ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------------------------
NGUYỄN THỊ THƯƠNG
NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH STREPTOKINASE
TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG Streptococcus pyogenes
TRONG Escherichia coli
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - 2011
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------------------------
NGUYỄN THỊ THƯƠNG
NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH STREPTOKINASE
TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG Streptococcus pyogenes
TRONG Escherichia coli
Chuyên ngành
:
Vi sinh vật học
Mã số
:
60 42 40
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. QUYỀN ĐÌNH THI
LUẬN VĂN ĐƢỢC THỰC HIỆN TẠI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Hà Nội – 2011
Nguyễn Thị Thương
Luận văn thạc sỹ
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................
1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................2
1.1 Chứng tắc nghẽn mạch máu ....................................................................2
1.1.1 Quá trình đông máu .............................................................................2
1.1.2 Cơ chế tan máu đông ...........................................................................6
1.1.3 Bệnh tắc nghẽn mạch máu ..................................................................7
1.2 Streptokinase ...........................................................................................9
1.2.1 Giới thiệu chung ..................................................................................9
1.2.2 Cấu trúc không gian ..........................................................................10
1.2.3 Cơ chế hoạt động...............................................................................11
1.2.4 SK tái tổ hợp .....................................................................................13
1.2.5 Tình hình nghiên cứu điều trị tan huyết khối của SK ......................17
1.3 Streptococcus pyogenes ........................................................................18
1.3.1 Phân loại khoa học ............................................................................18
1.3.2 Lịch sử nghiên cứu ............................................................................19
1.3.3 Đặc điểm sinh học .............................................................................19
1.3.4 Đặc điểm gây bệnh ............................................................................21
2
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .......................................22
2.1 Nguyên liệu và thiết bị ..........................................................................22
2.1.1 Tế bào và plasmid .............................................................................22
2.1.2 Hóa chất ............................................................................................22
2.1.3 Dung dịch và đệm .............................................................................23
2.1.4 Môi trường nuôi cấy ..........................................................................24
2.1.5 Thiết bị thí nghiệm ............................................................................24
2.2 Phương pháp nghiên cứu.......................................................................25
2.2.1 Các phương pháp vi sinh vật .............................................................25
2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử ...................................................25
2.2.3 Các phương pháp hóa sinh ................................................................29
1
Nguyễn Thị Thương
Luận văn thạc sỹ
3
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................35
3.1 Nhân dòng gene mã hóa mSK-nonhis...................................................35
3.2
3.3
Thiết kế plasmid biểu hiện mSK ...........................................................36
Biểu hiện streptokinase nonhis .............................................................39
3.4
3.5
Tinh sạch streptokinase nonhis .............................................................41
Hoạt hóa SK ..........................................................................................43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 45
PHỤ LỤC .............................................................................................................. 52
CÁC TỪ VIẾT TẮT
AMI
Acute myocardial infarction
BLAST
Basic local alignment search tool
bp
Base pair
DNA
Deoxyribonucleic acid
DNase
Deoxyribonuclease
dNTP
2-Deoxynucleoside 5-triphosphate
EDTA
Ethylenediamine tetraacetic acid
EtBr
Ethidium bromide
kb
Kilo base
kDa
Kilo Dalton
KP
Kali phosphate
M
Marker
MI
Myocardial infarction
mSK
Streptokinase
mSK-nonhis
Streptokinase không mang đuôi 6x-histidine
OD
Optical density
PCR
Polymerase chain reaction
2
Nguyễn Thị Thương
Luận văn thạc sỹ
Pr
Protein
rSK
Recombinant streptokinase
SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel
electrophoresis
Taq
Thermus aquaticus
TBE
Tris boric acid EDTA
TE
Tris EDTA
TEMED
N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine
v/v
Volume/volume
w/v
Weight/volume
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cơ chế đông máu. .......................................................................................5
Hình 1.2. Sơ đồ tiêu sợi huyết. ...................................................................................6
Hình 1.3. Huyết khối trong mạch. ..............................................................................8
Hình 1.4. Cấu trúc không gian 3 chiều của streptokinase. .......................................11
Hình 1.5. Cơ chế xúc tác của streptokinase. .............................................................12
Hình 1.6. Streptococcus dưới kính hiển vi điện tử. ..................................................20
Hình 1.7. Khuẩn lạc S. pyogenges trên môi trường thạch máu. ...............................20
Hình 2.1. Đường chuẩn SK. .....................................................................................33
Hình 2.2. Đường chuẩn Bradford. ............................................................................34
Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm nhân gene msk-nonhis. ...........................................35
Hình 3.2. Điện di đồ DNA thiết kế vector biểu hiện pEmSK. .................................36
Hình 3.3. Peak trình tự pEmSK-nonhis. ...................................................................37
Hình 3.4. Cấu trúc biểu hiện của pEmSK-nonhis. ...................................................38
Hình 3.5. Điện di đồ protein tổng số của mẫu biểu hiện. .........................................39
Hình 3.6. Phân tích năng suất protein biểu hiện tính bằng phần mềm Dolphin 1D. 39
Hình 3.7. Điện di đồ protein dịch nổi và cặn. ..........................................................40
Hình 3.8. Điện di đồ protein tinh sạch. ....................................................................41
Hình 3.9. Phân tích độ sạch của mSK-nonhis bằng phần mềm Dolphin 1D. ..........42
Hình 3.10. Phản ứng lai Western..............................................................................43
3
Nguyễn Thị Thương
Luận văn thạc sỹ
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các yếu tố đông máu. .................................................................................3
Bảng 2.1. Plasmid nhân dòng và biểu hiện...............................................................22
Bảng 2.2. Thành phần các loại đệm và dung dịch. ...................................................23
Bảng 2.3. Các thiết bị thí nghiệm. ............................................................................24
Bảng 2.4. Thành phần PCR. .....................................................................................26
Bảng 2.5. Thành phần gel co và gel tách. .................................................................29
Bảng 3.1. Hiệu suất tinh sạch mSK-nonhis tái tổ hợp. .............................................42
Bảng 3.2. Độ sạch của mSK-nonhis qua các lần phá siêu âm ..................................43
Bảng 3.3. Hoạt tính mSK-nonhis sau hoạt hóa.........................................................44
Các bảng phụ lục
Bảng 1. Hàm lượng protein các mẫu tinh sạch. ........................................................52
Bảng 2. Hoạt tính mSK-nonhis của các mẫu tinh sạch. ...........................................52
Bảng 3. Khả năng hoạt hóa mSK-nonhis xử lý bằng guanidine của các chất hoạt
hóa .............................................................................................................................53
Bảng 4. Đường chuẩn SK. ........................................................................................53
Bảng 5. Hàm lượng của các băng protein trong dịch tế bào JMpEmSK ..................54
Bảng 6. Độ sạch của mSK-nonhis sau các lần tinh sạch ..........................................55
4
Nguyễn Thị Thương
Luận văn thạc sỹ
MỞ ĐẦU
Trong xã hội hiện đại, khi nền kinh tế ngày một phát triển cộng với áp lực về
công việc và thời gian khiến cho chế độ ăn của con người trở nên mất cân đối là
một trong những nguyên nhân lớn dẫn đến bệnh tim mạch. Bệnh tim mạch đang là
nguyên nhân gây tử vong số một trên thế giới (www.who.int/2011). Bệnh tim mạch
làm chết 7 triệu người mỗi năm và chiếm 12,2% các ca tử vong trên toàn thế giới
[41]. Xu hướng này sẽ tiếp tục gia tăng trong hai thập kỷ tiếp theo và gây ra những
tác động lớn hơn ở các nước có thu nhập thấp và trung bình, nơi chiếm tới 3/4 số ca
tử vong do tim mạch vào năm 2001 [13, 55]. Bệnh tim mạch là nguyên nhân gây tử
vong hàng đầu ở các nước Mỹ Latinh, Caribe, các nước Trung Đông và cả Châu
Phi. Tử vong do tim mạch dự kiến sẽ tăng gấp 3 lần trong 20 năm tới [55]. Một
trong những nguyên nhân chính dẫn đến các bệnh tim mạch là do chứng tắc nghẽn
mạch máu. Do đó để hạn chế thấp nhất tỷ lệ tử vong và các biến chứng do bệnh tim
mạch gây ra, các nhà khoa học đi theo hướng phòng ngừa và xử lý các huyết khối
hình thành trong mạch.
Trên thị trường hiện nay có một số thuốc đặc trị tắc nghẽn mạch máu như
Durakinase, Streptase, Alteplase, Tenecteplase Tuy nhiên, đây hầu hết là các sản
phẩm của nước ngoài với giá thành rất đắt. Nghiên cứu so sánh không thấy sự khác
biệt về ưu thế của các loại thuốc trên [21]. Sự khác biệt lớn nhất là giá cả, thuốc có
bản chất r-tPA có giá gấp gần 10 lần streptokinase. Do đó, streptokinase thường
được sử dụng hơn ở các nước đang phát triển.
Ở Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu về các thuốc tan huyết. Đề tài
KC10 (2009-2010) có thể coi là công trình nghiên cứu cấp nhà nước đầu tiên về
lĩnh vực này. Trong đề tài này các nhà nghiên cứu đã nhân dòng, biểu hiện và tinh
sạch thành công streptokinase. Streptokinase được biểu hiện cả ở dạng có tín hiệu
và không có tín hiệu (mSK), trong đó mSK với hoạt tính cao hơn. Streptokinase tái
tổ hợp bước đầu được thử nghiệm trên đối tượng thỏ thí nghiệm cho kết quả tốt.
1
Nguyễn Thị Thương
Luận văn thạc sỹ
Để hạn chế thấp nhất tỷ lệ tử vong và các biến chứng của chứng tắc nghẽn mạch
máu thì thời gian xử lý huyết khối trong mạch là một yếu tố vô cùng quan trọng.
Thuốc tan huyết khối dạng tiêm được sử dụng rộng rãi hơn. Tuy nhiên, thuốc dạng
tiêm đòi hỏi phải có độ tinh khiết cao, trong khi các enzyme tái tổ hợp thông thường
thường dung hợp đuôi 6xhistidine (6xhis) để thuận tiện cho quá trình tinh sạch và
việc dung hợp đuôi 6xhis được xem là có thể gây tác dụng phụ cho con người. Trên
cơ sở đó, trong khuôn khổ đề tài KC10 “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ
sản xuất chế phẩm enzyme tái tổ hợp streptokinase và yếu tố hoạt hóa plasminogen
mô (tPA) sử dụng trong điều trị” chúng tôi thực hiện đề tài luận văn “Nhân dòng,
biểu hiện và tinh sạch streptokinase tái tổ hợp trong E. coli” với dạng
streptokinase tái tổ hợp không dung hợp đuôi 6xhistidine để tiến tới sản xuất dược
phẩm sinh học điều trị chứng tắc nghẽn mạch máu, có ý nghĩa khoa học và ý nghĩa
thực tiễn cao.
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Chứng tắc nghẽn mạch máu
1.1.1 Quá trình đông máu
Đông máu là quá trình máu chuyển từ thể lỏng sang thể đặc. Bình thường đây là
một cơ chế quan trọng giúp cơ thể sửa chữa những mạch máu bị tổn thương và
chống mất máu do bị tổn thương thành mạch. Quá trình đông máu phụ thuộc vào
các yếu tố đông máu (bảng 1.1) và gồm ba giai đoạn.
Giai đoạn tạo thành prothrombinase
Quá trình này xảy ra khi có chấn thương thành mạch, khi có sự tiếp xúc với
collagen của thành mạch, với các mô khác ngoài nội mạc hoặc bất cứ vật lạ nào. Sự
tạo thành prothrombinase được thực hiện theo hai cơ chế nội sinh và ngoại sinh
(hình 1.1). Hai cơ chế này chỉ khác nhau ở giai đoạn hình thành yếu tố X hoạt hóa
(Xa).
2
Nguyễn Thị Thương
Luận văn thạc sỹ
Cơ chế ngoại sinh: Khi máu tiếp xúc với mạch máu bị tổn thương, mô ở vị trí
tổn thương giải phóng ra yếu tố III (thromboplastin mô) và phospholipid. Yếu tố III
hoạt hóa yếu tố X thành yếu tố Xa. Sự hình thành phức hợp prothrombinase từ yếu
tố Xa có sự tham gia của yếu tố Va, ion Ca2+ và phospholipid. Yếu tố Va làm tăng
hoạt tính của yếu tố Xa. Phospholipid đóng vai trò là chất nền còn ion Ca2+ làm cầu
nối giữa các yếu tố. Thrombin trong trường hợp này có tác dụng điều hòa.
Cơ chế nội sinh: Khi máu tiếp xúc với collagen của thành mạch bị tổn thương
hoặc bề mặt vật lạ sẽ làm hoạt hóa yếu tố XII thành yếu tố XIIa và giải phóng
phospholipid tiểu cầu. Yếu tố XIIa chuyển yếu tố XI thành yếu tố XIa (có sự tham
gia của yếu tố Fletcher và Fitzgerald). Yếu tố XIa chuyển yếu tố IX thành yếu tố
IXa (có sự tham gia của yếu tố tiểu cầu). Yếu tố X được hoạt hóa có sự tham gia
của yếu tố VIIIa (yếu tố VIII được hoạt hóa nhờ thrombin), yếu tố IXa, ion Ca2+ và
phospholipid. Sự hình thành phức hợp prothrombinase từ yếu tố Xa có sự tham gia
của phospholipid, yếu tố Va (yếu tố V được hoạt hóa nhờ thrombin) và ion Ca 2+.
Prothrombinase được hình thành từ cơ chế nội sinh hoặc ngoại sinh hoặc đồng thời
cả hai cơ chế nội sinh và ngoại sinh. Điều này chứng tỏ hoạt tính của
prothrombinase là phụ thuộc vào sự hoạt hóa của các yếu tố tham gia vào quá trình
này.
Bảng 1.1. Các yếu tố đông máu.
Các yếu tố
Tên gọi và vai trò
I
Fibrinogen, là một loại globulin, do gan tổng hợp đưa vào máu.
II
Prothrombin, là một protein huyết tương do gan sinh ra. Sự tổng hợp
prothrombin liên quan chặt chẽ đến sự hấp thụ vitamin K. Nếu rối loạn
hấp thụ vitamin K ở đường tiêu hóa sẽ dẫn đến giảm prothrombin.
III
Thromboplastin, enzyme tạo ra khi tiểu cầu bị vỡ, hoặc mô bị tổn
thương.
IV
Ion Ca2+ có trong huyết tương, có tác dụng hoạt hóa prothrombin.
V
Proaccelerin, một loại globulin, do gan sinh ra, làm tăng tốc độ đông
máu.
VI
Dạng hoạt hoá của yếu tố V.
VII
Proconvectin, yếu tố xúc tiến tạo Thrombin.
3
Nguyễn Thị Thương
Luận văn thạc sỹ
VIII
Yếu tố chống chảy máu A, có trong huyết tương, có vai trò quan trọng
trong sự tạo thành thromboplastin nội sinh. Nếu thiếu yếu tố này, máu
vẫn đông nhưng cục máu mềm, dễ di động.
IX
Yếu tố chống chảy máu B, cũng là một protein huyết tương, cần cho sự
tạo thành thromboplastin.
X
Yếu tố stuart, có trong huyết tương, do gan sinh ra tương đối bền vững
có tác dụng trong sự tạo thành thromboplastin và chuyển prothrombin
thành thrombin.
XI
Prothromboplastin - có sẵn trong huyết tương, có vai trò tập trung tiểu
cầu.
XII
Yếu tố hageman, có trong huyết tương, có tác dụng hoạt hoá sự đông
máu.
XIII
Yếu tố ổn định fibrin, có sẵn trong huyết tương, có tác dụng củng cố sợi
fibrin thêm vững chắc.
Con đƣờng ngoại sinh
Mô tổn thương
Yếu tố mô
Ca2+
Yếu tố VII
Ca2+,
phospholipid
Con đƣờng nội sinh
Thành mạch tổn thương
Yếu tố XII
Yếu tố XIIa
Yếu tố XI
Yếu tố XIa
Yếu tố VIIa
Ca2+
Yếu tố IXa
Yếu tố IX
Ca2+, yếu tố VIII
phospholipid
Yếu tố X
4
Nguyễn Thị Thương
Luận văn thạc sỹ
Yếu tố X
Yếu tố Xa
Ca2+, yếu tố VIII
phospholipid
Yếu tố VII
Yếu tố Va, VIIIa
Prothrombin (yếu tố II )
Thrombin
Sợi fibrin
Ca2+
Yếu tố XIII
Yếu tố XIIIa
Cục máu đông
Hình 1.1. Cơ chế đông máu.
Giai đoạn tạo thành thrombin
Prothrombinase tạo ra theo cơ chế nội sinh và (hoặc) ngoại sinh cùng với Ca2+
xúc tác cho phản ứng chuyển prothrombin thành thrombin. Sự hình thành thrombin
từ prothrombin là rất nhanh, được tính bằng vài giây.
Giai đoạn tạo thành fibrin và cục máu đông
Fibrinogen là một protein do gan sản xuất, nồng độ trong máu bình thường là
100-700 mg/100 ml máu. Bình thường fibrinogen rất khó vào dịch kẽ. Khi thành
mạch tăng tính thấm (mô bị viêm) thì fibrinogen vào dịch kẽ và bị đông lại do các
yếu tố gây đông máu cùng vào dịch kẽ. Dưới tác dụng của thrombin, fibrinogen
dạng hòa tan chuyển thành fibrin đơn phân dạng không hòa tan. Các fibrin đơn phân
tự trùng hợp thành fibrin ở dạng sợi nhờ yếu tố XIII. Giai đoạn này cũng có sự tham
gia của ion Ca2+. Các tế bào máu được giữ lại trên lưới fibrin và tạo nên cục máu
5
Nguyễn Thị Thương
Luận văn thạc sỹ
đông. Như vậy bản chất của quá trình đông máu là hình thành lưới fibrin từ
fibrinogen nhờ thrombin.
1.1.2 Cơ chế tan máu đông
Cục máu đông có thể tan trở lại nhờ quá trình tiêu fibrin (fibrinolysis). Đây là
một quá trình ngược với đông máu (hình 1.2). Tiêu fibrin là một quá trình sinh lý,
nhằm làm tan cục máu đông được tạo thành ở giai đoạn trước đó, tái lưu thông tuần
hoàn máu. Các yếu tố tham gia gồm có plasminogen, plasmin và các chất hoạt hóa.
Plasminogen: Là tiền tố của plasmin, ở dạng bất hoạt. Hàm lượng trong huyết
tương là 0,2 µg/ml. Plasminogen là một chuỗi polypeptide 791 amino acid, bình
thường tồn tại ở dạng Glu-plasminogen (dạng nguyên vẹn), khi có tác động của
plasmin, Glu-plasminogen tách ra một số peptide nhỏ, phần còn lại là
Lys-plasminogen.
Plasmin: Các chất hoạt hóa sẽ chuyển plasminogen thành plasmin. Plasmin gồm
hai chuỗi polypeptide, nối với nhau bằng một cầu nối disulfide: chuỗi nhẹ gắn với
serine-protease, chuỗi nặng có vị trí gắn với fibrin.
Khi fibrin xuất hiện, lập tức xảy ra hiện tượng hoạt hóa plasminogen thành
plasmin. Plasmin xúc tác phản ứng cắt fibrin thành các sản phẩm bị phân hủy và do
đó làm tan cục máu đông.
Plasminogen
Các chất hoạt hóa
Plasmin
Fibrin
PDF (các sản phẩm bị phân hủy)
Hình 1.2. Sơ đồ tiêu sợi huyết.
6
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Thương
1.1.3 Bệnh tắc nghẽn mạch máu
Đông máu là một trong những cơ chế phòng vệ tự nhiên của cơ thể khi chấn
thương xảy ra. Tuy nhiên, khi thành mạch bị xơ vữa, bị tổn thương làm xuất hiện
huyết khối làm tắc nghẽn động mạch, tĩnh mạch gây nên bệnh tắc nghẽn mạch máu.
Nguyên nhân gây tắc nghẽn mạch máu
Tắc nghẽn mạch do yếu tố V: Yếu tố V Leiden là một biến thể của yếu tố V
trong quá trình đông máu. Yếu tố này bị bất hoạt chậm nên tồn tại lâu hơn trong
máu gây ra tình trạng đông máu. Tỷ lệ đột biến gene của yếu tố V Leiden chiếm 2040% các bệnh tắc nghẽn mạch máu và tần suất bệnh là 5% trong quần thể dân cư
[59].
Tắc nghẽn mạch do thiếu antithrombin: Antithrombin ức chế hoạt động của một
số yếu tố đông máu như thrombin, IXa, Xa. Do đó thiếu antithrombin là một
nguyên nhân gây tắc nghẽn mạch máu. Đây là bệnh mang di truyền thể trội trên
nhiễm sắc thể thường. Bệnh thường gặp là tắc nghẽn mạch phổi và tĩnh mạch, ít
thấy tắc nghẽn động mạch. Chứng tắc nghẽn mạch máu này có thể xảy ra một cách
tự phát hoặc do chấn thương, thai nghén và phẫu thuật [59].
Tắc nghẽn động mạch: Thường gặp ở người lớn tuổi. Mỡ và calci lắng đọng gây
biến dạng bề mặt thành mạch làm kích hoạt con đường đông máu nội sinh
(hình 1.3). Đây là nguyên nhân của tắc nghẽn mạch máu do tăng mỡ máu và tiến
triển thành xơ vữa động mạch. Nghẽn động mạch có thể gây ra nhồi máu cơ tim
hoặc đột quỵ.
7
Nguyễn Thị Thương
Luận văn thạc sỹ
Hình 1.3. Huyết khối trong mạch.
(http://about.com)
Tắc nghẽn mạch máu là nguyên nhân dẫn đến các bệnh tim mạch, là nguyên
nhân gây tử vong hàng đầu tại các nước phát triển.
Các phƣơng pháp điều trị tắc nghẽn mạch máu
Các thuốc hóa học
Trước đây, điều trị tắc nghẽn mạch máu thường tập trung vào việc kìm hãm sự
tạo thành fibrin. Các thuốc kháng đông có bản chất hóa học thường được sử dụng là
Heparin và Coumarin. Đầu những năm 1950, Aspirin được sử dụng trong việc ngăn
ngừa nhồi máu cơ tim [14], tuy nhiên vai trò của nó trong việc điều trị cấp tính
không được chứng minh. Các thuốc Atropine, Papaverine và Nitroglycerin cũng
thường xuyên được sử dụng để ngăn ngừa hoặc làm giảm co thắt mạch vành [42].
Như vậy, cho đến những năm 1950, các phương pháp điều trị chỉ là làm giảm nhẹ
chứ không phải điều trị. Do đó bệnh tắc nghẽn mạch vẫn là nguyên nhân gây tử
vong lớn ở người cao tuổi.
Các thuốc có bản chất enzyme
Hiện nay, khi nhận ra sự phân giải fibrin có thể được thực hiện trong cơ thể sống
bằng quá trình chuyển hóa plasminogen không hoạt động thành plasmin hoạt động,
người ta hướng đến phương pháp điều trị mới là sử dụng các chất hoạt hóa
plasminogen. Các nghiên cứu lâm sàng chỉ ra rằng cách tốt nhất để hòa tan khối
huyết là tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch một enzyme có khả năng hoạt hóa
plasminogen thành plasmin.
Streptokinase (SK): streptokinase là một protein có khối lượng phân tử 47 kDa,
do liên cầu khuẩn tan huyết β nhóm A sinh ra. Nó tác động theo một cơ chế phức
tạp với cả plasminogen liên kết và không liên kết với fibrin trong tuần hoàn để tạo
thành một phức hợp hoạt hóa. Phức hợp này biến đổi plasminogen còn dư thành
plasmin là enzym thủy phân protein, có tác dụng tiêu fibrin và có thể làm tan các
cục máu đông trong lòng mạch. SK được sử dụng để điều trị thuyên tắc mạch phổi
và tĩnh mạch sâu [37].
8
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Thương
tPA: là yếu tố hoạt hóa mô, có thể sản xuất bằng con đường tái tổ hợp nhưng
giá thành cao. Do là yếu tố hoạt hóa của tổ chức nên tPA không có vấn đề về miễn
dịch. Đầu tiên tPA gắn với fibrin, phức này sau đó gắn vào plasminogen tạo thành
phức hợp hoạt hóa plasminogen để thủy phân fibrin [29].
Urokinase: thường được dùng để tiêu hủy huyết khối tại chỗ, ngoài ra còn sử
dụng để điều trị tắc nghẽn phổi, huyết khối tĩnh mạch sâu (http://www.lrchueuni.edu.vn/dongy2009). Urokinase được phân lập từ nuôi cấy tế bào thận người
do đó an toàn hơn streptokinase nhưng giá thành cao.
Alteplase: một chất hoạt hóa plasminogen mô của người (t-PA) sản xuất bằng
công nghệ DNA tái tổ hợp. Alteplase làm tan huyết khối bằng cách gắn vào fibrin
và khởi đầu sự chuyển plasminogen thành plasmin. Tác dụng phụ của alteplase là
gây phân hủy toàn thân [52].
Tenecteplase (TNKase): được sử dụng trong trường hợp bị nhồi máu cơ tim cấp.
Phần lớn tác dụng của TNKase phụ thuộc vào sự có mặt của fibrin, chúng chỉ
chuyển hóa một lượng rất ít plasminogen thành plasmin khi không có fibrin, do đó
làm tăng tính đặc hiệu với fibrin.
Nattokinase: là một loại enzyme tự nhiên được chiết xuất từ môi trường lên men
của vi khuẩn Nattobacillus. Nattokinase làm tan fibrin mạnh gấp 4 lần plasmin nội
sinh trong cơ thể (http://nattokinase.asia/2011). Nattokinase được sử dụng như một
chế độ bổ sung dinh dưỡng giúp duy trì và tăng cường khả năng phân hủy fibrin
bình thường của cơ thể nhằm hỗ trợ điều trị và phòng ngừa bệnh huyết khối như
viêm động mạch tĩnh mạch, tim thiếu máu, đau thắt ngực, suy giảm trí nhớ ở người
già, đột quỵ [24, 54].
1.2 Streptokinase
1.2.1 Giới thiệu chung
Streptokinase (SK) (EC 3.4.99.22) là một protein ngoại bào do các chủng
Streptococcus nhóm A, C và G sinh ra. SK là một loại độc tố nguy hiểm của
Streptococcus do nó giúp cho liên cầu khuẩn thâm nhập một cách dễ dàng vào tế
bào vật chủ và tránh được hiện tượng thực bào.
9
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Thương
Streptokinase tự nhiên gồm 440 amino acid, trong đó 26 amino acid đầu N là
peptide tín hiệu sẽ bị cắt bỏ trong quá trình tiết protein ra ngoài môi trường. Protein
trưởng thành có 414 amino acid, không có cầu nối disulfide. Phân tử SK trưởng
thành là một chuỗi đơn, khối lượng phân tử khoảng 47 kDa với điểm đẳng điện tại
4,7 và pH tối ưu là 7,3-7,6 [38].
1.2.2 Cấu trúc không gian
SK được chia thành 3 vùng: vùng α (từ amino acid 1 đến 150), vùng β (từ amino
acid 151 đến 287) và vùng γ (từ amino acid 288 đến 414) [39] (hình 1.4). Mỗi vùng
đều liên kết với plasminogen nhưng không vùng nào có thể hoạt hóa plasminogen
một cách độc lập. Trong đó, cấu trúc dạng xoắn α chiếm 17%, dạng gấp nếp β
chiếm 28%, dạng vòng chiếm 21% và các cấu trúc ngẫu nhiên chiếm khoảng 34%
(hình 1.4).
Vùng α và γ có tính bảo thủ cao, có độ tương đồng trên 85%, chiếm hầu hết các
vị trí tiếp xúc với plasmin và cùng có vai trò trong hoạt hóa plasminogen.
Vùng α nằm ở đầu N, chứa một vòng di động duy nhất do các gốc từ 45-70 tạo
thành. Vòng di động này được cho là không xuất hiện ở vị trí tương ứng của các
chất hoạt hóa plasminogen khác. Vòng này không có chức năng hình thành trung
tâm hoạt động trong phức hợp chất hoạt hóa-cơ chất mà có tác dụng nhận biết
plasminogen và gây ra sự biến đổi trung tâm hoạt động trong plasminogen [62].
Vùng β không tiếp xúc trực tiếp với vị trí hoạt động của plasmin nhưng hỗ trợ
việc cắt ngắn phân tử plasmin thông qua vòng kẹp tóc lộ trên mặt (vòng 250) được
tạo thành giữa các gốc 251 và 262 [65].
10
Nguyễn Thị Thương
Luận văn thạc sỹ
Hình 1.4. Cấu trúc không gian 3 chiều của streptokinase.
(DrugBank.com, mã số DB00086)
Vòng thứ 2 (vòng 170) được tạo thành giữa amino acid 144 và 218, không đồng
nhất về trình tự. Các chuỗi bên của các amino acid không bảo thủ nằm trong vòng
170 được định vị trên bề mặt, nằm cách xa nửa tiếp xúc với plasmin của SK, không
ảnh hưởng đến việc hoạt hóa plasminogen. Như vậy tính đa hình của SK không liên
quan đến hoạt hóa plasminogen mà có thể quyết định đặc điểm sinh học liên quan
đến khả năng gây bệnh của chủng vi sinh vật [65]. Quá trình phát sinh đột biến tại
vùng đa hình này không làm thay đổi khả năng hoạt hóa plasminogen của protein
này mà có thể coi như biến đổi chức năng đối với bệnh do Streptococcus gây nên
[50].
Streptokinase có khả năng liên kết và hoạt hóa plasminogen của người. Đồng
thời nó cũng là một enzyme quan trọng của Streptococcus do enzyme này tạo ra
hoạt tính phân giải protein trên bề mặt tế bào vi khuẩn và giúp cho việc xâm nhập
các tổ chức của vật chủ dễ dàng hơn [39].
1.2.3 Cơ chế hoạt động
Năm 1933, Tillett và Garner đã tình cờ khám phá ra khả năng phân hủy huyết
khối của SK [57]. Năm 1941, Milestone đã phát hiện một chất thông thường tồn tại
trong huyết tương, cần thiết để ly giải cục máu đông, gọi là “yếu tố lytic” [51].
Christensen độc lập xác định rằng yếu tố lytic là một enzyme thủy phân protein bình
11
Nguyễn Thị Thương
Luận văn thạc sỹ
thường có mặt trong huyết tương như là một tiền chất không hoạt động. Các cơ chất
của liên cầu khuẩn kích hoạt tiền chất này sang một loại enzyme hoạt động, enzyme
hoạt động làm tan cục máu đông. Năm 1945, Christensen và MacLeod đề xuất thuật
ngữ “streptokinase” thay thế cho thành phần của cầu khuẩn được đề cập,
“plasminogen” thay cho protesae không hoạt động trong huyết tương và “plasmin”
thay cho enzyme hoạt động [12].
Phân hủy
Hoạt hóa
Vùng liên kết
chất ức chế
Vùng liên kết
chất hoạt hóa
Chất ức chế
Không phân
hủy
Hình 1.5. Cơ chế xúc tác của streptokinase.
Cơ chế hoạt hóa và ức chế plasminogen trong quá trình phân hủy fibrin được mô
tả như trong hình (hình 1.5) [17, 27]. Phân tử plasminogen có một vị trí liên kết với
chất ức chế và một vị trí liên kết với chất hoạt hóa. Khi chất hoạt hóa (SK,
staphylokinase, tPA) liên kết với plasminogen tại vị trí liên kết tạo thành phức hợp
plasminogen-chất hoạt hóa. Phức hợp này cắt phân tử plasminnogen và chuyển
thành phức plasmin-chất hoạt hóa, sau đó liên kết với fibrin và phân hủy nó. Còn
khi chất ức chế (các chất có bản chất lysine) liên kết với plasminogen tại vị trí chất
ức chế tạo thành phức plasminogen-chất ức chế thì phức này không thể liên kết với
fibrin do đó không có khả năng phân hủy fibrin. Các chất có bản chất lysine này
thường được sử dụng để điều trị chảy máu sau phẫu thuật.
Streptokinase hoạt hóa plasminogen theo con đường gián tiếp như một chất hoạt
hóa. Đầu tiên SK liên kết với plasminogen theo tỉ lệ đồng phân tử 1:1, tạo thành
phức hợp chất hoạt hóa [8]. Phức hợp này bị biến dạng và trở thành một enzyme với
trung tâm hoạt động nằm trên nửa plasminogen. Sau đó enzyme này có khả năng cắt
liên kết peptide L-arginyl-L-valyl trên các phân tử plasminogen khác (giữa gốc 560
12
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Thương
và 561) để tạo ra plasmin. Plasmin được tạo thành có khả năng phân hủy fibrin
thành các sản phẩm bị phân hủy dạng hòa tan [8, 45].
1.2.4 SK tái tổ hợp
Trên thế giới
SK được sử dụng rộng rãi trên thế giới trong điều trị chứng tắc nghẽn mạch máu.
Tuy nhiên các chủng tổng hợp SK tự nhiên là những chủng gây độc cho con người
và hiệu suất tổng hợp thấp. Do đó việc nghiên cứu SK trên thế giới chủ yếu đi theo
hướng nghiên cứu sản xuất SK tái tổ hợp
Năm 1984, Malke et al. đã nhân dòng và biểu hiện thành công gene mã hóa SK
từ chủng S. equisimilis H46A trong E. coli và S. sanguis sử dụng vector pACYC184
và pBR322 thu được SK có hoạt tính đạt từ 8 đến 100 U/ml dịch nuôi cấy [40]. Một
năm sau, Dao và Ferretti sử dụng vector pSA3 (kháng erythromycin,
chlorpheniramine, tetracyline) để biểu hiện SK trong S. sanguis thu được protein có
khối lượng phân tử 42 kDa nhưng có hoạt tính sinh học như SK tự nhiên. Kích
thước protein thấp hơn có thể là do kết quả của quá trình sau dịch mã [15]. Đến
năm 1986, Klessen et al. biểu hiện sk trong Bacillus subtilis, hoạt tính SK bị giảm ở
cuối pha sinh trưởng do các protease của chính B. subtilis tiết ra làm bất hoạt [33].
Năm 1989, Walter et al. đã nhân dòng thành công gene mã hóa SK từ chủng
S. pyogenes type 1 [64]. Sau đó đến năm 1992, Esrtrada et al. đã biểu hiện gene này
trong E. coli W3110 cho SK có hoạt tính như chủng tự nhiên với năng suất biểu
hiện đạt 25% protein tổng số [16]. Cũng trong năm 1989, Hagenson et al. sử dụng
promoter của alcohol oxidase từ P. pastoris để biểu hiện sk trong nấm men cho
năng suất đạt 77 mg/l và hoạt tính đạt 3000 U/ml [23].
Đến năm 1994, Wong et al. sử dụng gene nhân dòng sẵn có để biểu hiện trong
B. subtilis WB600 (đã gây đột biến mất 6 protease ngoại bào). Kết quả cho thấy
10-20% SK tiết ra ngoài môi trường bị thoái hóa từ dạng 47 kDa thành 44 kDa, làm
giảm hoạt tính sinh học của SK. Sự thoái hóa này là do một số gốc amino acid kị
nước trong phân tử SK là đích của chymotrypsin (protease do tế bào tiết ra). Do đó
13
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Thương
các tác giả đã tạo chủng đột biến pSKC-27 có glutamate tại vị trí 29 được thay bằng
lysine, SK thu được có hoạt tính tăng 2,5 lần [66].
Năm 1995, Ko et al. đã nhân dòng sk từ chủng S. equisimilis. Tác giả thay thế
trình tự peptide tín hiệu của sk bằng tín hiệu ompA, sử dụng vector pKK223-3 biểu
hiện trong E. coli JM109. Hoạt tính thu được đạt 5000 U/ml dịch nuôi cấy sau 12
giờ cảm ứng bằng IPTG [34]. Cũng năm 1995, Kubo et al. đã nghiên cứu hoạt hóa
SK tái tổ hợp từ E. coli. Các tác giả xử lý bằng nhiệt độ để tái cuộn xoắn cấu trúc
SK bị biến tính bởi guanidine hydrochloride. Hoạt hóa ở 50°C làm tăng 10% hoạt
tính enzyme và 25% hoạt tính riêng, cao hơn xử lý ở 20°C [35].
Năm 1997, Avilan et al. đã nhân dòng sk từ chủng S. equisimilis và biểu hiện
trong E. coli JM105. SK thu được giống với dạng tự nhiên. Ba sản phẩm SK thu
được có khối lượng phân tử lần lượt là 47,5, 45 và 33 kDa [6].
Năm 1999, Johnsen et al. đã nhân dòng gene mã hóa SK từ chủng S. uberis
NCTC 3858 và đọc trình tự cho thấy SK này tương đồng khoảng 26% với SK của
S. pyogenes và S. equisimilis. Protein suy diễn có 286 amino acid, trong đó peptide
tín hiệu dài 25 amino acid. Trình tự amino acid của SK này bị thiếu các amino acid
đầu C so với trình tự amino acid của SK từ chủng S. pyogenes và S. equisimillis
[30]. Caballero et al. sử dụng vector pQE30 để biểu hiện SK trong E. coli cho hoạt
tính tương đương với SK tự nhiên [11]. Đồng thời Pupo et al. đã biểu hiện nội bào
đối với sk từ S. equisimilis sử dụng vector biểu hiện pTrp. Hiệu suất biểu hiện đạt
15% protein tổng số (thấp hơn của Estrada). Tuy nhiên SK tái tổ hợp ở dạng hòa tan
nên tinh sạch dễ dàng hơn [44].
Pratap et al. năm 2000 đã nhân dòng sk từ S. equisimilis và biểu hiện trong
P. pastoris. SK thu được có khối lượng phân tử là 55 kDa, cao hơn SK gốc nhưng
có hoạt tính tương đương. Các tác giả chỉ ra rằng SK có khối lượng cao hơn là do
hiện tượng glycosyl hóa. Hoạt tính SK đạt 3200 U/ml dịch nuôi cấy [43].
Năm 2004, Kumar và Singh biểu hiện SK trong nấm men S. pombe đã bị đột
biến mất protease ngoại bào. Kết quả thu được SK biểu hiện ở dạng ngoại bào với
năng suất 50-100%, đạt 2450 U/ml dịch nuôi cấy. Hiệu suất biểu hiện đạt 24,5 mg/l
và hoạt tính riêng đạt 1581 U/mg protein [36]. Sau đó, năm 2006, Sriraman et al.
14
- Xem thêm -