các khoáng
đa lượng, vi lượng và một số loại vitamin. Một vài vi khuẩn thủy giải cellulose cần
các yếu tố cho sự phát triển mạnh như pepton hay dịch chiết nấm men [23].
1.3.1.2. Sự hình thành phức hợp cellulose-enzyme-microbe (CEM)
Sự biến dưỡng cellulose bắt đầu từ sự thủy phân cellulose thành các loại
đường đơn hoặc đôi và sau đó sử dụng các sản phẩm thủy giải này. Có 2 cách thủy
giải cellulose [23]:
7
Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18
Hoàng Nguyên
o Vi khuẩn hiếu khí và nấm: enzyme cellulase thường không gắn hay
gắn yếu vào cellulose, sản xuất cellulase ngoại bào và oxy hóa sản phẩm
thủy phân thành CO2 và nước.
o Vi khuẩn và nấm kị khí cho thấy khuynh hướng gắn enzyme
cellulase vào cellulose, sản xuất ra phức hợp cellulase được tổ chức thành
các cellulosome và tạo ra nhiều sản phẩm lên men khác nhau.
Yêu cầu đầu tiên cho sự thủy giải cellulose là sự liên kết enzym vào
cellulose hình thành phức hợp enzyme-cơ chất hoặc hình thành phức hợp CEM
[23]. Chủng đột biến C. thermocellum và F. succinogenes không có sự kết dính
này giảm khả năng thủy phân cellulose. Do đó, sự gắn kết phức hợp CEM là một
yêu cầu quan trọng cho sự sử dụng cellulose giữa các vi khuẩn kị khí, là tác nhân
quan trọng cho thủy giải cellulose [23].
Phức hợp CEM có nhiều thuận lợi hơn trong hoạt tính thủy giải cellulose
trong môi trường nuôi cấy: tập trung enzym trên bề mặt cellulose, cho phép vi sinh
vật thủy giải cellulose tiếp xúc với các sản phẩm thủy phân, bảo vệ vi khuẩn dưới
tác động của bacteriophage và các enzym thủy giải protease trong môi trường.
Nhìn chung, việc tạo các yếu tố liên kết cellulose có nhiều lợi ích trong việc tiết
kiệm phí tổn năng lượng cho vi khuẩn [23].
1.3.1.3. Sự hấp thu và biến dưỡng sản phẩm thủy phân cellulose
Sự hấp thu glucose và cellodextrin được tìm thấy ở nhiều loài thủy giải
cellulose. C. thermocellum cho thấy sự hấp thu [14C]cellobiose và cellodextrin bởi
hệ thống phụ thuộc ATP trong khi đó glucose cũng được hấp thụ theo cơ chế riêng
biệt và phụ thuộc ATP. Sự sụt giảm vận chuyển cellobiose và cellodextrin nhanh
chóng khi giảm nồng độ ATP nội bào.
8
Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18
Hoàng Nguyên
Hình 1.2. Sự hấp thu carbohydrate và phosphoryl hóa bởi C.thermocellum [35]
Chú thích: G-1-P, glucose-1-phosphate; G-6-P, glucose-6-phosphate; Pi, phosphate vô
cơ; CBPase, cellobiose phosphorylase; CDPase, cellodextrin phosphorylase; HK,
hexokinase; PGM, phosphoglucomutase.
Chủng vi khuẩn thủy giải cellulose Streptomyces reticuli sản xuất protein
ABC (ATP-binding cassette protein) có khả năng hỗ trợ vận chuyển cellobiose,
cellotriose và cellodextrin. Trái lại, F. succinogenes dùng nồng độ điện hóa cho sự
hấp thu glucose và cellobiose. Sự yêu cầu Na+ cho sự phát triển trên cellulose cho
thấy rằng Na+ cũng là động lực cho sự hấp thụ cellodextrin [26].
Nồng độ cellodextrin và các cơ chất khác như cellulose hoặc cellobiose
quyết định con đường biến dưỡng cellodextrin cũng như sự phân cắt thủy giải
phosphoryl hóa hay sự thủy giải không phosphoryl hóa. Sự điều hòa dòng cơ chất
thông qua hai con đường biến dưỡng có lẽ cung cấp một phương cách để điều
chỉnh cung cấp ATP đáp ứng với các yếu tố môi trường. Sinh khối tế bào gia tăng
cùng với sự gia tăng chiều dài chuỗi cellodextrin, sản lượng tế bào trên cellulose
cao hơn trên cellobiose [26].
9
Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18
Hoàng Nguyên
1.3.1.4. Sự biến dưỡng lên men và sản phẩm sau cùng
Đối với Clostridium và R. albus, ethanol và H2 là sản phẩm biến dưỡng cuối
cùng và acetyl coenzyme A (acetyl-CoA) có vai trò quan trọng tạo ra ethanol và
acetate [14]. Sự sản xuất ethanol trong nuôi cấy mẻ của C. thermocellum được gia
tăng khi cho thêm acetate và lactate và sụt giảm khi cho thêm ethanol [23]. Chủng
Anaerocellum thermophilum là chủng duy nhất trong số vi khuẩn kị khí thủy giải
cellulose, tạo ra lactate là sản phẩm chính của sự lên men cellulose [38].
Sản phẩm cuối cùng được điều hòa ở vài mức độ: nồng độ các chất trung
gian, sản phẩm lên men, chất mang electron, hoạt tính và sự tổng hợp enzym.
Chủng F. succinogenes S85, R. albus 7, và R. flavefaciens FD-1 ít thay đổi sản
phẩm lên men khi thay đổi tỷ lệ phát triển, pH, nguồn carbohydrate trong tự nhiên.
C. cellulolyticum và C. thermocellum có sự gia tăng tỉ lệ chuyển đổi ethanol thành
acetate và thay đổi tỷ lệ sản phẩm sau cùng khi có sự hiện diện của dịch chiết nấm
men trong môi trường [23].
Hầu hết các vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose phát triển tối ưu khi tiếp xúc
trực tiếp với cơ chất, một vài loài sự tiếp xúc này là bắt buộc. Giống như các vi
khuẩn kị khí khác, vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose thường có sinh khối thấp,
phần lớn cơ chất được chuyển thành các sản phẩm lên men khác nhau: ethanol,
acid hữu cơ, CO2 và H2 [23].
1.3.2. Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển hình
Clostridium thermocellum: là vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, thủy giải
cellulose và có khả năng sinh ethanol, chuyển đổi trực tiếp cơ chất cellulose thành
ethanol. Chúng phân hủy vật liệu cellulose thông qua một phức hợp cellulase lớn
gọi là cellulosome. Đây là một phức hợp protein rất phức tạp bao gồm khoảng 20
loại enzym có hoạt tính xúc tác khác nhau có trọng lượng từ 40-180 KDa.
Cellulosome của C. thermocellum được nghiên cứu nhiều và được dùng như là
kiểu mẫu trong nghiên cứu cellulosome ở các loài khác. Enzym thủy giải cellulose
trong môi trường nuôi cấy C. thermocellum được phân bố trong cả dịch lỏng và
trên bề mặt tế bào [23].
10
Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18
C. thermocellum
Hoàng Nguyên
Anaerocellum thermophilum
C. saccharolyticus
Hình 1.3. Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển hình
C. thermocellum thủy phân cellulose tạo thành sản phẩm trung gian
cellobiose và cellodextrin, sau đó tiếp tục được biến dưỡng và tạo thành sản phẩm
cuối cùng là ethanol, acetic acid, lactic acid, hydrogen và carbon dioxide [23].
C. thermocellum được quan tâm nghiên cứu nhiều bởi vì: chúng có thể sử
dụng chất thải thực vật và tạo ra ethanol, gián tiếp thủy giải vật liệu chứa lignin
như các loại gỗ cứng thay thế cách tiền xử lý bởi acid, giảm chi phí cung cấp oxy,
giảm tạp nhiễm và chi phí làm mát trong quá trình lên men, dễ dàng hơn trong quá
trình thu nhận ethanol, vi sinh vật ưa nhiệt có sức sống mạnh và hệ enzym bền
vững, sinh khối tế bào thấp nên cơ chất chuyển thành ethanol sẽ nhiều hơn [11].
Anaerocellum thermophilum: là vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, phát triển tối
ưu tại 75°C, không tạo bào tử, Gram dương được phân lập ở suối nước nóng
Kamchatka, Russia. Chúng phát triển nhanh chóng tại 75°C.
Anaerocellum thermophilum dùng nhiều loại polysaccharide, bao gồm
cellulose tinh thể, hemicellulose, pectin, tinh bột và sinh khối thực vật chưa được
tiền xử lý. Chúng tạo sản phẩm cuối cùng chủ yếu như lactate, acetate, CO2 và H2.
Anaerocellum thermophilum có trình tự bộ gen dài 2.97 Mb, bao gồm một
chromosome và hai plasmid (8.3 và 3.6 Kb). Bộ gen mã hóa nhiều loại enzym thủy
giải cellulose, vận chuyển, biến dưỡng đường đơn và có cấu trúc giống như loài ưa
nhiệt kị khí khác Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903 [21].
Caldicellulosiruptor saccharolyticus: là vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, Gram
dương lên men sinh khối thực vật chứa cellulose, hemicellulose và pectin tạo thành
acetate, CO2 và hydrogen. Chúng sử dụng nhiều loại cơ chất, khả năng tạo
11
- Xem thêm -