Tài liệu Nhân dòng, biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính của protein pwo dna polymerase tái tổ hợp ở e coli

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Thị Thu Huyền NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA PROTEIN PWO DNA POLYMERASE TÁI TỔ HỢP Ở E. COLI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Thị Thu Huyền NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA PROTEIN PWO DNA POLYMERASE TÁI TỔ HỢP Ở E. COLI Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 8420101.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Lê Thọ Sơn TS. Hoàng Thị Mỹ Hạnh Hà Nội - 2019 Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền LỜI CẢM ƠN Khoảng thời gian học tập và nghiên cứu tại bộ môn Di truyền học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN là hành trang quý báu giúp em trưởng thành và có ích hơn trong cuộc sống. Lời đầu tiên em xin được cảm ơn các thầy cô của bộ môn Di truyền học đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt những kiến thức chuyên môn cho chúng em. Thầy cô luôn quan tâm để cho chúng em có một môi trường học tập toàn diện và gần gũi nhất. Em sẽ coi bộ môn Di truyền như ngôi nhà thứ hai của mình. Tiếp theo, em xin được cảm ơn hai thầy cô TS. Lê Thọ Sơn và TS. Hoàng Thị Mỹ Hạnh đã đồng ý hướng dẫn cho em trong luận văn tốt nghiệp này. Thầy cô không chỉ động viên em trong quá trình học tập mà còn cho em rất nhiều lời khuyên trong cuộc sống. Em cũng xin gửi lời cảm ơn trìu mến tới gia đình và bạn bè, những người luôn tin tưởng, hỗ trợ và dìu dắt em trong suốt thời gian qua. Đặc biệt là bố, mẹ những người luôn hy sinh thầm lặng cho cuộc sống của em. Sau cùng, em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy TS. Nguyễn Văn Sáng. Thầy đã cho em có cơ hội hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Thầy luôn là động lực để em phát triển cũng như cố gắng hơn mỗi ngày. Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106-NN.02-2016.58. Nghiên cứu có sự hợp tác và hỗ trợ cung cấp trình tự gen mã hóa bới Công ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa. Hà Nội, tháng 12 năm 2019 Học viên Nguyễn Thị Thu Huyền i Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................i MỤC LỤC ...................................................................................................................... ii DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................iv DANH MỤC BẢNG .......................................................................................................v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................................vi MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... vii CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................1 1.1. Khái quát DNA polymerase .................................................................................1 1.1.1. Phân loại DNA polymerase ...........................................................................1 1.1.2. Cấu trúc và chức năng của DNA polymerase ...............................................1 1.1.3. Quá trình sao chép DNA ...............................................................................2 1.2. Ứng dụng của DNA polymerase ..........................................................................3 1.2.1. Kỹ thuật giải trình tự .....................................................................................4 1.2.2. Kỹ thuật PCR .................................................................................................5 1.3. Tình hình nghiên cứu Pwo DNA polymerase ......................................................6 1.3.1. Phân loại nguồn gốc ......................................................................................6 1.3.2. Nghiên cứu biểu hiện Pwo DNA polymerase tái tổ hợp ............................... 7 1.3.3. Các đặc tính quan trọng của DNA polymerase dùng cho PCR .....................8 1.4. Công nghệ protein tái tổ hợp ..............................................................................10 1.4.1. Tổng hợp gen, tối ưu mã codon ...................................................................10 1.4.2. Nhân dòng gen đích vào vector mong muốn ...............................................11 1.4.3. Biểu hiện protein tái tổ hợp .........................................................................12 1.4.4. Các phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp .............................................16 CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .........................................................19 2.1. Vật liệu nghiên cứu............................................................................................. 19 2.1.1. Nguyên vật liệu............................................................................................ 19 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị ......................................................................................19 2.1.3. Hóa chất và môi trường ...............................................................................19 2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................21 2.2.1. Thiết kế gen đích mã hóa Pwo DNA polymerase .......................................21 ii Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền 2.2.2. Nhân dòng, tạo vector mang gen mã hóa Pwo DNA polymerase ...............22 2.2.3. Biểu hiện protein Pwo DNA polymerase ở E. coli .....................................27 2.2.4. Tinh sạch protein Pwo DNA polymerase ....................................................27 2.2.5. Xác định hoạt tính của protein Pwo DNA polymerase ............................... 30 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 33 3.1. Phân tích gen mã hóa Pwo DNA polymerase tái tổ hợp ....................................33 3.2. Nhân dòng vector mang gen mã hóa Pwo DNA polymerase ............................. 34 3.2.1. Tạo vector tái tổ hợp pEtM-Pwo .................................................................34 3.2.2. Biến nạp vector tái tổ hợp pEtM-Pwo vào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3)...35 3.2.3. Tách plasmid, kiểm tra trình tự ...................................................................36 3.3. Biểu hiện protein Pwo DNA polymerase ở vi khuẩn E. coli.............................. 38 3.4. Tinh sạch protein tái tổ hợp Pwo DNA polymerase ...........................................38 3.4.1. Phương pháp tinh sạch sắc ký ái lực nickel.................................................39 3.4.2. Phương pháp tinh sạch kết tủa bằng muối ammonium sulfate ....................43 3.5. Xác định hoạt tính của protein tái tổ hợp Pwo DNA polymerase ......................44 3.5.1. Tối ưu thành phần buffer PCR ....................................................................44 3.5.2. Hoạt tính sao chép .......................................................................................45 3.5.3. Khả năng chịu nhiệt độ cao .........................................................................47 3.5.4. Hoạt tính khi có mặt chất ức chế .................................................................47 CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................... 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 50 iii Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền DANH MỤC HÌNH Hình 1: Sự đa dạng trong cấu trúc của một số loại DNA polymerase ............................2 Hình 2: Thành phần phức hệ sao chép DNA (replisome) ở vi khuẩn Cổ .......................3 Hình 3: Cây phát sinh của nhóm vi khuẩn Cổ chịu nhiệt ................................................6 Hình 4: Cơ chế cạnh tranh động học cho một DNA polymerase ....................................8 Hình 5: Sơ đồ minh họa các bước tổng hợp gen bằng phương pháp POS ....................10 Hình 6: Thiết kế mồi nhân dòng gen mã hóa protein Pwo-pol .....................................12 Hình 7: Cấu trúc vector biểu hiện protein tái tổ hợp ở E. coli ......................................15 Hình 8: Sơ đồ mô tả quá trình nhân dòng vector tái tổ hợp pEtM-Pwo ........................22 Hình 9: Sơ đồ quá trình tinh sạch protein Pwo-pol .......................................................27 Hình 10: Khuếch đại gen mã hóa Pwo-pol và xử lý enzyme cắt giới hạn ....................34 Hình 11: Biến nạp, nuôi cấy, chọn lọc plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo ..........................35 Hình 12: Tách chiết và kiểm tra plasmid tái tổ hợp ......................................................36 Hình 13: So sánh trình tự amino acid của gen mã hóa Pwo DNA polymerase.............37 Hình 14: Biểu hiện protein DNA polymerase ở E. coli ................................................38 Hình 15: So sánh sự phá vỡ tế bào với nhiệt độ cao .....................................................39 Hình 16: Mẫu siêu âm phá vỡ tế bào tinh sạch sắc ký ái lực ........................................40 Hình 17: Tinh sạch sắc ký ái lực kết hợp xử lý ở nhiệt độ 70oC ...................................41 Hình 18: Tinh sạch sắc ký ái lực kết hợp xử lý ở nhiệt độ 95oC ...................................42 Hình 19: Tinh sạch bằng kết tủa muối AS bão hòa ở 4oC .............................................43 Hình 20: Ảnh hưởng của pH đến sự ổn định của buffer PCR .......................................44 Hình 21: Ảnh hưởng của nồng độ KCl đến khả năng khuếch đại đoạn gen ngắn ........45 Hình 22: Hoạt tính sao chép của Pwo-pol tái tổ hợp sau tinh sạch ............................... 46 Hình 23: Phản ứng của enzyme và protein tái tổ hợp ở nhiệt độ biến tính 98oC ..........47 Hình 24: Hoạt tính của các proein Pwo-pol trong phản ứng sử dụng khuôn genome ..48 iv Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Phân loại DNA polymerase ứng dụng giải trình tự ...........................................4 Bảng 2: Đặc tính của một số enzyme DNA polymerase bền nhiệt .................................5 Bảng 3: Các chủng E. coli phổ biến cho biểu hiện protein tái tổ hợp ...........................13 Bảng 4: Vị trí các đặc điểm của vector biểu hiện pEtM................................................16 Bảng 5: Dung dịch đệm, hóa chất pha stock .................................................................20 Bảng 6: Trình tự cặp mồi nhân dòng gen mã hóa Pwo DNA .......................................22 Bảng 7: Thành phần phản ứng PCR nhân dòng gen mã hóa Pwo-pol ..........................23 Bảng 8: Thành phần phản ứng cắt, nối gen và plasmid.................................................24 Bảng 9: Trình tự các cặp mồi giải trình tự ....................................................................26 Bảng 10: Thành phần hóa chất đổ gel điện di SDS-PAGE ...........................................30 Bảng 11: Thành phần phản ứng PCR thử hoạt tính nhân đoạn gen AcrH ....................30 Bảng 12: Thành phần phản ứng PCR thử hoạt tính nhân đoạn gen KOD .....................31 Bảng 13: Thành phần buffer bảo quản protein Pwo-pol ...............................................32 Bảng 14: Thành phần 10X buffer PCR tối ưu hoạt tính của protein Pwo-pol ..............32 Bảng 15: Phân tích sử dụng codon của gen mã hóa Pwo DNA polymerase .................33 v Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên đầy đủ aa Acid amin APS Ammonium persulfate bp Base pair BSA Bovine serum albumin CAI Codon adaptation index DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxynucleoside triphosphate DTT Dithiothreitol E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetracetic Acid His Histidine IMAC Immobilized metal affinity chromatography IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kb Kilo base kDa Kilo dalton Kod-pol T. kodakarensis DNA polymerase LB Luria-Bertani NTA Nitrilotriacetic acid PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PCR Polymerase Chain Reaction Pfu-pol P. furiosus DNA polymerase Pwo-pol P. woesei DNA polymerase RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate Taq-pol T. aquaticus DNA polymerase TEMED Tetramethylethylenediamine vi Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền MỞ ĐẦU Enzyme DNA polymerase là một trong những enzyme quan trọng được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: (1) trong sinh học phân tử, nhằm nghiên cứu gen và hệ gen; (2) trong y học, để chẩn đoán và phát hiện các bệnh di truyền, tầm soát ung thư; (3) trong nông nghiệp, như xác định các tác nhân gây bệnh cho cây trồng vật nuôi, thực vật biến đổi gen; (4) trong khoa học hình sự, để nhận diện các dấu chuẩn di truyền. Mặc dù có vai trò quan trọng, nhưng ở Việt Nam việc tự sản xuất enzyme DNA polymerase vẫn gặp nhiều khó khăn về mặt quy trình và đánh giá chất lượng. Các nghiên cứu nếu có đến nay, hầu hết là quy trình tối ưu cho dòng enzyme DNA polymerase thế hệ cũ với hoạt tính kém bền, kém ổn định. Do vậy, nguồn enzyme DNA polymerase thế hệ mới sử dụng cho các mục đích phát triển khoa học công nghệ ở Việt Nam đã và đang phải nhập từ nước ngoài. Quá trình nhập khẩu thường kèm theo nhiều vấn đề không mong muốn cho người sử dụng như (1) thời gian vận chuyển kéo dài từ một đến vài tháng làm chậm tiến độ của đề tài, dự án; (2) chất lượng của enzyme bị ảnh hưởng do điều kiện bảo quản không đảm bảo trong thời gian dài; (3) bởi các yếu tố rủi ro mà giá thành mua enzyme từ các công ty hóa chất là rất đắt đỏ. Hiện nay, các công ty công nghệ sinh học của Việt Nam đang rất cần nguồn enzyme được sản xuất trong nước với chất lượng tốt, tương đương với quốc tế nhưng có giá thành rẻ hơn, thời gian cung cấp nhanh hơn để làm nguyên liệu đầu vào cho việc phát triển các loại kit khác nhau. Do vậy cần thiết phải xây dựng được quy trình sản xuất enzyme DNA polymerase có chất lượng tốt tại các cơ sở nghiên cứu trong nước. Việc sản xuất enzyme trong nước sẽ giúp chủ động được nguồn nguyên liệu, giảm giá thành và các chi phí vận chuyển khi phải nhập enzyme từ nước ngoài, tạo động lực cho sự phát triển của các công ty công nghệ sinh học của Việt Nam. Pwo-pol là enzyme có hoạt động ổn định nhất với các chuỗi DNA kích thước dưới 3 kb. Hiện nay trên thị trường, enzyme này đang được thương mại hóa bởi một số hãng như Roche (Sigma), Genaxis và peQlab (Avantor) tuy nhiên quy trình sản xuất lại không được công bố. Xuất phát từ thực tiễn nêu trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nhân dòng, biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính của protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp ở E. coli”. Mục đích của nghiên cứu nhằm góp phần đánh giá chính xác hiệu quả sử dụng enzyme Pwo-pol ở quy mô phòng thí nghiệm đồng thời vii Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền định hướng cải tiến hiệu quả enzyme trong ứng dụng ở Việt Nam. Nghiên cứu được thực hiện dựa trên các mục tiêu cụ thể như sau: 1. Thiết kế tối ưu mã bộ ba cho gen mã hóa Pwo DNA polymerase sử dụng công cụ tin sinh. 2. Tổng hợp và nhân dòng gen mã hóa Pwo DNA polymerase, tạo vector tái tổ hợp pEtM-Pwo. 3. Biểu hiện protein Pwo DNA polymerase ở vi khuẩn E. coli BL21 (DE3). 4. Tinh sạch protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp. 5. Xác định hoạt tính của protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp tinh sạch được. viii Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái quát DNA polymerase DNA polymerase là thành phần trung tâm tổng hợp nên các chuỗi DNA bổ sung theo khuôn mẫu trong tế bào sống [7]. Ngoài những vai trò cơ bản nhằm duy trì tính toàn vẹn của bộ gen bởi quá trình sao chép và sửa chữa, DNA polymerase còn được sử dụng rộng rãi trong in vitro. Vì vậy, nhiều enzyme DNA polymerase đã được phân lập để xác định cấu trúc và chức năng của chúng. 1.1.1. Phân loại DNA polymerase DNA polymerase thể hiện sự đa dạng cả trong cấu trúc và chức năng ở các sinh vật khác nhau. Vào những năm 1950, nhà khoa học Arthur Kornberg và cộng sự đã tìm thấy DNA polymerase (pol) I, đầu tiên ở vi khuẩn E. coli. Các nhà nghiên cứu sau đó tiếp tục phát hiện thêm nhiều loại DNA pol thuộc các loài khác nhau cung cấp cho khoa học [25]. Theo phân loại dựa trên so sánh trình tự amino acid và mối quan hệ di truyền, các DNA pol được chia thành 7 họ lần lượt A, B, C, D, X, Y, RT. Họ polymerase A bao gồm Klenow Fragments của Escherichia coli và DNA polymerase I của Bacillus, Thermus aquaticus DNA polymerase, và T7 RNA – DNA polymerases. Họ polymerase B phụ thuộc DNA bao gồm các DNA polymerase của phage T4, và RB69. Họ polymerase C (như DNA pol III của E. coli), họ polymerase D (như DNA pol II của Euryarchaeotic), họ polymerase X (như DNA pol β của người), họ polymerase Y (như DNA pol IV, V của E. coli), họ polymerase RT. Mặt khác, dựa trên đặc điểm riêng của mỗi loại DNA polymerase có thể phân chúng thành các loại có đặc tính (1) sao chép (replicative) như pol α, γ; (2) sửa chữa (repairing) như pol β; (3) đọc sửa (proofreading) chiều 5’ – 3’ như pol δ, ε [44]. Cụ thể, các DNA-pol có khả năng sao chép từ sinh vật nhân thực được tìm thấy trong họ polymerse B (pol α); từ vi khuẩn được tìm thấy trong họ polymerase A (pol I) và C (pol III); và với vi khuẩn Cổ chúng thuộc họ polymerase B và D [2]. 1.1.2. Cấu trúc và chức năng của DNA polymerase Hiện nay, các nghiên cứu đã xác định được nhiều cấu trúc của DNA polymerase. Một số DNA pol đại diện ở hình 1 cho thấy sự đa dạng nhưng vẫn duy trì tính bảo thủ cao về mặt cấu trúc trong quá trình thực hiện chức năng của chúng. 1 Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền Hình 1: Sự đa dạng trong cấu trúc của một số loại DNA polymerase Được so sánh bởi Steitz và cộng sự, 1999 [39] a. Taq DNA polymerase liên kết DNA; b. Cấu trúc bậc hai của HIV-RT và DNA; c. Mô hình DNA liên kết với RB69 gp43; d. Phức hợp cấu trúc bậc 3 pol β của chuột với DNA và dideoxy-NTP. Các màu khác nhau biểu diễn các miền khác nhau tương ứng trên cả 4 cấu trúc: Miền “thumb” chuỗi màu xanh lá, miền “palm” chuỗi màu đỏ, miễn “finger” chuỗi màu xanh dương, chuỗi màu vàng là vị trí liên kết DNA, và chỉ duy nhất trong cấu trúc pol β của chuột có chứa miền màu tím có khả năng đọc sửa trong quá trình sao chép DNA. Theo quan sát tổng thể, các DNA polymerase có hình dạng giống cấu trúc bàn tay phải, bao gồm các miền “thumb,” “palm,” and “fingers”. Miền palm có chức năng xúc tác phản ứng chuyển hóa phosphoryl. Trong khi đó, miền finger đảm nhận các tương tác quan trọng với các nucleoside triphosphate của mạch khuôn DNA. Miền thumb đóng vai trò xác định vị trí DNA xoắn kép, thúc đẩy quá trình dịch chuyển và gắn nucleotide của DNA polymerase (processivity). Nghiên cứu của Kim và cộng sự, 2008 đã so sánh sự tương đồng trong cấu trúc của Pfu DNA polymerase với KOD1 DNA polymerase (polB). Ngoài 3 thành phần quan trọng là các miền “fingers, palm, thumb” các DNA polymerase này còn có vùng exonuclease và N-terminal là những vùng có ý nghĩa quan trọng cho ứng dụng công nghệ sinh học [23]. 1.1.3. Quá trình sao chép DNA Quá trình sao chép DNA là sự kiện quan trọng diễn ra trong mỗi chu kỳ của tế bào [37] có sự tham gia của một bộ máy sao chép. Trong đó, các thành phần chính đã biết có sự tương tác với nhau và với các protein khác (hình 2). 2 Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền Hình 2: Thành phần phức hệ sao chép DNA (replisome) ở vi khuẩn Cổ Nghiên cứu bởi Li và cộng sự [27], 2010 đã tinh sạch các protein này bằng phương pháp dung hợp đuôi 6xHis-tag và tinh sạch sắc ký ái lực ở Thermococcus kodakarensis. Trong đó, leading strand: mạch tổng hợp liên tục; lagging strand: mạch tổng hợp gián đoạn. Các thành phần của phức hệ này bao gồm enzyme DNA polymerase PolB, polD liên kết kháng nguyên nhân tế bào tăng sinh (PCNA) tổng hợp nên các đoạn DNA mới; enzyme DNA ligase cũng liên kết với PCNA nối các đoạn tổng hợp ngược chiều tháo xoắn; còn enzyme Fen I liên kết PCNA sửa chữa trình tự tổng hợp; với sự trợ giúp của các enzyme MCM phức hệ protein duy trì liên kết với enzyme tháo xoắn helicase; GINS: liên kết trực tiếp với MCM-helicase và primase enzyme tổng hợp đoạn RNA ngắn; RPA: protein ngăn chặn sự đóng xoắn trở lại của sợi đơn). Nhìn chung, các phức hệ sao chép DNA được duy trì khả năng hoạt động dựa trên những nguyên tắc chung ở cả ba giới vi khuẩn thông thường (bacteria), vi khuẩn Cổ (archaea), và sinh vật nhân thực (eukaryotes). Trong số các sinh vật nhân sơ, bộ máy sao chép của vi khuẩn Cổ được xem là ít phức tạp hơn nhưng lại gần gũi với sinh vật nhân chuẩn hơn so với các loại vi khuẩn thông thường. Thành phần chính được mô tả và có chức năng giống nhau giữa chúng là các DNA polymerase như pol α tương ứng polB hoặc polD; pol δ, ε tương ứng với enzyme Fen I. 1.2. Ứng dụng của DNA polymerase Hai kỹ thuật PCR và giải trình tự là những kỹ thuật cốt lõi trong nghiên cứu di truyền học. Đặc biệt được ứng dụng trong các lĩnh vực khoa học và sự sống như: (1) trong Sinh học: bảo tồn sự đa dạng động thực vật, bảo tồn nguồn gen quý; (2) trong y học: phân tích đánh giá khả năng mắc các bệnh di truyền; (3) trong khoa học pháp y: nhận biết các dấu chuẩn di truyền (STR), các đoạn lặp, tìm kiếm đa hình; (4) trong nông nghiệp: tạo giống cây trồng vật nuôi có hiệu quả kinh tế; (5) trong vi sinh vật với môi trường: nghiên cứu khả năng tiến hóa, mức độ lây lan ảnh hưởng tới con người và các sinh vật khác. DNA polymerase đóng vai trò quan trọng trong cả hai kỹ thuật trên. Cùng với sự phát triển nhanh chóng của các công ty công nghệ 3 Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền sinh học, đã đặt ra những thách thức trong quá trình sản xuất enzyme DNA polymerase có chất lượng tốt đáp ứng nhu cầu nghiên cứu và ứng dụng. 1.2.1. Kỹ thuật giải trình tự Giải trình tự DNA/RNA là một ứng dụng quan trọng trong sinh học của DNA polymerase. Phương pháp giải trình tự bằng enzyme đã được Frederick Sanger tiến hành vào năm 1975 bằng cách sử dụng sự kết thúc chuỗi [36]. Từ đó, việc giải trình tự DNA/RNA trở thành thông lệ trong các nghiên cứu sinh học phân tử. Các công nghệ giải trình tự thế hệ kế tiếp (NGS) đã được phát triển và liên tục cải tiến từ năm 2005 đến nay. Bảng 1: Phân loại DNA polymerase ứng dụng giải trình tự Được tổng hợp bởi Chen-Yao, 2014 [5] Họ A Bacteria (E. coli) Pol I Eukaryote (Human) Archaea Viruses Enzyme Pol γ (p140/p55/p55) N.A. T3, T5, T7 Klenow, KlenTaq, Taq Pol θ (p100/p90/p80) Bst, Bsu, T7 Pol ν B Pol II Pol α/primase Pol BI HSV-1 T4, Ф29, 9 N, KOD1 (p180/p68/pri2/pri1) Pol BII RB69, T4 Pfu, Vent Pol δ (p125/p66/p50/p12) Pol BIII Ф29 N.A N.A. N.A. N.A. N.A. Pol D N.A. N.A. Pol ε (p260/p59/p17/p12) Pol ζ (p350/p24) C D Pol III core (α/ε/θ) *N.A. DP2/DP1 N.A.: không có DNA polymerase là thành phần khác biệt trong việc cải tiến các công nghệ giải trình tự. Ban đầu, giải trình tự Sanger sử dụng enzyme Klenow (một phần phân tách DNA-pol I của E. coli) để kết hợp hiệu quả với 2 ′, 3′-dideoxynucleotide (ddNTPs) dẫn đến chấm dứt chuỗi tổng hợp DNA (Atkinson và cộng sự, 1969). Tiếp theo với sự cải tiến hóa học, các chất nền nucleotide được sử dụng để giải trình tự DNA trở nên lớn hơn và cồng kềnh hơn, enzyme Klenow ban đầu không còn kết hợp hiệu quả các cơ chất mới [5]. Thay vào đó, sự đa dạng của DNA polymerase được sử dụng và thiết kế riêng cho các công nghệ giải trình tự tiếp theo. Hiện nay, các polymerase bền nhiệt họ polA, pol B đã và đang được cải biến, thử nghiệm trên các thiết bị điện di mao quản (CE) và NGS. 4 Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền 1.2.2. Kỹ thuật PCR Kỹ thuật nhân bản gen bằng phương pháp PCR là ứng dụng tiềm năng nhất của các DNA polymerase bền nhiệt (bảng 2) được phát triển bởi Kary Mullis và cộng sự, 1986 [20]. Như phân loại ở trên, DNA-pol thể hiện sự đa dạng rất cao về chủng loại cũng như đặc tính của chúng. Hiện nay, khoảng hơn 50 loại khác nhau của nhóm DNA-polB bền nhiệt đã được phân lập và xác định hoạt tính [31]. Bảng 2: Đặc tính của một số enzyme DNA polymerase bền nhiệt Được tổng hợp bởi Kay Terpe, 2013 [40] Tên loài Crenarchaeota Sulfolobus solfataricus Euryarchaeota Pyrococcus furiosus Pyrococcus GB-D Pyrococcus abyssi Pyrococcus woesei Thermococcus kodakarensis Thermococcus litoralis Thermococcus gorganarius Bacteria Thermus aquaticus Thermus brokianus Thermus caldophilus DNA-pol Họ Chịu nhiệt Tỉ lệ sai sót Kéo dài (kb/phút) Đọc sửa Đầu thò Dpo4 Y NP 8x10-3 – 3x10-4 NP _ NP Pfu B 95oC/1h 0.5 – 1.5 + Bằng Deep Vent B 95oC/23h 1.4 + 95% bằng Isis B 100oC/5h NP + Bằng Pwo B 100oC/2h NP NP + Bằng KOD1 B 95oC/12h 2.6 (x10-6) 6.0-7.8 + Bằng Vent B 95oC/6.7h 1.0 + 95% bằng Tgo B 95oC/2h 1.5 + Bằng Taq A 95oC/40’ 1.8x10-4 – 8.0x10-6 1.0 – 4.8 _ 95% 3'A Tbr A 96oC/150’ NP NP _ 3'A Tca A 95oC/70’ NP 1.0-2.3 _ 3'A 2.2 – 0.7 (x10-6) 12 – 2.7 (x10-6) 6.7 – 0.6 (x10-6) 45 – 2.8 (x10-6) 5.6 – 3.5 (x10-6) NP: Chưa công bố DNA-polB hay còn được gọi là enzyme DNA polymerase thế hệ mới có đặc tính đọc sửa 3’ – 5’ exonuclease giúp quá trình nhân bản DNA diễn ra chính xác hơn khi so sánh với Taq-pol (thế hệ enzyme bền nhiệt đầu tiên, có nguồn gốc từ Thermus aquaticus). Các nhà nghiên cứu đã nhận ra rằng các loại DNA-polB của vi khuẩn Cổ đã giải quyết vô số vấn đề gặp phải với Taq-pol như (1) dễ mắc lỗi sao chép khi nhân những đoạn DNA lớn; (2) hạn chế kích thước đoạn DNA nhân lên được; (3) hiệu suất PCR giảm do sự bắt cặp không khớp của mồi; (4) sự kết hợp không theo khuôn mẫu của dAMP khi kết thúc tái bản, một nu A luôn được duy trì ở đầu của mỗi sản 5 Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền phẩm PCR. Bên cạnh đó, các nghiên cứu động học tiết lộ rằng độ chính xác cao của các loại DNA-polB phụ thuộc rất nhiều vào sự kết hợp nucleotide chính xác cùng với khả năng đọc sửa exonucleoytic. Do đó, DNA-polB của vi khuẩn Cổ đã được phát triển để tự xúc tác các phản ứng PCR với hiệu quả cao ngay cả khi có mặt của chất ức chế. Đồng thời, các loại DNA-polB của vi khuẩn Cổ thường có độ sai sót thấp (khả năng đọc sửa 3’-5’ proofreading) nên được ứng dụng chính trong gây đột biến trực tiếp. So sánh các DNA-pol từ Thermococcus và Pyrococcus có tỷ lệ lỗi trung bình thấp khoảng 10-6 (bảng 2). Trong đó, KOD1-pol có hiệu suất PCR tốt hơn về các tiêu chí như (1) kéo dài và tổng hợp sợi DNA nhanh hơn (extension rate); (2) hoạt động xúc tác hiệu quả hơn (higher processivity); (3) thể hiện hiệu suất vượt trội trong cả hai loại phản ứng PCR thông thường và real time PCR. Tuy nhiên, chi phí sản xuất hoặc sử dụng enzyme này thường rất cao. Vì vậy Pwo-Pol của vi khuẩn thuộc chi Pyrococcus được sử dụng phổ biến hơn bởi độ bền cao, và cũng có độ chính xác tương đương KOD1-pol. 1.3. Tình hình nghiên cứu Pwo DNA polymerase 1.3.1. Phân loại nguồn gốc Pwo DNA polymerase có nguồn gốc từ vi khuẩn Cổ Pyrococcus woesei thuộc chi Pyrococcus được mô tả bởi Zillig và cộng sự, 1987 [46]. P. woesei là một trong những vi sinh vật ái cực đoan (extremophile) có khả năng sinh trưởng và phát triển trong những điều kiện khắc nghiệt nhất với nhiệt độ khoảng từ 95-103oC. Thermococcales Hình 3: Cây phát sinh của nhóm vi khuẩn Cổ chịu nhiệt Được xây dưng dựa trên trình tự gen 16S rRNA bằng phần mềm MEGA-7, chỉ ra 2 nhóm ngành chính: Crenarchaeota (nhánh màu đỏ) và Euryarchaeota (nhánh màu xanh) tách biệt với vi khuẩn suối nước nóng T. aquaticus. Trong đó, nhóm ngành Crenarchaeota bao gồm hầu hết các loài được phân lập có khả năng chịu nhiệt cao trên 80oC [8]. 6 Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền Hệ gen của P. woesei có sự tương đồng với các loài khác thuộc chi Pyrococcus (hình 3). Theo thống kê, các trình tự của P. woesei đã công bố trên ngân hàng gen (28857 bp) bao gồm 22 gen đơn lẻ và 1 cụm ba gen (X59857). Khi so sánh các trình tự này với các loài trong chi Pyrococcus thấy tỉ lệ tương đồng cao, giống đến 99% với các gen tương ứng của P. furiosus. Một nghiên cứu khác đã tiến hành phân tích microarray DNA kết hợp PCR trên tổng số 2065 khung đọc mở (ORF) của P. woesei. Kết quả đem so sánh với hệ gen của P. furiosus cho thấy 105 ORF tương đồng bị thiếu trên hệ gen của P. woesei. Các cụm gen thiếu này bao gồm một cụm (Mal I, PF1737 - PF1751) liên quan đến chuyển hóa maltose và một cụm khác (PF0691 - PF0695) giúp loại bỏ các loại nitơ trong phản ứng độc hại. So sánh với các loài khác trong cùng chi Pyrococcus là P. horikoshii và P. abyssi, độ tương đồng khoảng 75%, do chúng không có gen mã hóa amylase cũng như không có các yếu tố IS [19, 34]. 1.3.2. Nghiên cứu biểu hiện Pwo DNA polymerase tái tổ hợp Pwo DNA polymerase là một trong những enzyme bền nhiệt đã được nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp ở vi khuẩn E. coli. Các công bố này chỉ ra, Pwo-pol tái tổ hợp có khả năng gây độc đối với tế bào biểu hiện E. coli BL21 (DE3). Để khắc phục vấn đề này, quá trình tối ưu biểu hiện Pwo-pol đã được tiến hành trên trên tế bào vật chủ E. coli BL21 (DE3) plysS [6, 12]. Tuy nhiên, tất cả các nghiên cứu đều chưa có đánh giá nhiều về đặc tính của protein tái tổ hợp này (bảng 2). Pwo DNA polymease tự nhiên mang nhiều đặc tính nổi trội của nhóm enzyme bền nhiệt. Do đó, việc phân tích các đặc tính của protein Pwo-pol ở trong tự nhiên sẽ giúp đánh giá chính xác hoạt tính của protien Pwo-pol tái tổ hợp trong nghiên cứu. Tương tự các DNA polymerae khác Pwo-pol cần một co-factor là các ion Mg2+ hoặc Mn2+ để có thể xúc tác trong suốt quá trình. Lượng ion Mg2+ hoặc Mn2+ sẽ bị mất đi nếu enzyme bị ức chế hoặc bất hoạt trong giai đoạn diễn ra phản ứng bởi các chất gây ức chế như phospholipit, EDTA, phenol… Một phản ứng PCR với xúc tác enzyme Pwo-pol có thể được tối ưu từ 1 – 10 mM MgSO4, 100 – 300 µM dNTP mỗi loại [1]. 7 Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền 1.3.3. Các đặc tính quan trọng của DNA polymerase dùng cho PCR Khả năng bền nhiệt (Thermostability): đây là một trong những yếu tố cần thiết cho phản ứng khuếch đại DNA. Trong mỗi chu kỳ đều có bước biến tính làm tách mạch DNA bằng nhiệt độ cao (từ 94-98oC). Tính chất bền nhiệt của DNA polymerase phụ thuộc vào thời gian half-life của nó tại nhiệt độ cao nhất định. Cụ thể Pwo-pol có thời gian half-life lên đến 2h tại 100oC [6]. Thời gian bền nhiệt cũng phụ thuộc vào nồng độ protein hoặc một số điều kiện khác như các chất tẩy rửa (DTT, Tween 20), betaine (BSA) và đường. Chưa có nhiều chứng minh độ pH hay nồng độ muối ảnh hưởng đến tính bền nhiệt của ezyme DNA polymerase. Tốc độ kéo dài chuỗi (Extension rate): đại diện cho số lượng dNTPs trùng hợp mỗi giây trên mỗi phân tử DNA polymerase. Tốc độ kéo dài chuỗi DNA phụ thuộc mạnh mẽ vào môi trường phản ứng và khuôn mẫu DNA. Một số phân tử DNA có trình tự giàu GC, thậm chí có thể hình thành các cấu trúc ngăn chặn sự kéo dài mồi. Tốc độ kéo dài của Pwo-pol sẽ tương tự với Pfu-pol khoảng 0.5-1.5 kb/phút, thấp hơn 5-10 lần enzyme Tkod-pol [40]. Tốc độ kéo dài chuỗi không xem xét đến khả năng bám cũng như đọc sửa của của DNA polymerase ở trạng thái ổn định. Tốc độ kéo dài như là sự khác biệt giữa tốc độ trùng hợp và loại bỏ các nucleotide ở đầu 3’. υext ~ κpol – κexo Đặc tính xử lý trình tự (Processivity): là xác suất, sau khi gắn nucleotide, polymerase sẽ không tách khỏi DNA khi chuyển sang vị trí tiếp theo. Hình 4: Cơ chế cạnh tranh động học cho một DNA polymerase Được nghiên cứu bởi Pavlov và cộng sự, 2004 [31]. 8 Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền DNA polymerase nằm trên một điểm liên kết khuôn mẫu với primer (hình 4). Các hằng số tốc độ bậc một tương ứng: κpol (bổ sung nucleotide); κexo (cắt bỏ nucleotide); κoff (phân ly polymerase từ phân tử DNA). Khi đó, giá trị processivity của chúng được tính theo công thức: P = (κpol – κexo) / (κpol + κexo) + (κpol – κexo) / (κpol + κexo + κoff) Tương tự như khả năng kéo dài chuỗi, giá trị của P phụ thuộc vào trình tự DNA khuôn và thành phần phản ứng ví dụ như nồng độ muối. Hầu hết các enzyme DNA-polB có khả năng xử lý trình tự không cao khoảng từ 4-30 nucleotide/1 lần bám của DNA polymerase [40]. Điều này gây ra hạn chế với nhóm enzyme này trong một số ứng dụng sao chép DNA plasmid. Một phương pháp hiệu quả để cải thiện nhược điểm này là các DNA-pol lai được dung hợp với một phần protein khác có khả năng bám DNA tốt (như Sso7d). Sự chính xác (Fidelity): là một đặc tính của DNA polymerase, thể hiện số nucleotide được chèn chính xác sau mỗi lần chèn sai. Khả năng này cũng được hiểu là hiệu quả xúc tác cho những cơ chất biến đổi của DNA polymerase. Nếu DNA polymerse có khả năng xúc tác hiệu quả cao thì sự chính xác trong quá trình chèn nucleotide càng cao và ngược lại. Tốc độ đọc sai (Error-rate): Đối với các enzyme DNA polymerase bền nhiệt, chúng có khả năng đọc sửa (proofreading) nhờ hoạt động exonuclease theo chiều 3’-5’ để khắc phục nhược điểm chèn sai [43]. Tần số sai sót (đột biến) của Pwo-pol sau mỗi lần nhân đôi khoảng 10-6 thấp hơn 18 lần so với Taq-pol có sự sai sót từ 1.8x10-4 – 8.0x10-6 [40]. Các thành phần đệm PCR và điều kiện chu trình nhiệt có thể ảnh hưởng đến độ chính xác của DNA polymerase theo các cách khác nhau hoặc ở các mức độ khác nhau. Ví dụ, mặc dù các ion magie được xem như là co-factor giúp DNA polymerase xúc tác tổng hợp nucleotide chính xác, nhưng lượng magie dư thừa sẽ làm giảm độ chính xác của chúng. Nồng độ nucleotide không đồng đều cũng sẽ làm giảm độ chính xác vì sự kết hợp sai của nucleotide nồng độ cao hơn sẽ xảy ra thường xuyên hơn. Các điều kiện chu trình nhiệt như làm biến tính DNA đến nhiệt độ cao trong thời gian dài có thể dẫn đến việc giải phóng các bazơ từ chuỗi liên kết phosphodiester, dẫn đến những sai sót [21]. 9 Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền 1.4. Công nghệ protein tái tổ hợp 1.4.1. Tổng hợp gen, tối ưu mã codon Hiện nay, các nhà khoa học có thể dễ dàng truy cập các dữ liệu tin sinh nhằm khuếch đại và tổng hợp một đoạn trình tự gen đích của đối tượng nghiên cứu. Theo thống kê trên ngân hàng dữ liệu trình tự của NCBI, đã lưu trữ hệ gen của gần 50 nghìn loài sinh vật khác nhau trong đó bao gồm Eukaryotes (9631 trình tự); Prokaryotes (220559 trình tự); Viruses (33870 trình tự); Plasmids (19175 trình tự); Organelles (15058 trình tự). Từ nguồn dữ liệu quý giá này, các nhà khoa học tiếp tục phát triển nghiên cứu cấu trúc và chức năng của protein được mã hóa. Tổng hợp gen Tổng hợp gen de novo là một công cụ thiết yếu trong các nghiên cứu sinh học như tương tác protein nucleic acid, đột biến gen được định hướng và tối ưu hóa việc sử dụng codon để biểu hiện gen từ các trình tự đã biết. Một số phương pháp sinh học phân tử như cắt enzyme giới hạn [29], enzyme nối ligase [11], sau đó khuếch đại bằng PCR hoặc chèn vào vector nhân dòng để biểu hiện protein tái tổ hợp [30]. Tuy nhiên, quá trình này thường tạo ra các sản phẩm phụ hoặc không mong muốn do đột biến. Gen mã hóa protein Pwo-pol sử dụng trong nghiên cứu này được tổng hợp dựa trên quy trình lắp ráp oligonucleotide POS (patch oligonucleotide synthesis) như hình 5 bao gồm 3 bước chính: Phosphorylation, Ligase Chain Reaction, Polymerase Chain Reaction. POs là một trong những phương pháp tổng hợp gen nhanh chóng và chính xác nhất. Bước 1: Phosphorylation Bước 2: LCR Bước 3: PCR Hình 5: Sơ đồ minh họa các bước tổng hợp gen bằng phương pháp POS Được nghiên cứu bởi Yang và cộng sự, 2011 [42] 10