Tài liệu Nhân chủng virus cúm ah5n1 tạo lô chủng làm việc dùng trong sản xuất vắc xin cúm

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án này, Trước hết em xin gửi tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, phòng Đào tạo Đại học và Ban Giám đốc Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường lời cảm ơn, lòng tự hào vì đã được học tập tại trường trong những năm qua. Em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Thị Lan Phương – Trưởng phòng Kiểm Định – Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế và TS. Vũ Ngọc Bội – Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn, động viên em trong suốt thời gian thực hiện đồ án vừa qua. Xin cảm ơn CN. Trần Ngọc Nhơn, CN. Nguyễn Thị Thúy Hằng, CN. Đinh Thị Huấn cùng toàn thể các cán bộ viên chức phòng Kiểm Định - Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian thực hiện đồ án vừa qua. Cuối cùng, em xin cảm ơn cha mẹ, bạn bè đồng nghiệp và toàn thể quí thầy cô trong Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường đã dạy dỗ và tạo điều kiện về vật chất và tinh thần cho em trong suốt thời gian vừa qua. Nha trang, tháng 6, năm 2012 Nguyễn Thị Thu Huyền i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ..............................................................................................................i MỤC LỤC....................................................................................................................i DANH MỤC CÁC BẢNG .........................................................................................iv LỜI MỞ ĐẦU .............................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................................3 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÚM GIA CẦM ....................................................................3 1.2. TÌNH HÌNH BỆNH CÚM A/H5N1 Ở NGƯỜI TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM ..............................................................................................................4 1.2.1. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 ở người trên thế giới hiện nay .......................4 1.2.2. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 tại Việt Nam..................................................6 1.3. TÁC NHÂN GÂY BỆNH .................................................................................8 1.3.1. Đặc điểm sinh học của Virus cúm A/H5N1 .................................................8 1.3.2. Độc lực và tính thích ứng vật chủ ..............................................................10 1.3.3. Đường xâm nhập và lây bệnh của bệnh cúm A/H5N1................................11 1.3.4. Đặc điểm kháng nguyên – miễn dịch .........................................................15 1.4. SẢN XUẤT VẮC XIN PHÒNG BỆNH CÚM A/H5N1. .................................19 1.4.1. Tình hình sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 cho người ở Việt Nam ...............19 1.4.2. Chủng NIBRG-14 trong sản xuất vắc xin cúm...........................................20 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........24 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .........................................................................24 2.2. VẬT LIỆU ......................................................................................................24 2.3. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ ...................................................................................24 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................25 2.4.1. Phương pháp tạo chủng làm việc từ chủng gốc NIBRG-14 (MSL) ............25 2.4.2. Phương pháp kiểm tra chất lượng ..............................................................29 2.4.2.1. Xác định liều gây nhiễm EID50...........................................................29 ii 2.4.2.2. Xác định hiệu giá HA (Haemaagglutinin: phản ứng ngưng kết hồng cầu) .........................................................................................................30 2.4.2.3. Kiểm tra vô trùng ................................................................................32 2.4.2.4. Phát hiện Mycoplasma........................................................................32 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................35 3.1. NHẬN DẠNG VÀ XÁC ĐỊNH HIỆU GIÁ CHỦNG CỦA CHỦNG VIRUS NIBRG-14 .................................................................................................35 3.1.1. Xác định các đặc điểm nhận dạng:.............................................................35 3.1.1.1. Tính chất gây ngưng kết hồng cầu .......................................................35 3.1.1.2. Giải trình tự gen xác nhận đoạn gen H5 không độc tính và gen N1 của chủng virus NIBRG-14 (MSL) ..................................................................36 3.1.1.3. Hiệu giá EID50 gây nhiễm trên trứng gà có phôi của chủng NIBRG-14 (MSL)............................................................................................39 3.1.2.Xác định liều gây nhiễm tối ưu (Optimal Infectious Dose) của chủng MSL trên trứng gà có phôi ..................................................................................40 3.2. SẢN XUẤT VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CỦA LÔ CHỦNG LÀM VIỆC (WSL) ĐƯỢC NHÂN TRUYỀN TỪ CHỦNG NIBRG-14 (MSL)...............42 3.2.1. Kết quả sản xuất vắc xin............................................................................42 3.3.2. Kết quả đánh giá chất lượng của lô chủng WSL được nhân truyền từ chủng NIBRG-14 nguyên gốc .............................................................................43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................................48 1.KẾT LUẬN.........................................................................................................48 2.KIẾN NGHỊ ........................................................................................................48 TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................49 PHỤ LỤC iii CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN EID50 : Effective Infection Dose 50 (Liều gây nhiễm 50%) FAO : Food and Agriculture Organization (Tổ chức Nông lương thế giới) HA : Haemagglutinin (Kháng nguyên ngưng kết hồng cầu – Kháng nguyên HA) HPAI : Highly pathogenic avian influenza (chủng virus cúm gia cầm độc lực cao) LM1 : Liquit Medium 1 LM2 : Liquit Medium 2 LPAI : Low pathogenic avian influenza (Chủng virus cúm gia cầm độc lực thấp) NA : Neuraminidase (Kháng nguyên neuraminidase) NP : Nucleo Protein NIBSC : National Institute for Biological Standards and Control (Viện Quốc gia về tiêu chuẩn và Kiểm định Sinh học, Anh) OIE : Office International Epizoot (Tổ chức Thú y thế giới) PBS : Phosphate Buffer Saline (Dung dịch đệm) PR8 : Chủng virus cúm A/H1N1/ có nguồn gốc từ Puerto Rico RNP : Ribo Nucleo Protein SA : Sialic Acid TSA : Tryp Soyabeen Agar (Môi trường thạch) TSB : Tryp Soyabeen Broth (Môi trường) WHO : World Health Organization - Tổ chức Y Tế Thế giới (TCYTTG) WSL : Working Seed Lot (Chủng làm việc) iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Cách tính EID50 của liều gây nhiễm..........................................................30 Bảng 2.2. Thành phần cho 1 mẫu phản ứng PCR ......................................................34 Bảng 3.1. Kết quả chuẩn độ hiệu giá virus của chủng MSL .......................................40 Bảng 3.2. Kết quả xác định liều gây nhiễm tối ưu chủng MSL trên trứng gà có phôi ...........................................................................................................................41 Bảng 3.3. Các thông số trong qui trình sản xuất lô chủng WSL..................................42 Bảng 3.4: Kết quả kiểm tra hiệu giá HA ....................................................................46 Bảng 3.5: Kết quả liều gây nhiễm EID50 của chủng sản xuất ....................................46 Bảng 3.6. Kiểm tra tính ổn định về hiệu giá HA và hiệu giá chủng EID50 .................47 của lô P2 và P3 ..........................................................................................................47 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở người từ năm 2003 đến nay. ........................5 Hình 1.2. Các giai đoạn phát triển dịch cúm A/H5N1 ..................................................6 Hình 1.3. Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở nước ta từ năm 2003 đến nay .......................7 Hình 1.4. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B), và phức hợp ribonucleoprotein RNP (C) của virus cúm A ...............................................................8 Hình 1.5. Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào chủ. ....13 Hình1.6. Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật chủ của virus cúm A ........15 Hình1.7. Sơ đồ minh họa đột biến điểm của hiện tượng “ kháng nguyên” (antigenic drift) (A) và đột biến tái tổ hợp của hiện tượng “trộn kháng nguyên” (antigenic shift) ở virus cúm A (B). ..........................................................................18 Hình 1.8. Bằng kĩ thuật di truyền ngược chủng gốc NIBRG-14 được tạo ra từ 6 gen của virus A/PR8/34(H1N1) và 2 gen của virus A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), trong đó gen HA bị đột biến mất đoạn để giảm độc lực, cho phép virus này tái tổ hợp này nhân lên bằng công nghệ phôi trứng gà .........................................22 Hình 2.1. Hình ảnh về quá trình đánh dấu vị trí tiêm..................................................26 Hình 2.2. Hình ảnh về quá trình đục lỗ điểm tiêm ......................................................26 Hình 2.3. Hình ảnh về quá trình tiêm chủng vào dịch niệu đệm của trứng..................26 Hình 2.4. Hình ảnh về quá trình hàn điểm tiêm bằng parafin......................................26 Hình 2.5. Hình ảnh về quá trình cắt vỏ trứng tại vùng buồng khí ...............................27 Hình 2.6. Hình ảnh về quá trình dùng pipette Pasteur hút dịch niệu trong từng trứng..........................................................................................................................27 Hình 2.7. Hình ảnh về quá trình cho dịch niệu vào 1 tube vô khuẩn ...........................27 Hình 2.8. Hình ảnh về quá trình cho dịch niệu vào tube cryo bảo quản đông băng .....27 Hình 2.9. Sơ đồ nhân tạo chủng WSL ........................................................................28 Hình 2.10. Sơ đồ phản ứng ngưng kết hồng cầu.........................................................31 Hình 2.11. Sơ đồ chu trình nhiệt: ...............................................................................34 Hình 3.1. Kết quả kiểm tra HA chủng virus cúm NIBRG-14 .....................................35 vi Hình 3.2. Kết quả thu nhận các đoạn DNA của các gen N1 và gen H5 bằng kỹ thuật PCR từ virus có nguồn gốc khác nhau...............................................................37 Hình 3.3. Kết quả so sánh trình tự gen H5 đột biến bằng kỹ thuật di truyền ngược của chủng NIBRG-14 với chủng VN/1194/2004 (H5N1) tự nhiên. Gen H5 của chủng NIBRG-14 được đột biến từ gen H5 của chủng /Vietnam/1194/2004(H5N1) của Việt Nam thông qua làm mất đoạn 12 nucleotide tương đương với 4 amino acid RRRK thuộc đoạn gen có độc tính cao và 3 đột biến điểm đổi A thành C nhằm ngăn ngừa khả năng tái hợp của đoạn gen có độc lực cao này. ....................................................................................................38 Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự đoạn gen N1 của chủng di truyền ngược NIBRG-14 làm vắcxin và chủng A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) tự nhiên. Trình tự nucleotide của đoạn gen N1 đã kiểm tra ở hai chủng hoàn toàn giống nhau ...........39 Hình 3.5. Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma trên môi trường canh thang LM1 và LM2...........................................................................................................................44 Hình 3.6. Kết quả kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma bằng PCR ...................................45 1 LỜI MỞ ĐẦU Từ trường hợp nhiễm virus cúm A/H5N1 đầu tiên được phát hiện tại Hồng Kông tháng 5 năm 1997 đến nay, dịch cúm A/H5N1 trên người đã lan sang nhiều quốc gia trên thế giới. Cho đến nay, vẫn chưa có một bằng chứng nào cho thấy có sự lây truyền virus trực tiếp từ người sang người. Tuy nhiên, các chuyên gia khẳng định việc virus cúm A/H5N1 lây nhiễm trực tiếp từ người qua người chỉ là vấn đề thời gian. Điều này đã cảnh báo về nguy cơ của một đại dịch cúm A/H5N1 trên người gần kề và buộc các nhà khoa học trên thế giới phải nhanh chóng tìm ra phương thức phòng bệnh hiệu quả. Vắc xin luôn được coi là phương thức hiệu nghiệm nhất trong việc phòng chống, giảm tỷ lệ mắc bệnh và chết do virus cúm gây ra. Tuy vắc xin cúm đã được sản xuất từ thập niên 60 nhưng chỉ tập trung ở các nước Châu Âu và Bắc Mỹ. Với năng lực sản xuất vắc xin của thế giới hiện nay là 300 triệu liều/năm, nếu đại dịch cúm trên người xảy ra thì lượng vắc xin này chỉ có thể đáp ứng cho khoảng 10% dân số thế giới. Trước tình hình đó, Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) khuyến cáo tất cả các nước, đặc biệt các quốc gia Châu Á, chủ động nghiên cứu và sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 để có thể kịp thời cung ứng cho nhu cầu bảo vệ sức khỏe cộng đồng khi xảy ra đại dịch. Hiện nay vắc xin cúm gia cầm H5N1 được sản xuất dùng trong công nghệ nuôi cấy virus trên phôi gà 9 – 11 ngày tuổi. Việc xác định được nồng độ virus gây nhiễm, nhiệt độ nuôi cấy, thời gian thu hoạch thích hợp để có thể thu được dịch niệu với hiệu giá virus cao và ổn định là yếu tố quyết định đến thành công và đảm bảo tính kinh tế khi sản xuất vắc xin cúm. Việc sản xuất vắc xin hay các chế phẩm sinh học đều phải tuân thủ các qui trình sản xuất rất nghiêm ngặt theo qui định của TCYTTG, trong đó hệ thống chủng giống là một trong những yêu cầu bắt buộc đầu tiên. Các chủng sản xuất vắc xin cúm nói chung và vắc xin cúm A/H5N1 nói riêng phải là các chủng chuẩn (reference) do TCYTTG cung cấp. Từ các ống chủng này, nhà sản xuất phải tự thiết lập ngân hàng chủng giống cho sản xuất theo đúng trình tự và qui định của TCYTTG. Hiệu quả của vắc xin phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng giống virus, đặc biệt tính tương đồng của chủng virus vắc xin với chủng virus gây bệnh và hàm lượng protein HA chứa trong 2 liều vắc xin. Người ta đã chứng minh được nếu trình tự các axit amin giữa chủng vắc xin và chủng gây bệnh giống nhau khoảng 87% là có mối tương quan rất rõ đến hiệu quả phòng bệnh. Để đạt mục tiêu nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 có hiệu quả bảo vệ cao và an toàn cho người sử dụng, một trong những mục tiêu đầu tiên là xây dựng hệ thống chủng giống dùng cho sản xuất an toàn và ổn định. Với ý nghĩa trên chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu “Nhân chủng virus cúm A/H5N1 (NIBRG-14) tạo lô chủng làm việc dùng trong sản xuất vắc xin cúm” Mục đích của đề tài: Tạo lô chủng làm việc (WSL) từ chủng virus cúm NIBRG- 14 (A/H5N1) do TCYTTG cung cấp để sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 tại Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế, đạt yêu cầu chất lượng theo qui định. Nội dung nghiên cứu: - Nhận dạng và xác định hiệu giá của chủng virus cúm A/H5N1 (NIBRG-14). - Sản xuất và đánh giá chất lượng của lô chủng làm việc (WSL) được nhân truyền từ chủng NIBRG-14 (WSL). Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo hẳn còn có các hạn chế, em rất mong nhận được các ý kiến góp ý của quí thầy cô và bạn bè đồng nghiệp để báo cáo thêm hoàn chỉnh. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÚM GIA CẦM Cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm, do nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra, có khả năng lan truyền từ động vật sang người. Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA (H1 - H16) và 9 phân type NA (N1 - N9) có khả năng tái tổ hợp để tạo nên hàng trăm phân type khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh. Virus H5N1 thể độc lực cao (HPAI) vẫn đang là mối đe dọa cho chăn nuôi và sức khỏe cộng đồng. Từ cuối năm 2003 đến tháng 6/2008, thế giới đã có 385 trường hợp mắc cúm A/H5N1, trong đó có 243 trường hợp đã tử vong, chiếm 63,11%. Việt Nam và Indonesia là hai quốc gia có số người nhiễm và tử vong cao nhất [19], [24], [29]. Không giống như dịch cúm A/H5N1 giai đoạn 1996 - 2002, chúng ta có thể khống chế dịch bằng cách tiêu diệt và loại trừ các loài gia cầm bị nhiễm bệnh trong vùng dịch để cắt đứt đường lây truyền. Virus cúm A/H5N1 trong giai đoạn từ 2003 đến nay là thể có độc lực cao, với sự xuất hiện nhiều genotype khác nhau, đặc biệt là genotype Z, lan truyền từ Nam Trung Quốc đến các nơi khác trên thế giới. Tính gây bệnh của virus A/H5N1 thể độc lực cao không chỉ giới hạn ở chức năng điểm cắt protease của HA và hoạt tính của NA, mà là hiệu ứng của sản phẩm đa gen và khả năng tái tổ hợp tạo virus mới với đặc tính gây bệnh và độc lực khác nhau là vấn đề cần tính đến. Trong thời gian này, đặc biệt là trong 5 năm gần đây trên thế giới có hàng ngàn công trình nghiên cứu về cúm A và cúm A/H5N1 thậm chí là nghiên cứu phát triển công nghệ sản xuất vắc xin gây miễn dịch cho gia cầm và để chuẩn bị cho đại dịch có thể xảy ra ở người. Về phương diện dịch tễ, tiến hóa, tạo biến chủng, biến đổi kháng nguyên - miễn dịch, tính mẫn cảm và đề kháng với dược liệu, khác với nhiều virus khác ở gia cầm, virus cúm A/H5N1 có xu hướng đột biến nhanh để tạo nên nhiều biến chủng phân chia thành nhiều phân dòng khác nhau và có tính thích ứng phổ rộng đối với vật chủ. Bệnh cúm được Hippocrates mô tả lần đầu tiên vào năm 412 trước công nguyên tại Hy Lạp là bệnh nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính. Bệnh xảy ra theo chu kỳ và 4 thường gây dịch với quy mô khác nhau. Ở vùng ôn đới, các đợt phát dịch thường xảy ra vào mùa đông hằng năm. Ngược lại, ở các vùng nhiệt đới, bệnh cúm xảy ra quanh năm, bùng phát bất ngờ và lan rộng thành các vụ dịch. Trận dịch cúm đầu tiên trong lịch sử là dịch năm 1580, bắt đầu từ châu Á lan sang châu Phi và đến châu Âu. Tại Roma hơn 8000 người và nhiều thành phố của Tây Ban Nha tử vong. Trong thế kỉ 17-18 nhiều trận dịch rải rác khắp nơi, đặc biệt là khoảng năm 18301833, dịch cúm lan tràn, gây bệnh nặng đến một phần tư số người bị lây. Sang thế kỉ 19, dịch cúm vẫn tiếp tục hoành hành trên thế giới. Năm 1837, một nạn dịch lớn đã lan từ Berlin (Đức) sang Barcelona (Tây Ban Nha). Trận cúm mang tên cúm Tây Ban Nha- do dòng virus H1N1 gây ra trong hai năm 1918-1919 làm chết khoảng 40-50 triệu người. Trận đại dịch cúm này được nghiên cứu y học xem ngang hàng với trận dịch hạch làm chết hai phần ba người dân châu Âu giữa thế kỉ 14. Năm 1969 (loại A/H3N2) dịch cúm xảy ra ở Hồng Kông đã cướp đi gần 34000 người. 1.2. TÌNH HÌNH BỆNH CÚM A/H5N1 Ở NGƯỜI TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.2.1. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 ở người trên thế giới hiện nay Cúm A/H5N1 là một phân nhóm có khả năng gây nhiễm cao của virus cúm gia cầm. Chủng này lần đầu tiên được phát hiện và ghi nhận tại Hồng Kông vào năm 1997 khi nó gây bệnh trên người và gia cầm. Tên gọi phân nhóm H5N1 liên quan đến loại protein kháng nguyên trên vỏ virus: protein hemagglutinin nhóm 5 (H5) và neuraminidase nhóm 1 (N1). Kể từ cuối năm 2003 sự lan truyền cúm A/ H5N1 do các loài chim di cư ở Châu Á, Châu Âu, Trung Đông và Châu Phi trở thành mối quan tâm lớn của TCYTTG cũng như nhiều quốc gia trên toàn thế giới. Từ năm 2003 đến ngày 06/3/2012 theo thông báo của TCYTTG đã có tổng cộng 594 người mắc bệnh dương tính với cúm A/ H5N1, trong đó 349 người tử vong (chiếm tỷ lệ chung 58,75%) [19],[24],[29]. 5 Các quốc gia có số mắc và số tử vong cao là các nước Ai cập (163/57); Indonesia (186/134) và Việt Nam (122/61). Có 15 quốc gia ghi nhận cúm A H5N1 ở người từ 2003 đến nay như sau: Hình 1.1. Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở người từ năm 2003 đến nay [11], [34]. Hầu hết những ca nhiễm cúm gia cầm H5N1 trên người qua điều tra dịch tễ học cho thấy có liên quan đến tiếp xúc với gia cầm bị bệnh hoặc trung gian qua thực phẩm chế biến từ gia cầm bị bệnh hoặc qua tiếp xúc trực tiếp như: giết mổ, vận chuyển, mua bán, cầm và sờ vào gia cầm nhiễm bệnh. TCYTTG đã chia dịch cúm thành 6 giai đoạn, từ mức độ chỉ là nguy cơ nhỏ cho đến khi đại dịch bùng phát và lan tràn. TCYTTG đánh giá hiện nay đang nằm ở giai đoạn 3 của dịch, điều đó thừa nhận sự gây nhiễm trên người của virus H5N1 nhưng chưa có bằng chứng về sự lây truyền virus từ người sang người [19], [24], [29]. 6 Hình 1.2. Các giai đoạn phát triển dịch cúm A/H5N1 [34] 1.2.2. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 tại Việt Nam Tại Việt Nam, ca bệnh đầu tiên vào năm 2003, cho đến đầu tháng 3/2012 ghi nhận có tổng cộng 122 ca, đến ngày 7/3/2012 ghi nhận thêm 01 ca nhiễm cúm A (H5) là một bệnh nhân nam 31 tuổi, ở xã Ea Tyh, huyện Ea Kar, đây là ca bệnh thứ 4 xuất hiện tại Việt Nam trong năm 2012 và là ca bệnh đầu tiên tại Đắk Lắk từ trước đến nay đang được theo dõi và điều trị tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Tp. Hồ Chí Minh (ca đầu tiên tại Kiên Giang, ca thứ 2 tại Sóc Trăng, ca thứ 3 tại Bình Dương) [19],[24][29]. 7 Hình 1.3. Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở nước ta từ năm 2003 đến nay [34], [35] Qua điều tra dịch tễ, các trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 trên người được ghi nhận đồng thời với thời điểm có dịch cúm trên gia cầm. Mặc dù số mắc ít nhưng tỷ lệ tử vong chung rất cao (58,75%) và chi phí điều trị rất tốn kém, do vậy biện pháp tốt nhất là dự phòng để khỏi mắc bệnh. Trước tình hình dịch cúm A/H5N1 có nguy cơ lan rộng ở gia cầm và lây lan sang người, Chính phủ, Bộ Y tế, UBND các tỉnh đã có chỉ đạo các địa phương tiếp tục theo dõi chặt chẽ tình hình dịch bệnh truyền nhiễm trong nước và thế giới, tăng cường giám sát chặt chẽ các trường hợp mắc cúm tại các địa phương thông qua hệ thống giám sát trọng điểm cúm quốc gia, tại các bệnh viện và tại cộng đồng, phát hiện sớm các trường hợp mắc, sự biến chủng của virus, tổ chức điều tra dịch tễ để xác định nguồn lây và xử lý kịp thời ổ dịch. Và vắc xin được xem là phương pháp phòng bệnh hiệu quả nhất trong phòng chống các bệnh do virus cúm A/H5N1 gây ra. 8 1.3. TÁC NHÂN GÂY BỆNH 1.3.1. Đặc điểm sinh học của Virus cúm A/H5N1 Virus cúm A (còn gọi là virus cúm gia cầm, virus cúm gà) có tên khoa học là Avian Influenza (AI), thuộc họ Orthomyxoviridae trong hệ thống phân loại chung (Basic Taxomomy) [22]. Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính 80 -120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Da [19], [24], [29].  Phân tích thành phần hóa học một virion có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 75% là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbonhydrate [11].  Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn âm - negative single strand [11]. (Hình 1.4). Hình 1.4. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B), và phức hợp ribonucleoprotein RNP (C) của virus cúm A . Ghi chú: - A: Các dạng hình thái khác nhau của virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử. - B: Mô hình cấu tạo hạt virus cúm A (Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA, Neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA; PB2, PB1, PA: ba dưới đơn vị phức hợp enzyme polymerase của virus). - C: Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP (Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge). Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào vật chủ được đặc hiệu hóa 9 gắn các protein màng của virus. Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ virus, bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các dấu ấn khác của virus [14]. Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử NA và HA (tỉ lệ khoảng 1NA/4HA), đây là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm [7], [8]. Vật chất di truyền (còn gọi là hệ gen) của virus cúm A là RNA sợi đơn âm (viết tắt là (-) ssRNA), gồm 8 phân đoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên trong vỏ virus, mã hóa cho 11 protein tương ứng của virus, trong đó phân đoạn M mã hóa cho 2 protein là M1 và M2, phân đoạn NS mã hóa cho 2 protein là NS và NEP, phân đoạn PB1 mã hóa cho 2 protein là PB1 và PB1F2 [21] (Hình 1.4). Về danh pháp, nhóm virus cúm A được phân chia thành nhiều phân type (subtype), các phân type này được phân biệt bởi sự khác nhau ở các đặc tính kháng nguyên bề mặt (NA và HA), cho đáp ứng miễn dịch khác nhau giữa các chủng virus ở cơ thể bị nhiễm [7], [8]. Có 16 phân type HA và 9 phân type NA đã được phát hiện, sự tổ hợp giữa các phân type này, về lí thuyết, có thể tạo ra hơn 254 biến chủng khác nhau, trừ chủng ban đầu [29]. Hiện nay, dữ liệu gen và hệ gen của virus cúm A có thể được tìm thấy trong Ngân hàng gen [18], tại Mạng lưới chuyên gia cúm gia cầm của Tố chức Nông lương thế giới (FAO) và Tổ chức Thú y thế giới (OIE) [22], [23]; và tại trang web của Trung tâm dữ liệu các gen virus (Influenza Sequence Database, ISD: http://www.flu.lanl.gov/). TCYTTG đã quy định thống nhất danh pháp theo thứ tự kí hiệu: Tên serotype - Loài động vật bị nhiễm - Vùng địa lí phân lập - Số hiệu đăng kí chủng virus - Thời gian phân lập - Loại hình phân type [HA(H) và NA(N)]; ví dụ: A/Chicken/Vietnam/ HG4/2005(H5N1). Đối với các virus được phân lập trên người bệnh, thì không cần ghi loài mắc trong danh pháp, ví dụ: A/Vietnam/1194/2004(H5N1) [31]. 10 1.3.2. Độc lực và tính thích ứng vật chủ  Độc lực gây bệnh của virus cúm A Tính gây bệnh hay độc lực của virus cúm A được chia làm hai loại: Loại độc lực cao (HPAI), và loại độc lực thấp (LPAI), cả hai loại đều cùng tồn tại trong tự nhiên [21]. - HPAI: là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48 giờ sau nhiễm. Loại này rất nguy hiểm gây lo ngại cho cộng đồng. Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà và tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin [29]. - LPAI: là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ. Đây là loại virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của virus cúm A, loại này có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc lực cao đồng nhiễm trên cùng một tế bào, và trở thành loại virus HPAI nguy hiểm [29].  Tính thích ứng đa vật chủ của virus cúm A/H5N1 Vật chủ tự nhiên của tất cả các chủng virus cúm A/H5N1 là chim hoang dã (chủ yếu là vịt trời), đây là nguyên nhân lan truyền virus trong tự nhiên rất khó kiểm soát. Virus cúm A có khả năng gia tăng biên độ vật chủ của chúng trong quá trình lây truyền ở tự nhiên [21]. Nhờ đặc tính luôn thay đổi kháng nguyên trong tự nhiên, virus cúm A có khả năng xâm nhiễm ở nhiều loài vật chủ trung gian khác nhau như gia cầm, một số loài động vật có vú (hải cẩu, cá voi, ngựa, lợn) và cả ở người, tạo nên tính thích ứng lan truyền “nội loài” như gà - gà, hay “ngoại loài” như gà - lợn; gà - lợn - người (Hình 1.6). Vịt (vịt trời) và một số loài thuỷ cầm khác (ngỗng) luôn luôn là vật chủ tàng trữ nguồn virus gây nhiễm [34]. Đặc điểm thích ứng vật chủ này là điều kiện thuận lợi cho virus cúm A trao đổi, tái tổ hợp các phân đoạn gen, đặc biệt là các phân đoạn gen kháng nguyên (gen “độc” HA và NA) giữa các chủng, tạo ra một chủng virus cúm mới có khả năng thích ứng xâm nhiễm ở loài vật chủ mới của chúng đặc biệt khi chúng vượt qua được “rào cản loài” dễ dàng thích ứng lây 11 nhiễm gây bệnh từ gia cầm sang người và giữa người với người [18], [19]. Trong lịch sử các đại dịch cúm ở người, lợn thường là vật chủ trung gian chuyển tiếp giúp cho virus cúm A biến đổi để dễ dàng lây nhiễm sang người gây nên bệnh dịch [21], [35]. Ví dụ: cúm A/H3N2 là kết quả tái tổ hợp tự nhiên của virus cúm A/H2N2 của người và virus chứa gen H3 trong tự nhiên thông qua đồng nhiễm trên lợn, gây nên đại dịch cúm châu Á năm 1968 [19], [24], [29].  Sức đề kháng Virus cúm A tương đối nhạy cảm với các tác nhân bất hoạt vật lí hay hóa học. Các hạt virus tồn tại thích hợp trong khoảng pH từ 6,5 đến 7,9. Ở pH quá acid hay quá kiềm, khả năng lây nhiễm của virus bị giảm mạnh [17]. Lớp vỏ ngoài của virus bản chất là lớp lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, dễ bị phá hủy bởi các dung môi hòa tan lipid, chất tẩy rửa và các chất sát trùng: formaldehyde, phenol, βpropiolacton, sodium hypochloride, acid loãng và hydroxylamine. Virus bị bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ, tồn tại được 15 ngày ánh sáng thường, tia tử ngoại bất hoạt được virus nhưng không phá hủy được kháng nguyên của virus. Tuy nhiên, virus cúm A dễ dàng bị tiêu diệt hoàn toàn ở 100oC và ở 60oC/30 phút, tồn tại ít nhất 3 tháng ở nhiệt độ thấp (trong phân gia cầm), và tới hàng năm ở nhiệt độ bảo quản (−70oC). Trong phủ tạng gia cầm (40oC), virus tồn tại 25 - 30 ngày, nhưng chỉ tồn tại 7 - 8 ngày ở nhiệt độ cơ thể người (37oC), trong nước, virus có thể sống tới 4 ngày ở nhiệt độ 30oC [22], [29]. 1.3.3. Đường xâm nhập và lây bệnh của bệnh cúm A/H5N1  Đường xâm nhập của virus vào tế bào chủ Virus cúm A/H5N1 kí sinh nội bào bắt buộc, quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm [22], [24], có những nét đặc trưng như sau: - Quá trình xâm nhiễm của virus cúm A được mở đầu bằng sự kết hợp của HA và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào này, và cuối cùng là giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm (Hình 1.5). 12 - Quá trình nhân lên của RNA virus cúm A chỉ xảy ra trong nhân của tế bào, đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy ra trong nguyên sinh chất), và cuối cùng là giải phóng các hạt virus ra khỏi tế bào nhiễm nhờ vai trò của enzyme neuraminidase. Thời gian một chu trình xâm nhiễm và giải phóng các hạt virus mới của virus cúm chỉ khoảng vài giờ (trung bình 6 h). Sự tạo thành các hạt virus mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưng các tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử, và rơi vào quá trình chết theo chương trình (apoptosis) làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ [29], [35]. - Sau khi được giải phóng vào trong bào tương tế bào nhiễm, hệ gen của virus sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của virus và các RNA vận chuyển phụ thuộc RNA (RNA-dependent RNA transcription). Phức hợp protein– RNA của virus được vận chuyển vào trong nhân tế bào [15]. - Trong nhân tế bào các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA-polymerase. Các sợi này không được Adenine hóa (gắn thêm các Adenine - gắn mũ) ở đầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein (RNP) hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương tế bào. Đồng thời, các RNA thông tin của virus cũng sao chép nhờ hệ thống enzyme ở từng phân đoạn gen của virus, và được enzyme PB2 gắn thêm 10 - 12 nucleotide Adenin ở đầu 5’-, sau đó được vận chuyển ra bào tương và dịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các protein của virus (Hình 1.5). - Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện tượng “nảy chồi” của virus. NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại nhân tế bào để kết hợp với RNA thành RNP của virus. Sau cùng các RNP của virus được hợp nhất với vùng “nảy chồi”, tạo thành các “chồi” virus gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic acid. Các NA phân cắt các liên kết này và giải phóng các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác [22], [23]. 13 Hình 1.5. Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào chủ [11].  Phương thức lây truyền Các chủng của virus cúm gia cầm có thể lây nhiễm cho nhiều loại động vật khác nhau như chim, lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi, hổ và người. Virus cúm có thể lan truyền nhanh từ trại chăn nuôi này sang trại chăn nuôi khác bằng các cơ chế cơ học qua các phương tiện vận chuyển, quần áo, giày dép....Virus có nhiều trong chất bài tiết như dịch mũi họng, phân gia cầm bệnh, bụi và đất. Tiếp xúc trực tiếp với gia cầm bệnh hoặc đồ dùng, vật dụng bị nhiễm bởi phân gia cầm là đường lây truyền chính. Virus có thể lây truyền qua không khí (qua các giọt nhỏ dịch tiết đường hô hấp của gia cầm bệnh hoặc hít phải không khí có chứa bụi từ phân gia cầm) hay qua ăn uống (nước, thực phẩm nhiễm virus...) và tiếp xúc với dụng cụ và đồ vật nhiễm virus. Người có thể bị lây bệnh do tiếp xúc trực tiếp với gia cầm bị bệnh qua chăn nuôi, vận chuyển, giết mổ, chế biến, ăn gia cầm và sản phẩm của gia cầm bệnh chưa được nấu chín hoặc chế biến không hợp vệ sinh.  Khả năng gây bệnh của virus cúm A Virus cúm A có tính thích ứng lây nhiễm cao với biểu mô đường hô hấp, gây bệnh chủ yếu ở đường hô hấp, và cũng có thể tác động gây tổn thương nhiều cơ quan