Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng acid fenofibric và fenofibrat trong h...

Tài liệu Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng acid fenofibric và fenofibrat trong huyết tương chó bằng hplc

.PDF
52
348
82

Mô tả:

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NGỌC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ACID FENOFIBRIC VÀ FENOFIBRAT TRONG HUYẾT TƢƠNG CHÓ BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SỸ HÀ NỘI 2018 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NGỌC MSV : 1301293 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG AICD FENOFIBRIC VÀ FENOFIBRAT TRONG HUYẾT TƢƠNG CHÓ BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SỸ Người hướng dẫn : 1. TS. Nguyễn Thị Thuận 2. HVCH. Phạm Thị Huyền Chang Nơi thực viện : 1. Viện Công Nghệ Dƣợc Phẩm Quốc Gia 2. Bộ môn hóa dƣợc Hà Nội-2018 LỜI CẢM ƠN Trƣớc khi trình bày nội dung những phần thuộc đề tài của mình, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến những ngƣời trong suốt thời gian qua đã luôn hỗ trợ động viên tôi hoàn thành một cách tốt nhất khóa luận tốt nghiệp của mình. Trƣớc tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến với ngƣời cô đáng kính của tôi: TS. Nguyễn Thị Thuận - Bộ môn Hóa Dƣợc - trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội và ngƣời chị Phạm Thị Huyền Chang – Cao học 21 - trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội. Cô và chị không chỉ hƣớng dẫn chỉ bảo tôi tận tình mà còn luôn tạo những điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi hoàn thành khóa luận . Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của Viện Công Nghệ Dƣợc Phẩm Quốc Gia, Bộ môn Hóa Dƣợc - trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận này. Cuối cùng, tôi muốn cảm ơn gia đình, bạn bè, các anh chị, các bạn của nhóm kiểm nghiệm bộ môn Hóa đã chia sẻ buồn vui, giúp đỡ và khích lệ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Hà Nội, ngày 4 tháng 1 năm 2018 Sinh viên Nguyễn Thị Ngọc. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................ 1 CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN ................................................................................... 2 1.1.Tổng quan về acid fenofibric (FA) và fenofibrate (FB) ............................... 2 1.2. Tổng quan về kỹ thuật HPLC ....................................................................... 5 1.3.Một số phƣơng pháp định lƣợng acid fenofibric trong huyết tƣơng ......... 9 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 12 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ............................................................................... 12 2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 13 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................. 13 2.4. Ứng dụng thực tế .......................................................................................... 18 2.5. Phƣơng pháp xử lý kết quả ......................................................................... 18 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................. 20 3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký ............................................................................ 20 3.2. Thẩm định phƣơng pháp ............................................................................. 22 3.2.1. Sự phù hợp hệ thống sắc ký ..................................................................... 22 3.2.2. Độ chọn lọc, độ đặc hiệu ......................................................................... 23 3.2.3. Tỷ lệ thu hồi ............................................................................................. 23 3.2.4. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính ......................................................... 25 3.2.5. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng dưới (LLOQ) ............... 27 3.2.6. Độ đúng, độ lặp lại .................................................................................. 29 3.2.7. Độ ổn định ............................................................................................... 33 3.3. Ứng dụng thực tế .......................................................................................... 37 BÀN LUẬN .......................................................................................................... 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................................... 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 42 PHỤ LỤC ................................................................................................................ 44 DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Ký hiệu Chú thích µg Microgram µl Microlit Autosampler Hệ thống tiêm mẫu tự động C18 Cột Octadecylsilan CE Điện di mao quản CV Hệ số biến thiên DĐVN IV Dƣợc điển Việt Nam IV EtOAc Ethyl acetat FA Acid fenofibric FB Fenofibrate FDA Cục quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Mỹ HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao UPHLC Sắc ký lỏng siêu hiệu năng HQC Mẫu kiểm tra nồng độ cao HT Huyết tƣơng IS Chuẩn nội LC-MS/MS Sắc ký lỏng khối phổ 2 lần LLOQ Giới hạn định lƣợng dƣới LOD Giới hạn phát hiện LQC Mẫu kiểm tra nồng độ thấp MeCN Acetonitril MeOH Methanol MQC Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình PĐ Pha động r Hệ số tƣơng quan R% Độ thu hồi (%) RSD Độ lệch chuẩn tƣơng đối SD Độ lệch chuẩn SKD Sinh khả dụng Spic Diện tích pic TB Trung bình TĐSH Tƣơng đƣơng sinh học Tltk Tài liệu tham khảo tR Thời gian lƣu giữ V Thể tích ULOQ Giới hạn định lƣợng trên DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. 1 : Một số phƣơng pháp định lƣợng acid fenofibric trong huyết tƣơng ............ 9 Bảng 2. 1 : Danh mục chất chuẩn .................................................................................. 12 Bảng 2. 2 : Danh mục dung môi và hoá chất ................................................................ 12 Bảng 2. 3: Bảng nồng độ các mẫu QC .......................................................................... 14 Bảng 3. 1: Chƣơng trình gradient .................................................................................. 22 Bảng 3. 2 : Kết quả sự phù hợp hệ thống ...................................................................... 23 Bảng 3. 3: Kết quả tỷ lệ thu hồi FA sau khi chiết ......................................................... 24 Bảng 3. 4: Kết quả tỷ lệ thu hồi FB sau khi chiết.......................................................... 24 Bảng 3. 5: Kết quả tỷ lệ thu hồi IS sau khi chiết ........................................................... 25 Bảng 3. 6 : Các giá trị sử dụng trọng số ........................................................................ 25 Bảng 3. 7 : Kết quả khảo sát đƣờng chuẩn FA .............................................................. 26 Bảng 3. 8 : Kết quả khảo sát đƣờng chuẩn FB .............................................................. 26 Bảng 3. 9 : Kết quả xác định giới hạn định lƣợng dƣới FA .......................................... 27 Bảng 3. 10 : Kết quả xác định giới hạn định lƣợng dƣới FB ........................................ 28 Bảng 3. 11 : Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại trong ngày của FA .......................... 29 Bảng 3. 12 : Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại trong ngày của FB .......................... 30 Bảng 3. 13 : Kết quả xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày của FA .......................... 31 Bảng 3. 14 : Kết quả xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày của FB .......................... 32 Bảng 3. 15: Độ ổn định trong thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng .................................... 33 Bảng 3. 16: Độ ổn định của mẫu sau xử lý ................................................................... 34 Bảng 3. 17: Độ ổn định của mẫu huyết tƣơng sau 3 chu kì đông – rã .......................... 35 Bảng 3. 18: Độ ổn định trong 30 ngày của mẫu huyết tƣơng ....................................... 36 Bảng 3. 19 : Nồng độ FA, FB trong huyết tƣơng chó theo đƣờng chuẩn ..................... 37 DANH MỤC ĐỒ THỊ, HÌNH VẼ Hình 1. 1 : Công thức cấu tạo của FA ............................................................................. 2 Hình 1. 2 : Công thức cấu tạo của FB ............................................................................. 2 Hình 1. 3 : Sơ đồ máy HPLC........................................................................................... 6 Hình 3. 1: Phổ xác định bƣớc sóng hấp thụ của FA và FB ........................................... 20 Hình 3. 2 : Sắc ký đồ chạy MeCN: đệm phosphat pH3 ................................................ 20 Hình 3. 3 : Sắc ký đồ chạy MeOH: đệm phosphat pH3 ................................................ 21 Hình 3. 4: Sắc ký đồ hệ MeOH: đệm phosphat pH3= 80: 20 ....................................... 21 Hình 3. 5 : Sắc ký đồ hệ MeOH: đệm phosphat pH3= 90: 10 ...................................... 21 Hình 3. 6 : Sắc ký đồ chƣơng trình gradient ................................................................. 22 Hình 3. 7 : Sắc ký đồ của FA, FB, IS kiểm tra sự phù hợp hệ thống. ........................... 22 Hình 3. 8 : Sắc ký đồ mẫu LLOQ……………………………………………………..23 Hình 3. 9 : Sắc ký đồ mẫu trắng……………………………………...……………….23 Hình 3. 10: Sắc ký đồ phát hiện giới hạn phát hiện của FA .......................................... 28 Hình 3. 11: Sắc ký đồ phát hiện giới hạn phát hiện của FB .......................................... 29 Hình 3. 12: Đồ thị nồng độ FA trong HT chó theo thời gian ........................................ 38 Hình 3. 13: Đồ thị nồng độ FB trong HT chó theo thời gian ........................................ 38 ĐẶT VẤN ĐỀ Rối loạn lipid máu hay còn gọi là bệnh mỡ máu, hiện đang là căn bệnh phổ biến trong thế giới hiện đại. Trong những năm gần đây số ngƣời tử vong vì các bệnh tim mạch, đột quỵ tăng lên nhanh chóng, mà nguyên sâu xa lại bắt nguồn từ mỡ máu. Bệnh mỡ máu nếu đƣợc phát hiện sớm và điều trị kịp thời có thể duy trì ổn định các chỉ số mỡ máu, phòng tránh các biến chứng nguy hiểm. Hiện nay có nhiều nhóm thuốc để điều trị rối loạn lipid, trong đó nhóm thuốc statin và nhóm thuốc fibric đƣợc sử dụng rộng rãi. Fenofibrat là một dẫn chất của acid fibric đƣợc dùng trong điều trị rối loạn mỡ máu. Chất này có tác dụng ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở gan làm giảm các thành phần gây xơ vữa, giảm triglycerid và làm tăng lipoprotein tỉ trọng cao, do đó có tác dụng tốt trong điều trị mỡ máu. Sau khi uống, fenofibrat bị thủy phân trong huyết tƣơng thành chất chuyển hoá có hoạt tính là acid fenofibric. Hiện nay, fenofibrat có nhiều dạng bảo chế mới nên có thể khi uống vào cơ thể fenofibrat chƣa bị thủy phân ngay thành aicd fenofibric. Tuy nhiên ở Việt Nam chƣa có phƣơng pháp nào đƣợc xây dựng để định lƣợng đồng thời aicd fenofibric và fenofibrat trong huyết tƣơng. Do đó chúng tôi thực hiện đề tài : “NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG AICD FENOFIBRIC VÀ FENOFIBRAT TRONG HUYẾT TƢƠNG BẰNG HPLC” nhằm mục đích : 1. Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng FA và FB trong huyết tƣơng chó. 2. Ứng dụng đánh giá nồng độ FA và FB trong một số mẫu HT chó. 1 CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan về acid fenofibric (FA) và fenofibrate (FB) 1.1.1 Công thức cấu tạo và tính chất vật lý của FA và FB Acid fenofibric : O H3C CH3 Cl OH O O Hình 1. 1 : Công thức cấu tạo của FA - Tên khoa học : 2-[4-(4-clorobenzoyl) phenoxy]-2-methylpropanoic acid - Công thức phân tử : C17H15ClO4 - Khối lƣợng phân tử: 318,75 - Tính chất hóa lý: + Là dạng chuyển hóa có hoạt tính trong huyết tƣơng của FB bằng cách cắt liên kết ester trong phân tử FB nhờ enzyme esterase. + Dạng bột tinh thể màu trắng hoặc hơi trắng, không tan trong nƣớc, độ tan tăng trong các hệ đệm, tan tốt trong MeOH, nóng chảy ở 179-1830C. + Có khả năng hấp thụ UV cực đại ở 288nm, nên có thể định lƣợng bằng HPLC detector UV-VIS tại bƣớc sóng này. Fenofibrat: O O O Cl O Hình 1. 2 : Công thức cấu tạo của FB - Tên khoa học: 1-methylethyl 2-[4-(4-clorobenzoyl) phenoxy]-2-methylpropanoat. 2 - Công thức phân tử : C20H21ClO4 - Khối lƣợng phân tử: 360,8 [2] - Tính chất vật lý: Bột kết tinh màu trắng. Thực tế không tan trong nƣớc, rất dễ tan trong methylen clorid, khó tan trong ethanol 96%. Fenofibrat thân dầu, trung tính, hệ số phân bố D/N logP = 5,24. Nóng chảy ở 79-820C. - Tính chất hóa học: có cấu trúc ester nên dễ bị thủy phân cho acid fenofibric (FA) và isopropanol. Hấp thụ tia UV ở bƣớc sóng 286nm nên có thể định lƣợng bằng HPLC detector UV-VIS tại bƣớc sóng này [2]. 1.1.2 Đặc điểm dược động học của FA và FB Fenofibrat đƣợc hấp thu ngay ở đƣờng tiêu hóa cùng với thức ăn. Hấp thu thuốc bị giảm nhiều nếu uống sau khi nhịn ăn qua đêm. Thuốc nhanh chóng bị thủy phân thành acid fenofibric có hoạt tính; chất này gắn nhiều vào albumin huyết tƣơng và có thể đẩy các thuốc kháng vitamin K ra khỏi vị trí gắn. Nồng độ đỉnh trong huyết tƣơng xuất hiện khoảng 5 giờ sau khi uống thuốc. Acid fenofibric đào thải chủ yếu theo nƣớc tiểu (70% trong vòng 24 giờ, 88% trong vòng 6 ngày), chủ yếu dƣới dạng liên hợp glucuronic. Không thấy xảy ra điều gì nghiêm trọng khi ngừng dùng fibrat, thậm chí sau khi đã điều trị lâu ngày và cắt thuốc đột ngột [3]. 1.1.3 Dược lý dược lâm sàng 1.1.3.1 Tác dụng dược lý [3], [6] : Fenofibrat, dẫn chất của acid fibric, là thuốc hạ lipid máu. Thuốc ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở gan, làm giảm các thành phần gây vữa xơ (lipoprotein tỷ trọng rất thấp VLDL và lipoprotein tỷ trọng thấp LDL), làm tăng sản xuất lipoprotein tỷ trọng cao (HDL), và còn làm giảm triglycerid máu, do đó giúp cải thiện đáng kể sự phân bố cholesterol trong huyết tƣơng [6]. Fenofibrat đƣợc dùng để điều trị tăng lipoprotein- huyết typ IIa, typ IIb, typ III, typ IV và typ V cùng với một chế độ ăn rất hạn chế về lipid. Fenofibtrat có thể làm giảm 20- 25% cholesterol toàn phần và 40- 50% triglycerid trong máu. Ðiều trị bằng fenofibrat cần phải liên tục. 3 1.1.3.2 Chỉ định và liều dùng Fenofibrat đƣợc sử dụng trong điều trị rối loạn lipoprotein huyết các tip IIa, IIb, III, IV và V, phối hợp với chế độ ăn. Ðiều trị fenofibrat nhất thiết phải phối hợp với chế độ ăn hạn chế lipid. Phải uống thuốc cùng với bữa ăn vì thuốc giảm hấp thu khi nhịn đói. Ngƣời lớn: 300mg/ngày (1 viên 300mg, uống vào một bữa ăn chính hoặc uống 3 lần, mỗi lần 1 viên 100mg cùng với các bữa ăn). Liều ban đầu thƣờng là 200mg một ngày (uống một lần hoặc chia làm 2 lần). Nếu cholesterol toàn phần trong máu vẫn còn cao hơn 4g/l thì có thể tăng liều lên 300mg/ngày. Cần duy trì liều ban đầu cho đến khi cholesterol máu trở lại bình thƣờng, sau đó có thể giảm nhẹ liều hàng ngày xuống. Phải kiểm tra cholesterol máu 3 tháng một lần. Nếu các thông số lipid máu lại tăng lên thì phải tăng liều lên 300mg/ngày. Trẻ > 10 tuổi: Cần nghiên cứu kỹ để xác định nguyên nhân chính xác của tăng lipid máu ở trẻ. Có thể điều trị kết hợp với một chế độ ăn đƣợc kiểm soát chặt chẽ trong vòng 3 tháng. Liều tối đa khuyên dùng là 5mg/kg/ngày. Nếu nồng độ lipid trong máu không giảm nhiều sau 3 đến 6 tháng điều trị bằng fenofibrat thì cần thay đổi trị liệu (trị liệu bổ sung hoặc trị liệu khác). [3] 1.1.3.3 Chống chỉ định [3], [6] : Suy thận nặng. Rối loạn chức năng gan nặng. Trẻ dƣới 10 tuổi. 1.1.3.4 Tác dụng không mong muốn Tác dụng không mong muốn thƣờng nhẹ và ít gặp. - Thƣờng gặp, ADR >1/100 + Tiêu hóa: Rối loạn tiêu hóa, trƣớng vùng thƣợng vị, buồn nôn, ỉa chảy nhẹ. + Da: Nổi ban, nổi mày đay, ban không đặc hiệu. + Gan: Tăng transaminase huyết thanh. + Cơ: Ðau nhức cơ. - Hiếm gặp, ADR < 1/1000 Sỏi đƣờng mật, mất dục tính và liệt dƣơng, giảm tinh trùng, giảm bạch cầu. 4 1.1.3.4 Tương tác thuốc [3], [6] : Dùng kết hợp các thuốc ức chế HMG CoA reductase (ví dụ: pravastatin, simvastatin…) và fibrat sẽ làm tăng đáng kể nguy cơ tổn thƣơng cơ và viêm tụy cấp. Kết hợp fibrat với ciclosporin làm tăng nguy cơ tổn thƣơng cơ. Không đƣợc dùng kết hợp các thuốc độc với gan (thuốc ức chế MAO, perhexilin maleat...) với fenofibrat. Fenofibrat làm tăng tác dụng của các thuốc uống chống đông và do đó làm tăng nguy cơ xuất huyết do đẩy các thuốc này ra khỏi vị trí gắn với protein huyết tƣơng. Cần theo dõi lƣợng prothrombin thƣờng xuyên hơn và điều chỉnh liều thuốc uống chống đông trong suốt thời gian điều trị bằng fenofibrat và sau khi ngừng thuốc 8 ngày. 1.2. Tổng quan về kỹ thuật HPLC 1.2.1 Khái Niệm Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dƣới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố hay trao đổi ion tùy thuộc vào pha tĩnh đƣợc sử dụng. 1.2.2 Nguyên tắc Để tiến hành sắc ký, pha tĩnh đƣợc nhồi vào cột tách theo 1 kỹ thuật nhất định phù hợp. Pha tĩnh là yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký. Nếu pha tĩnh : + Là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thƣờng hay pha ngƣợc (hệ NP-HPLC hay RP-HPLC). + Là chất trao đổi ion, ta có sắc ký trao đổi ion ( Iex-HPLC) + Là chất lỏng thì ta có sắc ký chiết hay sắc ký phân bố (LLC) Cùng với pha tĩnh, để thực hiện sắc ký, rửa giải chất phân tích ra khỏi cột tách, chúng ta phải cần một dung môi rửa giải, đó là pha động. Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng các mối tƣơng tác : 5 Trong đó : X là chất phân tích SP là pha tĩnh MP là pha động Lực F1 giữ chất phân tích ở lại trên cột, trong khi đó lực F2 kéo chất phân tích ra khỏi pha tĩnh, F3 là lực tƣơng tác giữa pha động và pha tĩnh. Nếu trong 1 hệ sắc ký với các chất khác nhau thì F1 và F2 thay đổi, F3 không thay đổi. Nhƣ vậy F1 và F2 là hai yếu tố quyết định sự lƣu giữ của chất tan trong một hệ pha. 1.2.3 Cấu tạo hệ thống HPLC [1], [4]. Về kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao, sự tách các chất xảy ra liên tục trong cột sắc ký từ lúc mẫu đƣợc nạp vào cột cho đến khi nó đƣợc rủa giải ra khỏi cột cùng với pha động. Vì thế hệ thống HPLC cần có sự phù hợp giữa các bộ phận trong hệ thống để thu đƣợc kết quả tốt nhất. Về nguyên tắc hệ thống HPLC gồm các bộ phận sau : Hình 1. 3 : Sơ đồ máy HPLC * Bơm cao áp : Bơm cao áp để bơm pha động qua cột sắc ký. Bơm phải điều chỉnh đƣợc áp suất (áp suất bơm có thể từ 0- 400 bar) để tạo tốc độ dòng phù hợp với quá trình sắc ký và phải nhanh chóng đạt cân bằng tốc độ bơm đã chọn (thông thƣờng từ 0,2- 10ml/phút) và lặp lại tốt cũng nhƣ ổn định trong suốt quá trình bơm. 6 * Bộ phận tiêm mẫu : Để bơm mẫu vào cột sắc ký theo những lƣợng mẫu nhất định không đổi trong quá trình sắc ký. * Cột phân tích : Cột chính là trái tim của hệ thống sắc ký. Mọi diễn biến của sự tách hỗn hợp chất đều xảy ra ở đây và kết quả tốt hay không thì cột luôn là một yếu tố quyết định. Cột thƣờng có chiều dài 10-25cm và có đƣờng kính trong từ 2-4,5mm. Trong cột chứa pha tĩnh (chất nhồi cột). Pha tĩnh đƣợc chế tạo trên nền silica đƣợc sử dụng rộng rãi nhất với nhiều tính chất ƣu việt nhƣ khả năng chịu áp suất cao, bền với nhiệt, trơ với các dung môi chạy sắc ký và có độ thay đổi dung môi rất nhỏ khi thay đổi thành phần pha động. * Detecter : [4] Là bộ phận phát hiện chất khi ra khỏi cột. Hiện nay có nhiều loại detector khác nhau : + Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV- VIS): 190- 900 nm để phát hiện các chất hấp thụ quang. Đây là loại thông dụng nhất. + Detector huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng nhƣ các dẫn chất có huỳnh quang. Là loại detector có độ chọn lọc cao hơn hẳn detecter UV- VIS. + Detector mảng diod phát quang: Loại detecter này có độ nhạy, độ chọn lọc rất cao và có thể chọn bƣớc sóng hấp thụ cho từng chất dễ dàng. * Bộ phận ghi tín hiệu : Thông thƣờng ngƣời ta dùng các thiết bị để ghi lại sắc đồ của sự tách và máy tính để xử lý kết quả. Ngoài những bộ phận tối thiểu của hệ thống HPLC nhƣ đã nếu trên thì hệ thống HPLC ngày càng đƣợc hoàn thiện theo sự phát triển của khoa học kỹ thuật. Các hệ thống HPLC hiện đại còn có thêm bộ chƣơng trình dung môi để thay đổi thành phần pha động trong quá trình sắc ký , bộ phận nạp mẫu tự động, bộ điều nhiệt cho cột vv… 7 1.2.4 Các đại lượng đặc trưng [1], [4]. * Thời gian lưu giữ (tR) : Các chất phân tích khi nạp vào cột sắc ký sẽ bị lƣu giữ ở trong cột theo một thời gian nhất định, tR. Thời gian lƣu giữ này đƣợc tính từ lúc nạp mẫu vào cột sắc ký cho đến lúc chất tan đƣợc rửa giải ra khỏi cột ở thời điểm có nồng độ cực đại. tR = t0 + t’R Trong đó: t0 là thời gian không lƣu giữ (thời gian chất tan nằm trong pha động). t’R là thời gian lƣu giữ thực của chất trong cột. *Hệ số tách của 2 chất (α): Với 2 chất A và B kế tiếp nhau trong sắc ký đồ chúng ta có : α = t’R(B) - t’R(A) Giá trị α càng lớn thì sự tách của chất A và B càng rõ. Khi đại lƣợng này bằng 1 thì không có sự tách của 2 chất, lúc này 2 chất nằm trong cùng 1 pic. Còn nếu α gần bằng 1, thì pic sắc ký của hai chất A và B có chung một vùng đè lên nhau, nghĩa là chúng chập vào nhau không thể tách thành hai pic riêng biệt đặc trƣng cho hai chất đó. *Hệ số phân bố (K) : Quá trình tách sắc ký của các chất tan là dựa trên sự phân bố của chất tan giữa pha động và pha tĩnh xảy ra liên tục trong cột. Sự phân bố này đƣợc đặc trƣng bởi một đại lƣợng gọi là hệ số phân bố K. K = C S / CM Với CM , CS lần lƣợt là nồng độ chất tan trong pha động và pha tĩnh. Hệ số phân bố này cho biết khả năng phân bố của chất tan nhƣ thế nào trong mỗi pha (pha động và pha tĩnh). *Hệ số dung lượng (k) : Hệ số dung lƣợng cho ta biết tỷ số khối lƣợng của chất tan phân bố trong mỗi pha là bao nhiêu. k’ = ( CS.VS)/(CM.VM) k’ = K.VS/VM Với VM là thể tích pha động trong cột tách, VS là thể tích thực của pha tĩnh trong cột. 8 *Độ phân giải (RS) : Độ phân giải nói lên mức độ tách các chất khỏi nhau trong một chƣơng trình sắc ký. Độ phân giải đƣợc tính theo công thức sau: RAB = 2.(tR(A) – tR(B))/(WA – WB) Ở đây : tR(A), tR(B) lần lƣợt là thời gian lƣu của chất A và B. WA, WB là bề rộng đáy pic sắc ký của hai chất A và B. Hai chất A và B đƣợc tách khỏi nhau càng triệt để khi độ phân giải càng cao. R càng lớn thì pic 2 chất A và B càng tách xa nhau. Song nếu R lớn quá cũng không cần thiết vì nhƣ thế sẽ làm tốn dung môi pha động để rửa giải các chất hơn. Trong thực tế nếu R quá lớn thì chúng ta phải ứng dụng quá trình rửa giải gradient thành phần pha động để cho chất sau đƣợc rửa giải nhanh hơn. 1.3.Một số phƣơng pháp định lƣợng acid fenofibric trong huyết tƣơng Bảng 1. 1 : Một số phƣơng pháp định lƣợng acid fenofibric trong huyết tƣơng Tltk Phƣơng pháp Điều kiện sắc ký phân tích [5] HPLC-UV Xử lý mẫu -Cột: Germini C18 (250 × 4,6mm; Tủa protein 5µm) -Pha động: MeOH – đệm phosphat pH3 (75: 25) -Thể tích tiêm mẫu: 50µl -Bƣớc sóng phân tích 288nm -Chất nội chuẩn: atorvastatin [10] HPLC-UV -Cột: Symmetry Shield TMRP 18 (150 × 4,60mm; 5µm) Chiết lỏng- lỏng bằng EtOAc -Pha động: MeCN– acid phosphoric 0,02M (50: 50) -Bƣớc sóng phân tích: 287nm -Chất chuẩn nội: CFHB 9 [12] HPLC-UV -Cột: C18 (4,6x 250mmx 5µm) -Pha động: MeCN: đệm acetat 20mM Chiết lỏng- lỏng bằng EtOAc = 40:60 -Bƣớc sóng phân tích: 295nm -Chất chuẩn nội: Nevidipin [16] HPLC-UV -Cột: Lithosphere 60 RP-Select B (250x 4mm; 5µm) Chiết lỏng- lỏng bằng EtOAc -Pha động: MeCN: đệm phosphate pH 6,0 = 30: 70 -Chất chuẩn nội: Diazepam [15] LC-MS/MS -Cột: C18 pha đảo (2,1 × 50mm, 5µm) Chiết lỏng- lỏng -Pha động: methanol: water: formic = với hỗn hợp Nhexane: 75: 25: 0,25 dichloromethan: - Chất chuẩn nội: acid diclofenac isopropanol -Thời gian phân tích 1 mẫu là 2,5 phút [8] UHPLC- -Cột: UPLCTM BEH C18 column (50 Chiết lỏng -lỏng MS/MS × 2,1 mm, 1,7 μm; Waters Corp., bằng hỗn hợp Milford, MA, USA) diethylether- -Pha động: acetonitril: water: formic = ethylacetat 70: 30: 0,2 -Chất chuẩn nội : acid mefenamic -Tổng thời gian phân tích mẫu là 2 phút [14] CE -Mao quản 25cm x 50µm ( ID) Tủa protein -Dòng điện 5,5kV bằng MeCN 10 -Áp suất tiêm mẫu 3447Pa -Bƣớc sóng phát hiện 280nm -Hệ đệm là acid boric, sodium carbonat, polyethylen glycol 6000. -Thời gian phân tích: 7 phút Hầu hết các nghiên cứu trên đều sử dụng HPLC và xử lý mẫu bằng phƣơng pháp chiết lỏng- lỏng. Do đó chúng tôi cũng lựa chọn định lƣợng fenofibrat và acid fenofibric trong huyết tƣơng bằng HPLC với detector UV, sử dụng hệ sắc ký pha đảo với cột C18 và xử lý mẫu bằng phƣơng pháp chiết lỏng- lỏng với ethylacetat. 11 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu là acid fenofibric và fenofibrat trong huyết tƣơng chó. 2.1.2. Nguyên vật liệu, dung môi và hóa chất Bảng 2. 1 : Danh mục chất chuẩn Tên chuẩn Nơi cung cấp Số lô Hàm lƣợng Fenofibrat Viện kiểm nghiệm TW 0113295.01 99,82% Acid fenofibric Cayman chemical 19262 98% Natri diclofenac Viện kiểm nghiệm TW 0216130.02 99,83% Bảng 2. 2 : Danh mục dung môi và hoá chất STT Tên Độ tinh khiết Hãng sản xuất 1 Methanol HPLC Fisher- Hàn Quốc 2 Acetonitril HPLC Merck- Đức 3 Ethyl acetat P.A Merck- Đức 4 Kali dihydrophosphat P.A Merck- Đức 5 Natri hydroclorit P.A Merck- Đức Huyết tƣơng thử là huyết tƣơng chó lấy tại các thời điểm nhất định sau khi cho uống 1 liều fenofibrat (do nhóm dƣợc lý cung cấp). Huyết tƣơng trắng là huyết tƣơng đƣợc tách từ máu chó nuôi bình thƣờng, sử dụng heparin chống đông trong quá trình bảo quản máu. 2.1.3. Thiết bị dụng cụ: Thiết bị:  Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao của shimadu, cột Shim-pack GIST C18 (150 x 4,6mm; 5µm)  Bộ lọc dung môi (màng lọc 0,45µm). 12
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan

Tài liệu vừa đăng