Tài liệu Nghiên cứu xác định đột biến gen cyp11b1 ở bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt 11beta hydroxylase

VIỆN HÀN LÂM VÀ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CYP11B1 Ở BỆNH NHÂN TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH DO THIẾU HỤT 11 BETA HYDROXYLASE LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2018 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CYP11B1 Ở BỆNH NHÂN TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH DO THIẾU HỤT 11 BETA HYDROXYLASE Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 9 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Huy Hoàng 2. PGS.TS. Nông Văn Hải Hà Nội - 2018 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành và chia sẻ tới các bệnh nhân và gia đình họ. Đó là những người đang ngày đêm phải chống chọi với bệnh tật. Họ là động lực giúp tôi luôn có khát khao được giúp đỡ, được sẻ chia và phấn đấu trong nghiên cứu khoa học. Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Huy Hoàng và PGS. TS. Nông Văn Hải, là những người thầy hướng dẫn khoa học, đã tận tình truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm vô cùng quý báu để tôi có thể hoàn thành được luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Công nghệ sinh học; ThS. Bùi Thị Hải Hà - phụ trách đào tạo Viện Công nghệ sinh học; Viện Nghiên cứu hệ gen, Phòng nghiên cứu hệ gen học chức năng- Viện Nghiên cứu hệ gen, đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành nghiên cứu thí nghiệm. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới GS. Rita Bernhardt, bộ môn Hóa sinh, trường ĐHTH Saarlandes, CHLB Đức đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tôi tiến hành thí nghiệm. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc, các phòng ban chức năng Bệnh viện Nhi trung ương, Khoa Nội tiết-Chuyển hoá-Di truyền và Khoa Di truyền và Sinh học phân tử, Bệnh viện Nhi trung ương, cùng toàn thể các đồng nghiệp trong khoa, là nơi tôi công tác, đã đồng hành và chia sẻ, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. BS. Vũ Chí Dũng, trưởng khoa Nội tiết-Chuyển hóa-Di truyền và TS. BS. Ngô Diễm Ngọc, trưởng khoa Di truyền và Sinh học phân tử đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện và chia sẻ những kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành luận án. i Tôi xin được bày tỏ sự kính trọng, tình yêu thương vô bờ bến đối với bố mẹ, gia đình, Minh Anh và bạn bè tôi, đã ủng hộ và cổ vũ cho tôi trong suốt thời gian học tập và làm việc. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn và tình yêu thương sâu sắc tới chồng tôi, BS. Đào Trung Dũng và hai con gái, Phương Linh-Minh Châu. Tình yêu, sự chia sẻ, ủng hộ và những hy sinh thầm lặng của họ là chỗ dựa vững chắc, giúp tôi thêm nghị lực để hoàn thành luận án này. Lời cuối cùng, tôi xin dành tặng tới Người. Người đã cho tôi thấy tôi là ai, con đường tôi đang đi và sẽ đi, để tôi thấy trong tôi luôn có một tình yêu thương vô điều kiện và nhiệt huyết trong cuộc sống và công việc. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Nguyễn Thị Phương Mai ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả Nguyễn Thị Phương Mai iii MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU……………………………………………………………... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………..... 4 1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase……….. 4 1.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới………………………. 4 1.1.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam……………………... 6 1.1.3. Dịch tễ học bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase…………… 7 1.2. Định nghĩa, cơ sở hóa sinh và sinh lý bệnh học của TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase…………………………………. 12 1.2.1. Định nghĩa TSTTBS và các enzyme tham gia tổng hợp cortisol…………………………………………………… 12 1.2.2. Cơ sở hóa sinh của bệnh TSTTBS………………………. 13 1.2.3. Sinh lý bệnh TSTTBS do thiếu 11β-hydroxylase………. 15 1.3. Di truyền phân tử của bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase……. 16 1.3.1. Gen CYP11B1………………………………………………… 16 1.3.2. 11β-hydroxylase………………………………………… 18 1.4. Đặc điểm lâm sàng bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase………... 22 1.4.1. Thể cổ điển……………………………………………… 22 1.4.2. Thể không cổ điển………………………………………. 26 1.4.3. Người mang gen/dị hợp tử………………………………. 27 1.4.4. Một số các đặc điểm lâm sàng khác…………………….. 27 1.5. Điều trị bệnh thiếu hụt 11 β hydroxylase……………………. 34 1.5.1. Liệu pháp thay thế glucocorticoid………………………. 34 1.5.2. Điều trị hạ huyết áp……………………………………… 35 1.5.3. Chẩn đoán và điều trị trước sinh………………………… 35 1.6. Các phương pháp phân tích đột biến gen CYP11B1………… 36 1.6.1. Phương pháp giải trình tự gen CYP11B1………………... 36 1.6.2. Phương pháp phân tích sự ảnh hưởng của đột biến mới iv tới cấu trúc và chức năng của enzyme CYP11B1……….. 37 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1. Đối tượng nghiên cứu………………………………………….. 39 2.1.1. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân……………………………… 39 2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ……………………………………….. 40 2.2. Đạo đức trong nghiên cứu……………………………………... 40 2.3. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu……………………………….. 41 2.3.1. Hóa chất nghiên cứu……………………………………... 41 2.3.2. Thiết bị nghiên cứu………………………………………. 41 2.4. Phương pháp nghiên cứu……………………………………… 43 2.4.1. Quy trình thu thập và tách chiết mẫu nghiên cứu……….. 45 2.4.2. Phương pháp giải trình tự gen CYP11B1…………………... 46 2.4.3. Phương pháp phân tích đột biến mới…………………….. 47 2.4.4. Các phương pháp tin sinh học……………………………. 52 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU………………………….. 54 3.1. Kết quả xác định đột biến gen CYP11B1……………………...... 54 3.1.1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu………………….. 54 3.1.2. Kết quả khuếch đại gen CYP11B1……………………….. 54 3.1.3. Kết quả xác định đột biến gen CYP11B1………………… 56 3.1.4. Mối tương quan kiểu gen- kiểu hình các đột biến mới…... 58 3.1.5. Mối tương quan kiểu gen p.R43Q- kiểu hình……………. 68 3.2. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các đột biến mới trên gen CYP11B1 tới hoạt tính enzyme CYP11B1…………………… 73 3.2.1. Đột biến p.R51K…………………………………………. 73 3.2.2. Đột biến p.E147D-p.N152K……………………………... 75 3.3. Phân tích sự ảnh hưởng của đột biến mới trên gen CYP11B1 tới cấu trúc enzyme CYP11B1……………………………….. 77 3.3.1. Kết quả mô hình cấu trúc 3 chiều của enzyme CYP11B1.. 77 3.3.2. Ảnh hưởng của đột biến mới tới cấu trúc của enzyme CYP11B1…………………………………………………. v 80 3.3.3. Đột biến vùng trượt gen IVS6+5G>T……………………. 83 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ……………………………… 84 4.1. Các đột biến phát hiện trên gen CYP11B1 ở các bệnh nhân nghiên cứu……………………………………………………… 84 4.2. Sự ảnh hưởng của các đột biến mới tới hoạt tính enzyme CYP11B1……………………………………………………….. 88 4.2.1. Đột biến p.R51K…………………………………………. 88 4.2.2. Đột biến p.E147D/p.N152K……………………………... 89 4.2.3. Đột biến Y395X………………………………………….. 91 4.3. Sự ảnh hưởng của các đột biến mới tới cấu trúc enzyme CYP11B1……………………………………………………….. 92 4.3.1. Đột biến thay thế axit amin………………………………. 93 4.3.2. Đột biến vùng trượt gen………………………………….. 98 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………. 104 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN………………………….. 106 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH……………………… 107 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………… 115 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Danh sách các bệnh nhân nghiên cứu…………………….. 1 Phụ lục 2. Mẫu bệnh án nghiên cứu………………………………….. 3 Phụ lục 3. Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch các mẫu DNA tách từ máu ngoại vi của các bệnh nhân………………………….. 6 Phụ lục 4. Kiểu gen và kiểu hình bệnh nhân nghiên cứu…………….. 7 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 11βOH 11β-hydroxylase, enzyme CYP11B1, 11-beta-hydroxylase 11βOHD 11β-hydroxylase deficiency Thiếu hụt 11β-hydroxylase 17-CS 17-cetosteroid 17-OH 17-hydroxyl 17-OHCS 17-hydroxycorticosteroid 17-OHP 17-hydroxyprogesterone 21OH 21-hydroxylase 21OHD 21-hydroxylase deficiency Thiếu hụt 21-hydroxylase 3D 3 Dimension Ba chiều ACTH Adrenocorticotrophin hormone Hormone kích thích vỏ thượng thận AD Andreostenedione Cl Cloride CMO corticosterone methyloxidase CMO I Corticosterone CMO II 18-hydroxycorticosterone CRH corticotropin releasing hormone Hormone giải phóng corticotropin CVS chorionic villus sampling CYP Cytochrome P450 DHEA Dehydroepiandrosterone DHEAS DHEA sulfate DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium vii Gai rau DMSO Dimethysulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxy-NTPs DOC 11-Deoxycorticosterone E.Coli Escherichia coli EDTA Ethylenedinitrilotetraacetic acid F Cortisol FBS Fetal Bonvine serum ffDNA Fetal free-DNA DNA thai nhi lưu hành tự do trong máu mẹ FSH Follicle stimulating hormone Hormone kích thích nang trứng GC-MS Gas chromatography-mass spectrometry HGMD Human gene mutations database Dữ liệu đột biến gene người Hc11B1 Human CYP11B1 Trình tự CYP11B1 ở người Hc11B2 Human CYP11B2 Trình tự CYP11B2 ở người HPTLC High performance thin layer Sắc ký lớp mỏng cao áp chromatography K Kali LDL Low-density lipoprotein LH Luteinizing hormone MaxENT Maximum entropy model MDD Maximum dependence Lipoprotein phân tử thấp decomposition model MM Salt wasting Mất muối Na Natri NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide viii phosphate NC Non-classic Thể không cổ điển NHĐT Simple virilization Nam hoá đơn thuần Pc11B1 Pig CYP11B1 Trình tự CYP11B1 ở lợn POR P450 oxidoreductase PWM Position weight matrix Rc11B1 Rat CYP11B1 Trình tự CYP11B1 ở chuột Rc11B2 Rat CYP11B2 Trình tự CYP11B2 ở chuột RNA Ribonucleic acid S 11-deoxycortisol SCRs Structurally conserved regions SDS Sodium dodecylsulfate SRS Subtrate recognition site Vùng nhận biết cơ chất StAR Steroidogenic acute regulatory Protein điều hòa sản xuất protein steroid cấp tính T Testosterone TART Testicular adrenal rest tumors Vùng bảo thủ U tinh hoàn xuất phát từ tế bào có nguồn gốc thượng thận Taq Thermus aquaticus TEMED N,N,N’,N’tetramethylethylenediaminel THS Tetrahydro-11-decortisol TSTTBS Congenital adrenal hyperplasia Tăng sản thượng thận bẩm (CAH) sinh WT Wild type ix DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Các thể bệnh TSTTBS và thiếu hụt tổng hợp cortisol do thiếu enzyme vỏ thượng thận………………………………………. Bảng 1.2. Phân loại các đột biến trên gen CYP11B1 dựa trên các nghiên cứu in-vitro…………………………………………………… Bảng 1.3. 8 19 Các triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm hoá sinh và đặc điểm di truyền của các bệnh liên quan tới thiếu hụt isozyme 11βhydroxylase…………………………………………………… 33 Bảng 2.1. Trình tự đoạn Oligonucleotides……………………………… 42 Bảng 2.2. Thành phần dung dịch đệm RF1, RF2………………………. 48 Bảng 2.3. Thành phần gel tách/gel cô polyacrilamide………………….. 50 Bảng 3.1. Kiểu đột biến gen CYP11B1 phát hiện trên các bệnh nhân nghiên cứu……………………………………………………. 56 Bảng 3.2. Kiểu gen- kiểu hình của các bệnh nhân có đột biến mới…….. 57 Bảng 3.3. Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-010………… 59 Bảng 3.4. Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-011………… 62 Bảng 3.5. Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-006 và MS. CYP11B1-008……………………………………………….. 64 Bảng 3.6. Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-004………… 67 Bảng 3.7. Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-012………… 69 Bảng 3.8. Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-005………… 71 Bảng 3.9. Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-002………… 73 Bảng 4.1. Một số đột biến thay thế amino acid trên gen CYP11B1 dẫn đến sự ảnh hưởng hoạt tính 11β-hydroxylase trong tế bào động vật…………………………………………................... 97 Bảng 4.2. Đột biến trượt gen đã được phát hiện trên gen CYP11B1….. 98 Bảng 4.3. Chỉ số đánh giá trượt gen của các đột biến vùng splicing đã được phát hiện trên gen CYP11B1………………………….. x 101 DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1. Con đường tổng hợp hormone steroid từ cholesterol của vỏ thượng thận…………………………………………….. 14 Hình 1.2. Các phản ứng xúc tác bởi enzyme CYP11B1……………… 15 Hình 1.3. Vị trí gen CYP11B1 và gen CYP11B2 trên NST số 8……… 17 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu…………………………………………... 44 Hình 2.2. Sơ đồ nhân đoạn gen CYP11B1……………………………. 46 Hình 2.3. Cấu trúc của vector pSVL…………………………………. 47 Hình 3.1. Phân loại kiểu hình các bệnh nhân nghiên cứu……………. 54 Hình 3.2. Sản phẩm PCR khuếch đại gen CYP11B1…......................... 55 Hình 3.3. Phân bố các đột biến trên gen CYP11B1 trong nghiên cứu... 56 Hình 3.4. Đột biến p.R51K ở bệnh nhân MS. CYP11B1-010……….. 58 Hình 3.5. Bệnh nhân MS.CYP11B1-010…………………………… 59 Hình 3.6. Đột biến p.E147D và p.N152K ở bệnh nhân MS. CYP11B1-011……………………………………………… 60 Hình 3.7. Bệnh nhân MS. CYP11B1-011…………………………….. 61 Hình 3.8. Đột biến IVS6+5G>T bệnh nhân MS. CYP11B1-006…….. 63 Hình 3.9. Bệnh nhân MS. CYP11B1-006……………………………. 64 Hình 3.10. Đột biến IVS6+5G>T ở bệnh nhân MS. CYP11B1-008…... 65 Hình 3.11. Đột biến p.Y395X bệnh nhân MS. CYP11B1-004………… 66 Hình 3.12. Bệnh nhân MS. CYP11B1-004…………………………….. 67 Hình 3.13. Kiểu hình các bệnh nhân có đột biến dị hợp tử p.R43Q…… 68 Hình 3.14 Bệnh nhân MS. CYP11B1-012…………………………….. 70 Hình 3.15. Bệnh nhân MS. CYP11B1-005…………………………….. 71 Hình 3.16. Bệnh nhân MS. CYP11B1-002…………………………….. 72 Hình 3.17. Đột biến p.R51K biểu hiện trong tế bào động vật COS-1…. 74 xi Hình 3.18. Phân tích hoạt tính của 11-hydroxylase có đột biến p.R51K ở tế bào động vật COS-1…………………………………… Hình 3.19. Đột biến p.E147D và p.N125K biểu hiện trong tế bào động vật COS-1………………………………………………….. Hình 3.20. 74 75 Phân tích hoạt tính của 11β-hydroxylase có đột biến p.E147D và p.N152K ở tế bào động vật COS-1…………… 76 Hình 3.21A. So sánh trình tự axit amin CYP11B1 và CYP11B2 của người, bò, chuột, lợn và bằng chương trình CLUSTALW1.. 77 Hình 3.21B. So sánh trình tự axit amin CYP11B1 và CYP11B2 của người, bò, chuột, lợn và bằng chương trình CLUSTALW1.. 78 Hình 3.21C. So sánh trình tự axit amin CYP11B1 và CYP11B2 của người, bò, chuột, lợn và bằng chương trình CLUSTALW1.. 79 Hình 3.21D. So sánh trình tự axit amin CYP11B1 và CYP11B2 của người, bò, chuột, lợn và bằng chương trình CLUSTALW1.. 80 Hình 3.22. Mô hình cấu trúc 3D của đột biến p.R51K………………… 81 Hình 3.23. Mô hình cấu trúc 3D của đột biến p.E147D……………….. 82 Hình 3.24. Mô hình cấu trúc 3D của đột biến p.N152K………………. 83 Hình 4.1. Vị trí đột biến p.R43Q trên mô hình protein CYP11B1…… 85 Hình 4.2. Vị trí các đột biến trên gen CYP11B1 đã được công bố trên thế giới……………………………………………………... Hình 4.3. Hình 4.4. 86 Mô hình cấu trúc không gian của enzyme CYP11B1 và vị trí các đột biến được phát hiện trong nghiên cứu…………... 94 Mô hình cấu trúc 3D CYP11B1 ở người…………………... 95 xii 1 MỞ ĐẦU Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) là một nhóm các bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường do sự khiếm khuyết một phần hoặc hoàn toàn của một trong số các enzyme tham gia tổng hợp cortisol từ cholesterol ở tuyến thượng thận. Đặc điểm lâm sàng và hoá sinh của bệnh phụ thuộc vào khiếm khuyết enzyme đặc hiệu (Speiser và cs, 2010). Những nghiên cứu đầu tiên về bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh được nhà giải phẫu học người Italy, Luigi Crecchio, đưa ra vào cuối thế kỉ XIX khi ông phát hiện ra những biểu hiện nam hóa ở những bệnh nhân nữ mà ông tiến hành phẫu thuật (Delle Piane và cs, 2015). Những bệnh nhân đó không có đường cong ở nữ giới, có râu, cơ bắp phát triển, âm vật bị biến đổi tuy nhiên họ vẫn có âm đạo, tử cung, ống dẫn trứng và buồng trứng bình thường. Vào giữa thế kỉ XX, nhiều nghiên cứu về hormone tuyến thượng thận trong cơ thể người đã được tiến hành và thuật ngữ “tăng sản thượng thận bẩm sinh” (Congenital Adrenal Hyperplasia CAH) đã ra đời để giảm đi sự mơ hồ về bệnh này và nhấn mạnh những biến đổi sinh lý do bệnh gây ra. Khoảng 90-95% các trường hợp mắc TSTTBS là do thiếu hụt 21hydroxylase; 5-8% trường hợp TSTTBS bắt nguồn từ sự suy giảm 11βhydroxylase (Zachmann và cs, 1983). Còn lại là các trường hợp TSTTBS do sự suy giảm các enzyme hiếm gặp khác như 17- hydroxylase (17-OH), 3βhydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD) và 20/22 Desmolase. Bệnh TSTTBS với các dấu hiệu suy thượng thận cấp có thể dẫn đến tử vong ở thể mất muối hay trẻ có các biểu hiện nam tính hoá ở trẻ gái, giả dậy thì sớm ở trẻ trai gây ảnh hưởng nặng nề đến sự phát triển chiều cao, chức năng sinh dục, sinh sản và tâm lý (Arlt và Krone, 2007, Merke và Bornstein, 2005, Ogilvie và cs, 2006, White và Speiser, 2000). 2 TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase là bệnh hiếm gặp di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường. Bệnh do sự thiếu hụt hoặc mất hoàn toàn hoạt tính của enzyme 11β-hydroxylase (CYP11B1) dẫn đến sự thiếu hụt các hormone tuyến thượng thận. Đặc điểm lâm sàng phổ biến nhất của hội chứng thiếu hụt 11β-hydroxylase là bất thường bộ phận sinh dục ngoài, tăng nhanh sự phát triển xương dẫn đến tình trạng lùn của trẻ, dậy thì sớm ngoại biên, hạ kali máu và tăng huyết áp. Các xét nghiệm hoá sinh thường dựa trên mức độ tăng lên của 11-deoxycortisol và 11-deoxycorticosterol huyết thanh kết hợp với sự gia tăng nồng độ của adrogen thượng thận. TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase có các dấu hiệu đặc trưng nhưng cũng còn nhiều thách thức trong vấn đề chẩn đoán và điều trị. Sự đa dạng về kiểu hình, tỷ lệ phát hiện thấp là những lý do làm chậm chẩn đoán 11βhydroxylase. Hiện nay, trên thế giới và ở Việt Nam còn ít nghiên cứu về sự ảnh hưởng của các loại đột biến tới chức năng hoạt động của 11βhydroxylase. Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài “Nghiên cứu xác định đột biến gen CYP11B1 ở bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt 11 beta hydroxylase” được thực hiện nhằm góp phần phát hiện và làm sáng tỏ nguyên nhân gây bệnh rối loạn chuyển hoá 11β-hydroxylase ở người Việt Nam. Nghiên cứu này sẽ giúp cho các nhà nghiên cứu di truyền học giải thích được cơ chế gây bệnh và các bác sĩ lâm sàng điều trị bệnh hiệu quả, đúng hướng để nâng cao chất lượng cuộc sống. Hơn nữa, kết quả nghiên cứu cũng được ứng dụng phòng bệnh thông qua thực hành tư vấn di truyền, là cơ sở cho chẩn đoán và điều trị trước sinh khi có chỉ định. Mục tiêu của đề tài: 1. Sàng lọc các đột biến trên gen CYP11B1 trên các bệnh nhân TSTTBS do thiếu 11β-hydroxylase. 3 2. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các đột biến mới tới hoạt lực 11βhydroxylase trong tế bào động vật nuôi cấy. 3. Phân tích sự ảnh hưởng của các đột biến mới trong mô hình cấu trúc 3 chiều của 11β-hydroxylase. Nội dung nghiên cứu: 1. Giải trình tự gen CYP11B1 trên các bệnh nhân nghi ngờ mắc TSTTBS thể thiếu 11β-hydroxylase. 2. Chứng minh sự biểu hiện 11β-hydroxylase trong tế bào động vật bằng phương pháp Western blot. 3. Tách chiết hormone steroid, đánh giá hoạt tính 11β-hydroxylase. 4. Sử dụng phần mềm spdbv, ViewerLite, MAXent phân tích vị trí các đột biến mới. Những đóng góp mới của luận án: 1. Phát hiện 06 đột biến trên gen CYP11B1 ở các bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng là TSTTBS thể thiếu 11β-hydroxylase trong đó có 05 đột biến mới p.R51K, p.E147D, p.N152K, IVS6+5G>T, p.Y395X 2. Các đột biến mới p.R51K, p.E147D, p,N152K làm giảm hoạt tính của 11βhydroxylase tương ứng là 29%, 48% và 36%. 3. Dự báo đột biến IVS6+5G>T có khả năng ảnh hưởng tới cấu trúc mRNA bằng phần mềm MaxEnt. 4. 03 đột biến mới p.R51K, p.E147D, p.N152K đều có ảnh hưởng đến liên kết hydro với axit amin bên cạnh trong mô hình cấu trúc ba chiều của 11βhydroxylase. 4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH THIẾU HỤT 11 BETA HYDROXYLASE 1.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Năm 1951, các nhà khoa học đã nhận thấy có một số lượng bệnh nhân TSTTBS có dấu hiệu như tăng huyết áp, có các triệu chứng của thiếu hụt aldosterone, tăng natri, hạ kali máu. Các bệnh nhân này sau đó được phát hiện có sự thiếu hụt 11- hydroxylase. Đây là các dấu hiệu phân biệt giữa bệnh nhân TSTTBS do thiếu hụt 11- hydroxylase với các bệnh nhân TSTTBS do thiếu hụt 21 hydroxylase (Eberlein và Bongiovanni, 1955, Shepard và Clausen, 1951, Wilkins và cs, 1952, Wilkins và cs, 1951). Năm 1956, Eberlein và Bongiovanni đã miêu tả hiện tượng TSTTBS có kèm theo triệu chứng cao huyết áp (Eberlein và Bongiovanni, 1955). Glenthoj và cộng sự đã chẩn đoán 3 bệnh nhân TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase mà trước đó, 3 bệnh nhân này đã được chẩn đoán TSTTBS do thiếu hụt 21hydroxylase (Glenthoj và cs, 1979). Năm 1982, Rosler và cộng sự đã báo cáo 26 bệnh nhân TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase ở 18 gia đình Do Thái từ Morocco, Tunis, Thổ Nhĩ Kỳ và Iran. Trong đó có 7 gia đình kết hôn cận huyết. Các bệnh nhân có triệu chứng tăng huyết áp nặng. Các bệnh nhân nữ có triệu chứng lâm sàng đa dạng, từ âm vật phì đại đến thể nam hoá nặng. 10/14 bệnh nhân nữ được nuôi dưỡng giống như các trẻ trai và việc chẩn đoán muộn ở giai đoạn dậy thì (Rosler và cs, 1982). Triệu chứng tăng huyết áp dẫn đến tình trạng tử vong do bệnh tim mạch chỉ xuất hiện ở các bệnh nhân nam hoá ở mức độ trung bình, thể nam hóa nặng có ngoại hình giống hoàn toàn người nam ở các bệnh nhân nữ thì đôi khi lại có huyết áp bình thường. Sáu bệnh nhân có hạ kali máu. Năm 1985, Hochberg và cộng sự đã mô tả 15 trẻ 5 gái và 9 trẻ trai có thiếu hụt 11β-hydroxylase. Các bệnh nhân này đều là người Do thái di cư từ Morocco và Iran. Chiều cao cuối cùng của các bệnh nhân đã bị ảnh hưởng nghiêm trọng. Trẻ trai có hiện tượng dậy thì sớm, phát triển tuyến vú. Tất cả các bệnh nhân đều được nuôi dưỡng như các bé trai, mặc dù có 2 bệnh nhân có kết quả nhiễm sắc thể 46,XX (Hochberg và cs, 1985). Năm 1992, Rosler và cộng sự mô tả đặc điểm của 38 bệnh nhân thiếu hụt 11β-hydroxylase từ 25 gia đình trong vòng 39 năm. 19 gia đình đến từ Morocco, và 2 gia đình khác có bố hoặc mẹ đến từ Morocco (Rosler và cs, 1992). Cũng năm 1992, Helmberg đã báo cáo 1 ca bệnh là trẻ trai 8 tuổi người Thổ Nhĩ Kỳ, bố mẹ kết hôn cận huyết. Bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase. Bệnh nhân có tăng huyết áp, giả dậy thì sớm, chiều cao và cân nặng hơn 97 bách phân vị, nam hoá hoàn toàn (Prader type IV, lỗ đái thấp, phì đại âm vật). Bốn anh chị của bệnh nhân đã tử vong ngay sau đẻ (Helmberg và cs, 1992). Năm 1995, Al-Jurayyan báo cáo 78 trẻ Ả rập mắc TSTTBS trong vòng 10 năm. Trong số đó, có 20 (25,6%) bệnh nhân từ 11 gia đình có tiền sử mắc TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase. Hiện tượng dậy thì sớm giả ở trẻ nam và các mức độ nam hoá ở trẻ gái đã dẫn đến 7 bệnh nhân bị chẩn đoán nhầm về giới tính (58,3%). 3 trẻ sơ sinh ở thể mất muối trước khi được điều trị (Al-Jurayyan, 1995). Năm 2000, Clark đã mô tả 2 bệnh nhân mắc TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase thể không cổ điển (P. A. Clark, 2000) với tỷ lệ nam hoá bào thai và cao huyết áp thấp hơn so với thể cổ điển. Bệnh nhân đầu tiên là trẻ trai 6 tuổi có triệu chứng dậy thì sớm ngoại biên. Bệnh nhân có chiều cao trung bình so với tuổi và có huyết áp ở giới hạn trên của bình thường. Bệnh nhân thứ 2 là trẻ gái 1 tháng tuổi với triệu chứng âm vật phì đại nhưng không có bìu chẻ đôi. Bệnh nhân có huyết áp bình thường so với tuổi và có nồng độ 11-deoxycortisol tăng. 6 1.1.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam Từ những năm 2000, một số tác giả đã ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để sàng lọc các đột biến trên gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS như tác giả Võ Kim Huệ, Thái Thiên Nam đã ứng dụng kỹ thuật PCR để sàng lọc đột biến mất 8bp ở các bệnh nhân mắc TSTTBS ở Việt Nam cũng như các thành viên trong gia đình của bệnh nhân này (Thái Thiên Nam, 2002, Võ Kim Huệ, 2000). Năm 2006, tác giả Trần Kiêm Hảo cũng ứng dụng kỹ thuật PCR để sàng lọc một số đột biến phổ biến trên các bệnh nhân TSTTBS tại Bệnh viện Nhi trung ương (Trần Kiêm Hảo, 2006). Năm 2017, tác giả Vũ Chí Dũng công bố chẩn đoán phân loại thể thiếu các enzyme đặc hiệu khác nhau trên 715 bệnh nhân TSTTBS bao gồm 375 (52%) trẻ trai và 340 (48%) trẻ gái tại bệnh viện Nhi trung ương (Bùi Phương Thảo Vũ Chí Dũng, Nguyễn Ngọc Khánh, Cấn Thị Bích Ngọc, 2015). Trong đó, thể thiếu 21-hydroxylase là 703 (98,3%) bệnh nhân; thiếu 11β-hydroxylase là 9 (1,3%) bệnh nhân; và thiếu 3β-hydsroxysteroid dehydrogenase type 2 là 3 (0,4%) bệnh nhân. Nghiên cứu cho thấy, số bệnh nhân mắc TSTTBS ở Việt Nam là rất lớn. Đa số các bệnh nhân mắc bệnh TSTTBS thể thiếu 21-hydroxylase. Tuy nhiên, còn rất ít các nghiên cứu TSTTBS thể hiếm gặp. Gần đây, đã có một số nghiên cứu TSTTBS thể hiếm gặp bằng các phương pháp sinh học phân tử và phân tích sự ảnh hưởng của các đột biến mới. Năm 2012, tác giả Lê Bắc Việt mô tả một bệnh nhân mắc bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase. Bệnh nhân có đột biến dị hợp tử kép R43Q và A386V (Lê Bắc Việt, 2012). Đột biến A386V là đột biến làm thay đổi axit amin Alanine thành Valine. Đột biến này xảy ra tại vị trí axit amin thứ 386 và không nằm trên vùng quan trọng. Hai axit amin này đều là axit amin trung tính, không làm thay đổi liên kết hydro trong phân tử protein. Vì thế, tác giả dự đoán rằng, đột biến này không làm ảnh hưởng đến hoạt tính protein. Những nghiên cứu sau đó của tác giả về sự biểu hiện của đột biến cho