Tài liệu Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm A H5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật multiplex reverse transcription polymerase chain reaction

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- TRẦN THỊ TÌNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NHANH VIRUS CÚM GIA CẦM A/H5N1 TRONG MẪU BỆNH PHẨM BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX REVERSE TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- TRẦN THỊ TÌNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NHANH VIRUS CÚM GIA CẦM A/H5N1 TRONG MẪU BỆNH PHẨM BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX REVERSE TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. LƯƠNG XUÂN HIẾN Hà Nội – Năm 2011 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN .........................................................................................3 1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1.........................................................3 1.1.1. Phân loại học và danh pháp .........................................................................3 1.1.2. Hình thái và cấu trúc virus cúm A/H5N1 ....................................................5 1.1.3. Hệ gen và các protein của virus A/H5N1 ....................................................6 1.1.4. Chu trình tái bản của virus cúm A/H5N1 ....................................................9 1.1.5. Hiện tượng biến đổi kháng nguyên của virus cúm A.................................11 1.1.6. Khả năng thích ứng vật chủ của virus cúm A ...........................................12 1.1.7. Độc lực và khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1 ............................14 1.1.8. Sức đề kháng của virus cúm A ..................................................................15 1.2. CHẨN ĐOÁN, ĐIỀU TRỊ VÀ DỰ PHÒNG BỆNH CÚM GIA CẦM A/H5N1 .....................................................................................................................16 1.2.1. Triệu chứng nhiễm cúm A/H5N1 ..............................................................16 1.2.2. Các phương pháp xét nghiệm và chẩn đoán nhiễm cúm A/H5N1 ............17 1.2.3. Điều trị nhiễm cúm A/H5N1 ở người........................................................23 1.2.4. Kiểm soát lây nhiễm và dự phòng .............................................................24 1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VIRUS CÚM A/H5N1 Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI ................................................................................................................25 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................27 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .........................................................................27 2.1.1. Mẫu vật ......................................................................................................27 2.1.2. Hóa chất .....................................................................................................27 2.1.3. Thiết bị .......................................................................................................28 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................28 2.2.1. . Chọn mẫu..................................................................................................28 2.2.2. Kỹ thuật lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu .......................................28 2.2.3. Tách chiết RNA mẫu bệnh phẩm ..............................................................29 2.2.4. Thiế t kế mồ i ...............................................................................................30 2.2.5. Tối ưu phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA và NA ...................32 2.2.6. Tối ưu phản ứng Multiplex RT-PCR phát hiện virus A/H5N1.................38 73 2.2.7. Thử nghiệm phản ứng Multiplex RT-PCR trên mẫu bệnh phẩm ..............40 2.2.8. Điê ̣n di và phân tích kế t quả ......................................................................41 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................43 3.1. Thiết kế mồi ......................................................................................................43 3.1.1. Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen M của virus cúm A ....................................43 3.1.2. Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen HA của virus cúm A/H5N1 ......................44 3.1.3. Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen NA của virus cúm A/H5N1 .......................45 3.2. Tối ƣu phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA và NA .....................47 3.2.1 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi .............................................................................47 3.2.2. Tối ưu nồng độ mồi ...................................................................................49 3.2.3. Tối ưu thời gian kéo dài chuỗi ...................................................................50 3.2.4. Đánh giá độ nhạy của phản ứng RT-PCR ..................................................51 3.2.5. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng RT-PCR............................................53 3.3. Tối ƣu phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus A/H5N1 ....................56 3.3.1. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi ............................................................................56 3.3.2. Tối ưu nồng độ mồi ...................................................................................56 3.3.3. Tối ưu thời gian kéo dài chuỗi ...................................................................57 3.3.4. Tối ưu số chu kỳ phản ứng ........................................................................58 3.3.5. Đánh giá độ nhạy của phản ứng multiplex RT-PCR .................................59 3.3.6. Đánh giá đô ̣ đă ̣c hiê ̣u của phản ứng multiplex RT-PCR ...........................59 3.4. Ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR phát hiện virus A/H5N1 trên mẫu bệnh phẩm................................................................................................................61 Kết luận...............................................................................................................67 Kiến nghị ............................................................................................................67 TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................68 74 CHỮ VIẾT TẮT bp: Base pair DEPC-treated water: Diethylpyrocarbonate treated water DNA: Deroxi ribonucleic acid dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA: Etilendiamin tetraaxetic acid HA (H): Haemagglutinin LB: Luria-Bertani media M: Matrix protein NA (N): Neuraminidase NP: Nucleoprotein NS: Non-structural protein PA: Polymerase A protein PB: Polymerase B protein RT-PCR: Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction RNA: Ribonucleic acid TBE: Tris Base, Acid Boric, EDTA vRNP: Viral ribonucleoprotein 77 DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ Hình 1.1. Cấu trúc của virus cúm A............................................................................5 Hình 1.2. Các phân đoạn gen và các protein của virus cúm A/H5N1........................6 Hình 1.3. Chu trình tái bản của virus cúm A…........................................................10 Hình 1.4. Các vật chủ tự nhiên và khả năng lây nhiễm giữa các loài vật chủ của virus cúm A................................................................................................................13 Bảng 2.1: Các thành phần của phản ứng RT-PCR...................................................33 Bảng 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR....................................................33 Bảng 2.3: Thành phần của phản ứng multiplex RT-PCR.........................................37 Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex RT-PCR....................................38 Bảng 3.1: Cặp mồi phát hiện gen M của virus cúm A..............................................43 Hình 3.1: Đặc điểm cặp mồi phát hiện gen M của virus cúm A...............................43 Bảng 3.2: Cặp mồi phát hiện gen HA của virus cúm A/H5N1..................................44 Hình 3.2: Đặc điểm cặp mồi phát hiện gen HA của virus cúm A/H5.......................45 Bảng 3.3: Cặp mồi phát hiện gen NA của virus cúm A/H5N1..................................46 Hình 3.3: Đặc điểm cặp mồi phát hiện gen NA của virus cúm A/N1........................46 Bảng 3.4: Trình tự các mồi được lựa chọn để thực hiện phản ứng RT-PCR…........47 Hình 3.4. Ảnh điện di kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen riêng biệt............................................................................................49 Hình 3.5. Ảnh kết quả điện di tối ưu nồng độ mồi cho phản ứng RT-PCR...............50 Hình 3.6. Ảnh điện di kết quả tối ưu thời gian kéo dài chuỗi...................................51 Bảng 3.5: Giá trị đo độ hấp thụ OD của RNA 3 gen M, HA và NA..........................51 Hình 3.7. Ảnh điện di đánh giá độ nhạy của phản ứng RT-PCR..............................52 Bảng 3.6: Thành phần phản ứng RT-PCR phát hiện gen M.....................................53 Bảng 3.7: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR phát hiện gen M.........................54 Bảng 3.8: Thành phần phản ứng RT-PCR phát hiện gen H5...................................54 Bảng 3.9: Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR phát hiện gen H5..............................54 Bảng 3.10: Thành phần phản ứng RT-PCR phát hiện gen N1..................................55 75 Bảng 3.11: Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR phát hiện gen N1............................55 Hình 3.8: Ảnh điện di tố i ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng multiplex RT-PCR....56 Hình 3.9. Ảnh điện di tối ưu nồng độ mồi phản ứng multiplex RT-PCR..................57 Hình 3.10: Ảnh điện di tối ưu thời gian kéo dài chuỗi phản ứng multiplex RT-PCR ...58 Hình 3.11: Ảnh điện di tối ưu số chu kỳ phản ứng multiplex RT-PCR.....................59 Hình 3.12: Thử nghiê ̣m đánh giá độ nhạy của phản ứng multiplex RT-PCR….......59 Hình 3.13: Ảnh điện di đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng multiplexRT-PCR.......60 Bảng 3.12: Thành phần phản ứng multiplex RT-PCR .............................................60 Bảng 3.13: Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex RT-PCR ……………………….61 Hình 3.14: Kế t quả thử nghiê ̣m phản ứng multiplex RT-PCR trên mẫu bê ̣nh phẩm dương tính…………………………………………………………………………………...62 Hình 3.15: Kế t quả thử nghiê ̣m phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1 trên một số mẫu bê ̣nh phẩm………………………………………….63 Hình 3.16: Kế t quả thử nghiê ̣m phản ứng RT-PCR phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1 trên một số mẫu bê ̣nh phẩm………………………………………………….…64 Bảng 3.14: So sánh kết quả xét nghiệm phản ứng RT-PCR và multiplex RT-PCR trên mẫu bệnh phẩm………………………………………………………………………..64 Bảng 3.15: So sánh thời gian và chi phí hoá chất làm xét nghiệm giữa phản ứng multiplex RT-PCR và RT-PCR………………………………………………………………65 76 MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, dịch cúm gia cầm do virus A/H5N1 là vấn đề quan tâm đối với cả thế giới, đặc biệt là đối với các nước châu Á như Việt Nam, Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc... Kể từ cuối năm 2003 đến nay, dịch cúm A/H5N1 đã gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm và gây tử vong cho hàng trăm người. Cả thế giới đang lo sợ trước nguy cơ có thể xảy ra một đại dịch cúm trên người do virus A/H5N1 giống như các vụ đại dịch cúm đã xảy ra trong thế kỷ 20. Các nước trên thế giới đã tiêu tốn hàng tỷ đô la cho việc chuẩn bị chống lại một đại dịch cúm H5N1 có thể xảy ra trong tương lai như mua thuốc và các thiết bị y tế, nghiên cứu sản xuất vaccine, thực hành các phương án phòng chống dịch, thực hiện các chiến lược nhằm kiểm soát chặt chẽ đường biên giới... Ở Việt Nam, kể từ năm 2003 đến nay, dịch cúm gia cầm liên tục xảy ra ở hầu hết các tỉnh thành trên toàn quốc. Mỗi năm có hàng triệu gia cầm bị chết và tiêu hủy. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam đang đứng thứ 2 trên thế giới (sau Indonesia) về số người nhiễm và tử vong do virus A/H5N1. Virus cúm A/H5N1 là virus có khả năng biến đổi gen nhanh chóng và hình thành nên các chủng virus mới nên việc sử dụng vaccine để dự phòng thường không đạt được hiệu quả cao. Ở Việt Nam hiện nay, dịch cúm A/H5N1 vẫn liên tục xảy ra trên gia cầm và người, mặc dù mức độ không trầm trọng như giai đoạn trước đây nhưng nếu không được phát hiện và có các biện pháp dập dịch kịp thời thì dịch có thể trở nên bùng phát. Khi có dịch cúm gia cầm, một phương pháp chẩn đoán nhanh, nhạy và chính xác là cần thiết cho việc điều trị, kiểm soát và ngăn chặn kịp thời tránh lây lan rộng ra cộng đồng. Để phát hiện virus cúm A/H5N1 trong các mẫu bệnh phẩm ở người và gia cầm, hiện nay hầu hết các phòng xét nghiệm đều áp dụng kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction). Đây là kỹ thuật sinh học phân tử, cho phép phát hiện virus với độ chính xác cao, thời gian làm xét nghiệm khoảng 4-6 giờ nếu thực hiện Realtime RT-PCR và 12-24 giờ nếu thực hiện RT- 1 PCR và điện di trên gel agarose. Với RT-PCR thông thường, người ta phải thực hiện ba phản ứng để chẩn đoán xác định virus cúm A/H5N1, bao gồm: một phản ứng để xác định virus cúm A, một phản ứng xác định subtype H5 và một phản ứng xác định subtype N1. Để đơn giản hóa quá trình xét nghiệm, rút ngắn thời gian xét nghiệm và tiết kiệm chi phí người ta có thể ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR, cho phép chẩn đoán xác định cúm A/H5N1 chỉ với một phản ứng RT-PCR thay vì phải làm ba phản ứng RT-PCR. Tuy nhiên, việc nghiên cứu thiết kế và xây dựng quy trình thực hiện kỹ thuật multiplex RT-PCR khá phức tạp nên hiện nay hầu hết các phòng xét nghiệm trong nước chưa áp dụng kỹ thuật này trong chẩn đoán cúm A/H5N1. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện ”Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction” tại Labo Trường Đại học Y Thái Bình với mục tiêu: 1. Thiết kế và lựa chọn được các mồi phù hợp để thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus cúm A/H5N1. 2. Nghiên cứu tối ưu hóa được các điều kiện của phản ứng multiplex RT-PCR: nhiệt độ và thời gian gắn mồi, nồng độ mồi,... 3. Thử nghiệm được phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện A/H5N1 trên một số mẫu bệnh phẩm thu thập từ người và gia cầm. 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1 1.1.1. Phân loại học và danh pháp 1.1.1.1. Phân loại virus cúm Theo ủy ban Quốc tế về phân loại virus (ICTV - International Committee on Taxonomy of Viruses), virus cúm thuộc nhóm V, họ Orthormyxoviridae, gồm 3 type là A, B và C. Chúng là các virus có vật liệu di truyền là RNA sợi đơn âm [32]. Sự phân biệt virus cúm A, B và C dựa trên sự khác nhau về đặc tính kháng nguyên của nucleoprotein (NP) và protein nền M1 (matrix protein). Ngoài ra, hệ gen của virus cúm A và B đều có 8 đoạn RNA còn virus cúm C chỉ có 7 đoạn RNA [36]. Trong 3 type thì type A là virus có giới hạn vật chủ rất rộng, lưu hành phổ biến trên gia cầm và một số động vật có vú như lợn, ngựa, chó, mèo, hải cẩu,… và cả con người [32]. Virus cúm A là loại có độc lực mạnh nhất, có khả năng biến đổi gen rất lớn và nguyên nhân chủ yếu gây ra các vụ đại dịch cúm trong thế kỷ qua. Dựa vào sự khác biệt về đặc tính kháng nguyên của hai glycoprotein là haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA), virus cúm A còn được chia thành 16 subtype HA (H1-H16) và 9 subtype NA (N1-N9). Sự tái tổ hợp giữa các subtype HA và NA, về mặt lý thuyết sẽ tạo ra nhiều subtype khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh [2]. Tất cả các subtype HA và NA đều hiện diện trên các chủng virus lưu hành ở các loài thủy cầm hoang dã. Tuy nhiên, chỉ có một số subtype nhất định thường xuyên lưu hành trên người như H1N1, H1N2, H2N2, H3N2 [11]. Cúm A/H5N1 là một subtype có khả năng gây nhiễm cao của virus cúm. Các chủng của virus cúm gia cầm có thể xâm nhiễm vào nhiều loại động vật khác nhau như chim, lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi và con người. Virus cúm B và virus cúm C lưu hành chủ yếu trên người và chỉ gây ra các vụ dịch ở mức độ vừa và nhỏ. 3 1.1.1.2. Phân loại virus cúm A/H5N1 Virus cúm A/H5N1 được phân biệt với các subtype virus cúm A khác dựa trên sự khác biệt về đặc tính kháng nguyên HA và NA. Do có khả năng biến đổi di truyền nhanh chóng nên các chủng virus cúm A/H5N1 đang lưu hành còn được phân chia thành nhiều clade/subclade (nhóm/phân nhóm), mỗi clade/subclade có các đặc điểm di truyền đặc trưng [2]. Các genotype của virus cúm A/H5N1 Trong những năm gần đây virus cúm A/H5N1 đã có những biến đổi di truyền và được phân chia thành nhiều nhóm dựa vào sự khác biệt về kiểu gen (genotype). Kiểu gen của virus cúm A/H5N1 thể hiện đặc điểm di truyền của virus được hình thành do sự kết hợp của 8 phân đoạn gen. Trên cơ sở gen H5 và N1 của chủng gốc Goose/Guangdong/1/96, virus A/H5N1 được phân chia thành các kiểu gen khác nhau với các đặc điểm di truyền được hình thành do sự tái tổ hợp 6 gen còn lại từ các nguồn khác nhau. Các kiểu gen khác nhau của virus cúm A/H5N1 đã được xác định bao gồm A, B, C, D, E, G, V, W, X0, X1, X2, X3, Y, Z và Z+ [26]. Trong số các kiểu gen này, chỉ có một số kiểu gen (B, Z, Z+, V, G, W, và X0) lưu hành được trên 2 năm, chứng tỏ chúng đã thích nghi để có thể tồn tại [22]. Kiểu gen Z là kiểu gen lưu hành phổ biến ở Indonesia, Thái Lan, Việt Nam và phía nam Trung Quốc từ năm 2003 đến nay [14]. Các clade của virus cúm A/H5N1 Các tổ chức WHO (World Health Organization), OIE (Organisation for Animal Health) và FAO (Food and Agriculture Organization) đã cùng nhau xây dựng một hệ thống danh pháp thống nhất để có thể xác định các clade A/H5N1 [50]. Hiện nay, hệ thống danh pháp này chia virus A/H5N1 thành 10 clade khác nhau, mỗi clade còn có thể phân thành các subclade (phân dòng) [5, 46]. Hiện tại chỉ có các virus thuộc clade 0, 1, 2 và 7 là lây nhiễm cho người. Clade 2 gồm một số subclade khác nhau vẫn đang lưu hành và tiếp tục hình thành các subclade mới [5]. Kể từ 2008, các clade A/H5N1 hiện đang lưu hành và gây bệnh ở người gồm có 4 clade 2.3.2 (Trung Quốc), 2.3.4 (Trung Quốc và Việt Nam) 2.2 (Ai Cập), 2.1 (Indonesia), 1 (Campuchia) và 7 (Trung Quốc) [51]. 1.1.1.3. Danh pháp virus cúm Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã quy định thống nhất danh pháp của virus cúm theo thứ tự kí hiệu: type virus (A, B hoặc C), vật chủ (có thể bỏ qua nếu vật chủ là người), địa điểm phân lập virus, mã số chủng virus và năm phân lập. Nếu là virus cúm A thì phải thêm kí hiệu của kháng nguyên HA và kháng nguyên NA đặt trong dấu ngoặc đơn. Ví dụ: A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) là chủng virus cúm A ở người, phân lập ở Hong Kong, mã số chủng là 156, phân lập năm 1997, có kháng nguyên HA là H5 và kháng nguyên NA là N1. A/Chicken/Vietnam/G62/2005 (H5N1) là chủng virus cúm A phân lập ở gà tại Việt Nam năm 2005, mã số chủng là G62, kháng nguyên HA là H5 và kháng nguyên NA là N1. 1.1.2. Hình thái và cấu trúc virus cúm A/H5N1 Virus cúm H 5N1 là một subtype của virus cúm A , thuô ̣c ho ̣ Orthomyxoviridea. Virus cúm A/H5N1 mang các đă ̣c điể m của virus cúm A (hình 1.1). Hình 1.1. Cấu trúc của virus cúm A. http://thefutureofthings.com/news/6684/ human-antibodies-neutralize-avian-flu.html 5 Virus cúm A là virus có vỏ bọc, cấu trúc dạng hình cầu với đường kính từ 80120 nm (nanomet) hoặc hình sợi dài 200-300 nm, đường kính 20 nm. Vỏ bọc của virus là lớp màng lipid kép có nguồn gốc từ tế bào vật chủ, trên màng có khoảng 500 cấu trúc hình gai nhô ra. Các cấu trúc này chính là các kháng nguyên bề mặt của virus, dài khoảng 10-14 nm, đường kính 4-6 nm, bản chất là các glycoprotein HA, NA và M2 nằm xen kẽ với nhau. Sự phân bố của các kháng nguyên trên bề mặt của hạt virus không đồng đều, tỉ lệ HA/NA khoảng 4-5/1. Bên trong màng lipid được lót bởi một lớp protein nền M1 (khoảng 3000 phân tử M1) [36]. Vật chất di truyền (hệ gen) của virus cúm A là RNA sợi đơn âm (-)ssRNA, gồm 8 phân đoạn riêng biệt mã hóa cho 10 hoặc 11 protein virus (tùy theo từng chủng virus mà có thể có hoặc không có protein PB 1-F2). Bên trong hạt virus, mỗi phân đoạn đều liên kết với nucleoprotein (NP) và 3 tiểu đơn vị của enzyme polymerase (bao gồm PB1, PB2, và PA) hình thành nên các phức hợp ribonucleoprotein (viral ribonucleoprotein - vRNP) [37]. 1.1.3. Hệ gen và các protein của virus A/H5N1 H5N1 có hệ gen là RNA sợi đơn âm bao gồm 8 phân đoạn gen mang tên từ 1-8 với kích thước phân tử giảm dần hoặc gọi theo tên protein mà chúng mã hóa tổng hợp là PB2, PB1, PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2) và NS (NS1 và NEP) (hình 1.2). Hình 1.2. Các phân đoạn gen và các protein của virus cúm A/H5N1 6 Đặc điểm các phân đoạn gen của virus cúm A/H5N1 như sau: Các phân đoạn mã hóa cho các kháng nguyên bề mặt của virus (đặc trưng theo từng chủng virus): - Phân đoạn 4 (gen HA): Có kích thước khoảng 1704-1707 bases, mang gen mã hóa tổng hợp protein HA, là một kháng nguyên bề mặt của virus cúm có bản chất là glycoprotein. Kháng nguyên này có vai trò trong việc giúp cho virus gắn với tế bào vật chủ và vận chuyển vật liệu di truyền của nó vào bên trong tế bào vật chủ. Quá trình này có thể bị chặn lại nếu có các kháng thể đặc hiệu gắn kết với các kháng nguyên trên bề mặt của virus. Protein HA còn là kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm A, kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng subtype HA, và tham gia vào phản ứng trung hòa virus. HA là protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus, là đích của bảo vệ miễn dịch nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm, là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay. Một đặc điểm di truyền để phân biệt giữa virus cúm gia cầm và virus cúm người là: virus cúm gia cầm chỉ gắn với thụ thể alpha 2-3 sialic acid còn virus cúm người chỉ gắn với thụ thể alpha 2-6 sialic acid trên tế bào chủ. Ở một số động vật (lợn, gà...) có cả 2 loại thụ thể nên có thể bị nhiễm cả virus cúm gia cầm và cúm người [24]. Người ta đã phát hiện ra sự đột biến ở một số vị trí trên gen HA làm cho virus cúm gia cầm có thể gắn với tế bào người và gây bệnh cho người [11]. Một số nghiên cứu trong thời gian gần đây đã cho thấy ở người cũng có các thụ thể alpha 2-3 sialic acid với mật độ rất thấp và ở gia cầm cũng có các thụ thể alpha 2-6 sialic acid với mật độ rất thấp [28]. Người ta cũng nhận thấy nếu đột biến xảy ra ở 2 vị trí trên gen HA tương ứng với axit amin 182 và 192 thì virus có thể gắn với cả thụ thể của người và gia cầm [10, 27]. - Phân đoạn 6 (gen NA): Có kích thước khoảng từ 1350-1410 bases, mang gen mã hóa cho neuraminidase, một kháng nguyên bề mặt của virus, có vai trò là một enzyme cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của màng tế bào nhiễm với phân tử carbonhydrate của protein HA, giải phóng các hạt virus con ra khỏi tế bào vật chủ. Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan 7 loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu. Giống kháng nguyên HA, NA cũng là đích chủ yếu của cơ chế bảo vệ miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng virus đang nhễm. Như vậy, hai kháng nguyên bề mặt HA và NA của virus là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện này cho người và gia cầm và hạn chế lây truyền sang người [2]. Các phân đoạn mã hóa cho các protein thành phần của enzyme polymerase của virus, có độ dài ổn định và có tính bảo tồn cao, gồm: - Phân đoạn 1 (gen PB2) có kích thước khoảng 2431 bases, mang gen mã hóa tổng hợp protein PB2, là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp enzyme polymerase của virus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus [2]. Nghiên cứu thấy rằng, trên PB2 tất cả các virus cúm gia cầm đều có axit amin ở vị trí 627 là glutamine, còn PB2 ở các chủng A/H5N1 phân lập từ người mang đột biến chứa axit amin lysine ở vị trí 627. Sự có mặt của lysine ở vị trí 627 của PB2 sẽ tạo thuận lợi cho virus phát triển ở cả đường hô hấp trên và đường hô hấp dưới của động vật có vú, là nguyên nhân làm cho A/H5N1 có độc lực cao [29]. - Phân đoạn 2 (gen PB1) có kích thước khoảng 2431 bases, mang gen mã hóa tổng hợp protein PB1 và PB1-F2. PB1 là tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enyzme polymerase, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA [5]. PB1-F2 liên quan đến độc lực của virus và có thể có vai trò quan trọng trong việc xác định mức độ nguy hiểm của dịch cúm [43]. Khi so sánh các chủng virus trong vụ dịch ở Hong Kong năm 1997, người ta nhận thấy sự biến đổi axit amin asparagine ở vị trí 66 thành serine (N66S) trên PB1-F2 liên quan đến độc lực của virus. Sự thay đổi axit amin N66S cũng được phát hiện trên PB1-F2 của virus cúm gây ra đại dịch cúm năm 1918 [17]. - Phân đoạn 3 (gen PA) có kích thước khoảng 2233 bases, là phân đoạn gen bảo tồn cao, mã hóa tổng hợp protein PA, là một tiểu đơn vị của enzyme polymerase chịu trách nhiệm kéo dài RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus [40]. 8 Các phân đoạn mã hóa các protein chức năng khác của virus, chúng có kích thước tương đối ổn định giữa các chủng virus cúm A, gồm: - Phân đoạn 5 (gen NP) có kích thước khoảng 1556 bases, mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP), chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ. NP có đặc tính kháng nguyên biểu hiện theo nhóm virus, tồn tại trong các hạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA. - Phân đoạn 7 (gen M): có kích thước khoảng 1027 bases, mang gen mã hóa tổng hợp protein nền M1 và M2 của virus. Các protein này kết hợp với 2 kháng nguyên bề mặt tạo nên lớp vỏ capsid của virus. Hai protein này được tạo ra từ cùng một phân đoạn RNA với các khung đọc mở khác nhau. Protein M1 gắn với RNA của virus và M2 có tác dụng phá vỡ vỏ bọc của virus để giải phóng các phân đoạn RNA vào tế bào chất của tế bào chủ. M2 là protein xuyên màng có bản chất là một kênh ion, cần thiết cho quá trình xâm nhiễm của virus [36]. Sự thay thế axit amin ở vị trí 31 serin thành asparagine trên protein M2 của một số chủng H5N1 liên quan đến tình trạng kháng amantadin của virus [25]. - Phân đoạn 8 (gen NS) có kích thước khoảng 890 bases, chứa gen mã hóa cho 2 protein không cấu trúc của virus là NS1 và NEP (nuclear export protein) (thường được gọi là protein NS2). Độc lực của virus liên quan đến protein NS [39]. NS1 là protein có vai trò trong việc ghép nối, dịch mã và vận chuyển RNA qua màng tế bào. NEP có vai trò trung gian trong quá trình vận chuyển các ribonucleoprotein của virus (vRNPs) vào nhân tế bào chủ. 1.1.4. Chu trình tái bản của virus cúm A/H5N1 Chu trình tái bản của virus cúm xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm (hình 1.3). 9 Hình 1.3. Chu trình tái bản của virus cúm A Khởi đầu chu trình là sự gắn kết của virus với các thụ thể có chứa nhóm sialic acid trên bề mặt tế bào nhiễm nhờ kháng nguyên HA. Khi virus bám gắn được với tế bào, màng tế bào lõm lại hình thành túi thực bào (endosome). Túi thực bào giảm dần pH để giúp cho quá trình hoà nhập màng virus với màng túi thực bào và giải phóng các phức hợp RNP của virus vào tế bào chất của tế bào chủ . Sau đó, các phức hơ ̣p RNP đươ ̣c vâ ̣n chuyể n vào nhân tế bào để tổng hợp sợi dương RNA. Sợi dương RNA được làm khuôn để sao mã tạo mRNA và tái bản sợi âm RNA của virus. mRNA được đưa ra tế bào chất để tổng hợp protein của virus. Quá trình tổng hợp protein và tái bản hệ gen của virus là quá trình phức tạp được điều hoà bởi nhiều yếu tố của virus cũng như của tế bào. Các protein PB1, PB2, PA và NP của virus sau khi được tổng hợp sẽ được đưa vào nhân tế bào và kết hợp với RNA virus hình thành các phức hợp RNP và phức hợp được đưa ra tế bào chất. Các protein khác (HA, NA và M2) được glycosyl hoá nhờ mạng lười nội sinh chất và phức hệ golgi của tế bào. Sau khi hoàn thiện, các protein này được đưa đến màng tế bào gắn vào lớp lipid kép và khi mật độ đủ lớn thì các phức hợp RNP và protein M1 cũng tập hợp lại trên màng để hình thành hạt virus thế hệ con gắn trên bề mặt tế bào nhờ liên kết giữa HA với nhóm sialic acid của glycoprotein màng tế bào. Các hạt virus sau đó giải phóng khỏi màng nhờ tác dụng cắt nhóm sialic acid của enzyme neuraminidase. 10 Thời gian từ khi virus xâm nhiễm tế bào đến khi hình thành thế hệ virus con trung bình khoảng 6 giờ. Sự giải phóng các hạt virus mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưng các tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử và rơi vào quá trình chết theo chương trình (apoptosis) làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ [48]. 1.1.5. Hiện tƣợng biến đổi kháng nguyên của virus cúm A Virus cúm A là loại virus đặc biệt nhất trong các virus đường hô hấp do có hệ gen phân thành 8 đoạn và khả năng biến đổi kháng nguyên nhanh chóng. Khả năng biến đổi kháng nguyên của virus cúm A là hệ quả của các quá trình biến đổi di truyền của virus. Các cơ chế biến đổi di truyền của virus bao gồm: - Hiện tƣợng trao đổi kháng nguyên (antigenic shift): Antigenic shift là các biến đổi di truyền lớn của virus cúm, tạo ra chủng virus mới từ các chủng virus ban đầu bằng cách sắp xếp lại hệ gen. Quá trình này xảy ra khi virus cúm của các loài khác nhau đồng nhiễm trên cùng một vật chủ (ví dụ như hai chủng virus cúm người và virus cúm gia cầm đồng nhiễm trên lợn) trao đổi hệ gen cho nhau, tạo ra các thế hệ virus mới có các phân đoạn gen kết hợp từ các chủng ban đầu. Sự trao đổi kháng nguyên có thể tạo ra các chủng virus cúm mới có khả năng lây nhiễm các loài vật chủ mới hoặc gia tăng động lực gây bệnh [2]. - Hiện tƣợng lệch kháng nguyên (antigenic drift): Antigenic drift là quá trình tích lũy các đột biến gen trên gen mã hóa cho các kháng nguyên quan trọng của virus (kháng nguyên HA và NA). Do enzyme polymerase của virus không có cơ chế đọc sửa nên trong quá trình tái bản tần số đột biến ở virus rất cao, trung bình mỗi lần tái bản hệ gen của virus sẽ có 1 nucleotid bị biến đổi [21]. Qua nhiều thế hệ virus, các đột biến này dần dần được tích lũy lại và đến một lúc nào đó sẽ làm thay đổi đặc tính kháng nguyên của virus [21]. Chủng virus cúm với các đặc tính kháng nguyên mới có thể thoát khỏi hệ thống miễn dịch của cơ thể và dễ dàng lan truyền trong quần thể. - Hiện tƣợng glycosyl hóa: Glycosyl hóa (glycosylation) là sự gắn kết của một chuỗi oligosaccharide với amino acid asparagine ở một số vị trí nhất định trong 11 chuỗi polypeptide HA hay NA, hay một số polypeptide khác của virus cúm. Thông thường chuỗi oligosaccharide được gắn tại vị trí N-X-S/T (N = asparagine; X = amino acid bất kì, trừ proline; S/T = serine hoặc threonine) [7]. Đây là những vị trí được cho là gắn kết với các kháng thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên, nhằm bảo vệ cơ thể nhiễm. Hiện tượng lệch kháng nguyên sinh ra đột biến điểm hình thành bộ mã của asparagine, tạo tiền đồ cho hiện tượng glycosyl hóa xảy ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA, làm thay đổi đặc tính kháng nguyên của HA và NA, giúp cho virus thoát khỏi tác động miễn dịch bảo vệ của cơ thể chủ và điều hoà sự nhân lên của virus [7]. Hiện tượng lệch kháng nguyên và glycosyl hóa tạo ra những biến đổi di truyền nhỏ nhưng diễn ra liên t ục trong quá trình lưu hành của virus trong tự nhiên . Ngươ ̣c lại, hiện tượng trao đổ i kháng nguyên có thể xảy ra với tất cả các chủng của virus cúm A khi có hiê ̣n tươ ̣ng đ ồng nhiễm, tạo ra các biến đổi di truyền lớn và hình thành chủng virus mới . Đây cũng chính là vấn đề đáng lo ngại của virus cúm A/H5N1 hiện nay, mặc dù virus này chưa có sự thích nghi lây nhiễm dễ dàng ở người, nhưng nó có khả năng gây bệnh cho người với tỉ lê ̣ tử vong rấ t cao . Nế u như chủng virus A/H5N1 trao đổ i gen HA hay NA , hoặc cả hai gen với mô ̣t chủng virus cúm A đã thích nghi ở người (ví dụ như H 1N1 hoă ̣c H 3N2) có thể t ạo ra chủng virus mới thích ứng lây nhiễm dễ dàng ở người, là nguy cơ c ủa một đại dịch cúm mới [25]. 1.1.6. Khả năng thích ứng vật chủ của virus cúm A Vật chủ tự nhiên của tất cả các chủng virus cúm A là các loài thủy cầm hoang dã (chủ yếu là vịt trời), đây là nguyên nhân lan truyền virus trong tự nhiên rất khó kiểm soát. Virus cúm A có khả năng gia tăng biên độ vật chủ của chúng trong quá trình lây truyền ở tự nhiên (hình 1.4). 12 Hình 1.4. Các vật chủ tự nhiên và khả năng lây nhiễm giữa các loài vật chủ của virus cúm A. http://www.medicalecology.org/diseases/influenza/print_influenza.ht Nhờ đặc tính luôn thay đổi kháng nguyên trong tự nhiên, virus cúm A có khả năng xâm nhiễm nhiều loài vật chủ trung gian khác nhau như gia cầm, một số loài động vật có vú (hải cẩu, cá voi, ngựa, lợn…) và cả con người, tạo nên tính thích ứng lan truyền “nội loài” như gà - gà, hay “ngoại loài” như gà - lợn; gà - lợn - người. Đặc điểm thích ứng vật chủ này là điều kiện thuận lợi cho virus cúm A trao đổi, tái tổ hợp các phân đoạn gen, đặc biệt là các phân đoạn gen kháng nguyên (HA và NA) giữa các chủng, tạo ra một chủng virus cúm mới có khả năng thích ứng xâm nhiễm ở loài vật chủ mới của chúng đặc biệt khi chúng vượt qua được “rào cản loài” dễ dàng thích ứng lây nhiễm gây bệnh từ gia cầm sang người và giữa người với người [15]. Các nghiên cứu về virus H5N1 trong thời gian gần đây cho thấy virus đã có những biến đổi để thích nghi lây nhiễm trên người. Hai chủng virus H5N1 phân lập trên người năm 2003 (Hong Kong) cho thấy có hiện tượng giảm ái lực với thụ thể của gia cầm và có ái lực (mặc dù chỉ ở mức thấp) với thụ thể của người và sự thay đổi axit amin ở vị trí 227 (Ser thành Asn) là nguyên nhân làm thay đổi tính đặc hiệu với thụ thể của virus [23]. Đột biến ở vị trí 182 hoặc 192 (Asn182Lys hoặc 13