Tài liệu Nuôi cấy mô cây dầu mè (jatropha curcas l.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NUÔI CẤY MÔ CÂY DẦU MÈ (Jatropha curcas L.) Nghành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VĂN HẠNH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************** NUÔI CẤY MÔ CÂY DẦU MÈ (Jatropha curcas L.) Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học GVHD: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. TRẦN VĂN MINH NGUYỄN VĂN HẠNH Khóa: 2003-2007 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn:  Cha mẹ đã suốt đời tận tụy để con có đƣợc ngày hôm nay.  Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trƣờng.  Thầy Trần Văn Minh đã tận tình hƣớng dẫn, ân cần chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.  Cô Bùi Thị Tƣờng Thu, Thạc sĩ Trần Văn Định, Kỹ sƣ Khƣu Hoàng Minh, các anh chị nhân viên cùng các bạn sinh viên thực tập tại Phòng Thí Nghiệm Trọng Điểm Phía Nam về Công Nghệ Tế Bào Thực Vật thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành khoá luận này.  Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã gắn bó, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt 4 năm qua. Sinh viên thực hiện Nguyễn Văn Hạnh iii TÓM TẮT NGUYỄN VĂN HẠNH, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “NUÔI CẤY MÔ CÂY DẦU MÈ (Jatropha curcas L.)”. Giảng viên hƣớng dẫn: PGS.TS. TRẦN VĂN MINH Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm phía Nam về Công Nghệ Tế Bào Thực Vật, Viện Sinh Học Nhiệt Đới tại TP.HCM. Thời gian thực hiện tháng 2 đến tháng 8 năm 2007. Hạt của cây dầu mè có chứa một lƣợng lớn chất béo (37%) là nguồn nguyên liệu để sản xuất dầu diesel sinh học (biodiesel). Đây là nguồn nguyên liệu mới an toàn cho môi trƣờng, hiệu quả kinh tế và có khả năng tái sinh đƣợc. Nguồn năng lƣợng này hứa hẹn sẽ thay thế cho thủy điện, dầu diesel, dầu hỏa, khí hóa lỏng, than, củi … Dầu của cây còn sử dụng để sản xuất chất tẩy rửa, chất nhuộm và dầu thơm. Lá, vỏ và rễ cây chứa những chất có đặc tính dƣợc liệu. Cây có thể phát triển rất tốt trên những vùng đất khô cằn và không đòi hỏi nhiều sự chăm sóc của con ngƣời. Do đó, cây dầu mè rất thích hợp trở thành cây công nghiệp mang lại hiệu quả kính tế cao cho ngƣời dân. Và để đáp ứng cho nhu cầu giống, chúng tôi thực hiện đề tài “Nuôi cấy mô cây dầu mè (Jatropha curcas L.)”. Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi đạt đƣợc một số kết quả sau:  Mẫu hạt cây dầu mè đƣợc vô trùng tốt nhất với Natri hypochlorit 15% trong thời gian 60 phút, mẫu chồi cây dầu mè đƣợc vô trùng tốt nhất trong Natri hypochlorit 10% thời gian 45 phút.  Môi trƣờng khoáng cơ bản thích hợp để nuôi cấy mô cây dầu mè in vitro là môi trƣờng MS.  Môi trƣờng thích hợp để nhân chồi cây dầu mè là môi trƣờng MS bổ sung BA (0,1 mg/l) và IBA (0,01 mg/l).  Môi trƣờng thích hợp cho sự ra rễ là môi trƣờng MS bổ sung IBA nồng độ 0,3 mg/l. iv SUMMARY NGUYEN VAN HANH, Nong Lam University, HCMC. August, 2007. “TISSUE CULTURE OF PHYSIC NUT (Jatropha curcas L.)” Guided teacher: A.Professor Dr. TRAN VAN MINH This thesis was completed at Southern Key Laboratory for Plant Cell Technology, Institute of Tropical Biology from Frebruary to August 2007. Seeds of Jatropha contain a large amount of fat (37%), are a source to produce biodiesel. This is an environmentally safe, cost effective and renewable source of non-conventional energy as a promising substitute to hydel power, diesel, kerosene, LPG, coal, firewood etc. Jatropha oil can be used to produce washing agent, dye and perfume. Leave, bark and root contain medicinal substance. Jatropha can grow in arid and semi-arid condition and does not require so much human care. So jatropha is suitable to become an economic industrial plant. To produce breed of jatropha we’ve done this thesis “Tissue culture of physic nut (Jatropha curcas L.)” Some results of this thesis:  Seeds are steriled with Natri hypochlorit 15% for 60 min. axillary nodes with Natri hypochlorit 10% for 45 min.  Salt basal culture medium is MS.  Suitable medium for bud proliferation is MS supplemented with BA (0,1 mg/l) and IBA (0,01 mg/l).  Medium for rooting is MS complemented IBA (0,3 mg/l). v MỤC LỤC Phần Trang LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... iii TÓM TẮT ............................................................................................................... iv SUMMARY ............................................................................................................. v MỤC LỤC ............................................................................................................... vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... ix DANH SÁCH CÁC HÌNH ..................................................................................... ix DANH SÁCH CÁC BẢNG .................................................................................... xi Chƣơng 1. MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1 1.1. Đăt vấn đề.................................................................................................... 1 1.2. Mục đích và yêu cầu.................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích ............................................................................................ 2 1.2.2. Yêu cầu .............................................................................................. 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3 2.1. Nhân giống cây trồng in vitro ..................................................................... 3 2.1.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................. 3 2.1.2. Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật ..................... 3 2.1.3. Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật ................ 5 2.1.4. Các giai đoạn nhân giống in vitro ...................................................... 5 2.1.4.1. Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy ....................................... 5 2.1.4.2. Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy .......................................... 6 2.1.4.3. Giai đoạn 3: Nhân nhanh .......................................................... 6 2.1.4.4. Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh .............................................. 6 2.1.4.5. Giai đoạn 5: Đƣa cây ra đất ...................................................... 7 2.1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy mô ............................. 7 2.1.5.1. Mô nuôi cấy .............................................................................. 7 2.1.5.2. Vô trùng trong nuôi cấy ............................................................ 7 2.1.5.3. Điều kiện nuôi cấy .................................................................... 9 vi 2.1.5.4. Môi trƣờng nuôi cấy ............................................................... 12 2.1.5.5. Vai trò của chất kích thích sinh trƣởng trong nuôi cấy .......... 12 2.1.5.6. Ảnh hƣởng của pH và Agar .................................................... 14 2.2. Giới thiệu về cây dầu mè (Jatropha curcas L.) ........................................ 16 2.2.1. Vị trí phân loại ................................................................................. 16 2.2.2. Đặc điểm sinh học ............................................................................ 17 2.2.2.1. Mô tả ....................................................................................... 17 2.2.2.2. Sinh thái .................................................................................. 18 2.2.3. Công dụng ........................................................................................ 19 2.2.3.1. Nhựa mủ ................................................................................. 19 2.2.3.2. Lá, vỏ và rễ cây....................................................................... 19 2.2.3.3. Hạt và dầu ............................................................................... 19 2.2.3.4. Dầu mè và nguyên liệu sinh học ............................................. 20 2.2.4. Nhân giống ....................................................................................... 22 2.2.4.1. Phƣơng pháp nhân giống cổ truyền ........................................ 22 2.2.4.2. Phƣơng pháp nhân giống hiện đại .......................................... 23 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 25 3.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm ............................................................. 25 3.2. Vật liệu ...................................................................................................... 25 3.2.1. Đối tƣợng thí nghiệm ....................................................................... 25 3.2.2. Trang thiết bị và dụng cụ ................................................................. 25 3.2.3. Môi trƣờng nuôi cấy......................................................................... 25 3.2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro............................................................... 27 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................... 27 3.3.1. Phƣơng pháp khử trùng mẫu ............................................................ 27 3.3.2. Bố trí thí nghiệm .............................................................................. 28 3.3.2.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của nồng độ chất khử trùng và thời gian khử mẫu đến tỉ lệ sống của mẫu cây dầu mè ...... 28 vii 3.3.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trƣờng khoáng cơ bản thích hợp để nuôi cấy mô cây dầu mè in vitro ........................ 29 3.3.2.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của BA đến khả năng tạo chồi của cây dầu mè. ............................................................... 30 3.3.2.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến khả năng tạo chồi của cây dầu mè trong điều kiện in vitro .................... 31 3.3.2.5. 3.3.3. Thí nghiệm 5: Nuôi cấy tạo rễ cây dầu mè in vitro ................ 32 Phƣơng pháp xử lý số liệu ............................................................... 33 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 34 4.1. Thí nghiệm 1: Vô trùng mô cấy ban đầu từ cây thực sinh ........................ 34 4.1.1. Vô trùng mẫu hạt ............................................................................. 35 4.1.2. Vô trùng mẫu chồi ........................................................................... 36 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trƣờng khoáng cơ bản cho cây dầu mè in vitro ...................................................................................................... 39 4.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của BA đến sự hình thành chồi của cây dầu mè ................................................................................................ 41 4.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến sự hình thành chồi của cây dầu mè .......................................................................................... 43 4.5. Thí nghiệm 5: Nuôi cấy tạo rễ cây dầu mè in vitro................................... 45 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 47 5.1. Kết luận ..................................................................................................... 47 5.2. Đề nghị ...................................................................................................... 47 Chƣơng 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................ 48 PHẦN PHỤ LỤC ...................................................................................................... a viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BA : Benzyl adenine Ki : Kinetin 2,4-D : Dichlorophenory acetic acid HgCl2 : Thủy ngân chlorite IAA : -indole acetic acid IBA : -indole butyric acid NAA : -naphtalen acetic acid Cw : Nƣớc dừa (Coconut water) Suc : Đƣờng sucrose CRD : Completely randomized design Ctv : Cộng tác viên CV : Hệ số biến động LSD : Sai số nhỏ nhất MS : Murashige – Skoog, 1962 WPM : Lloy – Mc Cown, 1980 ix DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Cây dầu mè (Jatropha curcas L.) ......................................................... 16 Hình 2.2: Lá và hoa cây dầu mè ............................................................................ 18 Hình 2.3: Hoa, quả và hạt cây dầu mè .................................................................. 18 Hình 2.4: Các cây sản xuất dầu thực vật ............................................................... 22 Hình 4.2: Chồi cây dầu mè nảy từ các hạt vô trùng .............................................. 38 Hình 4.1: Mẫu thực sinh cây dầu mè đƣợc vô trùng phát sinh chồi ..................... 38 Hình 4.3: Sự phát triển của cây dầu mè trên các môi trƣờng khoáng cơ bản ....... 40 Hình 4.4: Ảnh hƣởng của BA đến sự tạo chồi của cây dầu mè ............................ 42 Hình 4.5: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến sự tạo chồi của cây dầu mè................ 44 Hình 4.6: Nuôi cấy tạo rễ cây dầu mè in vitro ...................................................... 44 Hình 4.7: Cây dầu mè in vitro ............................................................................... 46 x DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Năng suất dầu của cây dầu mè .............................................................. 20 Bảng 3.1: Ảnh hƣởng của nồng độ NaOCl và thời gian xử lý vô trùng mẫu ........ 29 Bảng 3.2: Thí nghiệm xác định môi trƣờng khoáng cơ bản .................................. 30 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng tạo cụm chồi in vitro cây dầu mè ............................................................................................. 31 Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến sự tạo chồi của cây dầu mè ............... 32 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của IBA đến tạo rễ cây dầu mè .......................................... 33 Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử mẫu đến tỉ lệ mẫu hạt vô trùng ............................................................................. 35 Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử mẫu đến tỉ lệ mẫu chồi vô trùng ........................................................................... 36 Bảng 4.3: Khảo sát môi trƣờng khoáng cơ bản cho cây dầu mè ........................... 39 Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của BA đến sự tạo chồi của cây dầu mè ............................ 41 Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến sự tạo chồi của cây dầu mè ............... 43 Bảng 4.6: Tác động của IBA đến việc tạo rễ cây dầu mè in vitro......................... 45 xi 1 Chƣơng 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đăt vấn đề Xã hội con ngƣời ngày càng phát triển hiện đại, cùng với nó là nhu cầu năng lƣợng và nhiên liệu cho phát triển kinh tế - xã hội ngày càng tăng. Nguồn nguyên liệu chính đƣợc con ngƣời sử dụng là xăng dầu có nguồn gốc hóa thạch. Xăng dầu đƣợc sử dụng để chạy các động cơ diessel trong các nhà máy, để vận hành động cơ. Xăng dầu có tác động cực kì lớn đối với sự phát triển nền kinh tế của mỗi quốc gia. Sản lƣợng xăng dầu tiêu thụ trên thế giới tăng tỉ lệ thuận với tốc độ tăng trƣởng kinh tế, các nƣớc tiêu thụ xăng dầu lớn nhất hiện nay là Mỹ và Trung Quốc. Theo ƣớc tính trữ lƣợng dầu mỏ trên thế giới là có giới hạn. Với xu hƣớng khai thác và sử dụng nhƣ hiện nay, chắc chắn trong một thời gian không lâu nguồn nguyên liệu hóa thạch này sẽ cạn kiệt. Do vai trò cực kì quan trọng của dầu mỏ nên trƣớc khi nguồn nguyên liệu này cạn kiệt, con ngƣời phải nhanh chóng tìm ra nguồn nguyên liệu thay thế. Có nhiều nguyên liệu đã đƣợc đề xuất nhƣ khai thác năng lƣợng mặt trời, năng lƣợng gió, thủy triều, sử dụng nguyên liệu hydrô … Và khoảng 30 năm trở lại đây, có một hƣớng rất mới là sử dụng dầu diessel sinh học (biodiesel) để thay thế cho dầu diesel bình thƣờng. Diessel sinh học là dầu đƣợc chiết xuất hoàn toàn từ thực vật nhƣ hạt cải dầu (Mỹ), hạt hƣớng dƣơng (Ý và Miền nam nƣớc Pháp), đậu nành (Mỹ và Braxil), hạt cây bông (Hy Lạp), dầu cọ (Malaysia) và từ hạt cây dầu mè (Nicaragoa và Nam Mỹ). So với các cây khác, cây dầu mè có ƣu điểm chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trƣờng tốt hơn. Ngoài lấy hạt để ép dầu, trồng cây còn giúp cải tạo đất và môi trƣờng nhất là ở những vùng đất hoang, khô cằn. Cây dầu mè là cây có tiềm năng kinh tế rất lớn lại thích hợp với điều kiện khí hậu nhiệt đới của Việt Nam. Nếu nhận đƣợc sự quan tâm đúng mức của bộ Nông nghiệp, cây hoàn toàn có thể trở thành một cây giúp nông dân làm giàu ngay trên những vùng đất bỏ hoang mà nhiều cây trồng khác không phát triển đƣợc. 2 Phƣơng pháp nhân giống cây dầu mè truyền thống là giâm cành, tuy nhiên phƣơng pháp này có nhƣợc điểm là nhân chậm và rễ tạo ra không sâu nên cây trồng dễ bị ngã đổ. Do đó, tôi thực hiện đề tài “Nuôi cấy mô cây dầu mè (Jatropha curcas L.)” để tạo ra nguồn cây giống nhanh và liên tục cung ứng cho những yêu cầu lớn về số lƣợng cây con. 1.2. Mục đích và yêu cầu 1.2.1. Mục đích Nghiên cứu khả năng nhân giống nhanh cây dầu mè (Jatropha curcas L.) in vitro nhằm tạo nguồn giống cây ban đầu sạch bệnh có tính đồng nhất về mặt di truyền đáp ứng yêu cầu cây giống phục vụ cho nhu cầu sản xuất. 1.2.2. Yêu cầu o Vô trùng mẫu nuôi cấy để tạo nguồn nguyên liệu ban đầu. o Khảo sát môi trƣờng khoáng cơ bản thích hợp để nuôi cấy in vitro cây dầu mè. o Khảo sát ảnh hƣởng của BA đến quá trình nuôi cấy tạo chồi cây dầu mè in vitro. o Khảo sát sự ảnh hƣởng của BA và IBA trong sự tạo chồi cây dầu mè in vitro. o Khảo sát quá trình tái sinh cụm chồi cây dầu mè in vitro. 3 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Nhân giống cây trồng in vitro 2.1.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học. Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, con ngƣời đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên. Do đó, tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đƣa một giống mới vào sản xuất. Hơn nữa, dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản cây trồng quý hiếm. Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô bắt đầu bằng một mảnh nhỏ thực vật vô trùng đặt vào môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này tạo ra bằng sự tăng sinh, đƣợc phân chia và cấy chuyền để nhân giống. Nuôi cấy mô tế bào thực vật cho đến nay đƣợc chứng minh là phƣơng pháp nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan hiệu quả nhất. Năm 1939, nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan trên sự hình thành chồi và rễ (White và Nobercourt, 1939). Và các kết quả nghiên cứu về sự tác động của các nhân tố bên trong và bên ngoài ảnh hƣởng đến sự hình thành cơ quan (Thorpe, 1980, 1988). Qua kết quả nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan in vitro, cho thấy có 3 nhân tố ảnh hƣởng trực tiếp: môi trƣờng nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy và mẫu đƣợc sử dụng trong nuôi cấy. Vận dụng quá trình hình thành cơ quan in vitro qua sự tác động tƣơng hỗ của các nhân tố nói trên, có hàng ngàn loài thực vật đã đƣợc nghiên cứu quá trình hình thành chồi và rễ. 2.1.2. Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ nằm trong sinh lý thực vật. Ở nƣớc ta ngành này mới đƣợc chú ý và phát triển khoảng 15 – 20 năm trở lại đây. Trong công tác giống cây trồng, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã 4 đƣợc phát triển những cơ sở lý thuyết về tế bào học và cơ sở sinh lý thực vật học nhƣ Nguyễn Văn Uyển (1996) và một số nhà nuôi cấy mô nƣớc ngoài đã nhận định: - Đó là tính toàn thể của mô và tế bào thực vật, cho phép tái sinh đƣợc cây hoàn chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi cấy tách rời. Đây là một điểm rất quan trọng, bởi vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện đƣợc những kỹ thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng. - Khả năng loại trừ virus bằng nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, tạo các dòng vô tính sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính. Vấn đề này đƣợc các nhà khoa học khai thác để phục tráng các giống khoai tây, cây ăn trái (cam, quýt). - Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi protocorm vào nhân giống vô tính với tốc độ cực nhanh cây trồng phục vụ sản xuất: cây lƣơng thực (khoai tây), cây cảnh (phong lan), cây lâm nghiệp (bạch đàn, tếch,...). - Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm, khả năng trao đổi quốc tế các nguồn gen sạch bệnh dƣới dạng cây nuôi trong ống nghiệm. - Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn, từ đó tạo ra các dòng đồng hợp tử tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn đƣợc chu trình lai tạo. - Khả năng hấp thu DNA ngoại lai vào tế bào nhờ công nghệ gen. - Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật nhƣ nuôi cấy vi sinh vật và qua đó ứng dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao phục vụ công tác tạo giống. - Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng dung hợp protoplast tái sinh cây hoàn chỉnh từ các protoplast lai. - Khả năng sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tƣợng bất thụ khi lai xa. - Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài và ở nhiệt độ thấp không mất tính toàn thể của tế bào. Đồng thời việc nuôi cấy mô tế bào cũng tạo những cơ sở cho quá trình nghiên cứu di truyền thực vật, vai trò chất điều hoà sinh trƣởng thực vật. Ngày nay cùng với công nghệ gen, nuôi cấy mô tế bào là một phần quan trọng không thể thiếu, thúc đẩy việc ứng dụng công nghệ sinh học trong ngành kinh 5 tế. Hai nhiệm vụ lớn của công nghệ sinh học thực vật ở nƣớc ta từ nay tới năm 2010 là: tạo ra các giống cây trồng mới bằng phƣơng pháp công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là công nghệ gen và nhân nhanh các giống, dòng ƣu việt bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (Nguyễn Văn Uyển, 1996). 2.1.3. Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật Theo Bùi Bá Bổng (1995), nhân giống bằng nuôi cấy mô có những lợi điểm sau: Nuôi cấy mô giống nhƣ nhân giống vô tính vì phƣơng pháp này tạo ra cây con đồng nhất và giống nhƣ cây mẹ về mặt di truyền. Đối với các cây trồng thuộc nhóm thụ phấn chéo nhƣ phần lớn các loài cây ăn trái, các cây con sinh ra từ hạt không hoàn toàn đồng nhất, và có thể không giống nhƣ cây mẹ, trong trƣờng hợp này nhân giống vô tính có lợi điểm hơn nhân giống từ hạt. So với kiểu nhân giống vô tính thông thƣờng (chiết cành, hom), nhân giống bằng nuôi cấy mô có ƣu điểm là có thể nhân một số lƣợng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trong thời gian ngắn. Có thể tạo ra cây con sạch bệnh nhờ áp dụng việc chọn lọc vật liệu ban đầu một cách chặt chẽ hoặc làm cho vật liệu ban đầu trở nên sạch bệnh. Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hƣởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh. Một giống cây quý có thể đƣợc nhân ra nhanh chóng để đƣa vào sản xuất. 2.1.4. Các giai đoạn nhân giống in vitro Theo Trần Thị Dung (2003), sự thành công của việc nhân giống in vitro chỉ đạt đƣợc khi trải qua các giai đoạn: 2.1.4.1. Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy Đây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra đƣợc nguyên liệu vô trùng để đƣa vào nuôi cấy in vitro. 6 Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên. Tuy vậy, nếu kiên trì tìm đƣợc nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt kết quả. 2.1.4.2. Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy Mục đích của các giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hƣớng các mô nuôi cấy. Quá trình này đƣợc điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin, cytokynin ngoại sinh đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy. Tuy nhiên, bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy. Thƣờng mô non, chƣa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn các mô trƣởng thành. Ngƣời ta còn nhận thấy rằng mẫu nuôi cấy trong thời gian sinh trƣởng nhanh của cây cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi. 2.1.4.3. Giai đoạn 3: Nhân nhanh Giai đoạn này đƣợc coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Để tăng hệ số nhân, ta thƣờng đƣa thêm vào môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo các chất điều hoà sinh trƣởng (Auxin, Cytokynin, Gibberellin,…), các chất bổ sung khác nhƣ nƣớc dừa, dịch chiết nấm men,… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Tuỳ thuộc vào từng đối tƣợng nuôi cấy, ngƣời ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành qua các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính. 2.1.4.4. Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh Khi đạt đƣợc kích thƣớc nhất định, các chồi đƣợc chuyển từ môi trƣờng ở giai đoạn 3 sang môi trƣờng tạo rễ. Thƣờng 2 – 3 tuần, từ những chồi riêng lẽ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này ngƣời ta thƣờng bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy các auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. 7 2.1.4.5. Giai đoạn 5: Đƣa cây ra đất Giai đoạn đƣa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bƣớc cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bƣớc quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất. Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dƣỡng sang sống hoàn toàn tự dƣỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt dộ, ánh sáng, ẩm độ, giá thể,…) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vƣờn ƣơm cũng nhƣ ruộng sản xuất. 2.1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy mô 2.1.5.1. Mô nuôi cấy Theo lý thuyết tất cả các mô chƣa hóa gỗ đang sinh trƣởng mạnh nhƣ: Mô phân sinh ngọn, tƣợng tầng, đầu rễ, phôi đang phát triển, thịt quả non…, khi đặt vào môi trƣờng có chứa một lƣợng hormon thích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo. Tuy nhiên, mỗi tế bào ở mỗi mô khác nhau có khả năng tạo mô sẹo, phân hóa thành rễ, thân, cành, lá… rất khác nhau. Do đó kết quả thu đƣợc cũng rất khác nhau ở những mẫu khi đƣa vào nuôi cấy. Việc chọn mẫu thực vật để sử dụng trong quá trình nuôi cấy có vai trò quyết định, nếu chọn sai mẫu chúng ta sẽ không thu nhận đƣợc kết quả, hoặc thu đƣợc những cây sẽ không phát triển mạnh, thậm chí cây có thể ngƣng phát triển ở một giai đoạn nhất định (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). Các kết quả nghiên cứu cho thấy để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, ngƣời ta chú trọng đến các chồi bên và mô phân sinh đỉnh. 2.1.5.2. Vô trùng trong nuôi cấy Môi trƣờng nuôi cấy mô thực vật có chứa đƣờng, muối khoáng và vitamin, thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật. Nếu môi trƣờng nuôi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần toàn bộ bề mặt môi trƣờng nuôi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn, thí nghiệm phải loại bỏ vì trong điều kiện này mô cấy không thể phát triển và chết dần. Khác với thí nghiệm vi 8 sinh có thể kết thúc trong vài ngày, mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi rất cao mới có hi vọng thành công. Để đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy đòi hỏi chúng ta phải thực hiện các yêu cầu sau: - Vô trùng mô cấy. - Vô trùng dụng cụ thủy tinh, môi trƣờng và nút đậy. - Trong thao tác nuôi cấy cần phải tránh làm rơi nấm, khuẩn lên bề mặt môi trƣờng nuôi cấy. Mô cấy có thể là các bộ phận khác nhau của thực vật, tùy theo sự tiếp xúc với môi trƣờng bên ngoài mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn, nấm. Phƣơng pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm, khuẩn. Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng trên bề mặt mô cấy. Các chất kháng sinh ít đƣợc sử dụng vì tác dụng không triệt để và ảnh hƣởng xấu lên sự sinh trƣởng của mô cấy. Ngoài ra, ngƣời ta còn sử dụng các chất làm giảm sức căng bề mặt nhƣ: Tween 80, fotoflo, teepol vào dung dịch diệt nấm khuẩn. Street (1974), đƣa ra khái niệm về nồng độ và thời gian sử dụng các chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô cấy nhƣ sau (Trần Văn Minh, 2004): Tác nhân vô trùng Nồng độ % Thời gian xử lý Hiệu quả (phút) Hypochlorite canxi 9 – 10 5 – 30 Rất tốt Hypochlorite natri 2 5 – 30 Rất tốt Hydroperoxid (H2O2) 10 – 12 5 – 15 Tốt Nƣớc Brom 1–2 2 – 10 Rất tốt HgCl2 0,1 – 1 2 – 10 Trung bình Chất kháng sinh 4 – 50 mg/l 30 – 60 Khá tốt Trong quá trình xử lý mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt nấm, khuẩn, với các bộ phận có bám nhiều cát, bụi trƣớc khi xử lý cần rửa sạch bằng xà 9 phòng và nƣớc máy. Sau khi xử lý xong, mô cấy đƣợc rửa sạch nhiều lần bằng nƣớc cất vô trùng (tối thiểu 3 lần), loại bỏ những phần bị tác nhân vô trùng trƣớc khi đặt mô cấy lên môi trƣờng nhằm tránh ảnh hƣởng trực tiếp của tác nhân vô trùng lên mô cấy (Trần Văn Minh, 2004). Sơ đồ xử lý mẫu thực sinh: Mẫu thực sinh Rửa kĩ bằng xà phòng và nƣớc máy Cho vào bình tam giác Ngâm trong cồn 700C khoảng 30 – 60 giây Rửa bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần Tiếp tục ngâm trong dung dịch diệt khuẩn 1 – 25% trong 5 – 15 phút với vài giọt Tween 80 Rửa bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần Cắt bỏ những phần mô bị tác nhân vô trùng làm trắng Đặt lên môi trƣờng nuôi cấy 2.1.5.3. Điều kiện nuôi cấy  Nhiệt độ: Nhiệt độ có ảnh hƣởng sâu sắc đến sinh trƣởng và phát triển cây in vitro qua các tiến trình sinh lý nhƣ hô hấp, hình thành tế bào và cơ quan, nhiệt độ thích hợp nhất thƣờng đƣợc dùng trong nuôi cấy mô tế bào là từ 20 – 270C (Trần Văn Minh, 2004). Còn theo Hughes (1981), nhiệt độ thích hợp trong nuôi cấy mô là 32 – 350C, trong khi những báo cáo khác ghi nhận nhiệt độ thích hợp cho Streptocapus là 120C