BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
PHẠM THỊ KIM NHUNG
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI VÀ CHẾ TẠO KÍT
QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM CHẨN ĐOÁN NEISSERIA
MENINGITIDIS, HAEMOPHILUS INFLUENZAE TÝP B,
STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
Chuyên ngành: Động vật học (Vi sinh vật học)
Mã số: 60420103
LUẬN VĂN THẠC SĨ HỌC SINH HỌC
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
1
Hà Nội, 2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO
TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
PHẠM THỊ KIM NHUNG
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI VÀ
CHẾ TẠO KÍT QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM CHẨN
ĐOÁN NEISSERIA MENINGITIDIS, HAEMOPHILUS
INFLUENZAE TÝP B, STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
Chuyên ngành: Động vật học (Vi sinh vật học)
Mã số: 60420103
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Đoàn Trọng Tuyên
Hà Nội, 2015
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
2
ĐẶT VẤN ĐỀ
Viêm màng não là một bệnh lý nhiễm trùng nghiêm trọng, tỷ lệ tử vong cao nếu
không được nghĩ đến, chẩn đoán và điều trị kịp thời. Viêm màng não do vi khuẩn là
bệnh nhiễm trùng hệ thần kinh trung ương cấp tính với biểu hiện lâm sàng rất đa dạng
như: hội chứng màng não rầm rộ, sốt cao, dịch não tủy đục mủ, nhiễm khuẩn huyết...
Bệnh diễn biến nặng, nếu không được chẩn đoán, điều trị kịp thời có thể tử vong hoặc
để lại di chứng nặng nề như: hội chứng màng não, điếc, câm, mù, rối loạn tâm thần,
động kinh....[7]. Bệnh hay gây thành dịch, nhất là những nơi tập trung đông người thì
nguy cơ lây nhiễm là rất cao. Sự hiểu biết về các tác nhân gây bệnh thường gặp sẽ hỗ
trợ cho công tác điều trị và xây dựng các chương trình phòng chống bệnh tật tại từng
Quốc gia. Hầu hết những dữ liệu về dịch tễ của viêm màng não ở người lớn đều xuất
phát từ những quốc gia đã phát triển, trong đó 4 tác nhân cũng là nguyên nhân quan
trọng gây bệnh và tử vong trên thế giới: Streptococcus pneumoniae (phế cầu) 30 - 60%,
Neisseria meningitidis (não mô cầu) 13 - 37%, Listeria monocytogiens và Haemophilus
influenzae [34,18 ].
Những năm gần đây nhiều loại kháng sinh tốt đã được đưa vào sử dụng. Tuy
nhiên tỷ lệ tử vong trung bình ở nhiều nước trong vùng dịch tễ do màng não cầu 7 –
10%, phế cầu 30%, do Haemophilus influenzae là 10 – 14% [7].
Tại Việt Nam, những nghiên cứu về viêm màng não do H. influenza,
S. pneumoniae và N. meningitidis đối với người trưởng thành chưa nhiều, chủ yếu tập
trung ở đối tượng trẻ em. Thời gian gần đây những nghiên cứu dịch tễ học được mở
rộng trên các đối tượng, tuy nhiên chưa có thống kê cụ thể. Theo Lê Thanh Bình (Bệnh
viện Trung ương Huế) từ 1999 – 2001 có 65 trường hợp tỷ lệ tử vong (9%), tỷ lệ di
chứng 11%, nguyên nhân hàng đầu là H. influenza (35,3%), thứ đến là não mô cầu
(18,4%), phế cầu (9,2%). Nghiên cứu của Phạm Nhật An và cộng sự năm 2001 tại
Viện Nhi Trung ương với bệnh nhân từ 0 đến 15 tuổi được chẩn đoán là viêm màng
não với tỷ lệ H. influenzae (50%), S. pneumoniae (22,06%), N. meningitidis
(11,76%), Streptococcus (5,88%) và một số loại vi khuẩn khác.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
3
Để chẩn đoán ca bệnh trước đây chủ yếu dựa vào triệu chứng lâm sàng, yếu
tố dịch tễ, xét nghiệm bằng kỹ thuật nhuộm soi và nuôi cấy phân lập từ những mẫu
bệnh phẩm lâm sàng. Các kỹ thuật này có độ nhạy thấp, thời gian phân lập cần 4872 giờ. Các kỹ thuật này không đáp ứng điều kiện chẩn đoán nhanh, điều trị kịp
thời, vì diễn biến của ca bệnh xảy ra rất nhanh (đặc biệt là não mô cầu từ khi xuất
hiện triệu chứng đầu tiên đến tử vong trung bình 18 giờ) [11 ].
Thử nghiệm ngưng kết hạt latex phát hiện kháng nguyên polysaccaride trong
bệnh phẩm máu, dịch não tủy... của H. influenza là 78 – 100%, đối với S.
pneumoniae là 67- 100% và N. meningitidis là 50 – 93%. Kỹ thuật này đơn giản,
chẩn đoán nhanh hơn kỹ thuật nuôi cấy (<15 phút). Tuy nhiên, kỹ thuật ngưng kết
latex đã xảy ra hiện tượng cho kết quả âm tính và dương tính giả [35], ngoài ra kỹ
thuật này chỉ dùng trong phát hiện ca bệnh.
Trong những năm gần đây, kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex – PCR: mPCR)
dần được cải tiến và phát triển. Với mục đích khắc phục những nhược điểm của các
kỹ thuật trên và phát hiện cùng một lúc 3 tác nhân vi khuẩn trên cơ sở xác định các
gene đặc hiệu, nhằm hỗ trợ công tác điều trị đạt hiệu quả cao, giảm giá thành, thời
gian xét nghiệm, nâng cao chất lượng giám sát, tiên lượng nguy cơ bùng phát dịch
trước, trong và sau vụ dịch, chúng tôi tiến hành: “Nghiên cứu xây dựng qui trình
PCR đa mồi và chế tạo kít qui mô phòng thí nghiệm chẩn đoán Neisseria
meningitidis, Haemophilus influenzae týp b, Streptococcus pneumoniae”
Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài này với mục tiêu:
- Xây dựng qui trình mPCR1 phát hiện N. meningitidis; H. influenzae týp b
và S. pneumoniae.
- Xây dựng qui trình mPCR2 phát hiện N. meningitidis nhóm huyết thanh A,
B, C.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
4
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1. 1.Tổng quan não mô cầu (Neisseria meningitidis)
1.1.1. Lịch sử
Viêm màng não do Neisseria meningitidis (não mô cầu) được Gaspard
Vieusseux mô tả kỹ từ vụ dịch viêm màng não ở Geneve vào mùa xuân năm 1805,
mặc dù từ thế kỷ thứ II trước công nguyên đã được đề cập. Năm 1884 Ettore
Marchiafava và Angelo Celli lần đầu tiên quan sát được vi khuẩn trong tế bào ở
dịch não tủy. Năm 1887 Anton Weichselbaum phân lập được vi khuẩn gây bệnh từ
dịch não tủy của bệnh nhân và mô tả với cái tên là: Diplococcus intracellularis
meningitidis. Sau đó, năm 1901 Albrecht và Ghon đã đổi thành Neisseria
meningitidis để ghi công Albert Neisser – nhà khoa học người Đức[8,36].
1.1.2. Dịch tễ học
Dịch não mô cầu xảy ra tại các khu vực khác nhau trên thế giới. Tác
nhân gây bệnh có thể thay đổi tùy theo vùng địa lý, mùa, thời gian và độ tuổi. Hầu hết
nguyên nhân gây dịch ở Châu Phi là do nhóm huyết thanh A, mặc dầu vậy nhóm C,
W135 và X cũng đã được ghi nhận (Greenwood, 2007). Ở Châu Âu và các vùng
công nghiệp, nhóm B và C là nguyên nhân chính gây bệnh viêm màng não, trong đó
nhóm B thường gây bệnh ở người dưới 20 tuổi. Năm 2007, tỷ lệ tử vong là
1/100.000 dân, cao hơn ở Ireland và UK là: 3,8/100.000 và 2,5/100.000 dân (CDC,
2009). Theo Rosenstein NE, Perkins BA và cộng sự (1999) thì nhóm A và C thường
gây bệnh ở Châu Á và Châu Phi, nhóm C gây một số vụ dịch ở Canada, Mỹ (19921993) và Tây Ban Nha (1995-1997). Nhóm B gần đây gây dịch nhiều hơn ở Tân
Tây Lan với 500 trường hợp hàng năm. Vụ dịch lớn ở Trung Quốc năm 1979 - 1980
bắt nguồn từ phía Bắc sau đó lan đến phía Nam nước này và lan ra toàn cầu và
nguyên nhân là do não mô cầu nhóm A. Trong vài năm gần đây, nhiễm khuẩn não
mô cầu do nhóm Y và W135 có chiều hướng tăng lên. Israel và Thụy điển cũng
cung cấp các số liệu cho thấy sự gia tăng của nhóm Y. Theo CDC, tại Mỹ, các ca
bệnh do nhóm W135 đã tăng từ 4% lên 20% trong vòng 3 năm từ 1978 đến 1980;
đặc biệt nhóm W135 gây bệnh cho vài trăm người ở Arập Saudi (2000-2001), gây
dịch ở Burkina Faso (Châu Phi) làm chết hơn 1.500 người. Năm 1996, vụ dịch não
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
5
mô cầu lớn nhất trong lịch sử 100 năm đã xảy ra tại vùng ngoại ô Saharan - Châu
Phi với 152.813 người mắc và 15.783 người chết.
Tại Việt Nam vào năm 1939-1940 ở miền Bắc, có một vụ dịch lớn nhiễm
trùng huyết và viêm màng não do N. meningitidis lan từ Trung Quốc sang với số
bệnh nhân lên tới 7.000 người [22]. Sau năm 1941, miền Bắc vẫn còn thấy một số
vụ dịch nhỏ. Năm 1977 vụ dịch ở Thành phố Hồ Chí Minh có 1015 ca mắc, do N.
meningitidis nhóm C gây ra [5]. Theo tác giả Bùi Đại (2009), các nhóm huyết thanh
lưu hành tại Việt Nam chủ yếu là nhóm huyết thanh A, B, C. Tuy nhiên, năm 2011
ghi nhận 1 trường hợp nhiễm nhóm W135 và một trường hợp đồng nhiễm cả B và
W135 tại Bắc Giang [9]. Giai đoạn từ 2001 – 2010, trung bình ghi nhận 650 trường
hợp mắc bệnh mỗi năm, chủ yếu ở các tỉnh khu vực phía Bắc. Năm 2012 ghi nhận
125 trường hợp mắc. Đầu năm 2013 vẫn có các trường hợp mắc rải rác tại nhiều
tỉnh, thành phố trong cả nước, nguy cơ lây lan trong cộng đồng là rất lớn [6]. Theo
Bộ Y tế, trong 6 tháng đầu năm 2015 cả nước ghi nhận 24 ca bệnh viêm màng não
do N. meningitidis, tăng 16 ca so với cùng kỳ năm ngoái. Trong đó riêng tháng 4, cả
nước ghi nhận 11 ca viêm màng não do não mô cầu, 2 ca tử vong.
N. meningitidis cư trú tại vùng họng mũi của người và lây truyền theo các
giọt nước nhỏ bài tiết qua đường hô hấp. Bệnh lây truyền trực tiếp do tiếp xúc gần
hay gián tiếp qua trung gian đồ dùng chung bị nhiễm khuẩn của bệnh nhân. Con
người là ký chủ tự nhiên duy nhất của não mô cầu, hiện nay chưa phát hiện có ký
chủ hay véctơ truyền bệnh nào khác. Thời gian ủ bệnh thường không xác định được
rõ và đã được ước tính trung bình từ 1 đến 10 ngày.
N. meningitidis có khả năng gây dịch lớn hoặc các trường hợp lẻ tẻ. Nhóm A
thường gây bệnh dịch lớn, xảy ra theo chu kỳ khoảng 20 - 30 năm hoặc dịch nhỏ có
chu kỳ 8 – 12 năm. Nhóm B và C thường gây các trường hợp riêng lẻ giữa thời gian
có dịch lớn, tuy nhiên vẫn có khả năng gây thành dịch lớn. Nhóm Y chỉ gây dịch
riêng lẻ trên trẻ em và thanh niên. Tuổi dễ mắc bệnh nhất là trẻ em từ 6 tháng đến 3
tuổi hoặc thanh thiếu niên từ 14 – 20 và tỷ lệ bệnh thấp ở người trên 20 tuổi. Tỷ lệ
người lành mang vi khuẩn chiếm khoảng 5 – 15%, tuy nhiên tỷ lệ này có thể dao
động và có mức độ cao hơn ở một số cộng đồng nhất định [5]. Bệnh thường xảy ra
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
6
ở nơi tập trung đông người (nhà trẻ, trường học, ký túc xá, doanh trại...), hay gặp
vào mùa đông - xuân.
1.1.3. Đặc điểm sinh học
Hình thể
N. meningitidis là cầu khuẩn Gram âm, kích thước thay đổi, có thể thấy ở dạng đơn
độc hoặc song cầu hình hạt cà phê với hai mặt dẹt đối diện nhau, kích thước khoảng 0,8
- 1µm, đứng riêng rẽ từng đôi một hoặc nhiều đôi tụ thành đám và có thể nằm trong
hoặc ngoài bạch cầu đa nhân. Trên tiêu bản nhuộm từ môi trường nuôi cấy, não mô cầu
thường có hình thể đa dạng, to nhỏ khác nhau và cách sắp xếp không điển hình. Vi
khuẩn ở trong bệnh phẩm dịch não tủy thường có vỏ, không di động, không sinh nha
bào, bắt màu Gram (-), đa số các chủng đều có vỏ.
Hình 1.1: N. meningitidis dưới kính hiển vi điện tử. Nguồn: Internet.
Tính chất nuôi cấy
N. meningitidis là loại vi khuẩn khó nuôi cấy, chỉ phát triển tốt ở môi trường
giàu chất dinh dưỡng như thạch máu, chocolate và khí trường có 5 – 10% CO2,
nhiệt độ thích hợp cho phát triển là 370C.
Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc tròn, nhẵn, lồi, óng ánh và có màu hơi
xám. Sau 24 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc có đường kính khoảng 1mm, không tan máu,
để lâu khuẩn lạc có màu xám đục và có thể làm màu môi trường ở dưới vùng nuôi
cấy vi khuẩn đậm.
Trên môi trường thạch chocolate, khuẩn lạc có dạng S, xám đục và óng ánh.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
7
Hình 1.2: N. meningitidis trên môi
Hình 1.3: N. meningitidis trên môi
trường thạch chocolate. Nguồn CDC.
trường thạch máu. Nguồn CDC.
Sức đề kháng
Cầu khuẩn N. meningitidis có sức đề kháng yếu: chỉ sống được trong bệnh
phẩm dịch não tuỷ 3 – 4 giờ sau khi ra khỏi cơ thể. Bị tiêu diệt ngay với tia cực tím,
dung dịch chloramin 0,5 – 1% hoặc cồn 700. Ở nhiệt độ 550C/30 phút hoặc ở
600C/10 phút não mô cầu cũng bị tiêu diệt. Không chịu được khô và ánh sáng. Các
thuốc sát trùng thông thường dễ tiêu diệt cầu khuẩn màng não. Ngoài ra vi khuẩn dễ
bị chết do men tự ly giải.
Cấu trúc kháng nguyên [5, 8,31,36]
Màng tế bào chất
Khoảng gian màng
Màng ngoài tế bào
Protein màng tế bào chất
Por A
Màng ngoài tế bào
Lipooligosaccharide
Por B
Pili
Vỏ
Protein màng ngoài
Phospholipid
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
8
Hình 1.4: Hình ảnh màng tế bào N. meningitidis cắt ngang.
Nguồn: Nancy E. Rosenstein và cộng sự (2001) [31].
- Lớp polysaccharide (PS) nang: là kháng nguyên vỏ, có tác dụng tạo kháng thể
bảo vệ (ngoại trừ nhóm B). Căn cứ vào tính không đồng nhất về cấu trúc và tính
kháng nguyên của PS người ta đã tìm được 13 nhóm huyết thanh của cầu khuẩn
màng não bao gồm: A, B, C, D, 29E, H, I, K, L, W135, X, Y, Z. Nhóm A chứa
mannosamine phosphate, trong khi đó nhóm B , C, Y, W135 chứa acid sialic - chất
đóng vai trò quan trọng trong sự tồn tại và độc tính.
- Lớp lipo - oligosaccharide (LOS) – Endotoxin: Cấu tạo của LOS gồm 1
glycolipid màng ngoài nhưng thiếu các chuỗi O đặc trưng và hình thái “xù xì” (ráp)
tương tự như của LPS. Nó bao gồm 3 thành phần chính: oligosaccharide nhân; lipid
A kỵ nước (thành phần gây độc) và một chuỗi oligosaccharide nhánh có thể thay
đổi (thành phần tạo miễn dịch). Tính không đồng nhất về cấu trúc và tạo miễn dịch
của các chuỗi oligosaccharide nhánh (lgtA, lgtC, lgtD và lgtG), được sử dụng để
phân loại các chủng thành 12 type miễn dịch bằng cách sử dụng kháng thể đơn
dòng. Type miễn dịch L1 - L8 liên quan chi phối nhóm huyết thanh B, C; type miễn
dịch L9 - L12 liên quan đến nhóm A. Màng ngoài chứa hơn 50% LOS, nó tương tự
như polysaccharide của vi khuẩn Gram âm và chứa lipid A.
- Lớp protein của màng ngoài (Por A và Por B): đặc hiệu type huyết thanh
(serotype) và phân type huyết thanh (serosubtype). Màng ngoài não mô cầu chứa một
số protein màng ngoài chính (OMPs): chức năng của Por B (tên trước đây là protein
lớp 2/3) và Por A (protein lớp 1) như porin, cho phép các chất dinh dưỡng đi vào. Hầu
hết độ lớn các kháng nguyên bộc lộ trên bề mặt tế bào não mô cầu và độ lớn của kháng
nguyên giữa các chủng là khác nhau, nên N. meningitidis được phân chia trên 20
serotype và serosubtype khác nhau chủ yếu ở nhóm B, C. Nhiều chủng phân lập không
thể phân loại được là serotype hay serosubtype nào bằng kháng thể đơn dòng hiện tại.
Cấu trúc kháng nguyên của type huyết thanh và phân type huyết thanh thay đổi in
vivo một cách nhanh chóng trên một cá thể người và trong cộng đồng. Sự thay đổi
này làm cho việc phát triển vắc xin mới là hết sức khó khăn.
Kháng nguyên X: kháng nguyên này chung với cầu khuẩn lậu cầu, phế cầu khuẩn.
Kháng nguyên này được dùng trong một số kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh.
1.1.4. Chẩn đoán [5]
a. Chẩn đoán ca bệnh lâm sàng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
9
- Dựa vào yếu tố dịch tễ: Có tiếp xúc với bệnh nhân hoặc sống trong tập thể
(nhà trẻ, trường học, ký túc xá, doanh trại…) có người đã được xác định bị mắc
bệnh do não mô cầu.
- Dựa vào lâm sàng:
+ Thời kỳ ủ bệnh trung bình là 4 ngày (2-10 ngày).
+ Biểu hiện nhiễm trùng: Sốt cao đột ngột, ho, đau họng, mệt mỏi, nhức
đầu... Tình trạng nhiễm trùng nhiễm độc nặng (sốc), có thể tử vong nhanh trong
vòng 24 giờ
+ Dấu hiệu màng não - não: Đau đầu dữ dội, nôn, gáy cứng (trẻ nhỏ có thể có
tiêu chảy, thóp phồng và gáy mềm), rối loạn ý thức, kích thích vật vã, có thể có co
giật, hôn mê…
+ Ban xuất huyết hoại tử hình sao, xuất hiện sớm và lan nhanh.
b. Chẩn đoán xác định ca bệnh
- Là ca bệnh lâm sàng, có kèm theo xác định được vi khuẩn gây bệnh bằng
một trong các xét nghiệm sau:
+ Soi thấy song cầu gram (-), cấy phân lập được N. meningitidis trong dịch
não tủy.
+ Cấy máu phân lập được N. meningitidis.
+ Soi và cấy phân lập được N. meningitidis trong tử ban.
+ PCR (+) với N. meningitidis trong dịch não tủy, máu, tử ban.
Kỹ thuật nhuộm soi
Bệnh phẩm là dịch não tủy (ly tâm lấy cặn nếu dịch não tủy trong) nhuộm gram,
soi trên kính hiển vi thấy hình ảnh song cầu gram (-) nằm trong và ngoài tế bào.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
10
Hình 1.5: N. meningitidis nhuộm Gram từ dịch não tủy.
Nguồn: WHO [40].
Kỹ thuật nuôi cấy, phân lập
Tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán não mô cầu là phân lập được N. meningitidis từ
dịch tiết vô trùng của cơ thể như: dịch não tủy, máu (lấy trước khi dùng kháng
sinh), được cấy trên môi thạch máu, môi trường Thayer - Martin cải tiến hoặc
chocolate (có bổ sung kháng sinh VCN) và được ủ ở 370C, 10% khí CO2. Chọn
khuẩn lạc, thử các tính chất sinh vật hoá học và ngưng kết với kháng huyết thanh để
xác định nhóm. Sự khác biệt với các vi khuẩn thuộc loài khác là khuẩn lạc được thử
nghiệm oxidase, catalase dương tính và thử nghiệm sinh hóa lên men. Cuối cùng là
xác định về huyết thanh nhằm xác định subgroup của N. meningitidis, đây là vấn đề
quan trọng trong giám sát dịch tễ học, phần này chỉ có thực hiện tại các phòng thí
nghiệm chuyên dụng.
Hình 1.6: N. meningitidis mọc trên thanh định danh API NH. Nguồn Internet.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
11
Kỹ thuật điện di miễn dịch: Phát hiện polysaccharide đặc hiệu của N.
meningitidis trong dịch não tuỷ, máu và nước tiểu. Kỹ thuật này có thể phát hiện được
polysaccharide ở mức 0,1µg/ml.
Kỹ thuật ngƣng kết: Gắn anti-polysaccaride lên hồng cầu hoặc hạt latex để
phát hiện kháng nguyên polysaccaride của N. meningitidis trong bệnh phẩm máu,
dịch não tủy, nước tiểu, độ nhạy dao động từ 2,5 - 62,5 ng/ml (62,5ng/ml đối với N.
meningitidis nhóm B) và chỉ dùng trong phát hiện ca bệnh. Do đó Trung tâm kiểm
soát bệnh tật CDC khuyến cáo không sử dụng kỹ thuật này trong thường qui xét
nghiệm chẩn đoán nhiễm não mô cầu.
Hình 1.7: Bộ sinh phẩm Pastorex phát hiện N. meningitidis.
Kỹ thuật sinh học phân tử
Phương pháp PCR, realtime PCR là công cụ tốt cho phát hiện tác nhân vi sinh vật
từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng (dịch tiết, máu và dịch não tủy, dịch tử ban…) và
không cần thiết yêu cầu vi khuẩn phải sống trong mẫu bệnh phẩm (vi khuẩn chết,
hoặc đang bị ly giải do điều kiện bảo quản hoặc trước khi sử dụng kháng sinh). Cho
đến nay PCR đã được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán và giám sát tác nhân vi sinh
vật vì nó có độ nhậy và độ đặc hiệu cao, nó chứng minh là công cụ bổ sung tốt cho
các phương pháp xác định kiểu hình như: nuôi cấy, nhuộm gram, và ngưng kết hạt
latex để nâng cao nhận định khẳng định kết quả. Kỹ thuật PCR rút ngắn thời gian
xét nghiệm còn khoảng 4 - 6 giờ, phù hợp với yêu cầu chẩn đoán nhanh trên đối
tượng bệnh nhân và điều tra người mang N. meningitidis trong vụ dịch. Tuy nhiên,
PCR không thể thay thế hoàn toàn được kĩ thuật nuôi cấy, phân lập thường qui.
Nuôi cấy, phân lập vừa tiêu chuẩn vàng vừa có thể giữ chủng não mô cầu, thử
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
12
nghiệm kháng sinh đồ, tuyển chọn chủng sản xuất vắc xin và thực hiện những
nghiên cứu chuyên sâu khác.
Một số gene đích xác định loài và nhóm N. meningitidis
Việc xác định N. meningitidis bằng kỹ thuật PCR tiêu chí được đặt lên hàng đầu
đó là lựa chọn các đoạn gene đặc hiệu và phù hợp, nhiều phòng thí nghiệm trên thế
giới sử dụng các đoạn gene đặc hiệu như ctrA, porA, crgA, sodC, IS1106... để phát
hiện loài N. meningitidis. Để phát hiện nhóm huyết thanh sử dụng gene sacD hoặc
Orf-2 cho phát hiện nhóm A, gene siaD cho phát hiện nhóm B và C.
Mỗi gen có vai trò và chức năng nhất định ví dụ: gene ctrA và sodC là hai
gene vận chuyển capsule đến bề mặt tế bào. Gene ctrA là đoạn gene mã hóa protein
màng ngoài có tính bảo thủ cao, ít thay đổi cấu trúc và được tìm thấy trong tất cả
các nhóm huyết thanh. Gene sodC phát hiện khả năng hình thành vỏ của cầu khuẩn,
nó có vùng đặc hiệu cho não mô cầu trên người bệnh và nhất là ở người mang mầm
bệnh không triệu chứng mà ở đó không có gene ctrA và được tìm thấy trong N.
meningitidis nhưng không có trong loài Neisseria. spp [24]. Gene porA là một
protein màng ngoài có chức năng như một tế bào mitogen B hay các chất hoạt hóa,
và lipooligosaccharide (LOS), là tác nhân chính có chức năng nội độc tố
(Singleton et al., 2005), gene crgA thuộc vùng gene bảo thủ, gen này tham gia điều
tiết độ bám dính của N. meningitidis để bám dính vào tế bào vật chủ[28].
Sơ đồ 1.1: Bản đồ gene capsule (CPS) của N. meningitidis. Nguồn CDC.
1.1.5. Đáp ứng miễn dịch [1,4,36,41]
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
13
Kháng nguyên gây miễn dịch của N. meningitidis nhóm A, C là
polysaccharide vỏ và sẽ tạo kháng thể chuyên biệt là IgG hay IgM. Riêng đối với
nhóm B, kháng nguyên gây miễn dịch chưa được định nghĩa rõ ràng, có thể bao
gồm cả protein màng tế bào và chỉ tạo đáp ứng IgM đơn thuần. Kháng nguyên vỏ
của nhóm B trong chẩn đoán miễn dịch thường gây phản ứng chéo với vỏ E. coli
serotype K1 (hay gây viêm màng não ở trẻ nhỏ) .
Trẻ em mới sinh có thể có miễn dịch thụ động IgG do được mẹ truyền qua nhau
thai. Miễn dịch sau tiêm vắc xin thu được ở các mức độ khác nhau tùy theo nhóm.
1.1.6. Điều trị dự phòng [5]
- Sử dụng thuốc điều trị dự phòng càng sớm càng tốt, tốt nhất là trong vòng
24h. Sau khi có chẩn đoán xác định ca bệnh thì những người tiếp xúc gần sử dụng
một trong các loại kháng sinh: Ciprofloxacin, Rifampicin, Azithromycin.
- Những người có tiếp xúc mật thiết với bệnh nhân trong thời gian từ 7 ngày trước
ngày khởi phát cho đến 24 giờ sau khi bệnh nhân được dùng kháng sinh đặc hiệu.
- Hạn chế tối đa việc tiếp xúc với bệnh nhân và những người khác.
- Vệ sinh cá nhân, đảm bảo thông thoáng nhà cửa theo nguyên tắc phòng bệnh
qua đường hô hấp.
- Vắc xin phòng bệnh: Trên thị trường phổ biến có 3 loại vắc xin: loại chứa một
kháng nguyên (A hoặc C), chứa 2 kháng nguyên (A và C) và cả bốn kháng nguyên (A,
C, Y và W 135). Riêng đối với nhóm B trên thế giới chỉ có vắc xin sản xuất tại Cu Ba
đạt tiêu chuẩn đưa vào chương trình tiêm chủng thường xuyên cho trẻ em.
1. 2.Tổng quan Haemophilus influenzae
1.2.1. Lịch sử
H. influenzae đã được phân lập đầu tiên vào năm 1892 bởi Richard Pfeiffer
từ đờm của một bệnh nhân cúm và được gọi là Bacterial influenzae (vi khuẩn cúm).
Vi khuẩn này đã bị nhầm lẫn với bệnh cúm cho đến năm 1933 khi phát hiện ra virút
cúm là căn nguyên gây bệnh cúm, vai trò của H. influenzae mới được làm sáng tỏ.
Xuất phát từ yếu tố lịch sử và nhu cầu đòi hỏi những yếu tố phát triển có mặt ở máu
(heamophilus: ưa máu) nên vi khuẩn này có tên gọi H. influenzae , thuật ngữ này
được để nguyên trong y văn tiếng Việt [2].
1.2.2. Dịch tễ học
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
14
Vi khuẩn H. influenzae là một trong những loại vi khuẩn ký sinh ở đường
hô hấp người và một số loài động vật. Loài H. influenzae là căn nguyên của một số
bệnh nhiễm trùng ở người (viêm đường hô hấp, viêm màng não...). H.
influenzae týp b (Hib) đã được thế giới xác định là một trong những căn nguyên
chính gây viêm màng não do vi khuẩn, đặc biệt ở trẻ em dưới 5 tuổi [10]
Tại những nước phát triển như khu vực Bắc Mỹ, Tây Âu, châu Úc hầu hết
những nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mang Hib ở họng rất cao ở trẻ nhỏ, đặc biệt là
những trẻ được chăm sóc tại các các trung tâm giữ trẻ có thể mang Hib đến 15%
[10]. Trẻ bị bệnh VMN nếu không được điều trị kịp thời có thể để lại những di
chứng nặng nề về thần kinh , khiến trẻ bị điếc , trí tuệ sa sút , mấ t khả năng ho ̣c tâ ̣p ,
khó khăn khi vâ ̣n đô ̣n g… Tỷ lệ tử vong có thể từ 5-10% đối với những trẻ bị viêm
màng não do Hib.
Trên thế giới, hàng năm, ước tính khoảng 8 triệu trường hợp viêm phổi, viêm
màng não mủ và khoảng 400.000 trẻ tử vong do Hib. Còn tại Việt Nam, theo thống
kê năm 2000 do WHO hợp tác với Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương tiến hành, ước
tính Hib gây ra 625 trường hơ ̣p VMN, 107.565 trường hơ ̣p viêm phổi nặng hàng
năm. Theo một nghiên cứu tại nội thành Hà Nội từ tháng 3/2000 - 2/2002: hàng
năm số mắc VMN do Hib khoảng 12/100.000 trẻ dưới 5 tuổi, với tỷ lệ tử vong 4%
và tỷ lệ di chứng 10%.
Vi khuẩn Hib tồn tại ở mũi và họng, dễ lây truyền từ người này sang người
khác qua đường hô hấp, qua những giọt nước bọt do hắt hơi vào ho. Người chưa có
miễn dịch phòng bệnh đều có nguy cơ cao mắc bệnh này, đặc biệt là trẻ từ 6 tháng
đến dưới 2 tuổi. Những người mang vi khuẩn Hib không có bất kỳ dấu hiệu, triệu
chứng nào của bệnh. Tuy nhiên, căn bệnh này hoàn toàn có thể phòng bằng tiêm
vắc xin sớm và đủ mũi cho trẻ dưới 6 tháng tuổi [14].
1.2.3. Đặc điểm sinh học [2, 13,14]
Hình thể
Hình thể điển hình của H. influenzae là cầu trực khuẩn nhỏ, Gram âm. Kích
thước 0,3 - 0,5 x 0,5 – 3,0 µm nhưng uốn cong ở hai đầu trông như hình cầu. Tuy
nhiên khi chúng ở dịch não tủy, hình thể của chúng có thể kéo dài ra gấp vài lần so
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
15
với chiều dài thông thường (vi khuẩn đa hình thái). Thường có vỏ, không có lông,
không sinh nha bào và không di động.
Hình 1.8: H. influenzae dưới kính hiển vi điện tử. Nguồn Internet.
Tính chất nuôi cấy
H. influenzae thuộc loại vi khuẩn khó nuôi cấy. Là vi khuẩn khuyết dưỡng,
không phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường chỉ mọc khi môi
trường có sẵn cả hai yếu tố X và V.
H. influenzae hiếu khí, phát triển tốt hơn trong khí trường 5 – 10% CO2. Mọc
tốt trên môi trường chocolate có Bacitracin và Levinthal ở nhiệt độ 370C, thời gian
18 – 24 giờ. Không mọc được trên thạch máu cừu, nếu mọc trên các loại thạch máu
khác (máu thỏ) thì không gây tan máu và khuẩn lạc nhỏ hơn nhiều so với trên
chocolate trong cùng điều kiện và thời gian nuôi cấy. Trên môi trường thạch máu có
thể thấy hiện tượng bội nhiễm của khuẩn lạc Staphylococcus aureus (do khả năng
tiết ra yếu tố V của S. aureus) còn môi trường này đã sẵn có yếu tố X.
Trên môi trường thạch, sau 16 – 18 giờ, H. influenzae phát triển thành khuẩn
lạc bóng mờ, vồng nhẹ, nhày ướt, óng ánh, không tan huyết, có mùi hăng đặc biệt
(hăng idol), đường kính 1 - 2 mm, khi có ánh sáng chiếu vào có đường kính lớn
hơn. Sau 24 giờ trạng thái mất vỏ xuất hiện, tính óng ánh biến mất, vi khuẩn tự ly
giải và tính chất bắt màu Gram thay đổi.
Trên môi trường lỏng, H. influenzae làm đục môi trường. Tình trạng mất vỏ
xảy ra sớm hơn trên môi trường thạch.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
16
Hình 1.9: H. influenzae trên môi
Hình 1.10: H. influenzae thử
trường thạch chocolate. Nguồn CDC.
nghiệm yếu tố X, V. Nguồn CDC.
Sức đề kháng
H. influenzae là vi khuẩn chịu đựng rất kém với các yếu tố ngoại cảnh.
Trong bệnh phẩm, chúng chết nhanh chóng nếu để ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp,
để khô hoặc lạnh giá. Các chất sát khuẩn thông thường tiêu diệt vi khuẩn này dễ
dàng. Vì vậy, bệnh phẩm để chẩn đoán H. influenzae nên được vận chuyển về
phòng thí nghiệm càng sớm càng tốt (trong vòng 1 giờ hoặc không quá 6 giờ ở nhiệt
độ phòng). Nếu là tăm bông bệnh phẩm phải giữ trong môi trường vận chuyển, bảo
quản 4 – 80C tối đa 24 giờ.
Cấu trúc kháng nguyên
H. influenzae có nhiều loại kháng nguyên như kháng nguyên vỏ, kháng
nguyên vách, kháng nguyên pili…Tuy nhiên H. influenzae được phân thành 2
nhóm: loại không vỏ polysaccharide (không xác định được týp huyết thanh) và loại
có vỏ (xác định được týp huyết thanh). Loài có vỏ được phân loại theo các týp huyết
thanh từ a đến f tùy thuộc vào đặc tính kháng nguyên của vỏ do gene qui định.
Trong đó týp b thường gặp và có vai trò gây bệnh quan trọng. Các gene mã hóa cho
việc tổng hợp kháng nguyên này nằm trên một phức hợp transposon (gen nhảy). Vỏ
bọc týp b là một dạng trùng hợp của ribose, ribitol và phosphate, được gọi là
polyribosyl – ribitol – phosphate (PRP). Những polysaccharide bề mặt có liên quan
chặt chẽ với độc lực của vi khuẩn, đặc biệt Hib nguyên nhân của nhiễm trùng hệ
thống nghiêm trọng bao gồm cả viêm màng não (chiếm trên 90%).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
17
Kháng nguyên pili và các protein bám dính giúp vi khuẩn bám vào tế bào
cơ thể chủ. Pili giúp vi khuẩn bám vào tế bào biểu mô đường hô hấp. Ngoài pili,
bốn yếu tố bám dính có bản chất protein là Hap, HMW1, HMW2 và Hia/Hsf. Sự
phân bố của các yếu tố bám dính có sự khác nhau tùy theo từng chủng.
1.2.4. Chẩn đoán [2,13]
a. Chẩn đoán lâm sàng
Trên lâm sàng, viêm màng não do Hib có thể tiến triển âm ỉ trên vài ngày,
thường phối hợp với nhiễm trùng đường hô hấp trên hoặc đột ngột tiến triển trong
vài giờ.
Những dấu hiệu không đặc hiệu: sốt, ngủ gà, suy hô hấp, rối loạn tâm thần,
dấu hiện Brudzinski, Kernig, co giật... Đối với trẻ lớn thường có nhức đầu, cứng
gáy, sợ ánh sáng.
b. Chẩn đoán phòng thí nghiệm
Hiện nay, bên cạnh phương pháp nuôi cấy phân lập truyền thống thì những
phương pháp chẩn đoán có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian trả lời kết quả
nhanh cũng được áp dụng để phát hiện Hib trong chẩn đoán viêm màng não.
Kỹ thuật nhuộm soi
Nhuộm soi có giá trị chẩn đoán sơ bộ Hib cũng như vi khuẩn khác gây viêm
màng não mủ. Lấy cặn ly tâm dịch não tủy làm tiêu bản nhuộm Gram. Nếu là viêm
màng não mủ do H. influenzae sẽ thấy các cầu trực khuẩn Gram âm to nhỏ không
đều, rải rác có thể thấy các vi khuẩn dài mảnh. Trên vi trường còn thấy nhiêu bạch
cầu đa nhân.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
18
Hình1.11: H. influenzae dưới kính hiển vi. Nguồn Internet.
Kỹ thuật nuôi cấy phân lập
Loại bệnh phẩm tùy theo bệnh. Đối với nhiễm khuẩn đường hô hấp bệnh
phẩm thường là đờm, dịch họng mũi, dịch phế quản hoặc dịch não tủy... thì cấy trên
môi trường thạch chocolate có bổ sung Bacitracin (nồng độ 300µg/ml), đặt vào tủ
ấm 370C với 5 – 10% CO2. Sau 18 – 24 giờ chọn khuẩn lạc nghi ngờ, nhuộm soi
xem hình thể và tính chất bắt màu, tiếp theo làm các thử nghiệm sinh hóa và kháng
huyết thanh để phân biệt capsule polysaccharide (serotype) và phân biệt giữa
H. influenzae b với loài không tạo vỏ.
Mặc dù có tính đặc hiệu cao, nhưng phân lập H. influenzae gặp khó khăn, do
sử dụng kháng sinh trước khi thu thập mẫu bệnh phẩm sẽ làm giảm tỷ lệ phân lập
được bởi vi khuẩn sẽ bị diệt trước khi được xác định. Mặt khác H. influenzae rất
yếu, bất kỳ sự thay đổi nào trong qui trình nuôi cấy sẽ làm giảm tỷ lệ phân lập. Đối
với các nước đang phát triển phòng thí nghiệm còn nghèo nàn dẫn đến kết quả phân
lập không cao đối với H. influenzae.
Kỹ thuật điện di miễn dịch
Còn được gọi là chẩn đoán Rapis test (RDT), kỹ thuật này đã được phát triển
để thử nghiệm trực tiếp kháng nguyên trong mẫu DNT mà không cần giai đoạn ủ
nhiệt và ly tâm, cho kết quả nhanh nhưng độ nhạy thấp thường cho kết quả âm tính
giả do nồng độ vi khuẩn trong mẫu xét nghiệm thấp.
Kỹ thuật ngƣng kết
Kỹ thuật ngưng kết hạt latex phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của Hib trong
DNT. Nguyên lý của phản ứng này là phát hiện kháng nguyên vỏ polysaccharide
của Hib trong DNT bằng kháng thể đơn giá kháng vỏ đặc hiệu với Hib được gắn lên
bề mặt hạt latex.
Thử nghiệm ngưng kết hạt latex (LAT) là một kỹ thuật có độ nhậy phát hiện
H. influenzae hơn nuôi cấy, phân lập, bởi vì kỹ thuật này phát hiện kháng nguyên,
không cần vi khuẩn sống, kết quả này không bị ảnh hưởng của kháng sinh sử dụng
trước đó. Tuy nhiên, thử nghiệm nhậy cảm kháng sinh là không thể thực hiện được
bằng thử nghiệm LAT, do đó vấn đề nuôi cấy vẫn là hết sức cần thiết.
Kỹ thuật sinh học phân tử
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
19
Có thể dùng phản ứng khuếch đại gene PCR, realtime - PCR để phát hiện
AND đặc trưng của H. influenzae trong bệnh phẩm. Phương pháp này có độ nhạy và
độ đặc hiệu cao, thời gian trả lời kết quả nhanh.
Một số gene đích phát hiện H. influenzae
Các gene hpd mã hóa protien D có tính bảo thủ cao, bản chất là
Lipoprotein bao phủ bề mặt tế bào vi khuẩn và nó có ở cả chủng encapsule và
nonencapsule [25,26], tính bảo thủ hiển nhiên của gene này có trong toàn bộ chủng
Hi, đó là lý do sử dụng gene này trong việc định loại đặc hiệu loài trong các thử
nghiệm PCR. Hiện nay phát triển thường quy gene hpd trong phản ứng PCR xác
định 6 serotype (a-f) và nontypeable (HiNT) có độ nhậy và độ đặc hiệu cao.
Multiplex - PCR và realtime – PCR sử dụng gene đích là bexA đã được phát triển
xác định 6 serotype của Hi. Tuy nhiên, độ nhậy phát hiện với Hib kém hơn so với
Hia,Hic, và Hid và không phát hiện được Hie, Hif, hoặc HiNT.
Capsule của 6 serotype của Hi (Hia,b,c,d,e và f) bao gồm 3 vùng mã hóa
chức năng để tổng hợp capsule polysaccharide (25,43,44). Gene bexD;C;B;A trong
vùng ATP (vùng I) mã hóa protein cho ATP. Gene hcsA và hcsB trong (vùng III),
tương tự lipA và lipB ( hiện nay gọi tên là ctrE và ctrF) (43), hai vùng này quyết
định toàn bộ serotype. Vùng đặc hiệu serotype (trước đây gọi là vùng II) bao gồm
các gene tổng hợp capsule và đặc trưng cho mỗi serotype. Những gene đặc hiệu cho
serotype có tên là asc,bcs.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
20
- Xem thêm -