BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN HUỲNH ĐỨC
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG HAI ĐỒNG PHÂN
BUTYLPARABEN VÀ ISOBUTYLPARABEN
TRONG MỘT SỐ MỸ PHẨM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2018
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN HUỲNH ĐỨC
MÃ SINH VIÊN: 1301097
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG HAI ĐỒNG PHÂN
BUTYLPARABEN VÀ ISOBUTYLPARABEN
TRONG MỘT SỐ MỸ PHẨM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Lê Thị Hường Hoa
2. GS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu
Nơi thực hiện:
Khoa Mỹ Phẩm
Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương
HÀ NỘI - 2018
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới GS.TS Thái Nguyễn
Hùng Thu, TS. Lê Thị Hường Hoa – hai người thầy đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và
truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài này.
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới DS. Ngô Thị Duyên cùng với sự giúp đỡ,
hướng dẫn của các cán bộ, nhân viên trong khoa Mỹ Phẩm – Viện Kiểm Nghiệm Thuốc
Trung Ương.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội, các
thầy cô bộ môn Hóa Phân Tích – Độc Chất, các thầy, các cô trong trường đã trang bị cho
tôi kiến thức quý báu và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập tại trường.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, anh em trong gia đình và
bạn bè đã luôn bên cạnh động viên hỗ trợ tôi lúc khó khăn.
Hà Nội, ngày 07 tháng 05 năm 2018
Sinh viên
Nguyễn Huỳnh Đức
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .............................................................................................. 2
1.1. TỔNG QUAN VỀ PARABEN ..................................................................................... 2
1.1.1. Đặc điểm chung ......................................................................................................... 2
1.1.2. Tính chất của butylparaben và isobutylparaben................................................... 2
1.1.3. Ứng dụng của paraben ............................................................................................. 3
1.1.4. Độc tính của paraben ............................................................................................... 3
1.1.5. Hành động của cơ quan quản lý đối với sản phẩm mỹ phẩm chứa paraben ..... 4
1.1.6. Một số nghiên cứu về phân tích paraben trong mỹ phẩm .................................... 5
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC ................................................................. 5
1.2.1. Khái niệm sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao ..................................................... 5
1.2.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký ............................................................................. 6
1.2.3. Cấu tạo của máy HPLC ........................................................................................... 6
1.2.4. Các thông số của quá trình sắc ký .......................................................................... 8
1.2.5. Tối ưu hóa quá trình tách sắc ký ............................................................................ 9
1.2.6. Ứng dụng của HPLC .............................................................................................. 10
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 12
2.1. THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT ........................................................................................ 12
2.1.1. Dung môi và hóa chất ............................................................................................. 12
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................................. 12
2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ..................................................................................... 12
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ....................................................................................... 13
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................... 13
2.4.1. Xây dựng quy trình xử lý mẫu .............................................................................. 13
2.4.2. Xây dựng phương pháp phân tích bằng HPLC ................................................... 13
2.5. XỬ LÝ THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM .................................................... 15
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN ...................................... 16
3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ .................................... 16
3.1.1. Kết quả khảo sát chọn cột ...................................................................................... 16
3.1.2. Kết quả khảo sát chọn pha động ........................................................................... 17
3.1.3. Kết quả khảo sát bước sóng ................................................................................... 20
3.1.4. Điều kiện sắc ký ...................................................................................................... 21
3.2. KẾT QUẢ LỰA CHỌN CÁCH XỬ LÝ MẪU .......................................................... 21
3.2.1. Khảo sát dung môi pha mẫu .................................................................................. 21
3.2.2. Khảo sát độ ổn định của chất nghiên cứu trong dung môi pha mẫu ................. 22
3.2.3. Chuẩn bị mẫu .......................................................................................................... 23
3.3. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ................................................................................. 23
3.3.1. Đánh giá độ thích hợp hệ thống ............................................................................ 23
3.3.2. Độ đặc hiệu .............................................................................................................. 24
3.3.3. Khảo sát khoảng tuyến tính ................................................................................... 25
3.3.4. Độ đúng .................................................................................................................... 26
3.3.5. Độ lặp lại .................................................................................................................. 28
3.3.6. Độ chính xác trung gian ......................................................................................... 29
3.3.7. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ................................. 31
3.4. ÁP DỤNG TRÊN MỘT SỐ MẪU MỸ PHẨM THỰC TẾ THU THẬP ĐƯỢC ...... 32
3.5. BÀN LUẬN ................................................................................................................. 33
3.5.1. Về hai paraben nghiên cứu .................................................................................... 33
3.5.2. Về phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 34
3.5.3. Về kiểm tra các mẫu mỹ phẩm .............................................................................. 35
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .............................................................................................. 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................ 37
PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 39
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao
QLD-MP: Quản lý Dược – Mỹ phẩm
UV-VIS: Tử ngoại - khả kiến
IBP: Isobutylparaben
BuP: Butylparaben
PB: Paraben
MP: Methylparaben
PP: Propylparaben
LOD: Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)
LOQ: Limit of Quantification (Giới hạn định lượng)
GC – MS: Gas Chromatography Mass Spectrometry (Phương pháp sắc ký khí khối phổ)
RSD: Độ lệch chuẩn tương đối
ACN: Acetonitril
MeOH: Methanol
CTCPDP: Công ty cổ phần Dược phẩm
TNHH: Trách nhiệm hữu hạn
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Tính chất của butylparaben và isobutylparaben................................................... 2
Bảng 2.1. Một số mẫu sữa rửa mặt và nước súc miệng thu được trên thị trường .............. 12
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát độ ổn định của dung môi pha mẫu ......................................... 22
Bảng 3.2. Đánh giá độ thích hợp hệ thống ......................................................................... 23
Bảng 3.3. Kết qủa xác định khoảng nồng độ tuyến tính của IBP và BuP .......................... 25
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ đúng của IBP trong mẫu sữa rửa mặt. ............................... 26
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ đúng của BuP trong mẫu sữa rửa mặt. .............................. 27
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ đúng của IBP trong mẫu nước súc miệng. ........................ 27
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ đúng của BuP trong mẫu nước súc miệng......................... 28
Bảng 3.8. Độ lặp lại của phương pháp trong nền mẫu sữa rửa mặt ................................... 28
Bảng 3.9. Độ lặp lại của phương pháp trên nền mẫu nước súc miệng ............................... 29
Bảng 3.10. Độ chính xác trung gian của phương pháp trong nền mẫu sữa rửa mặt .......... 30
Bảng 3.11. Độ chính xác trung gian của phương pháp trong nền mẫu nước súc miệng .... 31
Bảng 3.12. LOD và LOQ của IBP và BuP ......................................................................... 31
Bảng 3.13. Kết quả kiểm tra các paraben có mặt trong mẫu mỹ phẩm.............................. 32
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 3.1. Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn IBP và BuP trên cột C18 – Shimadzu, 25cm ..... 16
Hình 3.2. Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn IBP và BuP trên Cột C18 – Phenomenex, 15cm 16
Hình 3.3. Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn IBP và BuP trên Cột C6-Phenyl, 25cm .............. 17
Hình 3.4. Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn IBP và BuP trên Cột C6-Phenyl với các hệ pha
động có thành phần khác nhau ........................................................................................... 17
Hình 3.5. Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn paraben với các pha động sử dụng nước và đệm
có pH khác nhau ................................................................................................................. 18
Hình 3.6. Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn thêm vào nền mẫu sữa rửa mặt với các pha động
có thành phần khác nhau .................................................................................................... 19
Hình 3.7. Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn thêm vào nền mẫu với pha động ACN : Đệm pH
2,5 với các tỷ lệ khác nhau ................................................................................................. 20
Hình 3.8. Phổ hấp thụ UV-VIS của butylparaben (a) và isobutylparaben (b) ................... 21
Hình 3.9. Sắc kí đồ của hỗn hợp chuẩn IBP và BuP với điều kiện sắc kí được lựa chọn .. 21
Hình 3.10. Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn trong mẫu tự tạo với các dung môi pha mẫu khác
nhau. ................................................................................................................................... 22
Hình 3.11. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của IBP ....................................... 25
Hình 3.12. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của BuP ...................................... 26
Hình 3.13. Sắc ký đồ của mẫu Sữa rửa mặt trắng da Nivea Pearl Caring Whip ................ 32
Hình 3.14. Sắc ký đồ của mẫu Sữa rửa mặt cao cấp Benew Snail ..................................... 32
Hình 3.15. Sắc ký đồ của mẫu Sữa rửa mặt ngừa mụn Esunvy ......................................... 33
Hình 3.16. Sắc ký đồ của mẫu Nước súc miệng Listerine Total Care ............................... 33
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay kinh tế ngày càng phát triển, chất lượng cuộc sống ngày càng được
nâng cao, nhu cầu về chăm sóc của bản thân ngày càng cần thiết, do đó mỹ phẩm trở
thành một trong những sản phẩm tiêu dùng hàng đầu. Mỹ phẩm còn là loại sản phẩm,
hàng hóa có lợi nhuận cao, nên vì lợi nhuận mà việc sản xuất kinh doanh, buôn bán mỹ
phẩm kém chất lượng không an toàn là khó tránh khỏi. Do đó việc quan tâm đến công
tác kiểm soát chất lượng mỹ phẩm trở nên rất quan trọng đối với các cơ quan quản lý.
Paraben là những ester của acid p-hydroxy benzoic. Các paraben được sử dụng
trong mỹ phẩm và các sản phẩm chăm sóc sức khỏe khác làm chất bảo quản, có tác
dụng làm chậm sự phát triển của nấm và vi khuẩn hoặc hạn chế sự phân hủy của dược
chất. Tuy nhiên một số nghiên cứu cho thấy sử dụng các paraben có thể gây ra rối loạn
nội tiết, hình thành và phát triển ung thư vú ở phụ nữ. Hơn nữa, các nghiên cứu invitro
còn chỉ ra rằng các paraben còn kích thích việc tăng sinh các tế bào ung thư [6]. Do đó
việc phát hiện và định lượng các paraben rất cần thiết trong điều kiện hiện nay.
Ngày 13 tháng 4 năm 2005, dựa trên kết quả của kỳ họp Hội đồng Mỹ phẩm
ASEAN lần thứ 21, Cục Quản lý Dược đã ban hành công văn số 6577/QLD-MP [4] về
việc cập nhật quy định các chất được sử dụng trong mỹ phẩm, trong đó công bố danh
sách 5 paraben cấm dùng trong mỹ phẩm là isopropylparaben, isobutylparaben,
phenylparaben, benzylparaben và pentylparaben. Ngoài ra, cũng theo công văn này thì
butylparaben và các muối, propylparaben và các muối được phép dùng riêng lẻ với
nồng độ tối đa 0,14% (tính theo acid) và dạng hỗn hợp các paraben với tổng nồng độ
tối đa là 0,8% (tính theo acid). Như vậy, butylparaben là chất có giới hạn hàm lượng
còn đồng phân isobytlparaben là chất bị cấm dùng trong mỹ phẩm. Do đó việc phát
hiện và định lượng được 2 paraben trên là rất cần thiết.
Với những yêu cầu đó, đề tài: “Nghiên cứu xây dựng phương pháp phát hiện
và định lượng hai đồng phân butylparaben và isobutylparaben trong một số mỹ
phẩm” được thực hiện với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích 2 paraben trên trong nền sữa
rửa mặt và nước súc miệng.
2. Triển khai áp dụng phương pháp với một số mẫu mỹ phẩm thu được trên thị
trường.
-1-
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ PARABEN
1.1.1. Đặc điểm chung
Paraben là những ester của acid p-hydroxy benzoic [6][8], được sử dụng làm
chất bảo quản để ngăn ngừa sự phát triển của nấm và các vi khuẩn gây hại, để bảo vệ
cho sản phẩm đó và người tiêu dùng. Các paraben được sử dụng phổ biến hiện nay là
methylparaben, propylparaben, butylparaben và ethylparaben. Các paraben có thể
được sử dụng đơn độc hoặc kết hợp với nhau để có tác dụng tốt hơn. [7]
Paraben được sử dụng trong nhiều loại mỹ phẩm, cũng như trong thực phẩm và
thuốc. Mỹ phẩm có thể chứa paraben bao gồm dầu gội, sữa rửa mặt, son, chất dưỡng
ẩm, các sản phẩm chăm sóc tóc, kem đánh răng, phấn trang điểm… [7], [9].
1.1.2. Tính chất của butylparaben và isobutylparaben
Paraben được tạo ra từ phản ứng ester hóa acid p-hydroxy benzoic. Chúng có
công thức hóa học chung là R-para-hydroxy benzoat trong đó R có thể là 1 nhóm alkyl
hay aryl [9].
Bảng 1.1. Tính chất của butylparaben và isobutylparaben
Butylparaben
Isobutylparaben
Công thức phân tử
C11H14O2
C11H14O2
Khối lượng phân tử
194,23
194,25
Tinh thể hoặc dạng bột
Thể rắn, dạng bột
Màu trắng
Màu trắng
Áp suất hơi ở 25 C (*10 mmHg)
1,86
3,81
Nhiệt độ nóng chảy (oC)
68-72
72,95
309,2 ± 15
302,3 ± 15
Độ tan trong nước ở 20oC (g/L)
0,27
2,24
pKa
8,47
-
Thể chất
Màu sắc
o
-4
Nhiệt độ sôi (oC)
Isobutylparaben và butylparaben tan nhiều trong alcol, acetonitril, ether,
glycerin và propylenglycol (PG), ít tan trong nước. [9]
-2-
1.1.3. Ứng dụng của paraben
Các paraben có tác dụng diệt khuẩn (tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn gây hại khác
nhau) và chống lại nhiều loại vi nấm nên thường được sử dụng làm chất bảo quản
trong thực phẩm, mỹ phẩm và thuốc [7], [8], [10].
Cơ chế tác dụng của các paraben hiện nay chưa được xác định rõ. Các paraben
được cho là phá vỡ khả năng vận chuyển chất qua màng [12] hoặc ức chế tổng hợp
ARN hay ADN [13] hay một số enzym quan trọng như là ATPase hay
phosphotransferases ở một số loài vi khuẩn [7], [14].
1.1.3.1. Trong thực phẩm
Các paraben đã được thêm vào thực phẩm hơn 50 năm trước và qua các năm số
lượng các loại thực phẩm có sử dụng paraben ngày càng tăng. Các paraben được sử
dụng ở nhiều loại thực phẩm như là nước trái cây, dầu mỡ, các loại gia vị và rau củ…
với nồng độ từ 450 đến 2000 ppm [10].
1.1.3.2. Trong mỹ phẩm
Paraben được sử dụng rộng rãi trong mỹ phẩm, đặc biệt là methylparaben và
propylparaben [10]. Mỹ phẩm có thể chứa paraben bao gồm dầu gội, sữa rửa mặt, son,
chất dưỡng ẩm, các sản phẩm chăm sóc tóc, kem đánh răng, phấn trang điểm… [7],
[9], [10]. Sự phổ biến của các paraben xuất phát từ độc tính thấp, phổ kháng khuẩn
rộng, ổn định về mặt sinh học và chi phí thấp của chúng [10]. Các paraben cũng có khả
năng chịu nhiệt và ổn định ở khoảng pH rộng (hiệu quả ở pH từ 4,5 - 7,5). Bởi vì bền ở
nhiệt độ cao, các sản phẩm chứa paraben có thể được hấp tiệt khuẩn mà không làm
mất tính kháng khuẩn của nó [10].
Các paraben có thể được sử dụng đơn độc hoặc phối hợp với nhau để tăng hoạt
tính kháng khuẩn [7]. Hoạt tính kháng khuẩn của chúng mạnh nhất trên nấm men và
nấm mốc [10].
1.1.3.3. Trong thuốc
Paraben được sử dụng lần đầu tiên ở trong thuốc từ năm 1950 và từ đó đến nay
chúng được sử dụng trong nhiều loại chế phẩm như là chất bảo quản [10]. Trong số
các paraben, propylparaben là chất có tác dụng chống nấm tốt nhất. Paraben được sử
dụng trong nhiều dạng bào chế như là thuốc đặt, viên nén, hỗn dịch, dung dịch thuốc
tiêm… [10]. Nồng độ của các paraben trong các chế phẩm rất đa dạng, nhưng hiếm khi
vượt quá 1%.
1.1.4. Độc tính của paraben
1.1.4.1. Phản ứng dị ứng
Đối với những người có da bình thường, phần lớn paraben không gây kích ứng
và không nhạy cảm. Tuy nhiên, paraben có thể gây kích ứng da và viêm da tiếp xúc
-3-
hoặc gây bệnh rosacea (chứng đỏ mặt) ở những người bị dị ứng với paraben, chiếm
một tỷ lệ nhỏ trong dân số nói chung. [15]
1.1.4.2. Hoạt tính giả estrogen
Những năm gần đây có rất nhiều lo ngại về việc phơi nhiễm các chất estrogen
tổng hợp. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự bất thường chức năng của hệ miễn dịch,
tác động lên hệ thần kinh, hay sự xuất hiện của các khối u có thể liên quan đến sự phơi
nhiễm các chất độc, bao gồm cả estrogen. Nguyên nhân của việc giảm số lượng tinh
trùng ở nam giới được cho là liên quan đến nồng độ estrogen và các chất giả estrogen
trong cơ thể.
Hoạt tính giả estrogen của các paraben được mô tả lần đầu tiên bởi Routledge
và đồng nghiệp năm 1998 [18], sau đó một số thử nghiệm in vivo trên động vật và
nghiên cứu intro đã chứng minh hoạt tính giả estrogen [16], [17], [18]. Tuy nhiên, đa
số các nghiên cứu in vivo đều tiến hành trên chuột chưa có dữ liệu nghiên cứu trên
người. Trong các nghiên cứu in vitro đã chỉ ra các paraben có hoạt tính estrogen yếu,
trong khi chất chuyển hóa của chúng là acid p-hydroxybenzoic lại không thể hiện hoạt
tính này [16]. Mặc dù có những báo cáo về độc tính của paraben nhưng cho đến nay
vẫn chưa có nghiên cứu in vivo trên người được tiến hành để đánh giá tác động của
các paraben lên sự bài tiết testosteron và chức năng sinh sản ở nam giới. Do đó, vẫn
chưa đủ dữ liệu để khẳng định độc tính của các paraben lên rối loạn chức năng sinh
sản ở nam giới.
1.1.4.3. Ung thư vú
Bởi vì estrogen là yếu tố nguy cơ lớn trong sự hình thành và phát triển ung thư
vú nên có ý kiến cho rằng các paraben có thể làm tăng tỷ lệ ung thư vú ở phụ nữ. Năm
2004, Darbre và các cộng sự đã báo cáo có sự xuất hiện của các paraben (nồng độ cỡ
nanogram) trong các tế bào ung thư ở 20 bệnh nhân [10]. Đứng trước bối cảnh đó, Hội
đồng đánh giá các thành phần trong Mỹ phẩm của Mỹ đã xem xét và đánh giá lại tính
an toàn của 4 paraben phổ biến nhất (methyl, ethyl, propyl và butylparaben) và đã có
kết luận là vẫn chưa có bằng chứng thuyết phục chứng minh paraben có thể gây ung
thư vú [19] và khuyến cáo người tiêu dùng không nên quá lo lắng về vấn đề này.
1.1.4.4. Tăng nhạy cảm với ánh sáng mặt trời
Các nghiên cứu chỉ ra rằng methylparaben sử dụng trên da có thể phản ứng với
UVB (tia tử ngoại có bước sóng từ 290-320nm) và dẫn đến quá trình lão hóa và tổn
thương ADN [20], [21]
1.1.5. Hành động của cơ quan quản lý đối với sản phẩm mỹ phẩm chứa paraben
Ngày 28-7-2015, Cục Quản lý Dược, Bộ Y Tế đã cho biết: “Thực hiện quyết
định của Hội đồng Mỹ phẩm ASEAN về việc cập nhật quy định các chất dùng trong
mỹ phẩm. Cục Quản lí Dược đã có thông báo về việc đưa 5 dẫn chất paraben vào danh
-4-
mục các chất không dùng trong mỹ phẩm. Năm dẫn chất này bao gồm:
isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben và pentyl paraben.
Công văn số 6577/QLD-MP của Cục quản lý Dược [4] quy định cụ thể về việc
sử dụng paraben trong mỹ phẩm như sau:
- Butylparaben và các muối, propylparaben và các muối (tham chiếu 12a Annex
V) được phép dùng riêng lẻ với nồng độ tối đa 0,14% (tính theo acid), và dạng hỗn
hợp các paraben với tổng nồng độ tối đa là 0,8% (tính theo acid).
-05 paraben (isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben
và pentylparaben) được bổ sung vào Annex II (các chất không được dùng trong mỹ
phẩm).
1.1.6. Một số nghiên cứu về phân tích paraben trong mỹ phẩm
Tham khảo phương pháp hòa hợp của ASEAN năm 2005, các paraben được xác
định bằng phương pháp HPLC [22]:
- Pha tĩnh: Cột C18 (25cm x 4,6 mm hoặc 15cm x 4,6 mm, 5µm)
- Pha động: Tetrahydrofuran : Nước : Methanol : Acetonitril = 5 : 60 : 10 : 25.
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút
- Nhiệt độ cột: 25oC
Katerina và cộng sự đã tiến hành phân tích phenoxyethanol và các dẫn xuất của
paraben (methyl, ethyl, propyl và butyl-paraben) bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu
năng cao với cột Discovery C18 (5 m, 150mm x 4,6mm) với pha động là đệm
phosphat (pH=2,5) : Acetonitril = 67:33, tốc độ dòng là 1ml/phút [23].
Các paraben cũng có thể được xác định bằng phương pháp HPLC với pha động:
Methanol : Nước = 20 : 80, detector UV-VIS, bước sóng 254nm.
Ngoài phương pháp HPLC, cũng đã có nghiên cứu sử dụng phương pháp GCMS để xác định các paraben trong tế bào ung thư ở người. [24]
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC
1.2.1. Khái niệm sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký là một nhóm các phương pháp dùng để tách các thành phần của một hỗn
hợp. Sự tách sắc ký được trên sự phân chia khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và
không hòa lẫn vào nhau: pha tĩnh và pha động [1] [2].
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC- High performance liquid chromatography)
là một kỹ thuật tách trọng đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha
tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha,
tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự
rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó. Thành phần pha động
đưa các chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân
tích với thời gian hợp lí [2].
-5-
1.2.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký
Pha tĩnh được nhồi vào cột theo một kỹ thuật nhất định. Pha tĩnh là yếu tố quyết
định bản chất của quá trình sắc ký (sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi
ion…) [2].
Khi đặt chất phân tích lên pha tĩnh đầu cột rồi cho pha động liên tục đi qua,
chúng ta đã thực hiện quá trình sắc ký.
Yếu tố quyết định hiệu quả của quá trình sắc ký ở đây là tổng quan các tương
tác:
- Tương tác giữa chất phân tích với pha tĩnh
- Tương tác giữa chất phân tích với pha động
- Tương tác giữa pha động và pha tĩnh.
Mẫu phân tích được hòa tan trong pha động. Pha tĩnh được cố định trong cột.
các chất phân tích sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc
vào tương tác giữa chất tan – pha tĩnh – pha động. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau mà
các thành phần của mẫu sẽ tách ra riêng biệt.
1.2.3. Cấu tạo của máy HPLC
Do bản chất hóa học của các chất phân tích rất khác nhau nên có rất nhiều kỹ
thuật để tách định lượng bằng sắc ký lỏng. Tuy vậy, nguyên tắc cấu tạo của một máy
sắc ký lỏng đều giống nhau, có cùng một số bộ phận kết nối với nhau [2].
1.2.3.1. Hệ thống cấp pha động
Pha động trong sắc ký lỏng thường là hai dung môi hòa tan vào nhau để có khả
năng tách với độ phân giải phù hợp. Trước khi sử dụng, cần lọc (màng lọc 0,45µm) và
đuổi khí hòa tan trong pha động. Khí hòa tan có thể làm biến dạng pic, giảm hiệu lực
cột, làm nhiễu đường nền. Có thể loại khí hòa tan bằng cách: Siêu âm, sục khí trơ như
heli…
Pha động thường được chứa trong bình thủy tinh. Có hai cách để dùng pha động
rửa giải:
- Đẳng dòng (isocratic): Thành phần pha động không thay đổi trong quá trình
sắc ký
- Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là 2-4 loại đựng
trong các bình khác nhau. Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình sắc ký theo
chương trình đã định (chương trình dung môi).
Có hai kiểu thực hiện chương trình dung môi:
- Chương trình dung môi áp suất thấp: Các dung môi đựng trong các bình riêng.
Mỗi bình có van riêng lấy lượng dung môi xác định đưa vào bình hòa trộn, sau đó
dùng một bơm đưa pha động vào van tiêm mẫu.
-6-
- Chương trình dung môi áp suất cao: Điểm khác chủ yếu là mỗi dung môi có
một bơm riêng việc hòa trộn được thực hiện ở áp suất cao. Chương trình này có tốn
kém và cồng kềnh hơn so với loại trộn ở áp suất thấp. Tuy nhiên, nó có độ đúng và độ
lặp lại cao hơn.
1.2.3.2. Hệ thống bơm
Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng cần đáp ứng những yêu cầu sau:
- Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000psi trở lên (với 1 psi =
0,068atm).
- Đảm bảo lưu lượng lặp lại trong khoảng 0,01 – 5,0ml/phút.
- Có thể chịu được sự tác động của nhiều loại dung môi (không bị ăn mòn).
- Những máy sắc ký lỏng hiện đại có cấu hình hoàn thiện hơn. Khoảng bơm có
lưu lượng dao động từ 2-3ml/phút, áp suất có thể lên tới 10000 psi.
1.2.3.3. Hệ tiêm mẫu
Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở đầu cột
mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu (sample loop). Vòng
chứa mẫu có dung tích khác nhau: thường dùng loại 0,50 – 20 µl. Có vòng mẫu lớn
hơn.
Khi dùng van tiêm sẽ dễ dàng tự động hóa. Phần mềm máy tính dễ dàng điều
khiển và kiểm soát hệ bơm mẫu tự động (autosampler). Sai số tiêm mẫu dùng van
khoảng 0,5%.
1.2.3.4. Cột và pha tĩnh
Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép không gỉ, thủy
tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10-30 cm, đường kính trong 4-10 mm.
Cột nhồi thường có hạt cỡ 5 hoặc 10 µm. Số đĩa lý thuyết dao động 40000 đến
60000/m. Gần đây người ta có loại cột nhỏ với đường kính trong 1-2 mm, dài 3 – 7,5
cm. Loại cột này được nhồi hạt cỡ 3 hoặc 5 µm. Có trị số n lên đến 100000 đĩa. Ưu
điểm nổi bật của chúng là chạy sắc ký tốn ít dung môi và ít thời gian.
Chất nhồi cột cho sắc ký lỏng được chế tạo từ silica (silic dioxyd) bằng cách
làm kết tụ các hạt silica để tạo ra các hạt có kích thước lớn hơn và đường kính đều
nhau. Các hạt silica gel hình thành thường được bao một lớp mỏng hữu cơ liên kết với
bề mặt. Ngoài ra còn có các chất nhồi cột khác như nhôm oxyd, polyme xốp, nhựa trao
đổi ion… phụ thuộc vào loại hình sắc ký.
Cột bảo vệ được đặt trước cột sắc ký để loại các chất có mặt trong pha động và
trong mẫu phân tích làm giảm tuổi thọ của cột sắc ký.
Điều nhiệt cột: Trong sắc ký lỏng, khác với sắc ký khí, vận hành thiết bị thường
ở nhiệt độ phòng không cần điều nhiệt cột. Tuy nhiên các máy sắc ký lỏng hiện đại
-7-
thường được trang bị thêm hệ thống điều nhiệt cột có thể lên đến 150oC với độ chính
xác đến ± 0,1oC.
1.2.3.5. Detector
Detector là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho tín hiệu
được ghi trên sắc ký đồ. Detector trong sắc ký lỏng cần đáp ứng các yêu cầu sau:
- Đáp ứng nhanh và lặp lại.
- Độ nhạy cao, có thể phát hiện chất phân tích ở khối lượng hoặc nồng độ thấp.
- Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng.
- Khoảng hoạt động tuyến tính mạnh.
- Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng.
- Bộ phận ghi tín hiệu gồm có máy ghi, máy phân tích, máy tính.
Hiện có nhiều detector, nhưng thường sử dụng 6 loại detector thuộc 2 nhóm
quang học và điện hóa:
1 – Detector hấp thụ UV-VIS
2 – Dertector huỳnh quang
3 – Detector chỉ số khúc xạ
4 – Detector tán xạ bay hơi
5 – Detector đo dòng
6 – Detector độ dẫn.
1.2.4. Các thông số của quá trình sắc ký
1.2.4.1. Hệ số phân bố K
Tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K
Trong đó Cs là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh và Cm là nồng độ mol
trong pha động. Ái lực tương đối của chất tan với hai pha sẽ lượng giá hệ số K. Trị số
K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Nếu các chất trong hỗn
hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều thì việc tách càng dễ dàng hơn.
1.2.4.2. Thời gian lưu
Khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến detector được gọi là
thời gian lưu tR. Đối với những chất không lưu giữ thì tốc độ di chuyển của nó bằng
tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử pha động. Thời gian tM của chất không lưu
gọi là thời gian chết.
1.2.4.3. Hệ số dung lượng k’
Hệ số dung lượng k’ là một thông số quan trọng mô tả tốc độ di chuyển của
chất phân tích A qua cột. Hệ số k’ còn được gọi là hệ số phân bố khối lượng giữa hai
pha:
-8-
Như vậy, hệ số k’ có thể được tính dễ dàng từ pic sắc ký. Từ đó có thể thấy:
- Khác với hệ số phân bố K, hệ số k’ phụ thuộc không chỉ vào bản chất của chất
A, bản chất của hai pha mà còn phụ thuộc vào tỷ lệ thể tích pha động và thể tích pha
tĩnh
- Nếu hệ số k’ << 1 quá trình rửa giải diễn ra quá nhanh cho nên khó xác định
chính xác thời gian tR. Ngược lại, nếu k’ quá lớn (ví dụ 20 – 30), quá trình rửa giải quá
dài. Thường người ta chọn điều kiện sắc ký để k’ dao động từ 1 đến 5.
1.2.4.4. Hệ số chọn lọc α
Để đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B, người ta dùng hệ
số chọn lọc α.
Để tách riêng hai chất A, B cần α > 1, thường chọn α dao động trong khoảng
1,05 – 2. Nếu α lớn quá, thời gian phân tích sẽ dài.
1.2.4.5. Tính đối xứng của pic sắc ký
- Hệ số bất đối:
- Hệ số kéo đuôi: As
Trong đó a là nửa chiều rộng phía trước pic, b là nửa chiều rộng phía sau pic.
1.2.4.6. Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết
Cột sắc ký được coi là có N lớp mỏng, ở mỗi lớp, sự phân bố chất tan vào hai
pha được coi là trạng thái cân bằng. Những lớp mỏng này được gọi là đĩa lý thuyết.
Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc
ký nhất định. Cột có số đĩa lý thuyết lớn sẽ có hiệu lực cao, khi đó độ doãng pic nhỏ.
1.2.5. Tối ưu hóa quá trình tách sắc ký
Tách bằng sắc ký được tối ưu hóa bằng cách thay đổi các điều kiện thực nghiệm
để có thể tách được các thành phần trong hỗn hợp với chi phí (thời gian, kinh tế) cực
tiểu. Một nội dung quan trọng trong tối ưu hóa là tìm cách tăng hiệu lực cột sắc ký.
Đầu tiên, cần xem xét độ phân giải của cột tức là khả năng tách định lượng hai chất
trong hỗn hợp trên sắc ký đồ.
1.2.5.1. Độ phân giải của cột
Độ phân giải của cột được tính theo công thức:
-9-
Phương trình trên mô tả sự phụ thuộc của độ phân giải Rs vào cột vào số đĩa N,
hệ số chọn lọc α và hệ sô dung lượng k’. Để tăng hệ số phân giải ta có thể:
- Tăng số đĩa N bằng 2 cách:
+ Dùng cột dài hơn sẽ tăng được N nhưng thời gain phân tích dài hơn, pic sẽ
giãn rộng hơn.
+ Giảm chiều cao H bằng cách giảm tốc độ dòng pha động, giảm kích thước
hạt (thay cột khác).
- Tăng hệ số dung lượng k’B:
Nói chung khi tăng k’B sẽ tăng hệ số phân giải Rs. Tuy nhiên k’B tăng sẽ tăng
nhiều thời gian phân tích. Để dung hòa độ phân giải và thời gian rửa giải người ta
khuyên trị số k’ dao động từ 1 – 5.
- Tăng hệ số chọn lọc α bằng cách:
+ Thay đổi thành phần pha động, kể cả thay đổi pH
+ Thay đổi pha tĩnh (đổi cột khác)
+ Tăng nhiệt độ cột: thường đi kèm tăng k’.
1.2.5.2. Thời gian phân tích
Tối ưu hóa tách sắc ký là chọn điều kiện để tách định lượng các thành phần
trong hệ với chi phí, thời gian là ít nhất. Thời gian cần thiết cho một quá trình rửa giải
được tính từ thời gian lưu của pic cuối cùng trên sắc ký đồ.
1.2.6. Ứng dụng của HPLC
Sắc ký được coi là một kỹ thuật phân tích rất hiệu quả để tách và định lượng
các hợp chất có cấu trúc hóa học gần giống nhau trong một hỗn hợp. Vì vậy nó được
dùng phổ biến khi mẫu phân tích có nguồn gốc tự nhiên hoặc sinh vật.
1.2.6.1. Định tính
Sắc ký đồ cho ta thời gian lưu của chất phân tích cùng điều kiện sắc ký (pha
động, pha tĩnh, nhiệt độ) là những thông tin định tính giúp ta khẳng định sự có mặt của
chất phân tích trong mẫu. Với những mẫu nhiều thành phần, việc định tính bằng quang
phổ thường gặp khó khăn. Do vậy, HPLC thường được dùng để tách các thành phần
trước khi phân tích bằng quang phổ.
1.2.6.2. Định lượng
Dữ liệu thực nghiệm dùng trong định lượng là chiều cao pic hoặc diện tích pic.
Chiều cao pic dễ đo, tuy nhiên chỉ dùng được khi pic hẹp, cân đối. Diện tích pic được
dùng phổ biến và đảm bảo cho kết quả tin cậy.
Những phương pháp thường dùng trong phân tích sắc ký:
- Phương pháp chuẩn ngoại: tiến hành chạy sắc ký ở cả hai mẫu chuẩn và thử trong
cùng điều kiện. So sánh diện tích pic của mẫu thử với diện tích pic của mẫu chuẩn sẽ
tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử. Có 2 phương pháp:
- 10 -
+ Chuẩn hóa một điểm: Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của
mẫu thử
+ Chuẩn hóa nhiều điểm: xây dựng đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa
diện tích pic với nồng độ của chất chuẩn. Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để
tính toán nồng độ của chất cần xác định.
- Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của các chất
chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi tiến hành xử lý mẫu và sắc
ký trong cùng điều kiện. Nồng độ chưa biết của chất trong mẫu thử được tính dựa vào
sự chênh lệch nồng độ ∆C và sự tăng của diện tích ∆S.
- Phương pháp nội chuẩn: Người ta chọn một chất chuẩn nội đưa vào trong mẫu phân
tích và trong dung dịch đối chiếu. Tỷ số diện tích của chất phân tích và chất chuẩn nội
là thông số phân tích được dùng để xây dựng đường chuẩn.
Một số yêu cầu đối với chất chuẩn nội:
+ Pic của chất chuẩn nội phải tách khỏi pic của các thành phần khác.
+ Pic của chất chuẩn nội phải gần với pic của chất cần phân tích.
- Phương pháp chuẩn hóa diện tích: hàm lượng phần trăm của chất phân tích được xác
định bằng tỉ số (tính theo %) của diện tích pic chất đó và diện tích pic có trong mẫu
(trừ pic của dung môi, thuốc thử và pic của các chất có hàm lượng nhỏ hơn giới hạn
phát hiện).
- 11 -
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT
2.1.1. Dung môi và hóa chất
- Chất chuẩn isobutylparaben (Canada), số lô: 3-SCC-165-1, hàm lượng: 98%
- Chất chuẩn butylparaben (Sigma-Aldrich) số lô: BCBM9217V, hàm lượng:
99,1%
- Acetonitril HPLC (Merck)
- Nước tinh khiết.
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ
- Máy sắc ký lỏng Agilent với 4 module:
+ Bơm cao áp 4 kênh dung môi (G1311B)
+ Hệ thống bơm mẫu tự động (G1329B)
+ Detector mảng Diod (DAD) (G1315D)
+ Phần mềm điều khiển toàn bộ hệ thống và xử lý số liệu.
- Cân phân tích chính xác tới 0,01mg.
- Máy lắc siêu âm.
- Dụng cụ thủy tinh: Bình định mức, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh.
2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Mẫu sữa rửa mặt cao cấp Benew Snail: Nơi sản xuất: Công ty TNHH Quốc tế
Thiên Minh, Việt Nam, không có chất bảo quản nhóm paraben.
- Mẫu nước súc miệng Colgate Plas: Nơi sản xuất: Công ty Colgate Palmolive,
Thái Lan, không có chất bảo quản nhóm paraben.
- Một số mẫu sữa rửa mặt và nước súc miệng thu được trên thị trường (Bảng
2.1)
Bảng 2.1. Một số mẫu sữa rửa mặt và nước súc miệng thu được trên thị trường
TT
Tên mẫu
Công ty sản xuất
Mã mẫu
1
Sữa rửa mặt làm sạch da
Công ty Yves Rocher
48L140
2
Sữa rửa mặt ngừa mụn Esunvy
CTCPDP Gia Nguyên
48G726
3
Sữa rửa mặt làm sạch da Hydra vegetal
Công ty Yves Rocher
47L137
4
Sữa rửa mặt là đào Naive
Công ty Kraicie Home
48L04
5
Sữa rửa mặt trắng da Nivea Pearl Caring Whip
Thái Lan
48L05
6
Sữa rửa mặt trắng tinh khiết POND’S
PT Unilever Indonesia
48L06
7
Sữa rửa mặt cao cấp Benew Snail
Công ty TNHH Quốc tế Thiên Minh
48L07
8
Nước súc miệng Listerine Total Care
Công ty TNHH Johnson and Johnson
48L08
9
Nước súc miệng diệt khuẩn Listerine
Công ty TNHH Johnson and Johnson
48L09
10
Nước súc miệng Colgate Plas
Công ty Colgate Palmolive
48L10
- 12 -
- Xem thêm -