Tài liệu Nhân dòng, biểu hiện và nghiên cứu một số tính chất của protease từ HIV-1 tại Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN Nguyễn Thị Hồng Loan NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ HIV-1 TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH HỌC 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (Human immunodeficiency virus HIV) là nguyên nhân chính gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở ngƣời (AIDS) và là một trong số những virus gây bệnh nghiêm trọng nhất hiện nay. HIV biến đổi liên tục về cấu trúc và hệ gen để kháng lại các thuốc điều trị và gây ra tỷ lệ tử vong cao. Kể từ khi xuất hiện (từ năm 1981) đến nay đã có khoảng 60 triệu ngƣời trên hành tinh bị nhiễm HIV, trong đó có khoảng 25 triệu ngƣời đã chết do các bệnh có liên quan đến AIDS và AIDS đã trở thành một trong những căn bệnh gây chết nhiều ngƣời nhất trong lịch sử loài ngƣời (UNAIDS, 2010). Theo các tài liệu đã công bố, có ít nhất hai type HIV gây nên AIDS đó là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV-2), nhƣng HIV-1 là nguyên nhân chính gây ra AIDS ở ngƣời trên toàn thế giới. Trong chu trình sống của HIV-1, 3 enzyme reverse transriptase, integrase và protease có vai trò quan trọng không thể thiếu trong sao chép, đóng gói và hình thành virus hoàn chỉnh. Vì vậy, các chất ức chế của 3 enzyme này đã đƣợc nghiên cứu, sản xuất để điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS và các điều trị này đƣợc gọi là liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus (antiretroviral drug therapy, gọi tắt là ART). Trong số 3 enzyme nói trên, protease đƣợc mã hóa bởi gen pol của virus có chức năng cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) tại những vị trí nhất định để tạo thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus hoàn chỉnh. Nếu protease bị mất hoạt tính, HIV-1 không đƣợc đóng gói phù hợp để tạo virus hoàn chỉnh (Darke và tập thể, 1989). Tuy nhiên, do tốc độ sinh sản nhanh của HIV – 1, có khoảng 10 triệu hạt virus mới đƣợc tạo ra mỗi ngày và tỷ lệ sai sót rất cao của enzyme reverse transriptase (1/10.000 base) dẫn đến tình trạng kháng thuốc phổ biến ở những bệnh nhân nhiễm bệnh thậm chí khi chƣa điều trị. Khi có ART, các chủng mang đột biến kháng thuốc đƣợc chọn lọc và trở thành chủng ƣu thế (Hoffmann và tập thể, 2007). Mặc dầu, ngày càng có nhiều chất ức chế protease (PI) chống HIV đƣợc phát triển và thƣơng mại hóa nhƣng hiện vẫn chƣa tìm đƣợc chất ức chế nào thực sự có hiệu quả. Vì vậy, việc sản xuất và tinh sạch để thu đƣợc lƣợng lớn 2 protease của HIV-1 cho các nghiên cứu điều tra, phát triển chất ức chế hiệu quả là cần thiết. Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu để sản xuất protease của HIV-1 (đƣợc gọi tắt là protease HIV-1) nhƣng thực tế cho thấy protease HIV-1 không dễ dàng đƣợc biểu hiện trong tế bào vật chủ do đặc tính gây độc tế bào, khó tan; lƣợng protease thu đƣợc sau biểu hiện thƣờng thấp, trong một số trƣờng hợp chỉ có thể phát hiện đƣợc bằng phƣơng pháp miễn dịch với các quy trình biểu hiện, tinh sạch gồm nhiều bƣớc rất phức tạp. Mặt khác, các nghiên cứu đều sản xuất protease HIV-1 phân lập từ phân nhóm B là phân nhóm HIV phổ biến gây bệnh ở Mỹ, Australia và các nƣớc Tây Âu. Trong khi, phần lớn các trƣờng hợp nhiễm HIV-1 trên thế giới và ở Việt Nam không thuộc phân nhóm B. Những nghiên cứu gần đây cho thấy sự khác nhau về cấu trúc của protease phân nhóm B so với các phân nhóm khác dẫn đến hiệu quả điều trị thuốc ức chế protease (PI) và mức độ kháng thuốc có thể khác nhau. Chính vì vậy, thiết lập hệ thống biểu hiện và tinh sạch protease HIV-1 tái tổ hợp hiệu quả và đại diện cho phân nhóm HIV-1 gây bệnh chủ yếu ở Việt Nam có vai trò quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả điều trị bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS. Bên cạnh đó, các đột biến kháng PI tƣơng đối đặc hiệu cho từng loại thuốc riêng biệt, do đó thay thế một loại thuốc khác trƣớc khi có sự tích lũy đột biến thì các phác đồ sau vẫn thành công (Hoffmann và tập thể, 2007). Vì vậy, xét nghiệm kháng thuốc thƣờng theo hƣớng phát hiện đột biến trong gen mã hóa protease HIV-1 có vai trò rất quan trọng trong việc xây dựng phác đồ điều trị HIV/AIDS. Ở Việt Nam, protease HIV-1 từ các bệnh nhân Việt Nam là vấn đề còn ít đƣợc nghiên cứu. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào xác định nhóm virus gây bệnh chủ yếu ở ngƣời Việt Nam và tìm ra một số đột biến liên quan kháng thuốc. Đặc biệt, chƣa có nghiên cứu nào về biểu hiện protease HIV-1 phân lập từ các bệnh nhân ngƣời Việt Nam. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nhân dòng, biểu hiện và nghiên cứu một số tính chất của protease từ HIV-1 tại Việt Nam” để tạo ra chế phẩm protease HIV-1 tái tổ hợp sử dụng cho mục đích sàng lọc và phát 3 triển các chất ức chế sự nhân lên của HIV, từng bƣớc làm cơ sở phát triển thuốc điều trị HIV/AIDS. 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - Phát hiện một số đột biến trong gen mã hóa protease HIV-1 ở ngƣời Việt Nam. - Thiết lập quy trình hiệu quả cho việc biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 ở vi khuẩn E. coli và tinh sạch protease HIV-1 tái tổ hợp ở dạng có hoạt tính. - Nghiên cứu một số tính chất protease HIV-1 và tìm hiểu tác dụng của một số chất ức chế làm cơ sở để tìm kiếm và phát triển các PI mới có thể ứng dụng trong điều trị HIV/AIDS. 3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài Đối tượng nghiên cứu của đề tài: Gen mã hóa protease HIV-1 từ huyết thanh các bệnh nhân nhiễm HIV-1 tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ƣơng. Nội dung nghiên cứu của đề tài: - Tinh sạch RNA của HIV-1 và tổng hợp cDNA của một số mẫu HIV-1 từ các bệnh nhân nhiễm HIV-1 tại Việt Nam. - Nhân bản, nhân dòng và đọc trình tự gen mã hóa protease HIV-1 của các mẫu virus phân lập đƣợc, đánh giá sự sai khác về trình tự gen mã hóa protease HIV-1 giữa các đối tƣợng bệnh nhân nhiễm HIV-1 so với trình tự gen tƣơng ứng trên thế giới. - Thiết kế hệ thống vector và xác định điều kiện biểu hiện gen mã hóa cho protease HIV-1 ở E. coli. - Xây dựng quy trình tinh sạch protease HIV-1 tái tổ hợp. - Nghiên cứu một số đặc trƣng xúc tác của protease HIV-1 tái tổ hợp thu đƣợc. - Tìm hiểu tác dụng ức chế của một số hợp chất tổng hợp và tự nhiên lên protease HIV-1 tái tổ hợp. 4. Địa điểm thực hiện đề tài Các nghiên cứu của luận án đƣợc thực hiện chủ yếu tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. 5. Đóng góp mới của đề tài 4 - Công trình nghiên cứu có tính hệ thống từ việc nhân bản, nhân dòng và biểu hiện ở E. coli gen mã hóa protease HIV-1 tái tổ hợp thuộc chủng CRF01_AE của Việt Nam; thiết lập đƣợc phƣơng pháp đơn giản để tinh sạch protease HIV-1 với hiệu suất thu nhận enzyme cao hơn so với các nghiên cứu trên thế giới. - Là công trình đầu tiên phát hiện thấy tác dụng ức chế protease HIV-1 bởi axit asiatic, 8-hydroxyquinoline và menadione. 6. Ứng dụng thực tiễn của đề tài - Cách thức biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 và tinh sạch protease tái tổ hợp tạo ra trong công trình nghiên cứu này có thể dễ dàng đƣợc áp dụng để sản xuất một số protease tái tổ hợp khó tan và chỉ đặc hiệu với một số cơ chất nhất định. - Chế phẩm protease HIV-1 tạo ra là cơ sở cho việc tìm kiếm và phát triển các PI mới để có thể ứng dụng trong điều trị bệnh nhân HIV/AIDS. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ HIV-1 1.1.1. HIV-1 nguyên nhân của AIDS Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (HIV) lần đầu tiên đƣợc Montagnier và tập thể ở Viện Pasteur Paris phân lập vào năm 1983 với tên gọi ban đầu là virus liên quan tới viêm hạch (LAV). Năm 1986, virus này đƣợc Ủy ban Quốc tế thống nhất gọi tên HIV (Greene, 2007). Cùng thời điểm đó ngƣời ta đã phân lập đƣợc một virus mới ở Tây Phi và đặt tên là HIV–type 2, đây là virus gốc của HIV-type 1. Hai loại virus này đều làm suy giảm hệ thống miễn dịch của ngƣời và đặt tên chung là HIV. Mặc dù HIV-type 2 có một số điểm giống với HIV-type 1 nhƣ về cách thức 5 truyền bệnh, các hình thức nhiễm bệnh cơ hội và phƣơng pháp điều trị nhƣng ngƣời nhiễm HIV-type 2 ít phát sinh bệnh hơn so với nhiễm HIV-type 1 và HIV-type 2 thấy chủ yếu ở các vùng của Châu Phi (Hoffmann và tập thể, 2007). Vì vậy, HIVtype 1 (HIV-1) đƣợc xem nhƣ là nguyên nhân chính gây nên bệnh AIDS. HIV thuộc họ retrovirus, là họ gây ung thƣ cho ngƣời và động vật. HIV-1 có 3 nhóm chính là M (main), N (new), và O (outlier). Có tới 90% sự lây nhiễm HIV trên toàn thế giới thuộc nhóm M; nhóm này có 9 phân type đƣợc ký hiệu bằng các chữ cái A-D, F-H, J, K và nhiều dạng tái tổ hợp khác đƣợc gọi tắt là các phân nhóm CRF (circulating recombinant forms). Sự khác nhau giữa phân nhóm này với phân nhóm khác là ở trình tự axit amin của protein vỏ và có thể vƣợt quá 30%. Phân nhóm B phổ biến ở Mỹ, Tây Âu và Australia; trong khi các phân nhóm không phải nhóm B lại phân bố ở các nƣớc đang phát triển của châu Á và châu Phi, nơi mà phần lớn những ngƣời bị nhiễm đang sinh sống. Sự đa dạng của virus có thể thấy ở vùng Sahara (châu Phi). Ở Việt Nam và các nƣớc Đông Nam Á phân nhóm HIV-1 phân lập từ các bệnh nhân nhiễm HIV-1 chủ yếu thuộc nhóm CRF01_AE, bên cạnh đó là một số ít các phân nhóm B, C và các dạng tái tổ hợp khác (UNAIDS, 2010; Nguyen và tập thể, 2003; Ishizaki và tập thể, 2009; Phan và tập thể, 2010). Phần lớn việc nghiên cứu để tìm ra thuốc điều trị bệnh do HIV gây nên đều dựa trên phân nhóm B. Tuy nhiên gần đây, sự đa dạng về trình tự axit amin giữa các phân nhóm đƣợc xem nhƣ hƣớng nghiên cứu quan trọng trong các con đƣờng kháng thuốc PI (Bandaranayake và tập thể, 2008). 1.1.2.Tình hình nhiễm HIV-1 Đại dịch HIV/AIDS đã và đang là một thách thức to lớn đối với tiến trình phát triển xã hội. Sau 3 thập kỷ phát hiện mà đầu tiên là ở các nƣớc phát triển, HIV/AIDS đã lan rộng trên toàn thế giới, đặc biệt ở khu vực châu Phi và các nƣớc châu Á. Đến nay vẫn chƣa có vaccine phòng ngừa HIV hay thuốc chữa trị đặc hiệu. Theo chƣơng trình HIV/AIDS của Liên hiệp quốc (UNAIDS, 2010), đến cuối năm 2008 số ngƣời nhiễm HIV/AIDS đang sống trên thế giới tăng 20% so với năm 2000 và tỷ lệ hiện nhiễm HIV/AIDS ƣớc tính cao gấp 3 lần năm 1990. Số liệu mới nhất tính đến cuối năm 2009 ƣớc tính khoảng 33,3 triệu ngƣời đang mang căn 6 bệnh HIV/AIDS, trong đó số đối tƣợng nhiễm mới là 2,6 triệu ngƣời và có khoảng 1,8 triệu bệnh nhân đã chết vì AIDS trong năm 2009. Ở Việt Nam, trƣờng hợp nhiễm HIV-1 đầu tiên đƣợc phát hiện đầu năm 1990; giữa những năm 2000 đến 2007, số ngƣời nhiễm đã tăng gấp đôi từ 122.000 đến 290.000 ngƣời và mỗi năm có khoảng 40.000 ngƣời nhiễm mới. Tính đến ngày 30/9/2010 trên cả nƣớc có 180.631 trƣờng hợp nhiễm HIV/AIDS. Thành phố Hồ Chí Minh là địa phƣơng có tỷ lệ bệnh nhân HIV/AIDS cao nhất với 23% tổng số bệnh nhân trong cả nƣớc (Liao và tập thể, 2009; UNAIDS, Vietnam). Theo đánh giá chung, tình hình nhiễm HIV/AIDS có xu hƣớng giảm nhƣng đại dịch HIV/AIDS vẫn trong giai đoạn tập trung – xảy ra chủ yếu trong các nhóm có hành vi nguy cơ cao, đặc biệt trong nhóm tiêm chích ma túy và mại dâm. Theo phân tích của các chuyên gia, tổng số ngƣời nhiễm HIV còn sống vẫn đang tiếp tục gia tăng là hệ quả của hai tác động chủ yếu: Số ngƣời mới nhiễm HIV hàng năm trên toàn cầu vẫn cao và do kết quả tích cực của các liệu pháp điều trị kháng virus làm giảm số ngƣời tử vong, kéo dài sự sống cho ngƣời bệnh. 1.1.3. Sinh bệnh học của nhiễm HIV-1 1.1.3.1. Cấu trúc hình thể của HIV-1 Trên kính hiển vi điện tử, HIV-1 và HIV-2 có cấu trúc gần nhƣ giống nhau hoàn toàn. Chúng chỉ khác nhau ở khối lƣợng của các protein cũng nhƣ các gen phụ trợ. Cả HIV-1 và HIV-2 đều nhân bản trong tế bào lympho CD4 và đều gây bệnh ở ngƣời, mặc dù mức độ suy giảm miễn dịch do HIV-2 gây ra là ít hơn (Hoffmann và tập thể, 2007). HIV-1 có kích thƣớc khoảng 120 nm, dạng cầu (hình 1.1). Vỏ ngoài của virus là lớp lipid kép với nhiều protein gắn vào và nhô lên đƣợc ký hiện là Env. Protein Env có phần chỏm đƣợc tạo thành từ 3 phân tử glycoprotein có khối lƣợng phân tử là 120 kDa (gp120) và phần thân đƣợc tạo thành bởi 3 phân tử gp41 gắn với nhau tạo thành các phân tử gp160 đính vào lớp vỏ ngoài của virus; gp160 có thể đƣợc phát hiện trong huyết thanh cũng nhƣ mô bạch huyết của bệnh nhân HIV. Trong quá trình nảy chồi, virus có thể gắn thêm các protein từ màng của tế bào vật chủ vào lớp lipoprotein của virus, ví dụ các protein HLA lớp I và II, hoặc các protein kết dính nhƣ ICAM-1 giúp virus gắn vào tế bào đích. Protein p17 đƣợc gắn vào mặt trong của màng lipoprotein. 7 Lõi có dạng hình trụ đƣợc bao bọc bởi lớp capsid tạo thành từ 2.000 bản sao của protein p24 (Hare, 2006; Hoffmann và tập thể, 2007). Hình 1.1. Cấu trúc của một hạt HIV-1 (Hoffmann và tập thể, 2007) 1.1.3.2. Tổ chức hệ gen của virus Hệ gen của HIV-1 nằm trong phần lõi của virus và bao gồm hai sợi RNA (+) đơn, mỗi sợi có chiều dài khoảng 9,8 kb và có 9 gen mã hóa cho 15 protein khác nhau (hình 1.2). So với các virus khác thuộc họ retrovirus thì hệ gen của HIV-1 phức tạp hơn. Trên mỗi sợi RNA có 3 gen cấu trúc là gag, pol và env; trong đó gag có nghĩa “group-antigen” (kháng nguyên nhóm), pol là “polymerase” và env là “envelope” (vỏ). Cấu trúc “cổ điển” của bộ gen retrovirus là 5’LTR-gag-pol-envLTR 3’. Trong đó, vùng LTR (long terminal repeat hay đoạn lặp dài đầu cùng) là hai đầu của bộ gen virus, nối với DNA tế bào vật chủ sau khi tích hợp và không mã hóa cho bất cứ protein nào của virus. Các gen gag và env mã hóa cho nucleocapsid và glycoprotein của màng virus; gen pol mã hóa cho 3 enzyme: reverse transcriptase, integrase và protease. Ngoài ra, HIV-1 còn có 6 gen (vif, vpu, vpr, tat, rev và nef) ở vùng RNA 9 kb (Hoffmann và tập thể, 2007). 8 Hình 1.2. Cấu tạo hệ gen của HIV-1 (Hoffmann và tập thể, 2007) Hình 1.2. Cấu tạo hệ gen của HIV-1 (Hoffmann và tập thể, 2007) 1.1.3.3. Chu trình nhân bản của nhiễm HIV-1 Quá trình nhiễm HIV-1 của tế bào vật chủ bắt đầu bằng việc gắn một phần virus lên bề mặt của tế bào (hình 1.3). Quá trình này đƣợc bắt đầu khi protein bề mặt vỏ gp120 gắn vào thụ thể trên bề mặt tế bào đích. Nhiều trƣờng hợp thụ thể là CD4 có ở tế bào lympho T hoặc có ở một số tế bào khác nhƣ đại thực bào, bạch cầu đơn nhân hay tế bào lympho B. Các tế bào này có vai trò rất quan trọng trong hệ thống miễn dịch của cơ thể; chúng nhận diện, báo động và huy động các tế bào lympho tấn công và tiêu diệt vi sinh vật lạ vào cơ thể. Sự liên kết đầu tiên của gp120 với CD4 để lộ ra vị trí khác của trimer Env, sau đó gp120 liên kết với đồng thụ thể, thƣờng là thụ thể chemokine CXCR4 hoặc CCR5. Tiếp đó phân tử gp41 qua thụ thể gắn vào màng tế bào đích và hòa tan màng, HIV-1 cởi bỏ lớp vỏ lipid bên ngoài và bơm vật liệu di truyền RNA của nó cùng với reverse transcriptase vào tế bào chất của tế bào vật chủ. Nhờ reverse transcriptase, sợi RNA của virus đƣợc tổng hợp thành sợi DNA bổ sung (cDNA). Sợi RNA của virus kết hợp cDNA thành chuỗi RNA/DNA – chuỗi lai này chuyển thành 2 sợi DNA xoắn mạch thẳng, sau đó chuyển thành DNA xoắn dạng vòng chui qua màng nhân đi vào nhân tế bào và nhờ enzyme integrase, DNA kép của virus đƣợc chèn vào DNA nhiễm sắc thể của tế bào chủ. DNA virus đƣợc hợp thành (hay gọi là tiền virus, phân biệt nó với dạng virion) có thể tồn tại ở trạng thái tiềm tàng trong nhiều giờ hoặc nhiều năm trƣớc khi trở thành dạng hoạt động mà có thể không biểu hiện bệnh (Hare, 2006). 9 Quá trình sao chép hệ gen của virus đƣợc thực hiện dƣới sự điều khiển phức tạp của một số protein, bao gồm Tat và các yếu tố sao chép DNA của tế bào. Chính việc gắn vật chất di truyền của virus vào hệ gen đã làm thay đổi cấu trúc gen của tế bào vật chủ. DNA của virus sẽ chỉ thị cho tế bào sản xuất ra RNA của virus nhờ enzyme RNA polymerase. Các RNA này đƣợc nhân lên, các protein của virus cũng đƣợc tổng hợp nhờ ribosome của tế bào vật chủ, chúng di chuyển ra mạng lƣới nội chất hoặc màng tế bào, tiếp theo là quá trình nảy chồi tạo thành các virion nằm trên màng hoặc tách ra khỏi tế bào chủ, đi vào máu và lại gắn vào các tế bào lympho T khác. Sự vận chuyển RNA của virus đã đƣợc sao chép ra khỏi nhân phụ thuộc vào một số nhân tố của virus và vật chủ trong đó có Rev; nó có thể đƣợc vận chuyển ra ngoài nhân dƣới dạng vật liệu di truyền cho các virion mới hay có thể đƣợc nối từng phần hoặc toàn bộ nhằm tổng hợp nên những protein khác nhau của virus (Hare, 2006; Hoffmann và tập thể, 2007). Bản sao DNA của HIV Hình 1.3. Chu kỳ sống của HIV-1 (Weiss, 2001) Các tế bào lympho T CD4+ bị nhiễm có thể bị giết trực tiếp khi một lƣợng lớn virus đƣợc sản sinh và nảy chồi từ bề mặt, phá vỡ màng tế bào hoặc khi các protein và axit amin của virus có mặt bên trong tế bào, cản trở sự hoạt động của bộ máy tế bào. Mặt khác, các tế bào lympho T CD4+ bị nhiễm có thể rơi vào tình trạng 10 tự chết (chết theo chƣơng trình) khi chức năng của tế bào bị rối loạn do HIV-1 gây ra. Thêm vào đó, nhiều nghiên cứu cho thấy rằng HIV-1 cũng phá hủy các tế bào tiền thân mà khi trƣởng thành chúng có các chức năng miễn dịch đặc hiệu, do đó có thể mất khả năng tái sinh, hơn nữa là làm giảm khả năng bảo vệ cơ thể của hệ thống miễn dịch. Các cơ thể nhiễm HIV cho thấy cả miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào đều kháng lại virus. Quá trình đáp ứng lại của tế bào có sự tham gia của tế bào lympho T CD8+ và CD4+ làm trung gian kìm hãm sự nhân lên của HIV-1 trực tiếp bằng cách nhận diện, giết các tế bào bị nhiễm và không trực tiếp bằng cách sản sinh các nhân tố kháng chemokine của virus. Trong thời gian đó, các kháng thể do hệ thống miễn dịch ở ngƣời đƣợc sản sinh khi có mặt các kháng nguyên của virus. Tuy nhiên, virus có các phƣơng thức để chống lại sự tấn công của hệ thống miễn dịch bằng cách biến đổi các epitope đích hoặc thoát ra khỏi sự bắt giữ. Vì vậy, cơ thể (hay hệ thống miễn dịch) không thể ngăn chặn đƣợc sự tiến triển của bệnh và cuối cùng HIV-1 phá hủy hệ thống miễn dịch (Feinberg, 1996; Hare, 2006). 1.1.3.4. Diễn biến của quá trình nhiễm HIV-1 Sự lây nhiễm HIV-1 ban đầu gọi là quá trình nhiễm sơ cấp, thƣờng từ 3-6 tuần, sau đó virus đi khắp cơ thể, các hạt virus gây nhiễm các cơ quan. Ngƣời bệnh sốt nhẹ, có dấu hiệu nhƣ cảm cúm cũng có khi không thấy triệu chứng gì, số lƣợng tế bào T CD4+ giảm. Tiếp theo là giai đoạn tiềm ẩn lâm sàng kéo dài từ 2 đến 10 năm; trong giai đoạn này, quá trình nhân lên của virus và số lƣợng tế bào lympho T CD4+ tăng lên dẫn tới các hoạt động khác thƣờng của hệ miễn dịch, khả năng kháng virus của ngƣời bệnh tăng lên làm cho ngƣời bệnh lầm tƣởng là đã khỏi nhƣng lúc này virus vẫn có khả năng truyền bệnh. Khoảng vài năm sau đó, mật độ virus trong máu tăng nhanh và giữ cho tới lúc chết, các kháng thể kháng virus giảm dần, giai đoạn này gọi là giai đoạn toàn phát hay giai đoạn cuối. Ngƣời bệnh thấy mức độ nhiễm khuẩn tăng lên, ngƣời gầy yếu, các vi sinh vật cơ hội có điều kiện tấn công. Đặc biệt, một số bệnh nhƣ bệnh ung thƣ, lao, tiêu chảy kéo dài, sút cân, dùng kháng sinh không khỏi, chân tay xuất hiện các nốt nhiễm, da và niêm mạc bắt đầu xuất hiện bệnh, ngƣời bệnh chết dần (Daar và tâ ̣p thể , 2001; Hoffmann và tập thể, 2007). 11 1.1.4. Phƣơng pháp điều trị HIV/AIDS Trong phòng chống nhiễm HIV-1, phát triển vaccine theo phƣơng pháp truyền thống gặp rất nhiều khó khăn do một số nguyên nhân nhƣ thời gian ủ bệnh của HIV-1 dài, thƣờng xuyên xảy ra đột biến ở vùng gen mã hóa cho kháng nguyên, chƣa có mô hình nhiễm HIV-1 trên động vật và tần suất phơi nhiễm HIV-1 cao. Nguời nhiễm HIV-1 muốn kéo dài cuộc sống chỉ có con đƣờng duy nhất là uống thuốc ức chế sự sao chép và nhân lên của HIV-1. Cho đến nay, việc điều trị HIV/AIDS phức tạp, tốn kém và chỉ giúp kéo dài sự sống mà không chữa khỏi đƣợc bệnh. Các thuốc điều trị HIV/AIDS có thể hƣớng đến các đích khác nhau dựa trên cơ sở hiểu biết về quá trình nhiễm và nhân lên của HIV trong tế bào (hình 1.4) nhƣ: ức chế quá trình nảy chồi, ức chế quá trình hòa màng và xâm nhập của HIV-1 và phổ biến nhất là liệu pháp dùng thuốc kháng retrovirus (ART) đƣợc áp dụng từ những năm 1987 bao gồm thuốc ức chế enzyme reverse transcriptase, protease và integrase (Hoffmann và tập thể, 2007). Hình 1.4. Các thuốc chống HIV và đích tác dụng (Hoffmann và tập thể, 2007) Các chất tương tự nucleoside (NRTI) ức chế enzyme reverse transcriptase: đây là nhóm thuốc chống retrovirus đầu tiên đƣợc triển khai. Đích tác động của NRTI là reverse transcriptase của HIV-1. Chúng chỉ có khác biệt nhỏ ở phân tử ribose so với các nucleoside bình thƣờng vì vậy có thể thay thế vị trí của nucleoside bình thƣờng theo cơ chế cạnh tranh. Khi các thuốc này đƣợc đƣa vào phân tử DNA đang đƣợc tổng hợp, thì quá trình kéo dài chuỗi của DNA sẽ bị ngừng lại. Nhóm 12 thuốc này gồm zidovudine (AZT), lamivudine, didanosine, zalcitabine, stavudine và abacavir. Một thuốc mới hơn là emtricitabine phải đƣợc dùng phối hợp với ít nhất 2 thuốc AIDS khác, điều trị cả HIV-1 và viêm gan B. Tuy vậy, khi điều trị kéo dài các thuốc nucleoside có thể gây nhiều tác dụng nhƣ: nhiễm độc thần kinh, sinh nhiều lactic, viêm đa dây thần kinh và viêm tu ̣y . Mặc dù ban đầu rối loạn phân bố mỡ đƣợc cho là do điều trị bằng thuốc ức chế protease nhƣng thực ra có nhiều rối loạn về chuyển hoá (đặc biệt là teo mỡ) hiện cũng đƣợc cho là đặc tính của thuốc nucleoside. Có lẽ chúng liên quan đến ức chế hoạt động của ty thể do hoạt động chức năng của ty thể cần đến nucleoside. Quá trình chuyển hoá của cơ quan quan trọng này bị rối loạn do việc sử dụng phải nucleoside “giả” dẫn đến sự thoái hoá của ty thể. Các thuốc khác nhau có thể gây độc với ty thể ở mức độ khác nhau (Galli và tâ ̣p thể , 2002). Thuốc ức chế virus xâm nhập: Các thuốc này ức chế hay cản trở sự xâm nhập của HIV vào tế bào vật chủ. Có 3 bƣớc chủ yếu giúp HIV-1 xâm nhập vào tế bào CD4: HIV-1 gắn vào thụ thể của tế bào CD4, gắn với đồng thụ thể và hòa nhập virus với tế bào. Mỗi bƣớc này đều có thể bị ức chế. Tất cả các nhóm thuốc cụ thể nhƣ thuốc ức chế gắn virus, đối kháng đồng thụ thể và ức chế hòa màng hiện nay đều đƣợc gọi chung là thuốc ức chế xâm nhập. Thuốc đầu tiên trong nhóm này đƣợc cấp phép năm 2003 là enfuvirtide (T-20) tỏ ra ức chế ngay cả những chủng HIV-1 kháng thuốc mạnh nhất. Tuy nhiên, bệnh nhân điều trị T-20 có sự gia tăng tỷ lệ về bệnh lý hạch và viêm phổi do vi khuẩn (Trottier và tập thể, 2005). HIV/AIDS còn có thể đƣợc điều trị bằng thuốc điều hòa miễn dịch nhƣ Alpha-interferon, interleukin 2, loprinasine với tác dụng tăng cƣờng khả năng bảo vệ các hệ miễn dịch. Ngoài ra, bệnh nhân HIV/AIDS còn có thể đƣợc điều trị với một số thuốc phòng ngừa bệnh cơ hội. Dầu vậy, bức tranh phòng chống HIV/AIDS đến năm 1994 vẫn hết sức ảm đạm, nhiều bệnh nhân nhiễm bệnh từ giữa những năm 80 đã tử vong. Chính vì vậy, sự ra đời của các thuốc ức chế protease và thuốc ức chế enzyme reverse transcriptase không phải nucleoside (NNRTI) vào năm 1995 đã bắt đầu kỷ nguyên trị liệu kháng retrovirus hiệu lực cao (Highly Active Anti-Retroviral Therapy- 13 HAART) và tạo ra những tiến bộ vƣợt bậc về giảm tỷ lệ mắc và tử vong do HIV-1 cũng nhƣ giảm rõ rệt các nhiễm trùng cơ hội và khối u. Các chất ức chế protease (PI): đây là các chất có tác dụng cản trở sự nhân lên của HIV-1 ở giai đoạn muộn hơn trong vòng đời của virus, khiến cho HIV-1 bị rối loạn cấu trúc và không có khả năng gây nhiễm. Tuy nhiên, bệnh nhân điều trị bằng PI thƣờng phải uống nhiều lần thuốc trong một ngày và điều trị kéo dài gây ra một số tác dụng phụ thƣờng gặp nhƣ: bệnh dạ dày, ruột, giảm chức năng gan, rối loạn lipid máu, loạn nhịp tim (Nolan, 2003; Anson và tập thể, 2005). Điều này cũng đã đƣợc hạn chế với sự ra đời của các PI mới (PI tăng cƣờng) thƣờng đƣợc biểu thị bằng cách thêm chữ “r” vào sau tên thuốc. Việc tăng cƣờng có thể hiệu quả trên những chủng virus kháng thuốc nhờ vào việc làm tăng nồng độ thuốc trong huyết tƣơng. Kháng thuốc cũng hiếm gặp khi điều trị PI tăng cƣờng, ít nhất ở những bệnh nhân chƣa từng điều trị ART bởi hàng rào kháng thuốc cao. Theo nhiều chuyên gia, bệnh nhân có tải lƣợng virus cao cần phải dùng PI tăng cƣờng ngay từ khi bắt đầu điều trị. Tuy nhiên, lạm dụng PI tăng cƣờng cũng dẫn đến rối loạn lipid máu và các tác dụng phụ khác nặng nề hơn (Van der Valk và Reiss, 2003). Dù vậy, PI vẫn là một thành phần quan trọng và không thể thiếu của HAART. Các thuốc trong nhóm gồm saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir, amprenavir, lopinavir và atazanavir. Thuốc PI tiêu biểu là atazanavir (Reyataz ™) là PI uống 1 ngày 1 lần duy nhất với lợi thế không hại lipid máu, không kháng insulin đƣợc đƣa vào sử dụng từ năm 2004 (Noor và tâ ̣p thể , 2004). Thuốc có tác dụng dung nạp tốt và hiệu lực kháng virus mạnh đƣợc cấp phép sử dụng cho các bệnh nhân đã điều trị ART. Hiện nay, atazanavir đang cạnh tranh với lopinavir để dành vị trí PI đƣợc kê đơn nhiều nhất. Lopinavir đƣợc cấp phép tháng tƣ năm 2001 và là thuốc PI đầu tiên và duy nhất có một liều tăng cƣờng làm tăng nồng độ lopinavir lên trên 100 lần. Lopinavir/r có hàng rào kháng thuốc rất cao, cần tích lũy ít nhất 6-8 đột biến kháng thuốc thì mới đủ gây thất bại trong điều trị (Kemp và tâ ̣p thể , 2002). Các chất ức chế reverse transcriptase không nucleoside (NNRTI): giống với các NRTI, đích tác động của chúng là enzyme reverse transcriptase. Tuy vậy, NNRTI gắn trực tiếp và không cạnh tranh với enzyme ở vị trí gần sát với nơi gắn các nucleoside. Kết quả là làm phong bế hoàn toàn vị trí gắn các chất hoạt hóa 14 enzyme reverse transcriptase, làm giảm đáng kể quá trình tổng hợp axit nucleic. Nhóm thuốc này gồm: nevirapine (viramuneTM), efavirenz (sustiva™ hay stocrin™) và delavirdine (rescriptor™). Tuy nhiên, bệnh nhân điều trị bằng NNRTI có nguy cơ kháng thuốc không chỉ rất cao mà còn có thể xuất hiện khá nhanh. Một khi đã xảy ra kháng thuốc thì hầu nhƣ sẽ kháng với cả nhóm thuốc này. Chỉ cần một đột biến ở vị trí gắn kỵ nƣớc (đột biến K103N) là đủ loại bỏ toàn bộ cả nhóm thuốc. Nếu đã có đột biến kháng thì không nên điều trị tiếp tục bằng NNRTI, bởi lẽ khả năng nhân lên của virus có đột biến kháng NNRTI lại không bị giảm sút nhƣ những trƣờng hợp có đột biến kháng PI hay NRTI. Mặc dù có những vấn đề liên quan đến nguy cơ kháng thuốc, rất nhiều nghiên cứu đều cho thấy NNRTI có hiệu quả rất tốt nếu phối hợp cùng với các thuốc NRTI. Các dữ liệu về miễn dịch học cũng nhƣ virus học ở những bệnh nhân chƣa từng đƣợc điều trị ART cho thấy các thuốc NNRTI cũng có hiệu lực tƣơng đƣơng nếu không muốn nói là vƣợt trội hơn so với các thuốc PI (Robbins và tâ ̣p thể , 2003). Liều dùng đơn giản và dung nạp thuốc tốt giúp nevirapine và efavirenz trở thành thành phần quan trọng của HAART và thậm chí vƣợt trội các PI. Vừa qua, nhiều nghiên cứu ngẫu nhiên đã chứng minh rằng nếu đảm bảo đã ức chế đƣợc virus thì hoàn toàn có thể chuyển từ điều trị bằng PI sang NNRTI và sử dụng NNRTI đôi khi đem lại hiệu lực tốt hơn so với tiếp tục dùng các thuốc PI (Hoffmann và tập thể, 2007). Trong phác đồ điều trị cho bệnh nhân HIV/AIDS, các thuốc thƣờng đƣợc dùng phối hợp để tăng hiệu quả và hạn chế tác dụng phụ. Đến năm 1997, các mô hình tính toán toán học cho thấy thời gian ức chế hoàn toàn HIV-1 là 3 năm, sau thời gian này các nhà khoa học tiên đoán rằng các tế bào mang virus có lẽ đã chết hết và chữa trị hoàn toàn tiệt căn HIV-1 là có thể. Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây cho thấy, HIV-1 vẫn còn tồn tại tiềm tàng ở nhiều tế bào thậm chí sau một thời gian dài bị ức chế, không ai có thể biết các tế bào mang virus tiềm tàng này sống đƣợc bao lâu và dù còn một lƣợng rất nhỏ thì HIV-1 vẫn có thể bùng phát trở lại ngay sau khi ngừng điều trị. Thời gian ƣớc lƣợng gần nhất để xóa sạch các tế bào mang HIV-1 là 73,3 năm và nhƣ vậy HIV-1 không thể chữa khỏi trong thời gian ngắn (Siliciano và tâ ̣p thể , 2003). Bên cạnh đó, các thuốc ức chế HIV-1 phải uống nhiều lần và điều trị kéo dài dẫn đến các tác dụng phụ (bệnh 15 dạ dày và đƣờng ruột, rối loạn trao đổi lipid máu, loạn nhịp tim...). Vấn đề này có thể đƣợc giải quyết bằng cách sử dụng nồng độ chất ức chế protease cao hoặc tạo ra các chất ức chế mới có hiệu lực cao. Mặt khác, HIV-1 nhân lên nhanh và enzyme reverse transcriptase phiên mã với tỉ lệ sai sót khá cao nên tốc độ đột biến HIV-1 lớn và HIV-1 luôn tạo ra các chủng mới dẫn đến sự thay đổi trong cấu trúc và giúp cho HIV có khả năng kháng thuốc. Đây là thách thức và dẫn đến thất bại trong điều trị HIV-1 bằng ART. Dầu vậy, dù HIV-1 là một tác nhân gây bệnh truyền nhiễm rất nguy hiểm với những biến đổi phức tạp, các nhà khoa học vẫn đang không ngừng nghiên cứu để tìm ra thuốc mới, hiệu quả chống HIV và hi vọng rằng trong 10 năm nữa hiệu quả điều trị bằng ART và HAART sẽ khác hoàn toàn. 1.2. PROTEASE HIV-1 VÀ ỨNG DỤNG Trong chu trình tái bản của HIV-1, protease là enzyme có tác dụng phân cắt các polyprotein tiền thân gag và gag-pol thành những protein cấu trúc và chức năng trong quá trình trƣởng thành của virus. Khi ức chế hoạt tính của protease hoặc gây đột biến trên gen mã hóa cho protease, các hạt virus vẫn hình thành nhƣng không đƣợc đóng gói phù hợp để tạo thành virus hoàn chỉnh nên chúng không có khả năng xâm nhiễm vào tế bào vật chủ (Darke và tâ ̣p thể , 1989). Với vai trò đặc biệt quan trọng nhƣ vậy, protease HIV-1 đã đƣợc nhiều nhóm các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu. 1.2.1. Cấu tạo protease HIV-1 Có nhiều cách phân loại protease, dựa vào vị trí cắt trên chuỗi polypeptide, protease đƣợc chia thành hai nhóm chính: exopeptidase và endopeptidase. Exopeptidase cắt liên kết peptide ở gần đầu N hoặc đầu C của cơ chất, trong khi đó endopeptidase cắt liên kết peptide nội chuỗi. Dựa vào cấu trúc của “nhóm chức” có mặt trong trung tâm hoạt động, protease lại đƣợc chia thành bốn nhóm chính: protease serine, protease aspartyl, protease cysteine và protease chứa kim loại, tiếp đó protease lại tiếp tục đƣợc phân chia thành nhiều họ khác nhau dựa vào trình tự axit amin (Rao và tâ ̣p thể , 1998). Dựa vào cách phân loại nhƣ trên, protease HIV-1 là một protease aspartyl (có chứa Asp trong trung tâm hoạt động). 16 Năm 1989, Navia và tập thể phòng thí nghiệm Merck là nhóm đầu tiên mô tả cấu trúc tinh thể của protease HIV-1. Từ đó đến nay, nhiều protease HIV-1 khác nhau đã đƣợc nghiên cứu về chức năng, tính đặc hiệu cơ chất và vị trí gắn của các chất ức chế. Cấu trúc của một số phức hợp protease HIV-1 kháng thuốc với các chất ức chế đặc hiệu cũng đã đƣợc làm sáng tỏ (King và tâ ̣p thể , 2000). Protease HIV-1 đƣợc mã hóa bởi hệ gen của HIV-1 và là một protease aspartyl, họ retropepsin A2, đƣợc tạo ra khi HIV nhiễm vào tế bào chủ. Protease HIV-1 là một dimer, mỗi monomer giống hệt nhau có khối lƣợng phân tử (KLPT) 11 kDa gồm 99 axit amin và đƣợc sắp xếp gần nhƣ theo kiểu đối xứng. Mỗi một monomer tạo thành cấu trúc các phiến gấp nếp với một đoạn xoắn ngắn gần đầu C (Tie, 2006). Nhƣ đƣợc chỉ ra ở hình 1.5, đầu N của protease HIV-1 với các axit amin 1-4 hình thành nên chuỗi β a là phần bên ngoài của bề mặt phiến gấp β. Các axit amin 9-15 hình thành chuỗi β b qua một vòng quay, tiếp tục đến chuỗi β c là nơi kết thúc vị trí bộ ba hoạt động (Asp25-Thr26-Gly27). Tiếp theo cấu trúc vòng của vị trí hoạt động là chuỗi β d gồm các axit amin từ 30–35. Một cấu trúc vòng rộng (axit amin 36–42) liên kết với chuỗi β a’ hình thành bởi các axit amin 43–49. Các axit amin 52–66 và 69-78 lần lƣợt hình thành nên chuỗi β b’ và chuỗi β c’. Sau một cấu trúc vòng tạo ra bởi các axit amin 79–82, một chuỗi ngắn d’ (các axit amin 83–85) dẫn trực tiếp đến một đoạn xoắn α h (các axit amin 86–94). Đoạn xoắn h theo sau bởi một chuỗi q thẳng tận cùng bằng đầu C (các axit amin 95–99) hình thành nên phần bên trong của bề mặt nhị phân. Bốn chuỗi β trong phân tử lõi tổ chức thành phiến ψ là đặc trƣng của tất cả các protease aspartyl. Các axit amin 44-57 trong mỗi tiểu phần hình thành nên một “mũ” gồm một cặp chuỗi song song ngƣợc nhau (a’ và một phần của b’) (Wlodawer và Vondrasek, 1998; Tie, 2006). Cấu tạo protease HIV-1 còn có thể đƣợc chia thành ba vùng (domain) chính: vùng cuối hoặc vùng dimer hóa, vùng lõi và vùng mũ. Vùng dimer hóa bao gồm 4 phần cuối của phiến β (các gốc axit amin 1-4 và 95-99 của mỗi monomer), vòng quay quanh axit amin 4-9 và chuỗi xoắn (axit amin 86-94 của mỗi monomer). Vùng này có vai trò thiết yếu trong hình thành cấu trúc dimer và ổn định hoạt tính protease HIV-1. Cấu trúc dimer sẽ đƣợc hình thành nhờ tƣơng tác không tích điện 17 giữa 4 sợi của phiến  từ các gốc axit amin 1-4 (vùng N đầu cùng N), 96-99 (vùng C tận cùng) và các gốc axit amin trong trung tâm hoạt động 24-29. Tƣơng tác giữa các gốc Ile50 và Gly51’; Asp29, Arg87 và Arg88’ cũng ảnh hƣởng đến sự ổn định của dimer. Sự gắn thêm chất ức chế hoặc cơ chất sẽ tăng cƣờng hơn nữa sự ổn định của cấu trúc dimer. Vùng lõi gồm 4 phần đầu sợi β (các axit amin 10-32 và 63-85 của mỗi monomer) có vai trò quan trọng trong ổn định dimer và hoạt tính. Bộ ba xúc tác Asp25-Thr26-Gly27 có tính bảo thủ trên mỗi monomer cũng nằm trong cấu trúc của vùng lõi. Vùng mũ bao gồm các axit amin từ 33-43 và 44-63 bao quanh trung tâm hoạt động. Phần đầu của vùng này giàu Gly tạo nên tính mềm dẻo của vùng cần thiết cho việc gắn cơ chất, giải phóng sản phẩm có vai trò quan trọng đối với hoạt tính của enzyme. Nếu đột biến xuất hiện ở vị trí mũ có thể làm giảm mạnh hoạt tính của enzyme (Wlodawer và Vondrasek, 1998; Tie, 2006). Hình 1.5. Mô hình cấu trúc của protease HIV-1 (Tie, 2006) A: Cấu trúc bậc hai của protease với chất ức chế (hoặc cơ chất), B: Cấu trúc của protease khi có/không có chất ức chế (cơ chất). Màu đỏ thể hiện protease khi liên kết với chất ức chế (cơ chất) và màu xanh thể hiện protease khi không có chất ức chế (cơ chất) Trung tâm hoạt động của protease chứa bộ ba Asp25-Thr26-Gly27 nằm tại mặt phân giới của dimer, đƣợc làm ổn định nhờ mạng lƣới các liên kết hydro giống với các enzyme ở sinh vật nhân chuẩn. Mạng lƣới liên kết hydro này khá vững chắc 18 (hình 1.6) tạo nên sự ổn định của trung tâm hoạt động cũng nhƣ dimer. Mỗi monomer đều có một bộ ba Asp-Thr-Gly với vị trí axit amin tƣơng ứng nhƣ sau: 25 (25’) – 26 (26’) – 27 (27’) và phân tử Asp cần thiết cho cả cấu trúc và hoạt tính xúc tác của protease. Hình 1.6. Cấu trúc kẹp trong trung tâm hoạt động của protease HIV-1 (Wlodawer và Vondrasek, 1998) Nhóm cacboxyl của Asp25 tạo liên kết hydro với –NH của Gly27. Nhóm – OH của Thr tạo liên kết hydro với hai điểm trên vùng đối diện, liên kết giữa NH của Thr (màu xanh) với gốc –CO (màu đỏ) của gốc phía trƣớc Asp Bên cạnh đó, bộ ba Gly86-Arg87-Asn88 của protease HIV-1 cũng là một vùng bảo thủ cao khác đóng vai trò trong việc hình thành cấu trúc dimer. Các vị trí liên kết cơ chất gồm S3 đến S4’ chủ yếu hình thành bởi các axit amin 8, 23-30, 32, 45-50, 53, 56, 76, 80-82 và 84. Các vị trí 1-3, 5-9, 23-27, 29, 47-52, 54, 67, 81, 87 và 90-99 góp phần liên hệ giữa bề mặt dimer. Các chất ức chế hoặc cơ chất liên kết giữa hai tiểu phần bằng liên kết hydro và tƣơng tác van der Waals với vị trí hoạt động gồm hai bộ ba đặc trƣng và hai mũ linh hoạt. Các mũ gấp xuống cơ chất hoặc các chất ức chế và hoạt động trong suốt quá trình xúc tác cùng với việc liên kết cơ chất cũng nhƣ loại trừ khỏi trung tâm hoạt động. Có một phân tử nƣớc đƣợc giữ lại hình thành nên cầu nối giữa nhóm CO ở liên kết P2-P1’ giữa chất ức chế và nhóm – NH- của Ile 50/50’ –NH- ở các mũ. Phân tử nƣớc này rất cần thiết cho hoạt tính thủy phân của protease và có thể bị thay thế bởi một nhóm carbonyl có trong chất ức chế thích hợp nào đó. 19 Ceccherini-Silberstein và tập thể (2004) đã nghiên cứu về mức độ bảo thủ của protease HIV-1 khi có mặt cũng nhƣ vắng mặt các chất ức chế protease từ kết quả giải trình tự gen mã hóa protease HIV-1 của 475 bệnh nhân chƣa dùng thuốc và 639 bệnh nhân có sử dụng PI. Kết quả phân tích trên các bệnh nhân không dùng thuốc cho thấy 68 trong số 99 axit amin có mức độ bảo thủ cao (chiếm 69%). Các tác giả cũng chỉ ra 5 vùng khá bảo thủ của protease ở các bệnh nhân này và hầu hết đều là các vùng có chức năng quan trọng nhƣ vùng N đầu cùng (P1-P9), vùng C tận cùng (G94-F99), vùng trung tâm hoạt động (E21-V32), vùng mũ (P44-V56) và vùng G78-N88. Trong khi đó, trình tự axit amin của protease HIV-1 phân lập từ các bệnh nhân sử dụng thuốc ức chế protease lại có sự thay đổi đáng kể, chủ yếu do các đột biến kháng thuốc ức chế protease. Có 45 trong số 99 axit amin thể hiện tính bảo thủ (chiếm 45% so với 69% ở các bệnh nhân không sử dụng thuốc). Hơn nữa, khi so sánh với các bệnh nhân không sử dụng thuốc, các vùng N đầu cùng và vùng C tận cùng là khá bảo thủ, trong đó có sự thay thế C95 với xác suất dao động từ 0,6% đến 2,7%. Tất cả các vùng bảo thủ lớn khác (E21-V32, P44-V56, G78-N88) cũng ít bảo thủ hơn cụ thể là D25-D29, G49-G52, G78-P81 và G86-R87. Cho đến nay, hầu hết các nghiên cứu về cấu trúc protease HIV-1 đều của nhóm B, trong khi đó theo Bandaranayake và tâ ̣p thể (2008) thì sự khác nhau về trình tự axit amin giữa các phân nhóm HIV-1 gần đây đƣợc xem là cũng có vai trò quan trọng trong các cơ chế kháng thuốc ở protease HIV-1. Các tác giả này đã xác định cấu trúc của protease HIV-1 phân nhóm CRF01_AE và so sánh với phân nhóm B. Bằng cách sắp xếp các nguyên tử C chồng lên nhau, các tác giả cho thấy có sự tƣơng đồng cao giữa cấu trúc của protease HIV-1 phân nhóm B với phân nhóm CRF01_AE, độ lệch chỉ có 0,37 Ao. Tuy nhiên, trong cấu trúc của protease HIV-1 phân nhóm CRF01_AE có sự sắp xếp lại từ gốc axit amin 33-39 và gần vùng lõi (gốc axit amin 16-22). Sự khác nhau về cấu trúc ở cả trên hai monomer. Chuỗi bên ngắn hơn của Ile36 đƣợc ổn định qua tƣơng tác van der Waals với chuỗi bên của Asn18, Leu38 và Arg20 qua đó cho phép vùng mũ tiến lại gần hơn vùng lõi khi so sánh với chuỗi bên Met36 trong cấu trúc protease phân nhóm B. Phần cong của vùng mũ hƣớng về vùng lõi thúc đẩy sự hình thành liên kết hydro giữa –C0 của Asp35 và NH2- của Arg20. Tƣơng tác này làm cho chuỗi bên Asp35 hƣớng vào 20