Tài liệu Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng celecoxib trong huyết tương bằng hplc

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI CHU HUY KIÊN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CELECOXIB TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2018 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI CHU HUY KIÊN Mã sinh viên: 1301215 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CELECOXIB TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Thị Thuận 2. TS. Lê Đình Chi Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Hóa Dược 2. Trung tâm đánh giá tương đương sinh học (Viện kiểm nghiệm thuốc TW) HÀ NỘI – 2018 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành quá trình nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận này, lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn Thị Thuận thuộc Bộ môn Hóa Dược và TS. Lê Đình Chi thuộc bộ môn Hóa phân tích-Độc chất Trường Đại học Dược Hà Nội – những người đã hướng dẫn và tận tình giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này. Em xin được gửi lời cảm ơn tiếp theo đến ThS. Tạ Mạnh Hùng - Giám đốc Trung tâm đánh giá tương đương sinh học, chị Phan Thị Nghĩa cùng toàn thế cán bộ công nhân viên tại Trung tâm đánh giá tương đương sinh học – Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương đã tạo điều kiện và giúp đỡ, chỉ bảo em tận tình trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Cuối cùng, em xin cảm ơn những người thân, bạn bè đã luôn bên em, động viên em hoàn thành khóa luận này. Do thời gian thực hiện cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn nhiều thiếu sót. Em rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn. Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 26 tháng 04 năm 2018 Sinh viên Chu Huy Kiên MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1 1.1 Tổng quan về celecoxib ........................................................................ 2 1.1.1 Cấu tạo............................................................................................. 2 1.1.2 Tính chất vật lý, hóa học .................................................................. 2 1.1.3 Dược động học, tác dụng dược lý, cơ chế tác dụng .......................... 2 1.1.4 Chỉ định, chống chỉ định .................................................................. 4 1.2 Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ............ 4 1.2.1 Giới thiệu ......................................................................................... 4 1.2.2 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC ........................................... 4 1.2.3 Nguyên tắc của quá trình sắc ký....................................................... 6 1.2.4 Các đại lượng đặc trưng ................................................................... 6 1.2.5 Định lượng bằng HPLC ................................................................... 8 1.3 Các phương pháp phân tích celecoxib trong huyết tương bằng HPLC ............................................................................................................. 8 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 12 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị ..................................................................... 12 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu: ................................................................... 12 2.1.2 Nguyên vật liệu, dung môi, hóa chất .............................................. 12 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ ............................................................................ 12 2.2 Nội dung nghiên cứu .......................................................................... 12 2.3 Phương pháp nghiên cứu ................................................................... 12 2.3.1 Chuẩn bị mẫu phân tích ................................................................. 12 2.3.2 Khảo sát và xây dựng phương pháp ............................................... 14 2.3.3 Thẩm định phương pháp ................................................................ 15 2.4 Ứng dụng thực tế................................................................................ 19 2.5 Phương pháp xử lý kết quả ............................................................... 20 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................... 21 3.1 Khảo sát xây dựng phương pháp ...................................................... 21 3.1.1 Các điều kiện cố định..................................................................... 21 3.1.2 Các điều kiện khảo sát ................................................................... 21 3.1.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu ......................................................... 23 3.1.4 Phương pháp chính thức ................................................................ 24 3.2 Thẩm định phương pháp ................................................................... 25 3.2.1 Độ chọn lọc, đặc hiệu..................................................................... 25 3.2.2 Độ phù hợp hệ thống...................................................................... 26 3.2.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính ................................................ 27 3.2.4 Độ đúng, độ lặp lại......................................................................... 29 3.2.5 Giới hạn định lượng dưới LLOQ ................................................... 31 3.2.6 Độ ổn định ..................................................................................... 31 3.2.7 Nhận xét ........................................................................................ 35 3.3 Ứng dụng thực tế................................................................................ 36 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................. 39 4.1 Kết luận .............................................................................................. 39 4.2 Kiến nghị ............................................................................................ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Chú thích ADR Phản ứng bất lợi của thuốc CELE Celecoxib CHCl3 Cloroform Cl Hệ số thanh thải thuốc Cmax Nồng độ cực đại COX Cyclooxygenase CV% Độ lệch chuẩn tương đối DET Diethylether FELO Felodipin Flow Tốc độ dòng HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao HQC Mẫu kiểm tra nồng độ cao HT Huyết tương IS Chuẩn nội K Hệ số phân bố k’ Hệ số dung lượng LC MS/MS Sắc ký lỏng khối phổ LLOQ Giới hạn định lượng dưới LQC Mẫu kiểm tra nồng độ thấp MeCN Acetonitril MeOH Methanol MQC Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình NSAIDs Thuốc giảm đau hạ sốt chống viêm không steroid NTN Người tình nguyện PG Prostaglandin QC Mẫu kiểm tra r Hệ số tương quan Rs Độ phân giải SKD Sinh khả dụng Spic Diện tích pic SOP Quy trình thao tác chuẩn TB Trung bình TKPT Tinh khiết phân tích TLTK Tài liệu tham khảo tR Thời gian lưu TĐSH Tương đương sinh học TW Trung ương t1/2 Thời gian bán thải của thuốc ULOQ Giới hạn định lượng trên Vd Thể tích phân bố của thuốc WS Dung dịch làm việc α Hệ số chọn lọc DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. 1: Một số nghiên cứu định lượng CELE trong HT................................. 8 Bảng 2. 1: Bảng nồng độ các mẫu QC .............................................................. 13 Bảng 2. 2: Cách chuẩn bị đường chuẩn ............................................................ 13 Bảng 2. 3: Cách chuẩn bị mẫu LLOQ............................................................... 14 Bảng 3. 1: Kết quả khảo sát các dung môi chiết ............................................... 24 Bảng 3. 2: Kết quả xác định độ chọn lọc, đặc hiệu ........................................... 26 Bảng 3. 3: Kết quả khảo sát độ phù hợp hệ thống ............................................. 27 Bảng 3. 4: Số liệu khảo sát đường chuẩn (Spic – mAu*s) .................................. 28 Bảng 3. 5: Kết quả xác định hệ số weighting .................................................... 28 Bảng 3. 6: Kết quả khảo sát đường chuẩn......................................................... 29 Bảng 3. 7: Kết quả độ đúng, độ lặp lại trong ngày ............................................ 29 Bảng 3. 8: Kết quả độ đúng, độ lặp lại khác ngày............................................. 30 Bảng 3. 9: Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)........................ 31 Bảng 3. 10: Kết quả độ ổn định dài ngày dung dịch chuẩn gốc CELE ở -400C . 32 Bảng 3. 11: Kết quả độ ổn định dung dịch IS thời gian dài ở nhiệt độ 2-80C .... 32 Bảng 3. 12: Kết quả độ ổn định của mẫu HT sau 3 chu kỳ đông–rã.................. 33 Bảng 3. 13: Kết quả độ ổn định của mẫu HT ở nhiệt độ phòng thời gian ngắn . 33 Bảng 3. 14: Kết quả độ ổn định dài ngày của mẫu HT ở nồng độ LQC ............ 34 Bảng 3. 15: Kết quả độ ổn định dài ngày của mẫu HT ở nồng độ HQC ............ 34 Bảng 3. 16: Kết quả độ ổn định của mẫu sau xử lý trong auto-sampler ............ 35 Bảng 3. 17: Kết quả xây dựng đường chuẩn ..................................................... 36 Bảng 3. 18: Nồng độ CELE trong HT người theo thời gian .............................. 37 Bảng 3. 19: Các kết quả nghiên cứu nồng độ CELE trong HT người trước đó . 38 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1. 1: Công thức cấu tạo CELE ................................................................... 2 Hình 1. 2: Sơ đồ hệ thống HPLC ........................................................................ 5 Hình 1. 3: Các lực tương tác trong quá trình sắc ký ............................................ 6 Hình 3. 1: Phổ hấp thụ UV của mẫu CELE trong MeOH ................................. 21 Hình 3. 2: Phổ hấp thụ UV của mẫu CELE trong huyết tương ......................... 21 Hình 3. 3: Sắc ký đồ của FELO (a) và hỗn hợp CELE, FELO (b) trong MeOH 22 Hình 3. 4: Sắc ký đồ với pha động MeCN : đệm KH2PO4 pH 4,0 = 80:20 ........ 22 Hình 3. 5: Sắc ký đồ với pha động MeCN : đệm KH2PO4 pH 4,0 = 70:30........ 22 Hình 3. 6: Sắc ký đồ với pha động MeCN : đệm KH2PO4 pH 4,0 = 60:40........ 23 Hình 3. 7: Sắc ký đồ HT trắng có pha IS .......................................................... 25 Hình 3. 8: Sắc ký đồ HT trắng có pha IS và chuẩn CELE ở nồng độ LLOQ.... 25 Hình 3. 9: Sắc ký đồ huyết HT có pha IS và chuẩn CELE ở nồng độ khoảng giữa đường chuẩn (500 ng/ml) ......................................................................... 26 Hình 3. 10: Đồ thị nồng độ CELE trong HT người theo thời gian .................... 37 1 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Các thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs) là một trong những nhóm thuốc được dùng phổ biển và cũng là nhóm thuốc được kê đơn rộng rãi nhất với hàng chục triệu người dùng trong một ngày trên toàn thế giới [5]. Tuy vậy, hạn chế lớn nhất của nhóm thuốc này là tác dụng phụ trên tiêu hóa [1], [2], [5]. Nhiều giải pháp để hạn chế tác dụng phụ này đã được sử dụng nhưng các giải pháp này đều có những hạn chế nhất định. Việc tìm ra 2 đồng dạng COX-1 và COX-2 của men COX (cyclooxygenase) tham gia tổng hợp các protaglandin (PG) từ acid arachidonic đã mở ra hướng mới để khắc phục tác dụng phụ trên đường tiêu hóa của các NSAIDs. Các thuốc ức chế chọn lọc COX-2 làm giảm PG gây viêm song vẫn duy trì quá trình tổng hợp các PG bảo vệ đường tiêu hóa, từ đó làm giảm các tác dụng phụ trên đường tiêu hóa [1], [2]. Tuy nhiên, do sự gia tăng nguy cơ huyết khối và nhồi máu cơ tim [1], một số NSAIDs ức chế chọn lọc COX2 đã bị rút khỏi thị trường. Hiện nay chỉ còn celecoxib, parecoxib, etoricoxib được lưu hành, trong đó celecoxib được sử dụng rộng rãi nhất [2]. Việt Nam là một nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa; các bệnh thấp khớp, viêm xương khớp…. chiếm tỉ lệ khá cao nên nhu cầu về các NSAIDs nói chung và celecoxib nói riêng khá lớn. Để thực hiện được các nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học các thuốc nói chung và celecoxib nói riêng, yêu cầu quan trọng là phải có quy trình phân tích định lượng thuốc trong dịch sinh học. Trong đó, phương pháp thông dụng nhất là sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Tuy nhiên, ở Việt Nam những nghiên cứu ứng dụng phương pháp HPLC để định lượng celecoxib trong huyết tương còn hạn chế. Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng celecoxib trong huyết tương bằng HPLC“ với các nội dung chính sau: 1. Xây dựng phương pháp định lượng celecoxib trong huyết tương. 2. Thẩm định phương pháp vừa xây dựng. 3. Ứng dụng xác định nồng độ celecoxib trong một số mẫu huyết tương người. 1 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về celecoxib 1.1.1 Cấu tạo - Công thức phân tử: C17H14F3N3O2S [13], [16], [20]. - Trọng lượng phân tử: 381,4 g/mol [13], [16], [20]. - Công thức cấu tạo: [13], [16] Hình 1. 1: Công thức cấu tạo CELE - Tên khoa học: 4-[5-(4-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1-yl]benzensulfonamide [16], [20]. 1.1.2 Tính chất vật lý, hóa học - Cảm quan: Dạng bột kết tinh hoặc vô định hình, màu trắng hoặc vàng nhạt [16]. - Nhiệt độ nóng chảy: khoảng 160°C. - Độ tan: Celecoxib rất ít tan trong nước (3-7µg/ml; pH = 7,0; 40oC); tan tốt trong methanol, methylene chloride, cloroform và aceton [16]. Celecoxib ở dạng vô định hình dễ tan hơn dạng kết tinh. - pKa: pKa = 11,1; độ tan thay đổi theo pH của môi trường hòa tan. 1.1.3 Dược động học, tác dụng dược lý, cơ chế tác dụng Dược động học Hấp thu: Hấp thu nhanh qua đường tiêu hóa [1], [2], [3]. Thức ăn chứa nhiều chất béo làm tăng thời gian đạt Cmax trong huyết tương (tăng 1-2 giờ so với lúc đói) [3]. Cmax thường đạt ở 3 giờ sau khi uống một liều duy nhất 200 mg lúc đói và trung bình bằng 705 nanogam/ml [3]. Ở người trên 65 tuổi, Cmax tăng 40-50%. Phân bố: Vd khoảng 400 lít ( khoảng 7,14 lít/kg), thuốc phân bố nhiều vào mô. Ở nồng độ điều trị,celecoxib gắn mạnh với protein huyết tương [1], [2], [3], [9]. 2 Chuyển hóa: Celecoxib được chuyển hóa chủ yếu ở gan bởi isoenzym CYP 450 2C9 thành các chất chuyển hóa không có hoạt tính dược lý như các thuốc ức chế enzym COX-1 và COX-2 [1], [2], [3], [9]. Thải trừ: T1/2 trong huyết tương của celecoxib sau khi uống lúc đói là 11 giờ [1], [9] và hệ số thanh thải (Cl) trong huyết tương khoảng 500 ml/phút [3]. T1/2 của thuốc kéo dài ở người suy thận là 13,1 giờ và suy gan là 11 giờ hoặc 13,1 giờ [3]. Celecoxib thải trừ khoảng 27% trong nước tiểu, 57% trong phân, dưới 3% liều được thải trừ không thay đổi [3], [9]. Phản ứng viêm và vai trò của enzym COX Viêm là phản ứng tại chỗ của cơ thể do các mô bị kích thích hoặc tổn thương, gồm 4 yếu tố biểu hiện bên ngoài: sưng, nóng, đỏ, đau và gây ra các rối loạn chức năng cơ thể. Khi bị tổn thương, màng tế bào giải phóng ra phospholipid màng [1]. Dưới tác dụng của phospholipase A2, chất này bị chuyển thành axit arachidonic [1]. Tiếp theo đó dưới tác dụng của cyclooxygenase (COX), axit này bị chuyển hóa thành các prostaglandin [1]. Tác dụng của prostaglandin tùy thuộc vào vị trí tác dụng. Khi được tạo ra tại nơi viêm, prostaglandin làm tăng tình trạng viêm cục bộ và làm tăng sự mẫn cảm với đau. Ngược lại, đối với màng nhày của dạ dày và ruột, prostaglandin có tác dụng bảo vệ và tăng tưới máu màng nhày. Có 2 loại enzym COX: - COX-1 có mặt ở hầu hết các mô, thận, dạ dày, nội mạc mạch, tiểu cầu, tử cung, tinh hoàn… có tác dụng duy trì các hoạt động sinh lý bình thường của tế bào, tham gia vào quá trình sản xuất các PG sinh lý, tạo chất nhày bảo vệ dạ dày [1], [2]. - COX-2 được phát hiện ra vào năm 1991, enzym này có ở hầu hết các mô với nồng độ thấp, ở các tế bào tham gia vào phản ứng viêm, có chức năng thúc đẩy quá trình viêm [1], [2]. Do đó, các thuốc ức chế chọn lọc COX-2 sẽ có tác dụng chống viêm mạnh mà ít gây tác dụng phụ như: viêm loét dạ dày, tá tràng, xuất huyết dạ dày,… [1], [2]. Tác dụng dược lý của celecoxib: Celecoxib là 1 thuốc chống viêm không steroid, ức chế COX-2 mạnh hơn COX-1 từ 100 đến 400 lần, có tác dụng chống viêm, giảm đau, hạ sốt [1], [2]. Cơ chế tác dụng: Ức chế tổng hợp prostaglandin, chủ yếu thông qua tác dụng ức chế COX-2. Celecoxib không ức chế COX-1 với các nồng độ điều trị ở người, nên ít có nguy 3 cơ gây các tác dụng phụ (xuất huyết, viêm loét dạ dày, kéo dài thời gian chảy máu), nhưng có thể gây các tác dụng phụ ở thận tương tự như các NSAIDs khác. Celecoxib có thể làm tăng nguy cơ huyết khối mạch máu ở một số bệnh nhân vì ức chế tổng hợp PG (một chất kháng huyết khối) và không tác động đến thromboxan A2 (một chất dễ gây huyết khối) [3]. 1.1.3.1 Tác dụng không mong muốn ADR của celecoxib ở liều thường dùng nói chung nhẹ và có liên quan chủ yếu đến đường tiêu hóa. Một số phản ứng phụ thường gặp là nhức đầu, rối loạn tiêu hóa, choáng váng, viêm ruột, viêm dạ dày, dị ứng, thiếu máu, viêm phế quản, viêm gan, vàng da; hiếm hơn có thể phù mạch, sốc phản vệ [3]. ADR khiến phải ngừng dùng thuốc nhiều nhất gồm: khó tiêu, đau bụng [3]. 1.1.4 Chỉ định, chống chỉ định Chỉ định: Điều trị triệu chứng thoái hóa khớp ở người lớn, viêm khớp dạng thấp ở người lớn, đau cấp (cả đau sau phẫu thuật, nhổ răng), thống kinh nguyên phát. Điều trị bổ trợ để làm giảm số lượng polyp trong liệu pháp thông thường điều trị bệnh polyp dạng tuyến đại – trực tràng có tính gia đình [2], [3]. Chống chỉ định: Mẫn cảm với celecoxib. Viêm loét dạ dày tá tràng tiến triển hoặc xuất huyết tràng vị. Suy gan, thận nặng. Suy tim phù nề nặng [2], [3]. 1.2 Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 1.2.1 Giới thiệu Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục của các chất phân tích lên hai pha: một pha thường đứng yên có khả năng hấp phụ chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động. Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh [4]. Mẫu phân tích hòa tan trong pha động được đưa vào cột, các thành phần trong mẫu sẽ bị pha tĩnh giữ lại. Cho pha động liên tục chảy qua cột, các thành phần đó sẽ di chuyển trên cột theo pha động với các tốc độ khác nhau và được tách ra khỏi nhau tùy thuộc vào lực tương tác giữa pha tĩnh - pha động và chất tan [4]. 1.2.2 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC Hệ thống HPLC bao gồm các bộ phận chính sau đây: Bộ phận cấp pha động: Thường gồm các dung môi được chứa trong các bình kín riêng biệt. Các dung môi cần được lọc và đuổi khí trước khi bơm vào cột. Pha động có 4 thể là hỗn hợp nhiều dung môi và có 2 cách dùng pha động rửa giải là đẳng dòng (thành phần pha động không đổi trong quá trình sắc ký) và gradient (thành phần pha động thay đổi theo chương trình đã định) [4]. Bơm: Để bơm pha động vào cột phân tích. Bơm phải có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên, đảm bảo lưu lượng lặp lại trong khoảng 0,01 ÷ 5,0 ml/phút và phải chịu được tác động của nhiều loại dung môi (không bị ăn mòn) [4]. Hệ tiêm mẫu: Để tiêm mẫu phân tích vào cột phân tích trong quá trình sắc ký [4]. Cột phân tích: Cột phân tích là cột chứa pha tĩnh, là một trong những yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký của một hỗn hợp chất mẫu. Cột phân tích có nhiều cỡ khác nhau, tuỳ thuộc vào mức độ sắc ký. Cột bảo vệ dùng để loại một số thành phần trong pha động và trong mẫu phân tích có thể làm giảm tuổi thọ của cột sắc ký [4]. Detector: Dùng để phát hiện chất phân tích dựa vào đáp ứng chọn lọc với chất phân tích khi hấp thụ bức xạ UV hoặc huỳnh quang. Detector cần đáp ứng nhanh và lặp lại, độ nhạy cao, ổn định, khoảng hoạt động tuyến tính rộng [4]. Tuỳ theo chất phân tích mà chọn loại detector phù hợp để đạt độ nhạy cao khi phát hiện và định lượng. Trong đó, detector hấp thụ phân tử vùng phổ UV hay UV-VIS được dùng phổ biến nhất vì thích hợp cho nhiều loại chất và không quá đắt. Hệ thống thu nhận và xử lý số liệu: Thường là hệ thống máy tính điện tử cài đặt phần mềm nhận tín hiệu, xử lý số liệu và điều khiển toàn bộ hệ thống, có thể kèm theo thiết bị in dữ liệu. Hình 1. 2: Sơ đồ hệ thống HPLC 5 1.2.3 Nguyên tắc của quá trình sắc ký Trong quá trình sắc ký các phân tử chất tan luôn phân bố qua lại giữa hai pha trong khi pha động luôn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất định. Mặt khác, do cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử chất tan là khác nhau nên tốc độ dịch chuyển trung bình của mỗi chất tan cũng khác nhau trong quá trình di chuyển từ đầu cột đến cuối cột sắc ký. Khi ở trong pha động, phân tử chất tan dịch chuyển theo tốc độ của pha động; khi ở trong pha tĩnh, phân tử chất tan bị giữ lại. Như vậy sẽ có một thời gian nhất định chất tan bị lưu giữ lại trong cột sắc ký. Vì vậy, trong quá trình sắc ký, có chất bị lưu giữ lâu trên cột, có chất tan ít bị lưu giữ. Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng của các mối tương tác: giữa chất phân tích và pha tĩnh (F1), giữa chất phân tích và pha động (F2), giữa pha tĩnh và pha động (F3). chất phân tích F1 F2 pha tĩnh pha động F3 Hình 1. 3: Các lực tương tác trong quá trình sắc ký Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước. Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được quy định bởi ba lực F1, F2, F3. Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn. Ở đây F 1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột. Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau. Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột [4]. 1.2.4 Các đại lượng đặc trưng Thời gian lưu (tR) Các chất tan trong hỗn hợp mẫu phân tích, khi được nạp vào cột phân tích sẽ bị lưu giữ ở trong cột (pha tĩnh) theo một thời gian nhất định. Thời gian lưu là thời gian tính từ lúc bắt đầu bơm mẫu vào cột cho tới khi pic đạt giá trị cực đại [4]. Ý nghĩa: Chủ yếu dùng để định tính. 6 Hệ số phân bố (K) Tốc độ di chuyển chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K [4]: K = CS / CM Với CM , CS lần lượt là nồng độ mol chất tan trong pha động và pha tĩnh. Ý nghĩa: K càng lớn, chất tan di chuyển pha tĩnh càng chậm. Các chất trong hỗn hợp có hệ số K khác nhau càng nhiều càng dễ tách nhau [4]. Hệ số dung lượng (k’) Hệ số dung lượng k’ cho ta biết tỷ số khối lượng của chất tan i phân bố vào trong mỗi pha là bao nhiêu [4]. k’ = ( CS.VS)/(CM.VM) k’ = K.VS/VM Trong đó: VS, VM là thế tích pha tĩnh và pha động. Ý nghĩa: Nếu hệ số k’ << 1 quá trình rửa giải diễn ra quá nhanh, khó xác định chính xác thời gian lưu. Nếu hệ số k’ quá lớn, quá trình rửa giải diễn ra quá dài. Giá trị tối ưu: Nên chọn điều kiện sắc ký để k’ dao động từ 1 đến 5 [4]. Hệ số chọn lọc (α) Hệ số chọn lọc α đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B [4]: α = KB / KA Trong đó: KA, KB là hệ số phân bố 2 chất A, B (theo quy ước, KB > KA ). Ý nghĩa: Điều kiện cần thiết để hai chất A, B tách khỏi nhau là α > 1. Tuy nhiên nếu α lớn quá, thời gian phân tích sẽ kéo dài [4]. Giá trị tối ưu: α dao động trong khoảng từ 1,05 đến 2 [4]. Độ phân giải (Rs) Độ phân giải nói lên mức độ tách các cấu tử khỏi nhau trong một phép sắc ký. Hai cấu tử A và B được tách khỏi nhau càng triệt để khi độ phân giải càng cao. Độ phân giải của 2 pic chất A và B được tính theo công thức sau [4]: R = [(t ) − (t ) ] 1 (W + W ) 2 Trong đó: (tR)A, (tR)B là thời gian lưu của 2 chất A, B. WA, WB là độ rộng pic chất A, B. 7 Ý nghĩa: RS càng lớn, 2 pic chất càng tách xa nhau. Nhưng nếu RS quá lớn, quá trình phân tích sẽ kéo dài. Điều kiện để 2 pic chất tách rõ nhau trên sắc ký đồ là R S ≥ 1,3 [4]. 1.2.5 Định lượng bằng HPLC Phương trình cơ bản để định lượng Trong kỹ thuật HPLC, để định lượng một chất, người ta dựa theo hai phương trình cơ bản sau đây về mối quan hệ giữa pic sắc ký (diện tích hoặc chiều cao) của chất với nồng độ C của chúng được bơm vào cột phân tích. H = a.C + b S = a.C+ b Trong đó: H : Chiều cao pic sắc ký của chất. S : Diện tích pic sắc ký của chất. Để phân tích định lượng các chất theo kỹ thuật HPLC, chúng ta có thể dùng một trong hai phương pháp chuẩn hoá là phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm chuẩn. Việc lựa chọn phương pháp nào là tuỳ thuộc vào loại mẫu phân tích và hàm lượng chất phân tích. 1.3 Các phương pháp phân tích celecoxib trong huyết tương bằng HPLC Bảng 1. 1: Một số nghiên cứu định lượng CELE trong HT TLTK Phương pháp phân tích Điều kiện sắc ký (cột, pha động, IS, detector …) Xử lý mẫu Cột: Nucleosil-NO2 (150 x 4,6mm; 5µm) Pha động: Hexan : CH2Cl2 : isopropyl alcohol = 70:25:5 [18] HPLC-UV Chiết pha rắn Flow: 1,4 ml/phút Detector: UV 260 nm IS: Chất có cấu trúc tương tự CELE Cột: Prontosil C18 AQ (150 x 3mm, 3µm) Pha động: H2O : MeCN = 40:60 [19] HPLC-FL Flow: 0,35 ml/phút Detector: Huỳnh quang (bước sóng kích thích 240nm, bước sóng phát xạ 380 nm) 8 Chiết lỏng - lỏng bằng chloroform IS: 4-[5-phenyl-3-(trifluoromethyl)-1Hpyrazol-1-yl]benzene-sulfonamide Cột: Nucleosil CN (250mm × 4,6mm; 5µm) Pha động: MeCN : H2O = 60:40 [12] HPLC-UV Flow: 0,9 ml/phút Chiết lỏng - lỏng bằng cloroform IS: flutamide Detector: UV 260nm Cột: Aqua C18 (5µm; 75mm x 4,6mm) Pha động: [22] HPLC-UV MeCN : đệm KH2PO4 (pH 3,5) = 50:50 Tủa protein bằng Flow: 1ml/phút MeCN Detector: UV 254nm IS không có Cột: RP-18e (100mm x 4,6mm) Pha động: MeCN : MeOH : H2O = 45:10:45 [21] HPLC-UV Flow: 2 ml/phút Tủa tạp bằng MeCN và NaCl Detector: UV 254nm IS: acid mefenamic Cột: C18 µ-Bondapak (250 × 3,9mm) [10] HPLC-UV Pha động: Chiết lỏng lỏng bằng Đệm KH2PO4 (pH 4,0) : MeCN = 60:40 hỗn hợp dung môi n- Flow: 1,5 ml/phút hexan : isoamyl Detector: UV 260nm alcol = 97 : 3 IS: flutamide Cột: C18 (55mm x 2mm; 3µm) Pha động: MeOH : Đệm CH3COONH4 = [17] LC–MS/MS 75:25 Tủa tạp bằng dung IS: celecoxib-D4 dịch IS trong MeOH Flow: 0,2 ml/phút Detector: UV 254nm 9 Cột: Luna HILIC (50mm x 2,0 mm; 3µm) [15] LC-MS/MS Pha động: chiết lỏng lỏng bằng Đệm HCOONH4 (pH 3,0) : MeOH = 5:95 methyl tert-butyl Flow: 0,2 ml/phút ether IS: artorvastatin calcium Cột: Hypersil BDS C18 (250 x 4,6mm; 5µm) Pha động MeOH : H2O = 75:25 [14] HPLC-UV Flow: 1,25 ml/phút Detector: UV 250nm IS không có Cột: Phenomenex LUNA RP-18, 250 x 4,6 mm; 5 µm. Pha động: MeOH : MeCN : H2O = 12:45:43 [6] HPLC-UV điều chình pH bằng CH3COOH tới 3,5. Flow: 2 ml/phút. Detector: UV 254nm Chiết lỏng lỏng bằng hỗn hợp dung môi nhexan : isopropanol = 97 : 3 IS: acid mefenamic. Nhận xét: Các nghiên cứu trên sử dụng 2 phương pháp chiết là chiết pha rắn và phương pháp chiết lỏng - lỏng. Phương pháp chiết pha rắn để xử lý mẫu cho hiệu quả cao nhưng việc xử lý mẫu này tốn kém và phức tạp. Phương pháp chiết lỏng - lỏng tuy hiệu quả không cao bằng nhưng phù hợp với điều kiện thực nghiệm của cơ sở nghiên cứu nên chúng tôi sẽ áp dụng phương pháp này để tiến hành nghiên cứu của mình. Hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng cột C18 nên chúng tôi quyết định lựa chọn loại cột này để tiến hành nghiên cứu của mình. Các nghiên cứu sử dụng pha động gồm MeOH (hoặc MeCN) với H2O (hoặc đệm). Trong đó, MeCN là dung môi được ưa chuộng hơn MeOH do nền mẫu thấp (hấp thu UV kém), cho phép việc phân tích diễn ra ở áp suất thấp (ít ảnh hưởng đến độ bền cột). pKa =11,1; pH pha động sẽ ảnh hưởng đến trạng thái phân ly của celecoxib và ảnh hưởng đến thời gian lưu; vì vậy cần sử dụng đệm trong thành phần pha động để đảm 10 bảo độ lặp lại của phép phân tích. Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn pha động gồm MeCN, đệm KH2PO4 (pH = 4,0) để tiến hành phân tích Celecoxib trong huyết tương. 11