Tài liệu Nghiên cứu xác định các độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin 1, dinophysistoxin 2 trong một số nhuyễn thể hai mảnh vỏ ở biển việt nam bằng sắc ký lỏng khối phổ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TỐNG THỊ THANH VƯỢNG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘC TỐ GÂY TIÊU CHẢY ACID OKADAIC, DINOPHYSISTOXIN-1, DINOPHYSISTOXIN-2 TRONG MỘT SỐ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ Ở BIỂN VIỆT NAM BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TỐNG THỊ THANH VƯỢNG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘC TỐ GÂY TIÊU CHẢY ACID OKADAIC, DINOPHYSISTOXIN-1, DINOPHYSISTOXIN-2 TRONG MỘT SỐ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ Ở BIỂN VIỆT NAM BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 9720210 Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Đình Chi PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo HÀ NỘI, NĂM 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tống Thị Thanh Vượng i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận án này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình và hiệu quả của nhiều cá nhân và tập thể, các thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: TS. Lê Đình Chi, giảng viên bộ môn Hoá phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội và PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo, Viện trưởng Việm Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, là hai người thầy, cô đã tận tình hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ, cho tôi những kiến thức quý báu và động viên tôi quyết tâm hoàn thành luận án. GS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu, nguyên Hiệu phó, trưởng chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội là người thầy đã động viên, chỉ dẫn và đóng góp ý kiến quý báu cho tôi hoàn thành luận án. Ban Giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội và Ban Lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án đúng thời gian quy định. Các thầy, cô Bộ môn Hoá phân tích – Độc chất và Phòng Sau đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Gia đình và những người thân đã chia sẻ, động viên tôi có đủ nghị lực, quyết tâm hoàn thành luận án. Tác giả luận án Tống Thị Thanh Vượng ii MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………… 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN………………………………………………… 3 1.1. ĐỘC TỐ SINH VẬT BIỂN……………………………………………………. 3 1.1.1. Nguồn gốc……………………………………………………………… 3 1.1.2. Tóm tắt quá trình nghiên cứu một số nhóm độc tố tảo đơn bào gây độc cho con người……………………………………………………. 1.2. NGUỒN GỐC, CẤU TRÚC HOÁ HỌC, ĐỘC TÍNH VÀ QUY ĐỊNH KIỂM 4 SOÁT ĐỘC TỐ DSP………………………………………………………………… 7 1.2.1. Nguồn gốc độc tố DSP………………………………………….............. 7 1.2.2. Cấu trúc hoá học độc tố DSP……………………………………………. 8 1.2.3. Cơ chế tác dụng, độc tính độc tố DSP…………………………………… 10 1.2.4. Ngộ độc cho người do độc tố DSP……………………………………… 11 1.2.5. Quy định kiểm soát độc tố DSP…………………………………………. 12 1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ DSP…………………………… 16 1.3.1. Các phương pháp xử lý mẫu để chiết độc tố nhóm acid okadaic………… 16 1.3.1.1. Lựa chọn dung môi để chiết độc tố nhóm OA từ nhuyễn thể…............... 17 1.3.1.2. Các phương pháp làm sạch dịch chiết ban đầu………………………… 18 1.3.1.3. Các phương pháp thuỷ phân mẫu và làm sạch sau thuỷ phân………….. 20 1.3.2. Các phương pháp sinh học để phân tích độc tố nhóm acid okadaic……… 21 iii 1.3.2.1. Các phương pháp định lượng sinh học in vivo………………………… 21 1.3.2.2. Các phương pháp định lượng qua gây độc tế bào……………………… 22 1.3.2.3. Các phương pháp hoá sinh ……………………………………………. 23 1.3.3. Các phương pháp hoá lý để phân tích độc tố nhóm acid okadaic………... 24 1.3.3.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao…………………………………….............. 24 1.3.3.2. Điện di mao quản……………………………………………………... 26 1.3.3.3. Sắc ký khí……………………………………………………............... 27 1.4. ỨNG DỤNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ TRONG PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ NHÓM ACID OKADAIC…………………………………………………............................. 27 1.4.1. Các đặc trưng khối phổ của độc tố nhóm OA……………………………. 27 1.4.1.1. Khối phổ của OA trong kỹ thuật EI và CI……………………………... 27 1.4.1.2. Khối phổ của OA trong kỹ thuật FAB………………………………… 28 1.4.1.3. Khối phổ của OA trong kỹ thuật ESI………………………….............. 29 1.4.1.4. Khối phổ dạng ester của OA…………………………………............... 34 1.4.2. Phân tích định tính, định lượng độc tố nhóm OA bằng LC – MS/MS…… 36 1.4.2.1. Kỹ thuật ion hoá………………………………………………………. 36 1.4.2.2. Lựa chọn phân tích khối………………………………………………. 37 1.4.2.3. Điều kiện sắc ký………………………………………………………. 38 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………………………… 43 2.1. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ…………………………………............... 43 2.1.1. Dung môi, hoá chất và chất chuẩn………………………………………. 43 2.1.1.1. Chất chuẩn……………………………………………………………. 43 iv 2.1.1.2. Dung môi, hoá chất…………………………………………………… 43 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ phân tích……………………………………………… 43 2.1.2.1. Thiết bị phân tích……………………………………………………… 43 2.1.2.2. Dụng cụ phân tích……………………………………………............... 44 2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU…………………………………………………... 45 2.2.1. Mẫu nhuyễn thể lấy tại các địa phương………………………………….. 45 2.2.2. Mẫu thêm chuẩn………………………………………………………… 45 2.2.3. Mẫu chuẩn nhuyễn thể có chứa độc tố…………………………………... 45 2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………….. 46 2.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời OA, DTX1, DTX2 trong nhuyễn thể……………………………………………………………………... 46 2.3.1.1. Khảo sát xây dựng điều kiện khối phổ………………………………… 46 2.3.1.2. Khảo sát xây dựng điều kiện sắc ký…………………………………… 47 2.3.1.3. Khảo sát điều kiện chiết độc tố từ mẫu nhuyễn thể……………………. 48 2.3.1.4. Khảo sát điều kiện thuỷ phân để phân tích độc tố toàn phần………...… 48 2.3.1.5. Thẩm định phương pháp………………………………………………. 49 2.3.2. Lấy mẫu nhuyễn thể và bảo quản mẫu………………………...………… 51 2.3.2.1. Lựa chọn số lượng cá thể cho mỗi mẫu nhuyễn thể……………………. 51 2.3.2.2. Khảo sát điều kiện bảo quản mẫu nhuyễn thể…………………………. 51 2.3.3. Phân tích độc tố trong mẫu nhuyễn thể và biện giải kết quả……………... 51 2.3.3.1. Tiến hành phân tích trên mẫu thực…………………………………….. 51 2.3.3.2. Các tiêu chí đánh giá kết quả phân tích độc tố trong nhuyễn thể………. 52 2.3.3.3. Các hướng biện giải, bàn luận kết quả………………………………… 52 v CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………………………… 53 3.1. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH OA, DTX1 VÀ DTX2…............... 53 3.1.1. Khảo sát thiết lập điều kiện phân tích OA, DTX1 và DTX2 bằng MS…... 53 3.1.1.1. Điều kiện của detector MS/MS……………………………….............. 53 3.1.1.2. Điều kiện sắc ký………………………………………………………. 59 3.1.2. Khảo sát thiết lập điều kiện xử lý mẫu để chiết OA, DTX1 và DTX2 từ nhuyễn thể……………………………………………………………………... 65 3.1.2.1. Đồng nhất mẫu………………………………………………………... 65 3.1.2.2. Lựa chọn dung môi chiết độc tố……………………………………….. 65 3.1.2.3. Lựa chọn thể tích dung môi chiết……………………………………… 67 3.1.2.4. Khảo sát điều kiện làm sạch dịch chiết………………………………... 68 3.1.2.5. Điều kiện xử lý mẫu để phân tích độc tố ở dạng tự do…………………. 73 3.1.2.6. Khảo sát thiết lập điều kiện thuỷ phân để phân tích OA, DTX1 và DTX2 toàn phần trong nhuyễn thể…………………………………………….. 74 3.1.3. Khảo sát thiết lập điều kiện bảo quản nhuyễn thể……………….............. 79 3.1.3.1. Đánh giá độ ổn định của độc tố trong nhuyễn thể ở một số điều kiện nhiệt độ………………………………………………………………………... 79 3.1.3.2. Điều kiện bảo quản mẫu nhuyễn thể…………………………………... 82 3.2. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH OA, DTX1 VÀ DTX2………….. 82 3.2.1. Điều kiện của các phương pháp được thẩm định………………………... 82 3.2.1.1. Phương pháp phân tích độc tố tự do trên cột Cortecs………………….. 82 3.2.1.2. Phương pháp phân tích độc tố tự do và toàn phần trên cột Zorbax…….. 84 3.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích độc tố trên cột Cortecs……………… 85 vi 3.2.2.1. Độ đặc hiệu…………………………………………………………… 85 3.2.2.2. Độ thích hợp hệ thống……………….………………………………... 87 3.2.2.3. Độ tuyến tính của khoảng nồng độ làm việc………….……….............. 88 3.2.2.4. Độ chính xác.…………………………………………………………. 88 3.2.2.5. Độ đúng……………………………………………………………….. 91 3.2.2.6. Độ nhậy……………………………….................................................. 92 3.2.3. Thẩm định phân tích độc tố tự do và toàn phần trên cột Zorbax…………. 94 3.2.3.1. Độ đặc hiệu………………………........................................................ 94 3.2.3.2. Độ thích hợp hệ thống………………………………………………… 96 3.2.3.3. Độ tuyến tính của khoảng nồng độ làm việc…………………………... 97 3.2.3.4. Độ chính xác khi phân tích độc tố tự do……………………………….. 98 3.2.3.5. Độ chính xác khi xác định độc tố toàn phần…………………………… 101 3.2.3.6. Độ đúng khi phân tích độc tố tự do……………………………………. 103 3.2.3.7. Độ đúng khi phân tích độc tố toàn phần……………………………….. 104 3.2.3.8. Độ nhậy……………………………………………………………….. 104 3.3. PHÂN TÍCH OA, DTX1 VÀ DTX2 TRONG MẪU NHUYỄN THỂ…………... 107 3.3.1. Lấy mẫu nhuyễn thể và phân tích độc tố………………………………… 107 3.3.2. Kết quả phân tích độc tố trong mẫu nhuyễn thể…………………………. 109 3.3.2.1. Kết quả phát hiện độc tố tự do…………………………………………. 109 3.3.2.2. Kết quả phát hiện độc tố sau khi thuỷ phân……………………………. 111 3.3.3. Sự phân bố các mẫu phát hiện có độc tố…………………………………. 113 3.3.3.1. Phân bố các mẫu có độc tố theo loại nhuyễn thể………………………. 113 3.3.3.2. Phân bố các mẫu có độc tố theo địa điểm lấy mẫu……………............... 116 vii 3.3.3.3. Phân bố các mẫu có độc tố theo thời điểm lấy mẫu……………………. 119 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN……………………………………………………. 122 4.1. BÀN LUẬN PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐƯỢC XÂY DỰNG……………. 122 4.1.1. Điều kiện phân tích độc tố bằng LC – MS/MS…………………............... 122 4.1.2. Điều kiện xử lý mẫu nhuyễn thể………………………………………… 126 4.1.2.1. Cỡ mẫu nhuyễn thể……………………………………………………. 126 4.1.2.2. Điều kiện xử lý mẫu để phân tích độc tố tự do…………………...……. 126 4.1.2.3. Điều kiện xử lý mẫu để phân tích độc tố toàn phần……………………. 127 4.2. BÀN LUẬN KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ TRONG NHUYỄN THỂ……... 129 4.2.1. Loại độc tố phát hiện được, tỷ lệ xuất hiện và mức độ hàm lượng trong nhuyễn thể……………………………………………………………………... 129 4.2.2. Dao động sự xuất hiện của độc tố trong nhuyễn thể cùng các yếu tố ảnh hưởng………………………………………………………………………….. 131 4.3. NGUY CƠ ẢNH HƯỞNG TỚI SỨC KHOẺ VÀ HƯỚNG KIỂM SOÁT ĐỘC TỐ NHÓM OA TRONG NHUYỄN THỂ TRONG TƯƠNG LAI…………………... 140 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………............... 142 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC viii DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Nội dung ACN Acetonitril ADAM 9-anthryldiazomethan ALP Alkaline phosphatase AOAC Hiệp hội các cộng đồng phân tích (Association Of Analytical Communities) ASP Mất trí nhớ do ngộ độc thuỷ sinh vật vỏ cứng (Amnesic Shellfish Poisoning) AZA Azaspiracid AZP Ngộ độc azaspiracid do thuỷ sinh vật vỏ cứng (Azaspiracid Shellfish Poisoning BAP 1-bromoacetylpyren BNNVPTNT Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn BrDMEQ 3-bromomethyl-6,7-dimethoxy-1-methyl-2(1H)-quinoxalinon BSA Huyết thanh bò (Bovine Serum Albumin) CA 9-cloromethylanthracen CI Ion hoá hoá học (Chemical Ionization) CE Năng lượng bắn phá ion sơ cấp (Collision Energy) CEFAS Trung tâm khoa học môi trường, ngư nghiệp và nuôi trồng hải sản Anh (Centre for Environtment, Fisheries and Aquaculture Science) CTX Ciguatoxin CXP Thế khi ra khỏi buồng va chạm (Collision Cell Exit Potential) i DP Thế tách chùm (Declustering Potential) DSP Tiêu chảy do ngộ độc thuỷ sinh vật vỏ cứng (Diarrhetic Shellfish Poisoning) DTX Dinophysistoxin DTX1 Dinophysistoxin-1 DTX2 Dinophysistoxin-2 EC Uỷ ban châu Âu (European Commission) EI Ion hoá điện tử (Electron Ionization) ELISA Định lượng bằng gắn miễn dịch liên kết enzym (Enzym - Linked ImmunoSorbent Assay) ESI Ion phun điện tử (Electrospray Ionization) EU Liên minh châu Âu (European Union) FAB Bắn phá nhanh nguyên tử (Fast-Atom Bombardment) GC Sắc ký khí (Gas Chromatography) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performace Liquid Chromatography) HRP Horseradish Peroxidase IP Điển định danh (Identification Point) KB Tế bào ung thư biểu mô LC Sắc ký lỏng (Liquid Chromatography) LC-MS Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid Chromatography Mass Spectrometry) LC-MS/MS Sắc ký lỏng khối phổ hai lần (Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry) ii LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantification) MBA Định lượng sinh học trên chuột (Mouse Bioassay) MEKC Sắc ký điện động mixen (Micellar Electrokinetic Chromatography) MeOH Methanol MRM Theo dõi đa phản ứng (Multiple Reaction Monitoring) MU Đơn vị chuột (Mouse Unit) NAFIQAD Cục quản lý chất lượng nông lâm sản và thuỷ sản (National AgroForestry-Fisheries Quality Assurance Department) Ngộ độc thần kinh do thuỷ sinh vật vỏ cứng (Neurotoxic Shellfish NSP Poisoning) NRCC Hội đồng nghiên cứu quốc gia Canada (National Research Council Canada) NT2MV Nhuyễn thể hai mảnh vỏ OA Acid Okadaic PP Protein Phosphatase PSP Tê liệt do ngộ độc thuỷ sinh vật vỏ cứng (Paralytic Shellfish Poisoning PTX Pectenotoxin SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) SDS Sodium DodecylSulfate SIM Chế độ chọn lọc ion (Select Ion Monitoring) S/N Tín hiệu trên nhiễu nền (Signal/Noise) SOP Quy trình thao tác chuẩn (Standard Operation Procedure) iii SPE Chiết pha rắn (Solid phase extraction) TCVN Tiêu Chuẩn Việt Nam TFA Acid trifluoroacetic TT Thông tư TTX Tetrodotoxin UPLC Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (Ultra Performace Liquid Chromatography) USFDA Cơ quan quản lý Dược phẩm và thực phẩm Mỹ (United States Food and Drug Administation) UV-Vis Tử ngoại – Khả kiến (Ultra Violet – Visible) YTX Yessotoxin iv DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Trang Bảng 1.1 Quy định kiểm soát độc tố sinh học trong nhuyễn thể theo Thông tư 33/2015/TT – BNNVPTNT………………………... Bảng 1.2 15 Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp LC – MS để xác định độc tố nhóm OA……………………………………………… 39 Bảng 2.1 Hàm lượng các độc tố trong mẫu chuẩn………………..…….. 46 Bảng 3.1 Điều kiện chạy nguồn ion hoá ESI……………………..…….. 59 Bảng 3.2 Điều kiện tách chùm ion sơ cấp và tạo ion thứ cấp của độc tố nhóm DSP………………………………………..................... 59 Bảng 3.3 Chương trình gradient dung môi cho cột Cortecs……….......... 64 Bảng 3.4 Khảo sát thể tích MeOH và số lần chiết…………………......... 67 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của các điều kiện tác động lên dịch chiết MeOH…. 69 Bảng 3.6 Khảo sát điều kiện nạp mẫu và khả năng thu hồi độc tố………. 71 Bảng 3.7 Khảo sát thể tích rửa giải………………………………........... 72 Bảng 3.8 Kết quả đánh giá khả năng làm sạch dịch chiết bằng ly tâm Bảng 3.9 lạnh…………………………………………………………… 73 Đánh giá khả năng bảo tồn độc tố sau khi xử lý dịch thuỷ phân.. 76 v Bảng 3.10 Đánh giá thay đổi hàm lượng độc tố tự do trong các điều kiện bảo quản khác nhau…………………………………………... 79 Bảng 3.11 Đánh giá thay đổi hàm lượng OA tự do và toàn phần trên mẫu thực trong các điều kiện bảo quản khác nhau…………………. 80 Bảng 3.12 Đánh giá độ thích hợp hệ thống trên cột Cortecs……………… 87 Bảng 3.13 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của khoảng nồng độ làm việc…. 88 Bảng 3.14 Thẩm định độ đúng, độ chính xác với độc tố tự do trên cột Cortecs………………………………………………………... 89 Bảng 3.15 Thẩm định ảnh hưởng của loại nền nhuyễn thể lên độ đúng, độ chính xác với độc tố tự do……………………........................... 91 Bảng 3.16 Kết quả đánh giá LOD, LOQ trên cột Cortecs…………............ 92 Bảng 3.17 Đánh giá độ thích hợp hệ thống trên cột Zorbax Eclipse Plus…………………………………………………………… 97 Bảng 3.18 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của khoảng nồng độ làm việc…. 97 Bảng 3.19 Thẩm định độ đúng, độ chính xác với độc tố tự do trên cột Zorbax………………………………………………………… 99 Bảng 3.20 Thẩm định ảnh hưởng của loại nền nhuyễn thể lên độ đúng, độ chính xác với độc tố tự do khi phân tích trên cột Zorbax………. 100 Bảng 3.21 Đánh giá độ đúng, độ chính xác trên mẫu chuẩn………………. 102 Bảng 3.22 Thẩm định độ chính xác với độc tố toàn phần trên mẫu thực….. 103 Bảng 3.23 Kết quả đánh giá LOD, LOQ trên cột Zorbax Eclipse Plus……. 105 Bảng 3.24 Kết quả lấy mẫu nhuyễn thể theo thời gian, địa điểm lấy mẫu và loại mẫu……………………………………………………. 108 Bảng 3.25 Tổng hợp kết quả các mẫu phát hiện có độc tố………………… 110 vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Công thức cấu tạo của OA và các DTX………………..……….. Hình 1.2 Phổ khối của OA trong các điều kiện khác nhau: (a) phổ EI, (b) phổ CI ion dương, (c) phổ CI ion âm [19]………... …………… Hình 1.3 33 Cơ chế phân mảnh ion thứ cấp từ ion [M+Na]+ của OA, DTX1, DTX2 [24]………………………………….……...................... Hình 1.8 31 Phổ ion thứ cấp của ion [M+Na]+ của OA (a), DTX2 (b), DTX1 (c) [24]…………………………………………………………. Hình 1.7 30 Phổ ion thứ cấp của ion [M-H]- của OA (a), DTX2 (b), DTX1 (c) [24] ………………………………………………………… Hình 1.6 29 Cơ chế phân mảnh ion thứ cấp từ ion [M-H]- của OA, DTX1, DTX2 [24] .................................................................................. Hình 1.5 28 Phổ khối FAB của OA: (a) chế độ ion dương, (b) chế độ ion dương m/z từ 400 đến 1000, (c) chế độ ion âm [19]……………. Hình 1.4 8 34 Phổ ion thứ cấp của ion [M-H]- của OA (m/z 803) (a), OA palmitat (m/z 1041) (b), DTX1 (m/z 817) (c) và DTX1 palmitat (m/z 1055) (d) [123]…………………...………......................... vii 35 Hình 1.9 Các ion thứ cấp đặc trưng của các 7-O acyl ester có nguồn gốc từ ion [M-H]- (ion (i) và (ii), và ion [M+Na]+ (các ion I, II, III, IV) [123]………………………………………………………. 35 Hình 1.10 Một số ester diol và ester hỗn hợp của độc tố nhóm OA, cơ chế phân mảnh ion [M+Na]+ của các ester này [122]……................. 36 Hình 2.1 Chuẩn OA, DTX1, DTX2 của NRCC………………………….. 43 Hình 2.2 Mẫu chuẩn nhuyễn thể có chứa độc tố của NRCC……………... 46 Hình 3.1 Phổ ESI – MS của OA…………………………………………. 54 Hình 3.2 Phổ ESI – MS của DTX1………………………………………. 54 Hình 3.3 Phổ ESI – MS của DTX2………………………………………. 54 Hình 3.4 Kết quả khảo sát DP của OA……………………………............ 55 Hình 3.5 Kết quả khảo sát DP của DTX1………………………………... 55 Hình 3.6 Kết quả khảo sát DP của DTX2………………………………... 55 Hình 3.7 Kết quả ion thứ cấp thu được khi bắn phá ion sơ cấp OA………. 56 Hình 3.8 Kết quả ion thứ cấp thu được khi bắn phá ion sơ cấp DTX1……. 56 Hình 3.9 Kết quả ion thứ cấp thu được khi bắn phá ion sơ cấp DTX2……. 56 Hình 3.10 Kết quả tối ưu hoá CE cho các ion thứ cấp……………………... 57 Hình 3.11 Kết quả tối ưu hoá CXP cho các ion thứ cấp…………………… 58 Hình 3.12 Sắc ký đồ chuẩn độc tố ở cùng tỷ lệ pha động sử dụng dung môi là ACN (A,B) và MeOH (C,D)………………............................ 60 Hình 3.13 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ acid formic trong pha động tới đáp ứng pic của các độc tố………………………………….. viii 61 Hình 3.14 Hình dạng pic khi phân tích trên cột Cortecs với pha động ACN – H2O chứa 0,1% acid formic, rửa giải theo chương trình gradient tại bảng 3.3……………………………….................... 62 Hình 3.15 Ảnh hưởng của amoni format tới hình dạng pic khi phân tích trên cột Zorbax với pha động có tỷ lệ dung môi ACN – H2O (35:65, tt:tt)………………..…………………………………... 62 Hình 3.16 Ảnh hưởng của loại dung môi (A) và thể tích dung môi (B) tới hiệu quả chiết các độc tố từ nhuyễn thể………………................ 66 Hình 3.17 Đánh giá ảnh hưởng của thời gian tới hiệu quả thuỷ phân dẫn xuất ester của độc tố……………………………………………. 77 Hình 3.18 Đánh giá độ đặc hiệu trên cột Cortecs………………………….. 86 Hình 3.19 Kết quả đáp ứng sắc ký của các độc tố tại LOQ với cột Cortecs... 93 Hình 3.20 Kết quả đáp ứng sắc ký của các độc tố tại LOD với cột Cortecs... 94 Hình 3.21 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu trên cột Zorbax….................... 95 Hình 3.22 Kết quả đáp ứng sắc ký của các độc tố tại LOQ với cột Zorbax… 106 Hình 3.23 Kết quả đáp ứng sắc ký của các độc tố tại LOD với cột Zorbax… 107 Hình 3.24 Một số sắc ký đồ khi phân tích bằng MS/MS…………………... 112 Hình 3.25 Kết quả phát hiện độc tố trên vẹm xanh………………………... 113 Hình 3.26 Kết quả phát hiện độc tố trên hàu………………………………. 114 Hình 3.27 Kết quả phát hiện độc tố trên sò lông…………………………... 115 Hình 3.28 Kết quả phát hiện độc tố trên sò huyết………………………….. 116 Hình 3.29 Tỷ lệ phát hiện độc tố theo loại nhuyễn thể…………………..… 116 Hình 3.30 Kết quả phát hiện độc tố theo địa phương lấy mẫu ……..……… 118 ix Hình 3.31 Kết quả phát hiện độc tố trong nhuyễn thể theo thời gian lấy mẫu ……….…………………………………………………… 120 Hình 4.1 Dao động về tỷ lệ mẫu phát hiện có độc tố theo thời gian lấy mẫu…………………………………………………………….. 134 x