Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Phân lập, định danh và xác định đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn kị khí,...

Tài liệu Phân lập, định danh và xác định đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase

.PDF
61
138
97

Mô tả:

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HOÀNG NGUYÊN PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN KỊ KHÍ, ƯA NHIỆT, SINH CELLULASE CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH MÃ NGÀNH: 60 42 30 HDKH: TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH TP. HỒ CHÍ MINH, 06/2011 LỜI CẢM ƠN Khóa luận này được hoàn thành với sự quan tâm giúp đỡ rất nhiều của các thầy cô, các anh chị và các bạn. Xin được tỏ lòng cảm ơn chân thành đến: Thầy tiến sỹ Hoàng Quốc Khánh, phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam người đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận. Anh Ngô Đức Duy, anh Nguyễn Duy Long, chị Đào Thị Thu Hiền cùng toàn bộ các anh chị phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn trực tiếp hoàn thành khóa luận. Thầy cô và các anh chị ở Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam đã chỉ bảo trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Thầy cô bộ môn sinh hóa, cùng toàn thể các thầy cô khoa Sinh học Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh cũng như các thầy cô trước đây đã tận tâm dạy dỗ và truyền đạt nhiều kiến thức quí báu trong suốt nhiều năm học qua. Các bạn lớp cao học khóa 18 đã quan tâm, giúp đỡ và chia sẻ niềm vui nỗi buồn trong suốt quá trình học tập. Cuối cùng con xin cảm ơn ba mẹ đã nuôi nấng, chăm sóc, luôn dạy con điều hay lẽ phải và cho con ăn học thành người có ích cho xã hội. Em cũng xin cảm ơn các anh chị đã luôn quan tâm, chăm sóc, khích lệ em trong những lúc khó khăn nhất để em có thể vững bước trên đường đời. TP Hồ Chí Minh, 06/2011 Hoàng Nguyên MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ LỜI MỞ ĐẦU 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................... 1 1.1. Cấu trúc và thành phần của sinh khối cellulose ..................................... 1 1.1.1. Cấu trúc của cellulose .................................................................... 1 1.1.2. Thành phần của sinh khối thực vật ................................................ 2 1.2. Các chủng sinh vật sinh cellulase .......................................................... 3 1.2.1. Nấm mốc........................................................................................ 3 1.2.2. Vi khuẩn sản xuất cellulase ........................................................... 5 1.3. Đặc điểm vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt sinh cellulase ................................ 7 1.3.1. Đặc điểm chung ............................................................................ 7 1.3.1.1. Cơ chất ưu tiên ...................................................................... 7 1.3.1.2. Sự hình thành phức hợp cellulose-enzyme-microbe ............. 7 1.3.1.3. Sự hấp thu và biến dưỡng sản phẩm thủy phân cellulose ..... 8 1.3.1.4. Sự biến dưỡng lên men và sản phẩm sau cùng...................... 10 1.3.2. Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển hình ...... 10 1.4. Hệ thống enzym cellulase ..................................................................... 12 1.4.1. Thành phần của cellulase............................................................... 12 1.4.2. Cơ chế thủy giải cellulose.............................................................. 13 1.4.3. Ứng dụng enzyme cellulase........................................................... 14 1.4.4. Hệ thống cellulase không phức hợp............................................... 15 1.4.5. Cellulosome - Hệ thống cellulase phức hợp .................................. 16 1.4.5.1. Đặc điểm chung ..................................................................... 16 1.4.5.2. Cấu trúc cellulosome ............................................................. 18 1.4.5.3. Sự gắn kết cellulosome vào bề mặt tế bào ............................ 20 1.4.5.4. Sự sắp xếp của cellulosome .................................................. 22 1.4.5.5. Sự điều hòa nguồn carbon ..................................................... 24 1.5. Phương pháp phân lập vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase.............. 25 1.6. Phương pháp định danh sinh học phân tử .............................................. 26 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.................................................................. 29 2.1. Vật liệu..................................................................................................... 29 2.1.1. Nguồn phân lập .............................................................................. 29 2.1.2. Thiết bị dụng cụ ............................................................................. 29 2.1.2.1. Thiết bị thông dụng ............................................................... 29 2.1.2.2. Thiết bị phân lập vi khuẩn kị khí........................................... 29 2.1.2.3. Môi trường............................................................................. 30 2.1.2.4. Hóa chất .............................................................................. 31 2.1.2.5. Chủng vi khuẩn đối chứng............................................... 35 2.2. Phương pháp thực hiện ........................................................................... 35 2.1.1. Phương pháp tạo môi trường kị khí .............................................. 35 2.1.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn kị khí sinh cellulase ................... 36 2.2.2. Đặc tính sinh lí hình thái vi khuẩn................................................. 37 2.2.2.1. Đặc điểm khuẩn lạc .............................................................. 37 2.2.2.2. Phương pháp nhuộm Gram.................................................... 37 2.2.2.3. Phương pháp nhuộm bào tử .................................................. 38 2.2.3. Khảo sát khả năng sinh cellulase trên môi trường PCS................. 39 2.2.3.1. Khả năng sử dụng giấy lọc .................................................... 41 2.2.3.2. Khả năng sử dụng rơm rạ ...................................................... 41 2.2.3.3. Xác định hàm lượng protein ngoại bào ................................. 42 2.2.3.4. Định lượng hoạt tính cellulase tổng số.................................. 43 2.2.3.5. Bán định lượng hoạt tính endoglucanase .............................. 44 2.2.3.6. Hoạt tính endoglucanase xác định In-situ trên gel polyacrylamide.......................................................................................... 45 2.2.3.6.1. Lượng protein tối ưu thủy phân CMC .......................... 47 2.2.3.6.2. Sự khác biệt giữa dung dịch protein A và protein B..... 47 2.2.3.6.3. Khả năng thủy phân CMC của các chủng..................... 47 2.2.3.7. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh cellulase... 48 2.2.3.8. Tối ưu hóa hoạt tính cellulase ............................................... 48 2.2.3.8.1. Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase .................. 48 2.2.3.8.2. Ảnh hưởng pH lên hoạt tính cellulase........................... 48 2.2.4. Định danh vi khuẩn........................................................................ 49 2.2.4.1. Định danh nhanh bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc trưng cho vi khuẩn Clostridium.......................................................................... 50 2.2.4.2. Phản ứng PCR với cặp mồi universal và xây dựng cây phân loại loài ............................................................................................... 51 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ......................................................................... 52 3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase................. 52 3.2. Đặc điểm hình thái các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase 54 3.2.1. Đặc điểm khuẩn lạc........................................................................ 54 3.2.2. Nhuộm Gram ................................................................................ 55 3.2.3. Nhuộm bào tử ................................................................................ 56 3.3. Khảo sát khả năng sinh cellulase trên môi trường PCS ......................... 57 3.3.1. Khả năng sử dụng giấy lọc ........................................................... 57 3.3.2. Khả năng sử dụng rơm rạ ............................................................. 58 3.3.3. Xác định hàm lượng protein ngoại bào ....................................... 59 3.3.4. Xác định hoạt tính cellulase tổng số ............................................ 60 3.3.5. Bán định lượng hoạt tính endoglucanase trên đĩa thạch CMC..... 62 3.3.6. Hoạt tính endoglucanase xác định In-situ trên gel polyacrylamide ...................................................................................................... 64 3.3.6.1. Nồng độ protein tối ưu cho khả năng thủy phân CMC ......... 64 3.3.6.2. Sự khác biệt giữa dung dịch protein B và protein A ............ 65 3.3.6.3. Khả năng thủy phân CMC của 6 chủng khảo sát .................. 68 3.4. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh cellulase ................... 71 3.5. Tối ưu hóa hoạt tính cellulase ................................................................ 73 3.5.1. Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase .................................. 73 3.5.2. Ảnh hưởnng pH lên hoạt tính cellulase ....................................... 74 3.6. Định danh vi khuẩn ............................................................................... 75 3.6.1. Định danh nhanh bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc trưng cho vi khuẩn Clostridium ....................................................................... 76 3.6.2. PCR với cặp mồi universal và xây dựng cây phân loại ................ 77 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................ 81 4.1. Kết luận .................................................................................................. 81 4.2. Kiến nghị ................................................................................................ 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC 2 PHỤ LỤC 3 PHỤ LỤC 4 PHỤ LỤC 5 PHỤ LỤC 6 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Khả năng sử dụng giấy lọc.............................................................. 57 Biểu đồ 3.2. Khả năng sử dụng rơm rạ ................................................................ 58 Biểu đồ 3.3. Nồng độ protein ngoại bào của các chủng ...................................... 59 Biểu đồ 3.4. Hoạt tính cellulase tổng số của các chủng ..................................... 61 Biểu đồ 3.5. Sự tương quan giữa lg(trọng lượng phân tử) protein thang chuẩn với Rf.......................................................................................................................... 67 Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh cellulase...... 72 Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính celluase ............................... 73 Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính celluase ....................................... 85 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc cellulose trong vách tế bào thực vật ..................................... 3 Hình 1.2. Sự hấp thu carbohydrate và phosphoryl hóa bởi C.thermocellum ...... 9 Hình 1.3. Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển hình ........... 11 Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của hệ enzym cellulase của Trichoderma reesei.... 13 Hình 1.5. Cấu trúc cellulosome của C. thermocellum......................................... 18 Hình 1.6. Sự gắn kết cellulosome vào bề mặt tế bào .......................................... 21 Hình 1.7. Cấu trúc của phức hợp Coh-XDoc loại II của loài C. thermocellum .. 23 Hình 2.1. Quy trình thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi universal ................. 52 Hình 3.1. Vòng phân giải cellulose của mẫu DR5 và DM7 ............................... 53 Hình 3.2. Khuẩn lạc chủng DR5-1 ..................................................................... 54 Hình 3.3. Kết quả nhuộm Gram chủng TQ1-2.................................................... 55 Hình 3.4. Kết quả nhuộm bào tử chủng DR5-1 .................................................. 56 Hình 3.5. Vòng phân CMC của dung dịch protein B và protein A của TQ1-2 .. 62 Hình 3.6. Vạch phân giải CMC trên gel với lượng protein khác nhau của dung dịch Protein B chủng TQ1-2 ................................................................................ 64 Hình 3.7a. Kết quả điện di SDS-PAGE các chủng DM5-1, DM7-1, DR5-1 ..... 66 Hình 3.7b. Kết quả điện di SDS-PAGE các chủng DM8-1, DT2-1, TQ1-2...... 66 Hình 3.8a. Vạch phân giải CMC của dung dịch Protein B và protein A chủng DM5-1, DM7-1, DR5-1 ....................................................................................... 69 Hình 3.8b. Vạch phân giải CMC của dung dịch ProteinB và protein A chủng DM8-1, DT2-1, TQ1-2......................................................................................... 69 Hình 3.9. Sản phẩm PCR cặp mồi S-G-Clos-0586-S-21 và S-G-Clos-1205-A-21. .............................................................................................................................. 76 Hình 3.10. Sản phẩm PCR cặp mồi universal ..................................................... 77 Hình 3.11. Cây phân loại loài của các chủng khảo sát........................................ 80 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Đặc điểm sinh lý của một số vi khuẩn thủy giải cellulose.................. 5 Bảng 1.2. Vi khuẩn sản xuất hệ thống cellulosome ......................................... 17 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc.............................................................. 54 Bảng 3.2. Nhuộm Gram và khảo sát các đặc điểm hình thái tế bào.................... 55 Bảng 3.3. Hoạt tính cellulase tổng số của các chủng ......................................... 61 Bảng 3.4. Hoạt tính endoglucanase trên đĩa thạch CMC .................................... 62 Bảng 3.5. Trọng lượng phân tử của các vạch protein trên SDS-PAGE .............. 68 Bảng 3.6. Trọng lượng phân tử của các vạch protein phân giải CMC trên gel... 70 1 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cấu trúc và thành phần của sinh khối cellulose 1.1.1. Cấu trúc của cellulose Cellulose là polimer được cấu thành từ các đơn phân glucose được liên kết bởi β-1,4 glycoside, là vật liệu chủ yếu của vách tế bào thực vật và là nguồn carbohydrate phong phú nhất trong tự nhiên. Mức độ polimer hóa thường từ 100 đến 20.000. Các chuỗi cellulose gần nhau được liên kết với nhau tạo thành các tấm cellulose qua liên kết hydrogen và liên kết Vander Waal tạo thành cấu trúc tinh thể, phân tử dạng sợi, bền vững [43]. Khoảng 30 phân tử cellulose riêng lẻ được sắp xếp thành đơn vị lớn hơn gọi là sợi cơ bản, sau đó được bó thành sợi lớn hơn gọi là vi sợi và được cấu trúc thành những sợi cellulose. Sợi cellulose bền vững bởi các liên kết nội phân tử cũng như liên kết hydrogen nội phân tử. Sự xắp xếp các chuỗi riêng lẻ bên trong những sợi cơ bản đã được tìm hiểu từ sự phân tích tán xạ tia X [23]. Cấu trúc cellulose tinh thể bao gồm những cấu trúc cố định trong những vị trí riêng biệt có quan hệ chặt chẽ với những vị trí khác. Chúng có khả năng ngăn ngừa sự xâm nhập không chỉ enzym mà thậm chí những phân tử nhỏ như nước. Bên cạnh cellulose cấu trúc tinh thể, những sai sót trong cấu trúc tinh thể đã dẫn đến hình thành một nhóm sợi cellulose có cấu trúc vô định hình. Sợi cellulose còn có những cấu trúc bất quy tắc khác như: những chỗ xoắn trong vi sợi, những lỗ trống trên bề mặt, những lỗ, hốc nhỏ và một số mạch nhỏ. Tổng diện tích tiếp xúc của sợi cellulose lớn hơn bề mặt tinh thể trong cấu trúc cùng kích thước. Sự không đồng nhất trong cấu trúc làm cho sợi bị hydrate bởi nước khi nhúng vào môi trường lỏng và cho phép sự xâm nhập bởi các phân tử lớn bao gồm các enzym thủy phân cellulose [23]. Phân tử cellulose rất bền vững, với thời gian bán rã là 5-8 triệu năm cho sự phân cắt liên kết β-1,4 glycoside tại 25oC. Trong khi, quá trình phân hủy sinh học thường nhanh hơn và cung cấp dòng carbon cho khí quyển [43]. 1 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên 1.1.2. Thành phần của sinh khối thực vật Sinh khối thực vật chiếm giữ khoảng một nửa nguồn carbon trong sinh quyển. Người ta ước tính rằng lượng carbon được thực vật đồng hóa hàng năm khoảng 200 tỷ tấn [29]. Khoảng 70% sinh khối thực vật được cấu thành từ các đơn vị đường chứa 5, 6 carbon [27]. Phân tử cellulose kết hợp thành những sợi có cấu trúc tinh thể hình thành nên bộ khung cho vách tế bào thực vật. Sợi cellulose được liên kết chéo với các polysaccharide khác gọi là hemicellulose để làm tăng độ bền cho vách tế bào. Hemicellulose bao gồm xylan (đơn phân -D-xylose với liên kết 1,4-), glucomannan (đơn phân -D-mannose và -D-glucose với liên kết -1,4-), xyloglucan (đơn phân -D- glucose với liên kết 1,4-, và -D-xylose và -D-glucose với liên kết -1,6-), 1,3-1,4-glucan (đơn phân -D-glucose với liên kết -1,3- và -1,4-), và số lượng nhỏ polysaccharide khác bao gồm -D-glucose, -D-xylose, -D-mannose và đơn vị đường khác với các liên kết khác nhau. Bộ khung cellulose và hemicellulose còn được liên kết với pectin (đơn phân -D-galacturonic acid với liên kết chủ yếu -1,4-), với chức năng là chất gắn trong vách tế bào [23]. Thành phần và cấu trúc của vách tế bào có sự khác biệt lớn giữa các loài thực vật, hàm lượng cellulose thông thường chiếm từ 35 đến 50% trọng lượng khô thực vật. Trong một số trường hợp, sợi cellulose được gắn vào mạng lưới các sợi sinh học khác, chủ yếu là hemicellulose chiếm khoảng 20 đến 35% và lignin chiếm khoảng đến 30% trọng lượng khô thực vật [23]. Lignin, hiện diện cùng với cellulose trong nhiều loài thực vật giúp làm cứng vách tế bào thực vật. Các loại thực vật khác nhau thì có thành phần lignin khác nhau. Tuy nhiên, sự hiện diện của lignin ngăn cản sự chuyển đổi các polysaccharide thành các đơn phân dưới tác động của enzym [6]. 2 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên Hình 1.1. Cấu trúc cellulose trong vách tế bào thực vật [46] Sự sử dụng sinh khối cellulose phức tạp hơn so với cellulose thuần khiết không chỉ bởi thành phần phức tạp của chúng mà còn bởi vì cấu trúc đa dạng của tế bào thực vật. Tế bào thực vật rất khác nhau về kích thước và tổ chức. Một số loại tế bào thực vật có vách mỏng, ít bị lignin hóa thì dễ dàng bị thủy phân bởi các enzym thủy giải polysaccharide [23]. Sinh khối thực vật khó khăn trong việc thủy giải bởi vì: chúng liên kết với hemicellulose, được bao bọc bởi lignin và có cấu trúc tinh thể có khả năng hình thành sáu liên kết hydrogen: bốn liên kết nội phân tử và hai liên kết liên phân tử. Do đó, trước khi thủy giải với enzym, việc tiền xử lý là cần thiết để gia tăng diện tích bề mặt của cellulose bằng cách loại bỏ lớp lignin, hòa tan hemicellulose, phá vỡ cấu trúc tinh thể và gia tăng cấu trúc lỗ trong tinh thể [11]. 1.2. Các chủng sinh vật sinh cellulase 1.2.1. Nấm mốc Nhiều vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose nhưng chỉ có một vài vi sinh vật có khả năng phân hủy hiệu quả cellulose tinh thể [27]. Các sinh vật phân hủy cellulose hiếu khí như vi khuẩn và nấm, sử dụng cellulose thông qua sản xuất 3 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên số lượng lớn cellulase ngoại bào trong dịch nuôi cấy, mặc dù thỉnh thoảng cũng có sự hiện diện trên bề mặt tế bào. Hầu hết các loài nấm đều có khả năng sử dụng cellulose như là nguồn cơ chất cho sự phát triển. Nhiều loài nấm nguyên thủy, như lớp nấm Chytridomycete kị khí, có khả năng thủy giải cellulose trong vùng ruột của động vật nhai lại. Khả năng thủy giải cellulose cũng được tìm thấy ở nhiều loài nấm kị khí khác [23]. Với xấp xỉ 700 loài nấm Zygomycete, nhưng chỉ một vài loài thuộc giống Mucor cho thấy có hoạt tính thủy giải cellulose. Trái lại, ngành nấm Ascomycete, Basidiomycete và Deuteromycete, mỗi ngành có hơn 15,000 loài, thủy giải mạnh cellulose. Nhiều giống nấm thu hút nhiều sự nghiên cứu cho hoạt tính thủy giải cellulose và gỗ như: Chaetomium và Helotium (Ascomycete); Coriolus, Phanerochaete, Poria, Schizophyllum và Serpula (Basidiomycete); và Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Geotrichum, Myrothecium, Paecilomyces, Penicillium và Trichoderma (Deuteromycete) [23]. Nấm mốc thuộc giống Trichoderma và Aspergillus là hai loài sản xuất được số lượng lớn cellulase và đã có nhiều sản phẩm thương mại dùng trong công nghiệp. Trichoderma sản xuất ra lượng lớn endo-ß-glucanase và exo-ß-glucanase nhưng với mức độ thấp ß-glucosidase, trong khi đó giống Aspergillus sản xuất số lượng lớn endo-ß-glucanase và ß-glucosidase nhưng với số lượng thấp exo-ßglucanase [27]. Phức hợp cellulase của Trichoderma reesei có thể chuyển đổi hoàn toàn cellulose tự nhiên cũng như các dẫn xuất của cellulose thành glucose. Sự phát triển của các loại nấm cũng như sự sản xuất của các loại enzyme cellulase phụ thuộc nhiều vào thành phần môi trường, nước, pH, nhiệt độ và ánh sáng, và không khí môi trường xung quanh [34]. Chủng Aspergillus fumigatus cho thấy khả năng sử dụng cellulose tinh thể như là nguồn carbon duy nhất. Chúng tạo ra nhiều loại cellulase ngoại bào, trong đó có 6 vạch có hoạt tính endoglucanase khi điện di trên gel polyacrylamide. Hoạt tính CMCase tối ưu tại 65°C và pH 2, cho thấy đây là loài vi sinh vật sản xuất endoglucanase ưa nhiệt và acid [13]. 4 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên 1.2.2. Vi khuẩn sản xuất cellulase Trong số các loài vi khuẩn, khả năng thủy giải cellulose được tìm thấy ở hai bộ: Actinomycetales hiếu khí và Clostridiales kị khí. Dựa vào các đặc điểm sinh lí, vi khuẩn thủy giải cellulose có thể thấy bao gồm những nhóm sinh lí sau [23]: o Vi khuẩn kị khí, gram dương (Clostridium, Ruminococcus, và Caldicellulosiruptor) o Vi khuẩn gram dương hiếu khí (Cellulomonas và Thermobifida) o Vi khuẩn nhầy hiếu (Cytophaga, và Sporocytophaga) Thông thường, chỉ một vài loài trong những giống trên có hoạt tính thủy giải cellulose. Các vi khuẩn này khác nhau trong việc sử dụng oxy, nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ muối và cellulose trong môi trường tự nhiên. Việc phân loại các vi khuẩn kị khí sử dụng cellulose là hết sức phức tạp bởi vì gần đây nhiều chủng vi khuẩn không có khả năng thủy giải cellulose nhưng lại có hệ thống gen cellulosome không được biểu hiện do sự sai hỏng của trình tự promoter như loài Clostridium acetobutylicum [33]. Bảng 1.1. Đặc điểm sinh lý của một số vi khuẩn thủy giải cellulose [23] Tiêu thụ oxy Hiếu Khí Giống Loài tiêu biểu Gram Kiểu hình To tối ưu Tạo bào tử Di động Hệ thống cellulase Acidothermus A. cellulolyticus + Que - - Bacillus B. pumilis + Que C. cellovorans + Que Nội bào tử - Flagellar Caldibacillus Cellulomonasc + Que - Flagellar - Flagellar - Que cong Que - Cytophaga C. flavigena, C. uda C. fulvus, C. gilvus C. hutchinsonii - Gliding Erwinia C. carotovora - Que - Flagellar Không phức hợp Không phức hợp Không phức hợp Không phức hợp Không phức hợp Không phức hợp Không phức hợp Micromonospora M. chalcae + Bào tử - Pseudomonas - Sporocytophaga P. fluorescens var. cellulosa S. myxococcoides - que Flagellar Không phức hợp Gliding Không phức hợp Rhodothermus R. marinus que Ưa nhiệt Trung bình Ưa nhiệt Ưa nhiệt Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Ưa nhiệt Cellvibrio Que sợi que 5 Bào tử Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Kị Khí Hoàng Nguyên Streptomyces S. reticuli + Thermobifida T. fusca + Acetivibrio D. cellulolyticus - Anaerocellum D. thermophilum + Butyrivibrio B. fibrisolvens + Caldicellulosiruptor C. saccharolyticum Clostridium C. thermocellum, C. cellulolyticum Que sợi Que sợi Que cong Que - Que cong Que + Que Eubacterium E. cellulosolvens + Que Fervidobacterium F. islandicum - Que Fibrobacter F. succinogenes - Que Halocella H. cellulolytica - Que Ruminococcus + Cầu Spirochaeta R. albus, R. flavefaciens S. thermophila + Xoắn Thermotoga T. neapolitana - Que Trung bình Ưa nhiệt Trung bình Ưa nhiệt Trung bình Ưa nhiệt Ưa nhiệt, trung bình Trung bình Ưa nhiệt Trung bình Trung bình Trung bình Ưa nhiệt Ưa nhiệt Bào tử - Bào tử - - - - Flagellar Không phức hợp Flagellar Không phức hợp Flagellar Không phức hợp Flagellar Phức hợp Nội bào tử Không phức hợp Không phức hợp Phức hợp - - - Que - - - Flagellar Không phức hợp Phức hợp - Phức hợp Không phức hợp Các nhóm vi khuẩn kị khí và hiếu khí có sự khác nhau trong cơ chế thủy giải cellulose. Hầu hết các vi khuẩn kị khí phân hủy cellulose thông qua hệ thống cellulase phức hợp được tổ chức tốt như polycellulosome của Clostridium thermocellum [33]. Mặc dù, các vi khuẩn kị khí tùy ý phân bố rộng rãi, giống Cellulomonas là giống vi khuẩn kị khí tùy ý duy nhất có hoạt tính phân hủy cellulase. Các vi khuẩn thủy giải cellulose hiếu khí trong đất thường được tìm thấy: Bacillus, Micromonospora và Thermobifida [23]. Gần đây, chủng Bacillus subtilis DR được phân lập từ suối nước nóng tạo ra một vài loại cellulase bền nhiệt. Nhiệt độ môi trường cao cho phép sản xuất ra loại endocellulase CelDR bền nhiệt với nhiệt độ tối ưu lên đến 50°C và hoạt tính này vẫn còn đến 70% tại 75°C sau khi ủ 30 phút. Chủng vi khuẩn này cho thấy có 6 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên nhiều tiềm năng dùng trong công nghiệp lọc dầu bởi vì khả năng chịu được nhiệt độ cao [27]. Chủng vi khuẩn ưa nhiệt thủy giải cellulose Brevibacillus sp. JXL có khả năng sử dụng nhiều loại cơ chất như cellulose tinh thể, CMC, xylan, cellobiose, glucose và xylose. Enzym của Brevibacillus sp. JXL có khả năng bền nhiệt rất cao, vẫn giữ được 50% sau khi xử lý tại 100°C trong một giờ. 1.3. Đặc điểm vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt sinh cellulase 1.3.1. Đặc điểm chung 1.3.1.1. Cơ chất ưu tiên Những loài vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose (Fibrobacter, Ruminococcus và Clostridium) thường giới hạn trong phạm vi sử dụng carbohydrate, phát triển trên cellulose và những sản phẩm thủy phân của chúng nhưng không phát triển trên đường đơn, đường đôi, đường đa được cấu thành bởi các đơn phân khác glucose. C. thermocellum phát triển chậm trên môi trường glucose và cả C. thermocellum và R. albus dùng cellobiose ưu tiên hơn so với glucose. Một vài loài vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose có thể sử dụng xylan [23]. Một vài báo cáo gần đây cho thấy các vi khuẩn kị khí phân giải cellulose (Anaerocellum thermophilum, C. saccharolyticus và Halocella cellulolytica) có phạm vi rộng trong việc sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau với các hợp chất tinh bột, đường đơn, đường đa. Các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của những loài thủy giải cellulose bao gồm: nitrogen, phospho, lưu huỳnh, các khoáng đa lượng, vi lượng và một số loại vitamin. Một vài vi khuẩn thủy giải cellulose cần các yếu tố cho sự phát triển mạnh như pepton hay dịch chiết nấm men [23]. 1.3.1.2. Sự hình thành phức hợp cellulose-enzyme-microbe (CEM) Sự biến dưỡng cellulose bắt đầu từ sự thủy phân cellulose thành các loại đường đơn hoặc đôi và sau đó sử dụng các sản phẩm thủy giải này. Có 2 cách thủy giải cellulose [23]: 7 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên o Vi khuẩn hiếu khí và nấm: enzyme cellulase thường không gắn hay gắn yếu vào cellulose, sản xuất cellulase ngoại bào và oxy hóa sản phẩm thủy phân thành CO2 và nước. o Vi khuẩn và nấm kị khí cho thấy khuynh hướng gắn enzyme cellulase vào cellulose, sản xuất ra phức hợp cellulase được tổ chức thành các cellulosome và tạo ra nhiều sản phẩm lên men khác nhau. Yêu cầu đầu tiên cho sự thủy giải cellulose là sự liên kết enzym vào cellulose hình thành phức hợp enzyme-cơ chất hoặc hình thành phức hợp CEM [23]. Chủng đột biến C. thermocellum và F. succinogenes không có sự kết dính này giảm khả năng thủy phân cellulose. Do đó, sự gắn kết phức hợp CEM là một yêu cầu quan trọng cho sự sử dụng cellulose giữa các vi khuẩn kị khí, là tác nhân quan trọng cho thủy giải cellulose [23]. Phức hợp CEM có nhiều thuận lợi hơn trong hoạt tính thủy giải cellulose trong môi trường nuôi cấy: tập trung enzym trên bề mặt cellulose, cho phép vi sinh vật thủy giải cellulose tiếp xúc với các sản phẩm thủy phân, bảo vệ vi khuẩn dưới tác động của bacteriophage và các enzym thủy giải protease trong môi trường. Nhìn chung, việc tạo các yếu tố liên kết cellulose có nhiều lợi ích trong việc tiết kiệm phí tổn năng lượng cho vi khuẩn [23]. 1.3.1.3. Sự hấp thu và biến dưỡng sản phẩm thủy phân cellulose Sự hấp thu glucose và cellodextrin được tìm thấy ở nhiều loài thủy giải cellulose. C. thermocellum cho thấy sự hấp thu [14C]cellobiose và cellodextrin bởi hệ thống phụ thuộc ATP trong khi đó glucose cũng được hấp thụ theo cơ chế riêng biệt và phụ thuộc ATP. Sự sụt giảm vận chuyển cellobiose và cellodextrin nhanh chóng khi giảm nồng độ ATP nội bào. 8 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên Hình 1.2. Sự hấp thu carbohydrate và phosphoryl hóa bởi C.thermocellum [35] Chú thích: G-1-P, glucose-1-phosphate; G-6-P, glucose-6-phosphate; Pi, phosphate vô cơ; CBPase, cellobiose phosphorylase; CDPase, cellodextrin phosphorylase; HK, hexokinase; PGM, phosphoglucomutase. Chủng vi khuẩn thủy giải cellulose Streptomyces reticuli sản xuất protein ABC (ATP-binding cassette protein) có khả năng hỗ trợ vận chuyển cellobiose, cellotriose và cellodextrin. Trái lại, F. succinogenes dùng nồng độ điện hóa cho sự hấp thu glucose và cellobiose. Sự yêu cầu Na+ cho sự phát triển trên cellulose cho thấy rằng Na+ cũng là động lực cho sự hấp thụ cellodextrin [26]. Nồng độ cellodextrin và các cơ chất khác như cellulose hoặc cellobiose quyết định con đường biến dưỡng cellodextrin cũng như sự phân cắt thủy giải phosphoryl hóa hay sự thủy giải không phosphoryl hóa. Sự điều hòa dòng cơ chất thông qua hai con đường biến dưỡng có lẽ cung cấp một phương cách để điều chỉnh cung cấp ATP đáp ứng với các yếu tố môi trường. Sinh khối tế bào gia tăng cùng với sự gia tăng chiều dài chuỗi cellodextrin, sản lượng tế bào trên cellulose cao hơn trên cellobiose [26]. 9 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên 1.3.1.4. Sự biến dưỡng lên men và sản phẩm sau cùng Đối với Clostridium và R. albus, ethanol và H2 là sản phẩm biến dưỡng cuối cùng và acetyl coenzyme A (acetyl-CoA) có vai trò quan trọng tạo ra ethanol và acetate [14]. Sự sản xuất ethanol trong nuôi cấy mẻ của C. thermocellum được gia tăng khi cho thêm acetate và lactate và sụt giảm khi cho thêm ethanol [23]. Chủng Anaerocellum thermophilum là chủng duy nhất trong số vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose, tạo ra lactate là sản phẩm chính của sự lên men cellulose [38]. Sản phẩm cuối cùng được điều hòa ở vài mức độ: nồng độ các chất trung gian, sản phẩm lên men, chất mang electron, hoạt tính và sự tổng hợp enzym. Chủng F. succinogenes S85, R. albus 7, và R. flavefaciens FD-1 ít thay đổi sản phẩm lên men khi thay đổi tỷ lệ phát triển, pH, nguồn carbohydrate trong tự nhiên. C. cellulolyticum và C. thermocellum có sự gia tăng tỉ lệ chuyển đổi ethanol thành acetate và thay đổi tỷ lệ sản phẩm sau cùng khi có sự hiện diện của dịch chiết nấm men trong môi trường [23]. Hầu hết các vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose phát triển tối ưu khi tiếp xúc trực tiếp với cơ chất, một vài loài sự tiếp xúc này là bắt buộc. Giống như các vi khuẩn kị khí khác, vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose thường có sinh khối thấp, phần lớn cơ chất được chuyển thành các sản phẩm lên men khác nhau: ethanol, acid hữu cơ, CO2 và H2 [23]. 1.3.2. Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển hình Clostridium thermocellum: là vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, thủy giải cellulose và có khả năng sinh ethanol, chuyển đổi trực tiếp cơ chất cellulose thành ethanol. Chúng phân hủy vật liệu cellulose thông qua một phức hợp cellulase lớn gọi là cellulosome. Đây là một phức hợp protein rất phức tạp bao gồm khoảng 20 loại enzym có hoạt tính xúc tác khác nhau có trọng lượng từ 40-180 KDa. Cellulosome của C. thermocellum được nghiên cứu nhiều và được dùng như là kiểu mẫu trong nghiên cứu cellulosome ở các loài khác. Enzym thủy giải cellulose trong môi trường nuôi cấy C. thermocellum được phân bố trong cả dịch lỏng và trên bề mặt tế bào [23]. 10 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 C. thermocellum Hoàng Nguyên Anaerocellum thermophilum C. saccharolyticus Hình 1.3. Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển hình C. thermocellum thủy phân cellulose tạo thành sản phẩm trung gian cellobiose và cellodextrin, sau đó tiếp tục được biến dưỡng và tạo thành sản phẩm cuối cùng là ethanol, acetic acid, lactic acid, hydrogen và carbon dioxide [23]. C. thermocellum được quan tâm nghiên cứu nhiều bởi vì: chúng có thể sử dụng chất thải thực vật và tạo ra ethanol, gián tiếp thủy giải vật liệu chứa lignin như các loại gỗ cứng thay thế cách tiền xử lý bởi acid, giảm chi phí cung cấp oxy, giảm tạp nhiễm và chi phí làm mát trong quá trình lên men, dễ dàng hơn trong quá trình thu nhận ethanol, vi sinh vật ưa nhiệt có sức sống mạnh và hệ enzym bền vững, sinh khối tế bào thấp nên cơ chất chuyển thành ethanol sẽ nhiều hơn [11]. Anaerocellum thermophilum: là vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, phát triển tối ưu tại 75°C, không tạo bào tử, Gram dương được phân lập ở suối nước nóng Kamchatka, Russia. Chúng phát triển nhanh chóng tại 75°C. Anaerocellum thermophilum dùng nhiều loại polysaccharide, bao gồm cellulose tinh thể, hemicellulose, pectin, tinh bột và sinh khối thực vật chưa được tiền xử lý. Chúng tạo sản phẩm cuối cùng chủ yếu như lactate, acetate, CO2 và H2. Anaerocellum thermophilum có trình tự bộ gen dài 2.97 Mb, bao gồm một chromosome và hai plasmid (8.3 và 3.6 Kb). Bộ gen mã hóa nhiều loại enzym thủy giải cellulose, vận chuyển, biến dưỡng đường đơn và có cấu trúc giống như loài ưa nhiệt kị khí khác Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903 [21]. Caldicellulosiruptor saccharolyticus: là vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, Gram dương lên men sinh khối thực vật chứa cellulose, hemicellulose và pectin tạo thành acetate, CO2 và hydrogen. Chúng sử dụng nhiều loại cơ chất, khả năng tạo 11
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan