Tài liệu Nghiên cứu xác định đồng thời aspartame và saccharin trong một số loại đồ uống bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHẠM THANH TÙNG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ASPARTAME VÀ SACCHARIN TRONG MỘT SỐ LOẠI ĐỒ UỐNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC THÁI NGUYÊN - 2020 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHẠM THANH TÙNG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ASPARTAME VÀ SACCHARIN TRONG MỘT SỐ LOẠI ĐỒ UỐNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Ngành: Hoá Phân tích Mã số: 8.44.01.18 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Dương Thị Tú Anh THÁI NGUYÊN - 2020 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề được sử dụng trong bất cứ một công trình nào. Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Thái Nguyên, tháng 6 năm 2020 Tác giả luận văn Phạm Thanh Tùng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Cô giáo PGS.TS Dương Thị Tú Anh, người đã tận tình giúp đỡ, chỉ dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban chủ nhiệm Khoa, các Thày Cô giáo Khoa Hóa học - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã trang bị, chỉ bảo cho em những kiến thức quý báu trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Trung tâm, các cán bộ phòng thí nghiệm - Trung tâm kiểm tra an toàn thực phẩm tỉnh Quảng Ninh, đã tạo điều kiện cho em trong quá trình nghiên cứu thực nghiệm và hoàn thiện luận văn. Do thời gian có hạn và trình độ còn hạn chế, luận văn này không tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong được sự đóng góp ý kiến của thầy cô để luận văn này được hoàn thiện hơn. Thái Nguyên, tháng 6 năm 2020 Tác giả Phạm Thanh Tùng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC Lời cam đoan .................................................................................................................. i Lời cảm ơn .....................................................................................................................ii Mục lục ........................................................................................................................ iii Danh mục các từ viết tắt của luận văn ........................................................................... v Danh mục các bảng ....................................................................................................... vi Danh mục các hình ......................................................................................................vii MỞ ĐẦU ...................................................................................................................................... 1 Chương 1: TỔNG QUAN ......................................................................................................... 3 1.1. Tổng quan về hợp chất nghiên cứu ...................................................................................... 3 1.1.1. Tổng quan về Aspartame ................................................................................................... 3 1.1.2. Tổng quan về Saccharine ................................................................................................... 5 1.2. Một số phương pháp xác định saccharin, và aspartame ..................................................... 7 1.2.1. Phương pháp chuẩn độ ....................................................................................................... 8 1.2.2. Phương pháp quang phổ..................................................................................................... 8 1.2.3. Phương pháp điện di mao quản (CE) ................................................................................ 8 1.2.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ........................................................................... 9 1.3. Tổng quan các công trình nghiên cứu xác định saccharin và aspartam ........................... 10 1.3.1. Ở Việt Nam ....................................................................................................................... 10 1.3.2. Trên thế giới ...................................................................................................................... 11 Chương 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 16 2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất .............................................................................................. 16 2.1.1. Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................................... 16 2.1.2. Hóa chất, thuốc thử .......................................................................................................... 17 2.2. Thực nghiệm ........................................................................................................................ 18 2.2.1. Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu phân tích .............................................................. 18 2.2.2. Khảo sát các điều kiện tối ưu xác định hàm lượng Aspartame và Saccharin bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao................................................................................... 18 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 2.2.3. Xác định độ lặp, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp................................................................................................................................ 20 2.3. Quá trình phân tích .............................................................................................................. 22 2.4. Phương pháp xử lý số liệu................................................................................................... 24 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................................... 25 3.1. Kết quả nghiên cứu, khảo sát các điều kiện tối ưu xác định Aspartame và Saccharin bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao.......................................................................... 25 3.1.1. Lựa chọn detector ............................................................................................................. 25 3.1.2. Khảo sát lựa chọn bước sóng ........................................................................................... 25 3.1.3. Lựa chọn cột tách............................................................................................................. 26 3.1.4. Lựa chọn pha động ........................................................................................................... 26 3.1.5. Khảo sát pH của pha động ............................................................................................... 27 3.2. Kết quả xác định độ lặp, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp................................................................................................................................ 30 3.2.1. Kết quả nghiên cứu tính phù hợp của hệ thống .............................................................. 30 3.2.2. Độ đặc hiệu, tính chọn lọc của phương pháp.................................................................. 31 3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị đo ............................................. 32 3.2.4. Khoảng tuyến tính ............................................................................................................ 35 3.3. Áp dụng phân tích mẫu thực ............................................................................................... 38 3.3.1. Thời gian, địa điểm lấy mẫu ............................................................................................ 38 3.3.2. Kết quả phân tích mẫu ...................................................................................................... 39 3.3.3. Độ thu hồi chất phân tích của phương pháp ................................................................... 46 KẾT LUẬN................................................................................................................................ 52 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN .................... 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................... 53 PHỤ LỤC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CỦA LUẬN VĂN ACN ADI AOAC Asp ATVSTP Acetonitril Acceptable daily intake (lượng ăn vào hằng ngày có thể chấp nhận được) Assosiation of Official Analytical Chemists (Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thức) Aspartam An toàn vệ sinh thực phẩm BYT Bộ y tế DAD Diode Array Detector (Detector mảng diod) ĐKTN HPLC Điều kiện thí nghiệm High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện) LOQ Limit of Quantification (Giới hạn định lượng) MeOH ppm Methanol Nồng độ ppm (mg/kg; mg/L; mL/L) R (%) Độ thu hồi (đơn vị %) RSD Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) S/N Signal to noise ratio (Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu) Sac Saccharin TCVN UV-VIS Tiêu chuẩn Việt Nam. Ultraviolet - Visible (Tử ngoại khả kiến) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Tính chất của một số loại dung môi dùng làm pha động ...................... 19 Bảng 3.2. Giá trị diện tích pic của saccharin và aspartame phụ thuộc vào pH của dung dịch đệm ........................................................................................ 29 Bảng 3.3. Các điều kiện thí nghiệm thích hợp cho phép phân tích xác định saccharin và aspartame bằng phương pháp HPLC ................................ 30 Bảng 3.4. Kết quả tính toán sự phù hợp của hệ thống ........................................... 30 Bảng 3.5. Hệ số tách và độ phân giải của pic các chất phân tích ........................... 32 Bảng 3.6. Giá trị xác định LOD của thiết bị đo với Saccharin .............................. 33 Bảng 3.7. Giá trị xác định LOD của thiết bị đo với Aspartame ............................. 34 Bảng 3.8. Giá trị xác định LOQ của thiết bị đo với Saccharin .............................. 34 Bảng 3.9. Giá trị xác định LOQ của thiết bị đo với Aspartame ............................. 35 Bảng 3.10. Giới hạn phát hiện của thiết bị đối với saccharin và aspartame ............ 35 Bảng 3.11. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ chất phân tích ................... 36 Bảng 3.12. Phương trình hồi quy và hệ số tương quan của đường chuẩn ............... 37 Bảng 3.13. Địa điểm, thời gian lấy mẫu ................................................................... 38 Bảng 3.14. Kết quả phân tích hàm lượng saccharin trong mẫu thực (n=5) ............. 39 Bảng 3.15. Kết quả phân tích lặp lại hàm lượng aspartame trong mẫu thực (n=5) ................................................................................................................ 43 Bảng 3.16. Kết quả xác định độ thu hồi Saccharin của phương pháp trên các mẫu phân tích ................................................................................................. 47 Bảng 3.17. Kết quả xác định độ thu hồi Aspartame của phương pháp trên các mẫu phân tích ................................................................................................. 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Thời gian lưu của chất phân tích ..............................................................9 Hình 2.1. Hệ thống HPLC của hãng SHIMADZU ................................................16 Hình 2.2. Sơ đồ phân tích saccharin và aspartame bằng phương pháp HPLC ......24 Hình 3.1. Sắc ký đồ xác định bước sóng hấp thụ quang cực đại của saccharin và aspartame ...........................................................................................25 Hình 3.2. Sắc đồ phân tích hỗn hợp chất bằng cột C18 (250mm×4,6mm× 5μm) ........26 Hình 3.3. Sắc đồ phân tích hỗn hợp saccharin và aspartame ................................ 27 Hình 3.4. Sắc ký đồ của hỗn hợp saccharin và aspartame tại pH = 3,0 .................27 Hình 3.5. Sắc ký đồ của hỗn hợp saccharin và aspartame tại pH = 3,5 .................28 Hình 3.6. Sắc ký đồ của hỗn hợp saccharin và aspartame tại pH = 4,0 .................28 Hình 3.7. Sắc ký đồ của hỗn hợp saccharin và aspartame tại pH = 4,5 .................29 Hình 3.8. Sắc đồ của mẫu trắng (A) và mẫu trắng có thêm chuẩn (B) ..................31 Hình 3.9. Sắc đồ LOD của thiết bị đối với saccharin ............................................33 Hình 3.10. Sắc đồ LOD của thiết bị đối với aspartam .............................................33 Hình 3.11. Đường chuẩn của saccharin trong khoảng nồng độ 0,2 ÷ 200 ppm ......37 Hình 3.12. Đường chuẩn của aspartam trong khoảng nồng độ 0,5 ÷ 100 ppm .......37 Hình 3.13. Hàm lượng SCR và ASP trong các mẫu phân tích ................................ 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm luôn thu hút được sự quan tâm của toàn xã hội, của mọi quốc gia trên thế giới. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều kỹ thuật mới, hiện đại đã và đang được áp dụng để tạo ra những sản phẩm mới với chất lượng đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng. Tuy nhiên để tạo ra nhiều sản phẩm phù hợp với sở thích và khẩu vị của người tiêu dùng mà vẫn giữ được chất lượng toàn vẹn của thực phẩm cho đến khi sử dụng, trong quá trình chế biến, nhà sản xuất đã sử dụng các phụ gia thực phẩm để tăng giá trị thương phẩm và kéo dài thời gian sử dụng. Gần đây, liên tiếp xảy ra các vụ ngộ độc tại nhiều địa phương trên toàn quốc, cũng như việc xuất hiện nhiều mặt hàng không rõ nguồn gốc xuất xứ hoặc sử dụng những phụ gia ngoài danh mục cho phép hay sử dụng quá hàm lượng cho phép. Tác hại do sử dụng phụ gia sai quy định có thể ảnh hưởng đối với sức khỏe con người. Những tác động này thường không xảy ra cấp tính, rầm rộ và nguy kịch mà diễn biến lâu dài do tích lũy trong cơ thể. Theo báo cáo của Bộ Y tế, trong tháng 5-2019, toàn quốc đã xảy ra 8 vụ ngộ độc thực phẩm làm 218 người nhập viện, trong đó có 2 trường hợp tử vong. Đường là loại gia vị vô cùng quen thuộc với mọi người, gần như mọi món ăn hàng ngày đều không thể thiếu gia vị đường. Vì đường mang lại hương vị ngọt ngào, hấp dẫn cho khứu giác. Nhưng bên cạnh đó, đường cũng làm tăng nguy cơ cho những bệnh béo phì hay tiểu đường, vì thế do yêu cầu thực phẩm đặc biệt dành cho những người mắc bệnh này thì từ lâu người ta đã thấy cần phải sản xuất thực phẩm với hàm lượng đường thấp hơn. Tuy nhiên chỉ đơn thuần là giảm hàm lượng đường trong công thức chế biến thì không thể cho hiệu quả mong muốn, vì thế người ta cần phải sử dụng các chất tạo ngọt khác, đảm bảo vị ngọt cần thiết mà không làm tăng lượng calo của thực phẩm. Từ đó một số chất tạo ngọt nhân tạo thay thế đã được tổng hợp và sử dụng ngày càng phổ biến. Không chỉ thực phẩm dành cho người ăn kiêng mới sử dụng đường hóa học, hiện nay nhiều loại thực phẩm và đồ uống bán trên thị trường được sử dụng đường hóa học để tạo độ ngọt cao, chi phí sản xuất thấp và lợi nhuận cao. Nhưng chỉ có một số chất tạo ngọt được phép sử dụng trong chế biến thực phẩm với giới hạn tối Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn đa và có quy định rõ ràng gồm: manitol, acesulfam kali, aspartame, cyclamate, isomalt, saccharin, sorbitol, sucralose… Tuy nhiên khi ăn uống, chỉ bằng cảm quan chúng ta khó mà biết được loại thực phẩm nào có sử dụng chất tạo ngọt nhân tạo, đặc biệt là các chất đó được phép sử dụng hay không. Trước tình hình này, để đảm bảo sức khỏe cho con người thì việc định lượng các chất tạo ngọt nhân tạo trong trong thực phẩm nói chung và đồ uống nói riêng là một vấn đề cần thiết. Cùng với sự phát triển của khoa học, ngày càng có nhiều phương pháp hiện đại xác định đồng thời các chất tạo ngọt nhân tạo nói chung, cũng như Aspartame và Saccharin nói riêng. Trong đó phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được ứng dụng trong nhiều ngành kiểm nghiệm, đặc biệt là trong ngành kiểm nghiệm thực phẩm và dược phẩm. Nó hiện đang là công cụ đắc lực cho phân tích đa thành phần, định tính và định lượng các chất. Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi lựa chọn và thực hiện đề tài luận văn: “Nghiên cứu xác định đồng thời Aspartame và Saccharin trong một số loại đồ uống bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao”. Mục đích của luận văn Nghiên cứu xác định đồng thời Aspartame và Saccharin trong một số loại đồ uống bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Từ đó có những so sánh với hàm lượng Aspartame và Saccharin trong bảng liều lượng sử dụng trong thực phẩm theo Tiêu chuẩn Việt Nam của Cục an toàn thực phẩm Việt Nam(VFA), cũng như hàm lượng của chúng trong các mẫu phân tích khác nhau. Nội dung nghiên cứu * Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho phép phân tích xác định đồng thời Aspartame và Saccharin bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) như: dung môi pha động, bước sóng, thời gian lưu, tốc độ dòng, nhiệt độ … * Đánh giá độ đúng, độ chụm, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp thông qua việc phân tích mẫu chuẩn. * Áp dụng phân tích mẫu nghiên cứu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về hợp chất nghiên cứu Chất ngọt tổng hợp là những chất không có trong tự nhiên, vị ngọt rất cao so với đường sucrose và không có giá trị dinh dưỡng, thường được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau. Chất ngọt tổng hợp bao gồm nhiều loại khác nhau, chủ yếu người ta chia thành 2 loại: chất tạo ngọt không sinh năng lượng và chất tạo ngọt có sinh năng lượng. 1.1.1. Tổng quan về Aspartame Aspartame là một este methyl của axit aspartic/phenylalanine dipeptide, có pKa = 4,5 -6,0. Giống như nhiều peptide khác, aspartame có thể bị thủy phân thành các axit amin cấu thành trong điều kiện nhiệt độ cao hoặc độ pH cao. Điều này làm cho aspartame không được ưa chuộng như các chất tạo ngọt khác. Sự ổn định của Aspartame trong dung dịch nước phụ thuộc rất nhiều vào độ pH. Ở nhiệt độ phòng, nó ổn định nhất ở pH 4,3, thời gian bán hủy của nó gần 300 ngày. Tuy nhiên, ở pH 7,0 thời gian bán hủy của nó chỉ là một vài ngày. Hầu hết các loại nước giải khát có pH từ 3 đến 5, trong đó aspartame ổn định một cách hợp lý. Trong các sản phẩm có thể cần thời hạn sử dụng lâu hơn, chẳng hạn như xi-rô cho nước giải khát, aspartame đôi khi được pha trộn với chất làm ngọt ổn định hơn, chẳng hạn như saccharin [29]. 1.1.1.1. Danh pháp, công thức cấu tạo và tính chất vật lý của Aspartame ●Danh pháp IUPAC: Methyl L-α-aspartyl-L-phenylalaninate Tên gọi khác: N-(L-α-Aspartyl)-L-phenylalanine,1-methyl ester [7], [10]. ● Công thức phân tử: C14H18N2O5. ● Công thức cấu tạo: ● Tính chất vật lý [29]: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn - Aspartame có dạng tinh thể màu trắng, không mùi, có vị ngọt mạnh. - Tan ít trong nước, tan nhẹ trong ethanol. - Nhiệt độ sôi: 2470C. - Khối lượng mol phân tử: 294,3g/mol. 1.1.1.2. Công dụng và độc tính của Aspartame Hiện nay, aspartam là chất ngọt rất được ưa chuộng. Aspartame ngọt gấp 200 lần so với đường tự nhiên và có mặt trên thị trường với các tên NutraSweet, Equal Spoonful, Benevia, NatraTaste, ước tính chiếm tới 62% thị trường chất siêu ngọt. Nó đang được hơn 350 triệu người trên thế giới sử dụng thường xuyên. Ở Anh, chất này phổ biến trong nước ngọt Cola và những nước uống ít calo, nước quả, kẹo, kẹo cao su, ngũ cốc, sữa chua, đồ ăn nhanh, thuốc và vitamin bổ sung (gồm cả những loại dành cho trẻ nhỏ) [29]. Một gam aspartame tạo ra bốn kcal năng lượng khi chuyển hóa nên lượng calo là không đáng kể. Đa số người tiêu dùng có nhận xét là aspartam không để lại dư vị khó chịu, tuy nhiên một số người nhạy cảm cho rằng đường này để lại trên lưỡi một hậu vị không ngon. Điều này có thể khắc phục bằng cách trộn aspartam với các loại đường khác (như acesulfame - K hay saccharin) [10], [29]. Aspartame được thủy phân nhanh chóng trong ruột non. Ngay cả khi ăn với liều rất cao aspartam (trên 200 ppm), không có aspartame được tìm thấy trong máu do sự suy giảm nhanh chóng. Khi ăn phải, aspartame phân hủy thành các thành phần còn sót lại, bao gồm axit aspartic, phenylalanine, methanol, với tỷ lệ 4: 5: 1 theo khối lượng và các sản phẩm phân hủy khác bao gồm formaldehyde và axit formic. Các nghiên cứu trên người cho thấy axit formic được bài tiết nhanh hơn so với dạng được hình thành sau khi ăn phải aspartame. Trong một số nước trái cây, có thể tìm thấy nồng độ methanol cao hơn so với lượng chất aspartame trong đồ uống [7], [10], [29]. Methanol là một chất có độc tính thấp nhưng sau khi được đưa vào cơ thể, methanol được ôxy hóa tạo nên formaldehyde, chất này lại tiếp tục được ôxy hóa tạo nên axit formic (hoặc formate, tùy theo độ pH). Cuối cùng, axit formic được chuyển hóa thành khí cacbonic CO2 và nước, hai chất này được thải qua phổi và thận. Quá trình ôxy hóa xảy ra nhanh chóng khiến axit formic tích tụ trong huyết thanh. Sự tích Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn tụ của axit formic trong huyết thanh gây nên tình trạng toan chuyển hóa. Sự chuyển hóa methanol và tích tụ axit formic bên trong võng mạc mắt gây tổn thương võng mạc, tổn thương thần kinh thị giác dẫn đến mù lòa. Phenylalanine là một chất độc thần kinh. Cơ thể tiếp nhận quá nhiều phenylalanine có thể gây động kinh, chậm phát triển trí óc, mất ngủ… Bệnh phenylceton niệu (phenylketonuria - PKU) là nguyên nhân rối loạn di truyền gây mất chức năng chuyển hóa phenylalanin. Người bị bênh này phải kiểm soát lượng phenylalanin trong thức ăn được đưa vào để ngăn ngừa sự tích tụ của phenylceton trong cơ thể. Một dạng hiếm của bệnh này là bệnh tăng phenylalanin máu do bị mất chức năng tổng hợp một coenzym là biopterin. Phụ nữ mang thai bị bệnh tăng phenylalanin máu sẽ có triệu chứng tăng phenylalanin trong máu nhưng triệu chứng này thường mất đi ở cuối kì mang thai. Phenylalanin có trong chất làm ngọt aspartame. Chất này được chuyển hóa trong cơ thể tạo ra nhiều chất, trong đó có phenylalanin. Do đó chất này cũng có ảnh hưởng đến người bị PKU, mặc dù sự ảnh hưởng của nó ít hơn so với lượng proten ăn vào. Tất cả các sản phẩm có chứa aspartame ở Úc, Mĩ và Canada đều được dán nhãn "Chứa aspartame, cẩn thận đối với người bị PKU" [29]. Aspartic là chiếm khoảng 40% trong aspartam, một chất gây ra chứng đau đầu. Axit Aspartic là một chất kích thích thần kinh, ảnh hưởng đến hệ thống thần kinh trung ương, gây nên các chứng: nhức đầu, buồn nôn, đau bụng, mệt mỏi, rối loạn giấc ngủ, vấn đề về thị lực, trầm cảm, và bệnh suyễn, động kinh [10]. Không giống như một số chất làm ngọt khác, aspartame được chuyển hóa trong cơ thể và do đó có một số giá trị dinh dưỡng, 1 g cung cấp khoảng 17 kJ (4 kcal). Tuy nhiên, trong thực tế khi dùng một lượng nhỏ aspartame mang lại hiệu quả dinh dưỡng tối thiểu. 1.1.2. Tổng quan về Saccharine Saccharin là một axit với pKa = 2,0. Saccharin không ổn định khi đun nóng, nhưng nó không phản ứng hóa học với các thành phần khác của thực phẩm. Saccharin thường ở dạng bột kết tinh có màu màu trắng, tan ít trong nước và ête, nhưng dạng muối natri và canxi của nó thì dễ tan. Saccharin ổn định trong môi trường axit, nhưng lại không có phản ứng gì với các thành phần trong thực phẩm nên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn nó thường được dùng nhiều trong đồ uống, nước ngọt. Ở nhiệt độ cao saccharin vẫn giữ được độ ngọt vốn có, có thể thay thế tối đa là 25% lượng đường saccharose nên cũng được sử dụng trong sản xuất bánh, mứt, kẹo cao su, hoa quả đóng hộp, kẹo, bánh tráng miệng….[10], [30]. 1.1.2.1. Danh pháp, công thức cấu tạo và tính chất vật lý của Saccharine ●Danh pháp IUPAC: 1,1-Dioxo-1,2-benzothiazol-3-one Tên gọi khác : Benzoic sulfimide Ortho sulphobenzamide ● Công thức phân tử: C7H5NO3S. ● Công thức cấu tạo: ● Tính chất vật lý: - Saccharine tồn tại ở dạng tinh thể hoặc bột tinh thể trắng, không mùi. - Ít tan trong nước, ethanol, tan trong dung dịch kiềm. - Độ tan trong nước là 1g/270mL, trong ethanol (95%) là 1g/31mL. - Nhiệt độ sôi: 229,70C. - Khối lượng mol phân tử: 183,18g/mol. - Tỷ trọng: 0.828g/cm3 - Nhiệt độ nóng chảy: 228,8 – 229,70C [30]. 1.1.2.2. Công dụng và độc tính của saccharin Saccharin (E954i) là một phụ gia tạo ngọt nhân tạo, còn được gọi với tên khác là đường không sinh năng lượng; độ ngọt của saccharin cao hơn đường saccharose 300 lần, nhưng ở nồng độ cao saccharin có dư vị của kim loại. Saccharin được sử dụng để làm ngọt các sản phẩm như đồ uống giải khát, kẹo, bánh bích quy, thuốc chữa bệnh, kem đánh răng.... Cũng như nhiều chất ngọt thay thế khác saccharin không bị hấp thu bởi hệ tiêu hóa, không gây ảnh hưởng tới hàm lượng insulin trong máu, không tạo năng lượng. Vì vậy saccharin Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn được xếp vào nhóm chất ngọt không calo, còn được sử dụng trong cả những sản phẩm mỹ phẩm, vitamin và dược phẩm [7], [10], [30]. Saccharin không cung cấp năng lượng vì nó không được chuyển hóa bởi con người mà thay vào đó được bài tiết qua thận, khoảng 80% là saccharin và phần còn lại là sản phẩm thủy phân.Saccharin, mặc dù vô hại đối với con người, đã được được báo cáo là có độc tính tiềm tàng và do đó, đã bị cấm ở một số quốc gia xem xét có thể tác dụng gây ung thư [7], [10]. Nhiều năm sau khi saccharin được tổng hợp và ứng dụng trong sản xuất như một chất ngọt thay thế duy nhất lúc đó, thì đến năm 1977 một nghiên cứu của Canada cho biết saccharin gây ung thư bàng quang ở chuột đã gây hoang mang lớn cho người tiêu dùng. Khi đó FDA cũng đã phát lệnh cấm sử dụng saccharin trong thực phẩm và dược phẩm, nhưng do vào thời điểm đó saccharin là chất ngọt nhân tạo duy nhất và nhiều người vẫn muốn sử dụng những sản phẩm thực phẩm có chứa nó đặc biệt là những bệnh nhân tiểu đường. Trước những sức ép của người dân và cả nhà sản xuất Quốc hội Mỹ đã buộc phải cho sử dụng nhưng yêu cầu trên nhãn sản phẩm ghi rõ sản phẩm có chứa saccharin có nguy cơ gây nguy hiểm cho sức khỏe [30]. Đến cuối năm 2000 FDA đã chính thức loại bỏ saccharin ra khỏi danh mục những chất gây ung thư và cho phép gỡ bỏ những cảnh báo trên. Nhưng các chuyên gia cũng cảnh báo tới khả năng gây dị ứng sunfonamid ở những người sử dụng thuốc sulfa. Triệu chứng với dị ứng này là đau đầu, khó thở, phát ban, tiêu chảy. Saccharin được tìm thấy trong sữa công thức còn có nguy cơ gây rối loạn chức năng cơ. Với những đối tượng như phụ nữ có thai, trẻ nhỏ và đặc biệt là trẻ sơ sinh không nên sử dụng sản phẩm chứa saccharin. Dùng nhiều lượng saccharin có thể sinh ra chứng béo phì. Tuy nhiên tất cả những biến chứng do việc xử dụng saccharin vẫn còn là một tranh cãi và chưa có kết luận nào có tình cách thuyết phục [30]. 1.2. Một số phương pháp xác định saccharin, và aspartame Hiện nay, tùy thuộc vào điều kiện cơ sở vật chất mà các phòng thí nghiệm có thể tiến hành phân tích đối tượng nghiên cứu theo các phương pháp khác nhau. Một số phương pháp phổ biến có thể kể đến như quang phổ hấp phụ phân tử UV-VIS, sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, điện di mao quản vùng CZE. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 1.2.1. Phương pháp chuẩn độ Phương pháp này thường được áp dụng trong xác định saccharin: Cân khoảng 0,5g mẫu thử đã được làm khô, hòa tan trong 75 mL nước nóng. Làm nguội nhanh và thêm dung dịch phenolphtalein, chuẩn độ với dung dịch natri hydroxyd 0,1 M. Mỗi mL natri hydroxyd 0,1N tương đương với 18,32 mg C7H5NO3S. Phương pháp này cần hóa chất độc hại, chỉ phân tích được nếu hàm lượng chất lớn. Với các chất có hàm lượng nhỏ, phương pháp này mắc sai số lớn [1], [7], [10]. 1.2.2. Phương pháp quang phổ Nếu mẫu là chất rắn: hòa tan lượng mẫu thích hợp và định mức 25 mL với nước khử ion. Nếu là mẫu lỏng, pha loãng thể tích mẫu thích hợp thành 25 mL. Lấy 500 µL dung dịch trên pha loãng thành 10 mL với dung dịch đệm Clark and Lubs (dung dịch gồm KCl 0,2 M và HCl 0,2 M) pH = 1,3. Để xác định Saccharin trong các chất làm ngọt, sử dụng bước sóng phát hiện saccharin là 206 nm. Độ thu hồi đối với cả hai chất phân tích trên nền mẫu thực trong khoảng 93,5÷ 105,1%, sai số tương đối < 5%. Để xác định đồng thời 3 chất ngọt nhân tạo (Saccharin, Aspartame, AcesulfameK) và vitamin C trong đồ uống bằng phương pháp PLS – UV, cân chính xác 0,05 g mẫu, hòa tan và chuyển vào bình định mức 100 mL bằng dung dịch H3PO4 0,1N. Chất phân tích được đo ở bước sóng từ 190 – 300 nm. Nếu mẫu có chứa màu thực phẩm, các chất phân tích được chiết bằng dung dịch n - butanol và được đo ở bước sóng từ 190 – 300 nm. Phương pháp này được áp dụng cho đồ uống thương mại, đồ uống có màu (dạng bột và chất lỏng). Phương pháp này tương đối chính xác nhưng tốn dung môi, hóa chất độc hại, không xác định được đồng thời các chất cần phân tích [7], [10], [14]. 1.2.3. Phương pháp điện di mao quản (CE) Đây là phương pháp tách các chất phân tích là các ion hoặc các chất không ion nhưng có mối quan hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp chứa đầy dung dịch đệm, đặt trong điện trường. Do độ linh động điện di của các ion khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách khỏi nhau. Phương pháp này có độ nhạy cao, xác định được đồng thời các chất cần phân tích nhưng thiết bị đắt tiền, quy trình phân tích phức tạp [10]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 1.2.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography- HPLC; còn được gọi là Sắc ký lỏng cao áp) là một phương pháp phân tích hiện đại trong hóa học phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp [1]. Nguyên tắc của phương pháp: Phương pháp HPLC dựa trên hệ thống bơm để đẩy chất lỏng đã bị nén và hỗn hợp mẫu qua một cột đổ bằng một chất hấp phụ, dẫn tới sự phân tách của các thành phần trong mẫu. Thành phần hoạt động của cột, chất hấp phụ, tiêu biểu là một vật liệu cấu trúc hạt làm từ những hạt rắn như silica hay polymers, có kích thước trong khoảng 2-50 micro mét. Những thành phần của hỗn hợp mẫu được tách ra khỏi nhau bởi mức độ tương tác khác nhau với các hạt hấp phụ. Chất lỏng bị nén là hỗn hợp dung môi ví dụ nước, acetonitrile hay methanol và được gọi là "pha động". Thành phần và nhiệt độ của pha động đóng vai trò chính trong quá trình phân tách bằng cách tác động lên nhưng tương tác xảy ra giữa những thành phần trong mẫu và chất hấp phụ ở cột. Thành phần pha động có thể được giữ cố định (rửa giải đẳng dòng) hoặc thay đổi (rửa giải gradient) trong quá trình phân tích sắc ký. Rửa giải đẳng dòng đặc biệt hiệu quả trong phân tách những thành phần mẫu không khác nhau nhiều về ái lực của chúng với pha động. Với rửa giải gradient thành phần của pha động được thay đổi từ thấp tới cao để tăng sức rửa giải. Sức rửa giải của pha động được phản ánh bằng thời gian lưu của mẫu, sức rửa giải cao thì thời gian lưu của mẫu ngắn. C(nồng độ) t0 t(thời gian) Hình 1.1. Thời gian lưu của chất phân tích Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Thời gian mà một chất phân tích rửa giải ra khỏi cột gọi là thời gian lưu. Thời gian lưu được đo trong những điều kiện đặc trưng và được xem là đặc điểm nhận biết của chất phân tích. Dựa vào sắc ký đồ của chất phân tích để định lượng các chất phân tích đó [2], [3]. 1.3. Tổng quan các công trình nghiên cứu xác định saccharin và aspartam 1.3.1. Ở Việt Nam Ở Việt Nam, các nghiên cứu xác định saccharin và aspartam nói riêng và các chất tạo ngọt nói chung bằng các phương pháp khác nhau đã được các nhà khoa học và các tổ chức thực hiện. Đặc biệt phải kể đến nhóm nghiên cứu thuộc Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên -Đại học Quốc gia Hà Nội. Trong “Nghiên cứu xác định một số chất tạo ngọt trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc” tác giả Nguyễn Đức Thắng [6] đã tối ưu hóa các điều kiện phân tích đồng thời bốn chất tạo ngọt: Ace - K, Asp, Cyc, Sac bằng phương pháp CE-C 4D. Với các điều kiện tối ưu như sau: Dung dịch đệm điện di: Tris 100 mM /His 10 mM (pH = 9,2), thế điện di là 15 kV, thời gian bơm mẫu là 15 s, chiều cao bơm mẫu là 10 cm. LOD cho Ace-K, Asp, Cyc, Sac lần lượt là 0,7 ppm; 5,0 ppm; 1,0 ppm; 1,0 ppm. Tác giả Trần Phúc Nghĩa [4] cũng đã “Ứng dụng kỹ thuật sắc ký điện di mao quản phân tích acesulfame-k, saccharin, aspartame trong đồ uống”. Kết quả nghiên cứu đã xây dựng được phương pháp định lượng Acesulfame-k, Saccharin, Aspartame trong đồ uống, nước giải khát với các điều kiện điện di: bước sóng phát hiện các chất là 215,5 nm, sử dụng dung dịch đệm borat 20 mM pH = 9,5, điện thế đặt vào hai đầu mao quản là 25kV, nhiệt độ 25oC, với áp suất bơm mẫu 50mbar trong thời gian 5s, dòng điện 100A. Tác giả Bùi Thị Minh Thúy [12] đã tiến hành “Xác định một số đường hóa học và chất bảo quản trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)”. Kết quả ngiên cứu cho thấy điều kiện phù hợp cho việc xác định hàm lƣợng aspartam, axit sorbic, axit benzoic, acesulfam K, saccarin có trong mẫu thực phẩm bằng kỹ thuật HPLC với detector PDA: cột tách anion, bƣớc sóng phát hiện các chất phân tích khi sử dụng detector PDA đối với Aspartam, saccarin là 210 nm; Axit benzoic và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Acesulfam K là 225 nm; Axit sorbic là 254 nm; pha động: kênh A - dung dịch NaH2PO4 5mM (pH=8,2), kênh B là acetonitril; chƣơng trình rửa giải gradient, tốc độ dòng 1mL/phút. Tác giả Nguyễn Thị Hồng Thúy [13] đã “Nghiên cứu phương pháp phân tích axit benzoic, axit sorbic, muối của chúng và một số chỉ tiêu đường hóa học trong đối tượng thực phẩm”. Kết quả nghiên cứu khẳng định rằng đã khảo sát, xây dựng được phương pháp phân tích đồng thời saccharin, aspartam, axit sorbic và axit benzoic theo phù hợp, với với các điều kiện: nhiệt độ buồng cột: 300C; thể tích bơm mẫu: 20µl; Cột C18 (250 mm x 4,6 mm x 5µm); Nồng độ chuẩn bơm: 1ppm; Detector: DAD 210 nm, 26 nm, 254 nm; Tỷ lệ dung môi pha động tuân theo gradient. Áp dụng phân tích với các mẫu axit benzoic, axit sorbic, muối của chúng và một số chỉ tiêu đường hóa học trong đối tượng thực phẩm cho độ thu hồi đối với saccharin, aspartam, axit sorbic và axit benzoic lần lượt là 92,1 - 104,2%; 94,2 - 101,3%; 94,2 - 101,3% và 91,4 - 99,8%. 1.3.2. Trên thế giới Trên thế giới đã có khá nhiều công trình nghiên cứu về SCR, ASP nói riêng và các chất tạo ngọt nói chung. Khi nghiên cứu xác định hàm lượng các chất tạo ngọt trong một số loại đồ uống và thực phẩm dành cho người ăn kiêng bằng phương pháp HPLC sử dụng detector DAD, Daniela de Queiroz Pane và các cộng sự [16] nhận thấy rằng lượng chất làm ngọt nhân tạo trong các mẫu được phân tích dao động từ 0,3 đến 25,8 mg/100 mL đối với acesulfame-K; 1,3 đến 15,8 mg/100 mL 1 đối với saccharin; 36,7 đến 79,4 mg/100 mL đối với cyclamate và 2,7 đến 55,9 mg/100 mL đối với aspartame. Tất cả các mẫu nước sốt cà chua và thịt nướng có chứa nồng độ vượt quá giới hạn cho phép. Hơn nữa, một số mẫu chứa nồng độ cao hơn nồng độ ghi trên nhãn, cho thấy sự cần thiết phải kiểm soát và kiểm tra hiệu quả hơn trong ngành công nghiệp thực phẩm. Tác giả Małgorzata Grembecka, Piotr Baran, Agata Błażewicz, Zbigniew Fijałek & Piotr Szefer [20] đã phát triển phương pháp HPLC pha đảo để định lượng đồng thời aspartame, acesulfame-K, saccharin, axit citric và natri benzoate trong nước giải khát cola không đường. Việc tách sắc ký được thực hiện bởi sử dụng pha động là đệm kali dihydrogen orthophosphate (pH = 4,3) và acetonitrile (88:12, v/v). Cột Thermo Hypersil (150 mm x 4,6mm) và detector DAD với tín hiệu UV ở 210nm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn