Tài liệu Nghiên cứu xây dựng và phát triển phương pháp phân tích một số chất kích thích tăng trưởng (auxin, gibberellin, cytokinin) trong rau xanh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- LÊ VĂN NHÂN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ PHÁT TRIỂN PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG TRƢỞNG (AUXIN, GIBBERELLIN, CYTOKININ) TRONG RAU XANH LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội, 2021 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------LÊ VĂN NHÂN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ PHÁT TRIỂN PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG TRƢỞNG (AUXIN, GIBBERELLIN, CYTOKININ) TRONG RAU XANH Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 9.44.01.18 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS. TS. Nguyễn Quang Trung 2. TS. Vũ Đức Nam Hà Nội, 2021 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài Luận án “Nghiên cứu xây dựng và phát triển phương pháp phân tích một số chất kích thích tăng trưởng (auxin, gibberellin, cytokinin) trong rau xanh” là do tôi thực hiện với sự hƣớng dẫn của PGS. TS Nguyễn Quang Trung và TS. Vũ Đức Nam. Các kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực, không trùng lặp và sao chép với bất kỳ công trình khoa học nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Nghiên cứu sinh Lê Văn Nhân ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài luận án, nghiên cứu sinh đã nhận đƣợc sự hỗ trợ và giúp đỡ từ nhiều cá nhân và tập thể; nghiên cứu sinh rất trân trọng và biết ơn sự hỗ trợ và giúp đỡ này. Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến thầy giáo PGS. TS. Nguyễn Quang Trung, ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi và định hƣớng cho tôi trong quá trình nghiên cứu và thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS. Vũ Đức Nam, ngƣời luôn quan tâm, nhắc nhở, hƣớng dẫn và động viên tôi sớm hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ đã tạo điều kiện về mặt thời gian, cơ sở vật chất, trang thiết bị phục vụ cho việc nghiên cứu và thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ đã mời các giảng viên có nhiều kinh nghiệm và kiến thức chuyên sâu giảng dạy cho các nghiên cứu sinh cũng nhƣ bố trí thời gian học tập linh hoạt và phổ biến các thông tin kịp thời tới nghiên cứu sinh. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, khích lệ, cổ vũ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận án. Con xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới cha mẹ, vợ, con, các anh chị em và ngƣời thân đã luôn động viên, khích lệ và cổ vũ con hoàn thành chƣơng trình đào tạo nghiên cứu sinh. Xin chân thành cảm ơn! Nghiên cứu sinh Lê Văn Nhân iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN.................................................................................................. ii MỤC LỤC ...................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT....................................... vii DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... ix DANH MỤC HÌNH.......................................................................................... x MỞ ĐẦU......................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN.............................................................................. 3 1.1. Khái niệm chất kích thích sinh trƣởng thực vật.......................................... 3 1.2. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật ....... 3 1.2.1. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm auxin................... 3 1.2.2. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm gibberellin ........... 6 1.2.3. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm cytokinin ............. 7 1.3. Vai trò chức năng của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật ................... 9 1.3.1. Vai trò chức năng của các chất thuộc nhóm auxin ............................... 9 1.3.2. Vai trò chức năng của các chất thuộc nhóm gibberellin ..................... 10 1.3.3. Vai trò chức năng của các chất thuộc nhóm cytokinin ....................... 11 1.4. Các nghiên cứu về tác dụng của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật ... 11 1.4.1. Các nghiên cứu về tác dụng của các chất thuộc nhóm auxin............... 11 1.4.2. Các nghiên cứu về tác dụng của các chất thuộc nhóm gibberellin ....... 14 1.4.3. Các nghiên cứu về tác dụng của các chất thuộc nhóm cytokinin ......... 15 1.5. Các nghiên cứu về dƣ lƣợng của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật .. 17 1.6. Các phƣơng pháp phân tích các chất kích thích sinh trƣởng thực vật ......... 18 1.6.1. Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu............................................................. 18 1.6.1.1. Thu thập mẫu.......................................................................... 19 1.6.1.2. Chiết tách............................................................................... 19 1.6.1.3. Làm sạch và tinh chế mẫu ........................................................ 19 1.6.2. Phƣơng pháp phân tích ................................................................... 20 1.6.2.1. Phương pháp phân tích các hợp chất auxin ............................... 21 1.6.2.2. Phương pháp phân tích các hợp chất gibberellin ....................... 22 1.6.2.3. Phương pháp phân tích các hợp chất cytokinin .......................... 23 CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................ 25 2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm ................................................ 25 iv 2.1.1. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ........................................................ 25 2.1.2. Hóa chất thí nghiệm ....................................................................... 25 2.1.2.1. Hóa chất ................................................................................ 25 2.1.2.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn ....................................................... 26 2.2. Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................... 26 2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .................................................................... 26 2.2.2. Đối tƣợng phân tích ....................................................................... 27 2.2.3. Thu thập mẫu ................................................................................ 27 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................... 28 2.3.1. Phƣơng pháp khảo sát các điều kiện tối ƣu của quy trình phân tích ..... 28 2.3.1.1. Phương pháp khảo sát điều kiện khối phổ.................................. 28 2.3.1.2. Phương pháp khảo sát điều kiện sắc ký lỏng .............................. 28 2.3.2. Phƣơng pháp khảo sát điều kiện xử lý mẫu ...................................... 30 2.3.3. Phƣơng pháp xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng của quy trình phân tích ........................................................................................................ 32 2.3.4. Phƣơng pháp đánh giá dƣ lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau thu thập tại Hà Nội....................................................... 35 2.3.5. Phƣơng pháp đánh giá ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng thực vật đến sự phát triển của một số loại rau và mức độ tích lũy của chúng ........ 36 2.3.5.1. Bố trí thí nghiệm ..................................................................... 36 2.3.5.2. Phương pháp đánh giá sự ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thực vật đến sự phát triển của các loại rau ................................. 38 2.3.5.3. Phương pháp đánh giá sự tích lũy của chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các loại rau................................................................... 38 2.3.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu .............................................................. 39 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .............................. 40 3.1. Khảo sát các điều kiện tối ƣu của quy trình phân tích các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong rau ............................................................................. 40 3.1.1. Khảo sát điều kiện phân tích khối phổ ............................................. 40 3.1.1.1. Khảo sát mức năng lượng phân mảnh của các ion...................... 40 3.1.1.2. Khảo sát các hướng phân mảnh của các chất KTST ................... 45 3.1.1.3. Khảo sát các thông số của nguồn ion hóa.................................. 56 3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng ........................................................ 57 3.1.2.1.Khảo sát cột phân tích và dung môi pha động............................. 57 3.1.2.2. Khảo sát chế độ gradient của pha động..................................... 66 v 3.2. Tối ƣu hóa điều kiện xử lý mẫu ............................................................. 69 3.3. Xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng của quy trình phân tích................... 74 3.3.1. Xây dựng quy trình phân tích đồng thời các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau....................................................................... 74 3.3.2. Xác nhận giá trị sử dụng của quy trình phân tích............................... 77 3.3.2.1. Đánh giá độ ổn định của chu kỳ đông/rã đông mẫu .................... 77 3.3.2.2. Đường chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng............ 79 3.3.2.3. Ảnh hưởng của nền mẫu .......................................................... 81 3.3.2.4. Hiệu suất thu hồi và độ chính xác của phương pháp phân tích .... 83 3.3.2.5. So sánh với một số phòng thí nghiệm ........................................ 86 3.4. Kết quả đánh giá hiện trạng dƣ lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau thu thập tại Hà Nội ..................................................... 89 3.4.1. Số lƣợng mẫu rau phát hiện chứa các chất kích thích sinh trƣởng thực vật ......................................................................................................... 89 3.4.2. Số lƣợng chất kích thích sinh trƣởng thực vật phát hiện đƣợc trong các mẫu rau cải xanh .................................................................................... 90 3.4.3. Hàm lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật phát hiện đƣợc trong các mẫu rau cải xanh ...................................................................... 91 3.4.4. Sự tồn dƣ nhiều hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong mẫu rau cải xanh ở các khu vực nghiên cứu ........................................................... 93 3.5. Đánh giá ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng thực vật đến sự phát triển của một số loại rau và mức độ tích lũy của chúng ................................... 97 3.5.1. Ảnh hƣởng của GA3 đến sự phát triển của một số loại rau xanh ......... 97 3.5.1.1. Ảnh hưởng của GA3 đến sự phát triển của rau cải xanh .............. 97 3.5.1.2. Ảnh hưởng của GA3 đến sự phát triển của rau mồng tơi ............100 3.5.1.3. Ảnh hưởng của GA3 đến sự phát triển của rau xà lách ...............102 3.5.2. Sự tích lũy của GA3 trong một số loại rau .......................................105 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.........................................................................110 ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN .........................................................................111 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ..................................................112 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..............................................................................114 PHỤ LỤC .....................................................................................................128 PHỤ LỤC 1. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CÁC CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG THỰC VẬT TRONG RAU ......................................128 PHỤ LỤC 2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CHẾ ĐỘ GRADIENT ............................133 vi PHỤ LỤC 3. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỐI CHỨNG Ở CÁC PTN....................139 PHỤ LỤC 4. ĐƢỜNG CHUẨN CỦA GA3 TRÊN CÁC NỀN MẪU RAU THÍ NGHIỆM......................................................................................................144 PHỤ LỤC 5. MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG NGHIÊN CỨU ...........................145 vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt 2,4,5-T 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic acid Axít 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Axít 2,4-dichlorophenoxyacetic 4-CI-IAA 4-Chloroindole-3-acetic acid Axít 4-chloroindole-3-acetic AIA β-Indolyaxetic acid Axít β-Indolyaxetic APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization Ion hóa hóa học áp suất khí quyển BA N6-Benzyladenine N6-Benzyladenine Ctv Et al. Cộng tác viên DHZR Dihydrozeatin Riboside Dihydrozeatin Riboside EI Electron Ionization Ion hóa điện tử ELISA Enzym Link Immunosorbent Assay ESI Electrospray Ionization Thử nghiệm miễn dịch hấp thụ liên kết với enzyme Ion hóa tia điện FLD Flourescence Detector Đầu dò huỳnh quang GA1 Gibberellin A1 Gibberellin A1 GA3 Gibberellin A3 Gibberellin A3 GA4 Gibberellin A4 Gibberellin A4 GA7 Gibberellin A7 Gibberellin A7 GAs Gibberellin Gibberellin GC Gas Chromatography Sắc ký khí HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao IAA Indole-3-acetic acid Axít Indole-3-acetic IBA Indole-3-butyric acid Axít Indole-3-butyric ICA Indole-3-carboxylic acid Axít Indole-3-carboxylic iP N6-Isopentenyladenine 6-Isopentenyladenine IPA Indole-3-propionic acid Axít Indole-3-propionic iPR Isopentenyladenosine Isopentenyladenosine IT MS Ion Trap Mass Spectrometry Khối phổ bẫy ion K Kinetin Kinetin KTST Plant growth substances Chất kích thích sinh trƣởng thực vật LFMCE Leaf-Ferrocene Modified Carbon Paste Điện cực dán cacbon biến tính lá Electrode Ferrocene Multiple Reaction Monitoring Giám sát đa phản ứng MRM viii MS Mass Spectrometry Khối phổ NanoESI Nano-Electrospray Ionization Ion hóa tia điện nano PAA Phenylacetic acid Axít Phenylacetic PGR Plant Growth Regulator Chất điều hòa sinh trƣởng thực vật QQQ MS Triple Quadrupole Mass Spectrometry Khối phổ ba tứ cực RIA Radioimmunoassay Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ SIM Selected Ion Monitoring Giám sát ion chọn lọc SRM Selected Reaction Monitoring Giám sát phản ứng chọn lọc TDZ Diphenylurea, thidiazuron TOF-MS Time-of-Flight Mass Spectrometry Khối phổ thời gian bay tZ Trans-zeatin Trans-zeatin tZR Trans-zeatin Riboside Trans-zeatin Riboside UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng siêu cao áp Z Zeatin Zeatin α-NAA α-naphthaleneacetic acid Axít α-naphthaleneacetic - (Chú thích: Tên hóa chất trong luận án đƣợc viết theo tên tiếng Anh) ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm auxin..................... 5 Bảng 1.2. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm gibberellin ............. 7 Bảng 1.3. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm cytokinin ............... 9 Bảng 1.4. Một số nghiên cứu về tác dụng của auxin đối với các loại cây trồng ..... 13 Bảng 1.5. Một số nghiên cứu về tác dụng của gibberellin đối với các loại cây trồng ..................................................................................................................... 14 Bảng 1.6. Một số nghiên cứu về tác dụng của cytokinin đối với các loại cây trồng 16 Bảng 3.1. Các điều kiện tối ƣu hóa của khối phổ trong phân tích các chất KTST .. 42 Bảng 3.2. Các thông số của nguồn ion đƣợc tối ƣu hóa ...................................... 56 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát gradient của pha động ............................................. 67 Bảng 3.4. Điều kiện gradient tối ƣu sử dụng phân tích các chất KTST trong rau xanh .............................................................................................................. 68 Bảng 3.5. Diện tích píc của các chất KTST và độ ổn định của chu kỳ đông/ rã đông ..................................................................................................................... 78 Bảng 3.6. Đƣờng chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp phân tích ........................................................................................................ 81 Bảng 3.7. Độ lặp lại và độ thu hồi của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật .... 84 Bảng 3.8. Kết quả so sánh với một số phòng thí nghiệm đối với mẫu 10 ng.mL-1 .. 86 Bảng 3.9. Kết quả so sánh với một số phòng thí nghiệm đối với mẫu 100 ng.mL-1 87 Bảng 3.10. Kết quả so sánh với một số phòng thí nghiệm đối với mẫu 1000 ng.mL-1 ..................................................................................................................... 88 Bảng 3.11. Số lƣợng các chất KTST phát hiện đƣợc trong các mẫu rau cải xanh .. 90 Bảng 3.12. Hàm lƣợng của các KTST phát hiện đƣợc trong các mẫu rau cải xanh 92 x DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của các chất thuộc nhóm auxin................................... 3 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của các chất thuộc nhóm gibberellin ........................... 6 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của các chất thuộc nhóm cytokinin ............................. 8 Hình 2.1. Quy trình tách chiết và phân tích các hoocmon thực vật trong mẫu cây thuộc Họ Cải theo nghiên cứu của Xiangqing và cộng sự ................................... 30 Hình 2.2. Các khu vực nghiên cứu và thu thập mẫu rau ...................................... 35 Hình 2.3. Thuốc kích thích sinh trƣởng thực vật Gibber4TB............................... 37 Hình 2.4. Mô hình thí nghiệm đánh giá sự tích lũy của chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong một số loại rau xanh................................................................... 37 Hình 3.1. Kết quả khảo sát năng lƣợng phân mảnh ion của các chất KTST .......... 41 Hình 3.2. Phân mảnh ion đặc trƣng của các chất KTST ở điều kiện tối ƣu hóa ..... 44 Hình 3.3. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất IAA ................... 46 Hình 3.4. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất IBA ................... 47 Hình 3.5. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất ICA ................... 47 Hình 3.6. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất IPA.................... 48 Hình 3.7. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất GA3 ................... 49 Hình 3.8. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất GA4 ................... 49 Hình 3.9. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất GA7 ................... 50 Hình 3.10. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất BA................... 51 Hình 3.11. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất DHZR .............. 52 Hình 3.12. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất iP..................... 52 Hình 3.13. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất iPR .................. 53 Hình 3.14. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất K ..................... 54 Hình 3.15. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất tZ .................... 54 Hình 3.16. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất tZR .................. 55 Hình 3.17. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Hypersil sử dụng pha động ACN (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,1 mL.phút -1 ....................................................................................................... 58 xi Hình 3.18. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Hypersil sử dụng pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,1 mL.phút -1 ....................................................................................................... 59 Hình 3.19. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng pha động ACN (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,1 mL.phút -1 ....................................................................................................... 60 Hình 3.20. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng pha động ACN (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,3 mL.phút -1 ....................................................................................................... 61 Hình 3.21. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,1 mL.phút -1 ....................................................................................................... 62 Hình 3.22. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,3 mL.phút -1 ....................................................................................................... 63 Hình 3.23. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,5 mL.phút -1 ....................................................................................................... 64 Hình 3.24. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 1 mL.phút -1 ....................................................................................................... 65 Hình 3.25. Quy trình tách chiết và phân tích các KTST trong các mẫu rau xanh đƣợc phát triển và tối ƣu hóa ........................................................................... 70 Hình 3.26. Hiệu suất của quá trình chiết mẫu theo quy trình Xiangqing và cộng sự sử dụng các dung môi 1-propanol và 2-propanol ............................................... 72 Hình 3.27. Hiệu suất của quá trình chiết mẫu theo quy trình mới xây dựng và phát triển sử dụng các dung môi 1-propanol và 2-propanol ........................................ 73 Hình 3.28. Sơ đồ quy trình chiết và phân tích các chất KTST trong các mẫu rau... 74 Hình 3.29. Sắc ký đồ của các chất KTST ở điều kiện gradient tối ƣu ................... 76 Hình 3.30. Đƣờng chuẩn của các chất KTST trên nền mẫu rau cải xanh .............. 79 Hình 3.31. Ảnh hƣởng của nền mẫu đến tín hiệu của các chất KTST ................... 82 Hình 3.32. Tỷ lệ phát hiện các chất KTST trong rau cải xanh ............................. 90 xii Hình 3.33. Tỷ lệ phát hiện các chất KTST trong rau cải xanh ở các huyện nghiên cứu................................................................................................................ 90 Hình 3.34. Sự phân bố hàm lƣợng của các chất KTST trong các mẫu rau cải xanh ở các khu vực nghiên cứu................................................................................... 94 Hình 3.35. Ảnh hƣởng của GA3 đến sự phát triển của rau cải xanh ...................... 98 Hình 3.36. Ảnh hƣởng của GA3 đến sự phát triển của rau mồng tơi ...................101 Hình 3.37. Ảnh hƣởng của GA3 đến sự phát triển của rau xà lách.......................104 Hình 3.38. Sự tích lũy của GA3 trong các loại rau.............................................108 1 MỞ ĐẦU Nhu cầu sử dụng lƣơng thực, thực phẩm và rau xanh ở Việt Nam ngày càng gia tăng. Do đó, trong sản xuất nông nghiệp, ngƣời ta luôn tìm kiếm, nghiên cứu các giải pháp để nâng cao hiệu quả sản xuất cây trồng. Sử dụng chất điều hòa sinh trƣởng thực vật đƣợc xem là một trong những giải pháp tốt trong nông nghiệp để thúc đẩy nhanh quá trình tăng trƣởng của cây. Chất điều hòa sinh trƣởng thực vật là những chất có khả năng điều tiết sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật từ khi nảy mầm đến khi lão hóa và chết. Trong tự nhiên, các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật còn đƣợc gọi là các hoocmon sinh trƣởng thực vật, là những chất đƣợc sinh ra trong cây. Bằng con đƣờng hóa học nhân tạo, nhiều hợp chất khác nhau, có hoạt tính tƣơng tự với các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật tự nhiên đƣợc tổng hợp nhân tạo và dùng để điều chỉnh quá trình sinh trƣởng, phát triển của cây nhằm tăng năng suất và phẩm chất của cây trồng. Có hai nhóm chất điều hòa sinh trƣởng thực vật gồm: nhóm chất kích thích sinh trƣởng thực vật (auxin, gibberellin và cytokinin...), có vai trò thúc đẩy sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật và nhóm chất ức chế sinh trƣởng thực vật (absicic, ethylen và các hợp chất phenol...), có chức năng kìm hãm sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật để chuyển sang thời kỳ ra hoa, kết quả, hoặc chín. Trên thị trƣờng, nhiều loại hóa chất điều hòa sinh trƣởng thực vật đƣợc buôn bán và sử dụng ở các dạng khác nhau nhƣ: dạng bột, dạng lỏng hoặc dạng phối trộn cùng với các loại phân bón khác... Trong đó, nhiều hóa chất đƣợc sản xuất ở Việt Nam, một số loại khác đƣợc nhập khẩu từ các nƣớc trên thế giới và có cả những loại không nhãn mác, không có nguồn gốc xuất xứ. Nếu không đƣợc quản lý chặt chẽ và sử dụng đúng cách thì những chất này có thể tiềm ẩn những nguy cơ dẫn tới ô nhiễm môi trƣờng, ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe ngƣời sản xuất và tiêu dùng. Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật đã đƣợc các nhà khoa học trên thế giới quan tâm, nghiên cứu và ứng dụng từ nhiều năm nay. Việc sử dụng các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật trong sản xuất nông nghiệp cũng diễn ra khá phổ biến ở Việt Nam, tuy nhiên, rất ít công trình công bố nghiên cứu về phƣơng pháp phân tích và đánh giá dƣ lƣợng của các chất này trong các sản phẩm nông nghiệp, đặc biệt là rau xanh. Mặt khác, có nhiều loại thuốc điều hòa sinh trƣởng thực vật không 2 có nhãn mác và nguồn gốc xuất xứ vẫn đƣợc nông dân truyền tai nhau sử dụng do hiệu quả nhanh chóng và vƣợt trội của chúng mang lại cho cây trồng. Đây là một trong những nguyên nhân tiềm ẩn có thể gây nên tình trạng ngộ độc thực phẩm và ô nhiễm môi trƣờng liên quan đến dƣ lƣợng của các hóa chất sử dụng trong sản xuất nông nghiệp. Xuất phát từ thực tế trên, nghiên cứu sinh đề xuất thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng và phát triển phương pháp phân tích một số chất kích thích tăng trưởng (auxin, gibberellin, cytokinin) trong rau xanh”. Nghiên cứu này thành công sẽ là tiền đề cho việc phát triển và ứng dụng phƣơng pháp phân tích đánh giá dƣ lƣợng và thực trạng sử dụng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các loại rau xanh, các sản phẩm nông nghiệp và trái cây.... sản xuất ở nƣớc ta cũng nhƣ nhập khẩu từ các nƣớc trên thế giới. Đây cũng chính là cơ sở giúp các cơ quan chức năng, các nhà quản lý ban hành các chế tài và có phƣơng thức giám sát việc sử dụng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong sản xuất nông nghiệp một cách hiệu quả, đảm bảo sự phát triển sản xuất, an toàn cho ngƣời tiêu dùng và môi trƣờng sinh thái. Mục tiêu nghiên cứu của luận án:  Nghiên cứu xây dựng và phát triển phƣơng pháp phân tích đồng thời các hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong rau xanh bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với detector khối phổ bẫy ion.  Áp dụng phƣơng pháp xây dựng đƣợc để phân tích, đánh giá hiện trạng sử dụng, mức độ tồn dƣ và khả năng tích lũy của một số chất kích thích sinh trƣởng thực vật sử dụng trong rau tại một số quận/ huyện của Hà Nội. Nội dung nghiên cứu của luận án: 1) Khảo sát các điều kiện tối ƣu của phƣơng pháp phân tích các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong rau, gồm: các điều kiện vận hành trên thiết bị sắc ký lỏng khối phổ và các điều kiện của phƣơng pháp xử lý mẫu. 2) Xây dựng phƣơng pháp phân tích và đánh giá các thông số của phƣơng pháp. 3) Đánh giá hiện trạng dƣ lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau xanh thu thập tại Hà Nội. 4) Đánh giá ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng thực vật đến sự sinh trƣởng và phát triển của một số loại rau và mức độ tích lũy của chúng trong rau xanh. 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Khái niệm chất kích thích sinh trƣởng thực vật Chất kích thích sinh truởng thực vật (KTST) là nhóm các hợp chất hữu cơ nhƣ: auxin, gibberellin, cytokinin, brassinosteroid, jasmonate, salicyclic acid và strigolactone...; có tác dụng kích thích quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây [1]. Những chất này tác động lên sự sinh trƣởng của cây trồng theo cơ chế: (1) Kích thích tăng trƣởng thể tích tế bào ở lá, thân, quả [2-4]; (2) Kích thích hình thành tế bào mới, làm tăng cƣờng sự nảy chồi, đâm rễ, ra hoa [5-7]; (3) Bổ sung và tăng cƣờng hoạt động của các men trong quá trình sinh tổng hợp của cây bằng cách cung cấp thêm các chất vi lƣợng nhƣ Fe, Mn, Cu, Bo, Zn… [1]. 1.2. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật 1.2.1. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm auxin α-NAA (C12H10O2) 2,4-D (C8H6Cl2O3) 2,4,5-T (C8H5Cl3O3) Picloram (C6H3Cl3N2O2) Dicama (C8H6Cl2O3) IAA (C10H9NO2) IBA (C12H13NO2) IPA (C11H11NO2) ICA 4-CI-IAA PAA (C9H6NO2) (C10H8ClNO2) (C8H8O2) β-IAA Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của các chất thuộc nhóm auxin 4 Auxin là một hoocmon thực vật có nguồn gốc từ axít amin tryptophan, đƣợc xác định và phân lập về mặt hóa học vào những năm 1930. Auxin có trong tất cả các bộ phận của cây với các nồng độ khác nhau, trong đó, nồng độ auxin ở mỗi vị trí là thông tin quan trọng của sự phát triển, đƣợc điều chỉnh chặt chẽ thông qua cả quá trình trao đổi chất và vận chuyển trong cây. Auxin hoạt động kết hợp hoặc đối lập với các hoocmon thực vật khác. Ví dụ, tỷ lệ nhất định của auxin với cytokinin trong các mô thực vật có ảnh hƣởng đến sự hình thành rễ của các cành giâm [8]. Cấu trúc hóa học của các hợp chất auxin đƣợc trình bày ở Hình 1.1. Ở cấp độ phân tử, tất cả các auxin đều là hợp chất có một vòng thơm và một nhóm axít cacboxylic. Trong đó, indole-3-acetic acid (IAA) là một dẫn xuất của indole-3acetic acid, là monocacboxylic acid, hợp chất chứa acetic acid đƣợc liên kết với nguyên tử cacbon C3 của indole. IAA đƣợc xem là hợp chất quan trọng nhất của nhóm auxin, có vai trò tạo ra phần lớn các hiệu ứng auxin trong thực vật. Là một auxin tự nhiên nên trạng thái cân bằng của IAA trong cây có thể đƣợc kiểm soát theo nhiều cách từ tổng hợp cho đến sự phân hủy các phân tử của nó tùy theo điều kiện môi trƣờng [9]. Có 5 hợp chất auxin trong tự nhiên gồm: IAA, 4-chloroindole-3-acetic acid (4-CI-IAA), indole-3-butyric acid (IBA), indole-3-propionic acid (IPA) và phenylacetic acid (PAA) [10, 11]. Bên cạnh đó, nhiều hợp chất tổng hợp có tính chất tƣơng tự auxin nhƣ: Indole-3-carboxylic acid (ICA); α-naphthaleneacetic acid (α-NAA); 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D); 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T); 4-Amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (tordon or picloram); 2Methoxy-3,6-dichlorobenzoic acid (dicamba), β-Indolyaxetic acid (AIA)... [10]. Những auxin tổng hợp nhân tạo này cũng có khả năng kích thích sự phát triển của thực vật và đã đƣợc ứng dụng nhiều trong nông nghiệp và thƣơng mại. Các đặc điểm, tính chất hóa lý nhƣ khối lƣợng mol phân tử, mật độ, diện tích bề mặt, màu sắc, trạng thái, nhiệt độ nóng chảy và độ tan của một số hợp chất auxin đƣợc trình bày ở Bảng 1.1. 5 Bảng 1.1. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm auxin (Nguồn: PubChem) Hợp chất KLPT Mật độ Diện tích Màu sắc, Nóng chảy (g.mol-1) (g.cm-3) bề mặt (Å2) trạng thái (oC) IAA 175,187 1,4±0,1 53,1 Dạng rắn, màu trắng IBA 203,241 1,252 53,1 Tinh thể màu trắng hơi vàng IPA 189,214 151,1 53,09 ICA 161,15 208 53,1 4-CI-IAA 209,63 1,5±0,1 53,1 PAA 136,15 1,1 37,3 2,4-D 221,04 1,42 46,5 Tinh thể, màu vàng đến cam Tinh thể màu vàng nhạt Dạng bột màu trắng Dạng rắn màu trắng Màu trắng hơi vàng α-NAA 186,21 1,2±0,1 37,3 Màu trắng Dicamba 221,03 1,57 46,5 Màu trắng Picloram 241,45 - 76,2 Màu trắng 2,4,5-T 255,48 1,8 46,5 Màu trắng hơi vàng Độ tan 168-170 Không tan trong nƣớc, tan trong etanol (50 mg.L-1) 125 Trong nƣớc: 250 mg.L-1 ở 20oC; trong benzene: > 1000 g.L-1; Trong acetone, etanol, diethyl: 30-100 g.L-1; trong chloroform: 0,01-1 g.L-1 134-135 Trong nƣớc: 0,73 g.L-1; etanol: 50 mg.mL-1 232-234 Trong nƣớc: 5%; etanol: 95% 179-180 Trong nƣớc: 0,42 g.L-1 76-77 15 g.L-1 Trong nƣớc: 900 mg.L-1; trong aceton: 67,3 g/400 mL; trong benzene 0,94 g/100 mL 135 Trong nƣớc: 0,42 g.L-1 (ở 20oC); tan nhẹ trong dung môi hữu cơ: benzene, aceton, acetic acid, chlorofom 114-116 Trong nƣớc: 4500 mg.L-1 ở 25oC; tan trong dung môi hữu cơ: methanol, aceton, chloroform, dichloromethane 218,5 Trong nƣớc: 430 mg.L-1 (ở 25oC); tan trong các dung môi hữu cơ: aceton, acetonitrile, benzene, etanol, isopropanol 154-158 Trong nƣớc: 238 mg.kg-1 (ở 30oC) 140,5 6 1.2.2. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm gibberellin Gibberellin (GAs) là nhóm hoocmon thực vật đƣợc phát hiện sau auxin, đƣợc tổng hợp trong các mô non của chồi, có thể có trong rễ, hạt đang phát triển và lá cây [12]. Gibberellin chính là các diterpenoid acid đƣợc tổng hợp từ terpenoid trong thể hạt và sau đó đƣợc biến đổi thành dạng hoạt hóa sinh học trong lƣới nội chất và cytosol [13]. Các gibberellin đều dẫn xuất từ bộ khung ent-gibberellan và đƣợc tổng hợp thông qua ent-kauren. Các gibberellin đƣợc đặt tên theo thứ tự phát hiện của chúng là GA1, GA2, GA3.... GAn. Trong đó, GA3 là gibberellin đầu tiên đƣợc mô tả cấu trúc và là chất có tác dụng sinh học lớn nhất. Hiện nay, có 126 gibberellin đƣợc xác định từ thực vật, nấm và vi khuẩn với công thức phân tử không chứa nitơ [14]. Gibberellin là các deterpene acid, với sự xuất hiện của cacbon 19 (C-19) hoặc cacbon 20 (C-20). Các gibberellin C-19, bị mất đi C-20, tại vị trí đó sở hữu một cầu lacton 5 thành viên liên kết với cacbon 4 và cacbon 10. Gibberellin C-19 đƣợc xem là dạng gibberellin có hoạt tính sinh học [15]. Các gibberellin có hoạt tính sinh học gồm: GA1, GA3, GA4, GA7 với các đặc điểm chung là: nhóm hydroxyl gắn ở vị trí C-3β, một nhóm cacboxyl ở vị trí C-6, và một lacton ở vị trí giữa C-4 và C-10. Nhóm 3β-hydroxyl có thể đƣợc trao đổi cho các nhóm chức khác ở vị trí C-2 và/ hoặc C-3. GA5 và GA6 là các gibberellin có hoạt tính sinh học không chứa nhóm hydroxyl ở vị trí C-3β [16]. Công thức cấu tạo của một số gibberellin đƣợc trình bày ở Hình 1.2. GA1 (C19H24O6) GA3 (C19H22O6) GA4 (C19H24O5) GA7 (C19H22O5) Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của các chất thuộc nhóm gibberellin Gibberellin tan tốt trong dung môi hữu cơ nhƣng tan kém trong nƣớc. Các đặc điểm hóa lý của một số gibberellin đƣợc trình bày trong Bảng 1.2.