Tài liệu Nghiên cứu về khả năng hấp thụ thuốc diclofenac natri của vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường chuẩn

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN NGUYỄN TÚ HƢƠNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƢỜNG CHUẨN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật Hà Nội, 20 tháng 5 năm 2019 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN NGUYỄN TÚ HƢƠNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƢỜNG CHUẨN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. HÀ THỊ MINH TÂM Hà Nội, 20 tháng 05 năm 2019 LỜI CẢM ƠN Lời đầu, cho phép em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới Ban Giám hiệu Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2; các quý thầy, cô trong khoa Sinh-KTNN; các quý thầy, cô ở Viện Nghiên cứu khoa học và ứng dụng Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã giúp đỡ em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp. Em xin gửi lời biết ơn chân thành nhất tới ThS. Hà Thị Minh Tâm. Vì đây là lần đầu tiên đi vào làm nghiên cứu khoa học nên bƣớc đầu còn nhiều bỡ ngỡ và thiếu sót cả về mặt kiến thức cũng nhƣ kỹ năng, tuy nhiên đƣợc sự chỉ bảo tận tình của cô nên em đã hoàn thành tốt khóa luận của mình. Không có sự thành công nào mà không gắn liền với sự hỗ trợ, vì vậy em rất mong nhận đƣợc sự góp ý từ quý thầy, cô và các bạn sinh viên để khóa luận tốt nghiệp của em hoàn chỉnh hơn nữa. Em xin chân thành cám ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Tú Hƣơng LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan khóa luận “Nghiên cứu về khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trƣờng chuẩn” là đề tài nghiên cứu của em dƣới sự hƣớng dẫn tận tình của Ths.Hà Thị Minh Tâm. Các kết quả, số liệu có đƣợc là do quá trình nghiên cứu của bản thân em, không có sự trùng lặp của bất cứ đề tài nào. Em xin chịu trách nghiệm về lời cam đoan của bản thân nếu có sai sót! Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Tú Hƣơng DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BC : Cellulose vi khuẩn cs : Cộng sự MTC : Môi trƣờng chuẩn PC : Plant cellulose OD : Optical density VLC : Vật liệu cellulose G. xylinus : Gluconacetobacter xylinus MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1 NỘI DUNG ............................................................................................................... 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 3 1.1. Giới thiệu tổng quan đối tƣợng và lĩnh vực nghiên cứu .................................... 3 1.1.1. Giới thiệu về Diclofenac ................................................................................. 3 1.1.2. Tổng quan về Bacterial cellulose .................................................................... 4 1.1.3. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter xylinum ..................................... 5 1.2. Trình bày tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc........................ 6 1.2.1. Trên thế giới .................................................................................................... 6 1.2.2. Ở Việt Nam ...................................................................................................... 6 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 7 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu......................................................................................... 7 2.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................ 7 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 7 2.3.1. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................... 7 2.3.2. Phương pháp chế tạo vật liệu BC ................................................................... 9 2.3.3. Phương pháp xử lý thống kê ......................................................................... 13 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 14 3.1. Kết quả tạo các loại vật liệu BC ....................................................................... 14 3.1.1. Tạo màng BC từ các môi trường lên men ..................................................... 14 3.1.2. Thu màng BC thô .......................................................................................... 14 3.1.3. Xử lý màng BC trước khi hấp thụ ................................................................. 15 3.1.4. Đánh giá độ tinh khiết của màng BC ............................................................ 15 3.1.5. Xây dựng phương trình đường chuẩn của thuốc Diclofenac ........................ 17 3.1.6. Khảo sát khả năng hấp thụ màng BC ........................................................... 17 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................. 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ......................................................... 7 Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ...................................................... 8 Bảng 2.3. Thành phần thuốc và khối lượng tương ứng ............................................. 9 Bảng 3.1. Giá trị OD hấp thụ thuốc của màng BC (n=3) (OD – 283 nm) .............. 19 Bảng 3.2. Lượng thuốc hấp thụ vào các màng BC tại thời điểm 2 giờ.................... 20 Bảng 3.3. Hiệu suất hấp thụ thuốc các loại màng BC trong 2 giờ .......................... 21 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Công thức cấu tạo của thuốc Diclofenac .................................................. 3 Hình 3.1. Màng BC đang hình thành ...................................................................... 14 Hình 3.2. Rửa màng dưới vòi nước .......................................................................... 15 Hình 3.3. Màng BC tinh chế..................................................................................... 16 Hình 3.4. Màng BC được chia vào các bình tam giác ............................................. 16 Hình 3.5. Phương trình đường chuẩn của diclofenac.............................................. 17 Hình 3.6. Chuẩn bị dịch đo quang phổ .................................................................... 18 Hình 3.7. Lượng thuốc hấp thụ vào các màng BC có sự khác biệt.......................... 20 Hình 3.8. Hiệu suất hấp thụ thuốc của các loại màng BC....................................... 21 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Diclofenac đƣợc biết là loại thuốc chống viêm không steroid. Thuốc Diclofenac có tác dụng hạ sốt, giảm đau và chống viêm, do nó ức chế hoạt tính của cyclogenase. Vì vậy, giảm sự tạo thành prostanglandin, prostacyclin và thromboxane là những chất trung gian trong quá trình viêm. Ngoài ra, Diclofenac điều hòa con đƣờng lipoxygenase và sự kết tụ tiểu cầu. Diclofenac còn gây hại cho đƣờng tiêu hóa do làm giảm khả năng tổng hợp Prostaglandin gây ức chế tạo mucin (là chất bảo vệ cho đƣờng tiêu hóa). Prostaglandin là chất có vai trò duy trì tƣới máu thận. Các thuốc chống viêm không steroid ức chế tổng hợp Prostaglandin gây viêm cầu thận, hội chứng thận hƣ và hoại tử nhú đặc biệt biểu hiện rõ ở những ngƣời bệnh thận, ngƣời suy tim. Với những ngƣời bệnh trên, các thuốc chống viên không steroid gây suy thận cấp và suy tim cấp.[5] Trong tự nhiên xuất hiện một số vi khuẩn sinh màng cellulose. Nuôi cấy các vi khuẩn này trong môi trƣờng chứa glucose, glycerol hoặc một số nguồn cacbon hữu cơ khác nhau thì chúng có hình thành trên bề mặt một lớp màng cellulose sinh học thuần khiết, hay còn gọi là màng sinh học Bacterial cellulose (BC). BC cấu tạo bởi các sợi microfibril tạo thành những bó sợi song song hình thành mạng cellulose có độ bền cơ học, đô tinh khiết và thấm hút cao. BC là sản phẩm trao đổi chất sơ cấp, tạo màng bảo vệ. BC là nguồn polymer mới, giải pháp giúp cho nhiều nhà khoa học tìm ra nhiều nguồn nguyên liệu mới hiện nay, ứng dụng cho nhiều lĩnh vực khác nhau.[5] Với mục đích đánh giá đƣợc khả năng hấp thu thuốc Ranitidin của vật liệu BC và khảo sát các đặc tính lý hóa của vật liệu BC trƣớc và sau khi hấp thụ thuốc, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu Cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xilinus nuôi cấy trong môi trƣờng chuẩn”. 1 2. Mục đích của nghiên cứu - Mục đích nghiên cứu: Thiết kế đƣợc hệ thống màng BC lên men từ môi trƣờng chuẩn đƣợc nạp thuốc diclofenac natri. Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc tạo màng BC hấp thụ thuốc nhiều nhất. - Nhiệm vụ nghiên cứu: Chế tạo ra vật liệu BC, xử lý vật liệu BC trƣớc khi hấp thụ thuốc diclofenac natri, xác định lƣợng BC tạo thành, đánh giá độ tinh khiết vật liệu BC. Khảo sát tối ƣu hóa khả năng hấp thụ thuốc diclofenac natri vào vật liệu BC. Khảo sát đặc tính thuốc diclofenac natri trƣớc và sau khi đƣợc hấp thụ thuốc. 3. Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu Cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xilinus nuôi cấy trong môi trƣờng chuẩn. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn - Ý nghĩa khoa học: Xây dựng đƣợc quy trình tạo màng BC lên men trong môi trƣờng chuẩn. - Ý nghĩa thực tiễn: Từ kết quả nghiên cứu chọn ra đƣợc trƣờng hợp hấp thụ thuốc tốt nhất. Từ kết quả nghiên cứu trên có thể áp dụng vào thực tiễn đời sống. 5. Tính mới của đề tài - Nâng cao khả năng hấp thụ thuốc diclofenac natri trong điều trị giảm đau, chống viêm. - Khắc phục nhƣợc điểm của thuốc từ chính kết quả nghiên cứu áp dụng vào điều trị bệnh. 2 NỘI DUNG CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu tổng quan đối tƣợng và lĩnh vực nghiên cứu 1.1.1. Giới thiệu về Diclofenac -Tên quốc tế: Diclofenac -Tên biệt dƣợc: Cambia, Cataflam, Voltaren-XR, Zipsor, Zorvolex, Voltaren, Dyloject. - Công thức: Công thức phân tử: C14H11Cl2NO2 Hình 1.1. Công thức cấu tạo của thuốc Diclofenac - Dạng thuốc và hàm lƣợng: Diclofenac thƣờng đƣợc dùng ở dạng muối natri. Liều lƣợng tính theo diclofenac natri: Viên nén: 25mg; 50mg; 100mg Viên đạn: 25mg; 100mg Ống tiêm: 75mg/2ml; 75mg/3ml Thuốc gel bôi ngoài: 10mg/g 3 Thuốc nƣớc nhỏ mắt: 0,01% -Tác dụng của thuốc Diclofenac: Diclofenac đƣợc dùng để giảm đau, giảm sƣng và cứng khớp do viêm khớp. Diclofenac là một thuốc kháng viêm không steroit (NSAID). [5] Công dụng khác là: Diclofenac có thể sử dụng điều trị các tình trạng đau khác nhau nhƣ đau nhức răng, đau nhức cơ bắp, đau sau khi sinh và đau sau khi phẫu thuật. -Tác dụng phụ: nhức đầu, đau thƣợng vị, buồn nôn, chƣớng bụng, ù tai, chán ăn, khó tiêu. -Liều lƣợng thuốc tùy thuộc vào tình trạng sức khỏe, đáp ứng theo điều trị với các loại thuốc phù hợp. Không sử dụng quá số lƣợng thuốc đƣợc chỉ định.[5] 1.1.2. Tổng quan về Bacterial cellulose - Cellulose vi khuẩn là sản phẩm trao đổi chất sơ cấp và tạo màng bảo vệ. - BC là sản phẩm của chủng G.xylinum. Màng sinh học BC có cấu trúc, đặc tính giống cellulose thực vật, tuy nhiên, chúng khác nhau về cấu trúc đại thể [1]. Theo AJ. Brown (1886), BC gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là hemicellulose, có đƣờng kính là 1,5 nm, kết hợp với nhau tạo thành bó, các bó hợp thành dãy, mỗi dãy khoảng 100 nm, rộng khoảng 3-8 nm. - Tính chất độc đáo màng BC: độ tinh khiết cao, độ bền dai cơ học lớn, khả năng thấm hút nƣớc cao, bị thủy phân bởi enzym,… Chính vì vậy, BC ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực công nghiệp nhƣ: màng BC làm môi trƣờng phân tách cho quá trình xử lý nƣớc, làm chất màng đặc biệt cho pin và năng lƣợng tế bào, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học, công nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ giấy … Đối với y học, màng BC đƣợc ứng dụng làm da thay thế da trong điều trị bỏng, làm mạch máu nhân tạo, điều trị bệnh tim mạch, làm mặt nạ dƣỡng da cho con ngƣời. Trƣờng Đại học Y dƣợc thành phố Hồ Chí Minh đã nghiên cứu màng BC có tấm dầu mù u tạo màng trị 4 bỏng thực nghiệm ở thỏ. Kết quả là màng BC giúp mau lành vết thƣơng và ngăn nhiễm trùng. Ngoài ra, các sợi cellulose có cấu trúc màng BC tạo hệ thống vận chuyển, phân phối thuốc giúp tăng sinh khả năng của thuốc và giúp thuốc không bị phá hủy khi ở môi trƣờng acid [1]. 1.1.3. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter xylinum - G.xylinus thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter, họ Pseudomnadaceae, hiếu khí bắt buộc, có chu mao và có khả năng sản xuất cellulose ngoại bào [2]. Theo khóa phân loại của Bergey, A.xylinum thuộc: Lớp: Schizomycetes Bộ: Pseudomonadales Bộ phụ: Pseudomonadieae Họ: Pseudomonadaceae - Đặc điểm Hình thái: Thẳng, dạng hình que, hơi cong, dài khoảng 2-3 µm, kích thƣớc bề ngang khoảng 0,6-0,8 µm, không có khả năng sinh bào tử, không di động, gram âm, xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, tế bào già tế bào phình to, phân nhánh, có biến đổi [2]. Sinh lý, sinh hóa: Nhiệt độ tối ƣu là 25-300C, ở 370C tế bào suy thoái. Vi khuẩn phát triển với khoảng pH từ 3-8, tối ƣu sản xuất cellulose là 5,5. - Sau 36- 48 giờ lớp màng dày, trong và sau 7-19 ngày thì đạt độ dày nhất định. - Sinh tổng hợp BC: việc sử dụng đƣờng của Acetobacter xylinum đóng vai trò vô cùng lớn trong quá trình tổng hợp BC vì môi trƣờng nuôi cấy Acetobacter xylinum là môi trƣờng tổng hợp nguồn dinh dƣỡng cần thiết nhƣ nguồn cacbon, nito, nguồn sulfur, phosphot và các yếu tố tăng trƣởng, vi lƣợng. 5 1.2. Trình bày tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 1.2.1. Trên thế giới - Trên thế giới, đã có 18 công trình nghiên cứu ứng dụng BC trong hệ thống vận tải và phân phối thuốc (năm 2014) đã đƣợc báo cáo [7]. - Nghiên cứu của Wei B. và cs (2011) màng BC thu đƣợc sau khi ngâm trong benzalkonium chloride có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi đơn vị diện tích bề mặt đã đƣợc tìm thấy là 0.116 kg/cm2. Tác dụng của thuốc kéo dài ít nhất 24 giờ chống lại hoạt động của S. Aureus và B. Subtilis. 1.2.2. Ở Việt Nam - Các kết quả nghiên cứu BC mới dừng lại ở bƣớc đầu thí nghiệm nghiên cứu. - Gần đây nhóm nghiên cứu của Đinh Thị Kim Nhung đã đƣa ra hƣớng nghiên cứu điều trị ở thỏ [3], công tác gồm việc phẫu thuật, cấy ghép, tạo màng trị bỏng… sử dụng các chất có nguồn gốc từ tự nhiên để điều trị bỏng nhƣ da ếch, màng ối màng chitosan. Các thuốc trong tự nhiên có nhiều đặc tính tốt chữa lành các vết thƣơng, vết loét nghiêm trọng - Điều trị bỏng bằng thuốc tự nhiên sẽ đƣợc sử dụng rộng rãi ở các nƣớc. Điều trị bỏng tự nhiên sẽ ít gây ra phản ứng phụ và lành tính.[5] 6 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu - Khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trƣờng chuẩn. 2.2. Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu ở quy mô Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2. 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Vật liệu nghiên cứu 2.3.1.1. Chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn G.xylinus dùng lên men thu nhận BC đƣợc nhập từ Nhật Bản, dự trữ bởi Phòng sạch Vi sinh – Động vật, Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2. 2.3.1.2. Hóa chất nghiên cứu Bảng 2.1. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu STT Tên nguyên liệu 1 Diclofenac 99,5% 2 D- Glucose 3 Axit axetic 4 Amoni sunfat 5 Disodium phosphate 6 Axit citric 7 Cao nấm men 8 Pepton 7 9 Natri hidroxit 10 Nƣớc cất 2 lần 11 Methanol 12 Kali dihidrophotphat 2.3.1.3. Thiết bị và dụng cụ Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu Thiết bị Nƣớc sản xuất Máy đo quang phổ UV- Vis 2450 Shimadru- Nhật Bản Tủ sấy, tủ ấm Binder – Đức Buồng cấy vô trùng Haracus Cân phân tích Sartorius- Thụy Sỹ Cân kỹ thuật TE 412 Nồi hấp khử trùng HV100/HIRAIAMA Nhật Bản Khuấy từ gia nhiệt IKA- Đức Máy lắc tròn tốc độ chậm Orbital Shakergallenkup Anh Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu Bể rung siêu âm S60/H * Dụng cụ: Bình tam giác chia vạch, ống nghiệm, cốc đong thủy tinh chia vạch, bình thủy tinh 500 ml, micropipet 20-200µl, pipet (1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 25ml), kẹp gỗ, thƣớc, giấy lọc, giấy thấm, giấy bạc, khăn xô, kéo, bật lửa, đèn cồn và một số dụng cụ hóa sinh khác. 8 2.3.2. Phương pháp chế tạo vật liệu BC 2.3.2.1. Môi trường lên men thu vật liệu BC Vật liệu BC đƣợc tạo lên môt trƣờng chuẩn (MTC) Bƣớc 1: Sấy các bình đựng và dụng cụ, sau khi sấy xong lấy ra và để nguội Bƣớc 2: Chuẩn bị môi trƣờng theo bảng: Bảng 2.3. Thành phần thuốc và khối lượng tương ứng Thành phần Môi trƣờng MTC Glucose 20g Pepton 5g Diamoni photphat 2,7g Cao nấm men 5g Axit citric 1.5g Axit axetic 2% Nƣớc cất 2 lần 1000ml Dịch giống 10% Lƣu ý: pH của môi trƣờng đƣợc đo và hiệu chỉnh bằng HCl hoặc NaOH; pH của môi trƣờng đƣợc đo và hiệu chỉnh = 4-6, pH thấp sẽ tránh bị nhiễm những vi khuẩn khác. Bƣớc 3: Hấp khử trùng các môi trƣờng ở 1210C trong 15 phút (phải bọc các bình bằng giấy bạc). Bƣớc 4: Lấy các môi trƣờng ra khử trùng bằng tia UV trong 15 phút rồi để nguội môi trƣờng. 9 Bƣớc 5: Bổ sung 10% dịch giống, lắc đều tay cho giống phân bố đều trong dung dịch (trong quá trình này phải chú ý để môi trƣờng và dịch giống không bị nhiễm khuẩn). Bƣớc 6: Chuyển dịch sang dụng cụ nuôi cấy theo kích thƣớc nghiên cứu, dùng gạc vô trùng bịt miệng dụng cụ, đặt tĩnh trong khoảng 4-14 ngày ở 280C. Bƣớc 7: Thu vật liệu BC thô, rửa sạch chúng dƣới vòi nƣớc (xả nƣớc nhẹ). 2.3.2.2. Xử lý vật liệu BC a. Xử lý màng BC trƣớc khi hấp thụ thuốc Mục đích: Cần nuôi cấy tĩnh giúp loại đi các tạp chất trong môi trƣờng nuôi cấy và độc tố của vi khuẩn. Phƣơng pháp: Vật liệu chứa lƣợng lớn vi khuẩn vì vậy hấp vật liệu trong NaOH nóng 3%, nhiệt độ 1130C trong thời gian 15 phút bằng nồi hấp khử trùng để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn trong thời gian 1giờ. Sau khi ngâm NaOH, vớt vật liệu đặt dƣới vòi nƣớc chảy đến khi vật liệu trắng trong. Thử quỳ tím trên bề mặt vật liệu BC là trung tính, thu đƣợc BC tinh khiết. b. Đánh giá độ tinh khiết của màng BC Mục đích: Sau khi xử lý, màng BC loại đi các tạp chất gây độc hại. Phƣơng pháp: - Màng BC tinh chế sẽ mang đi cắt nhỏ, cho 50ml nƣớc cất. - Chia màng BC đã cắt vào các bình tam giác và đổ dung dịch thuốc Diclofenac natri. - Lắc máy rung siêu âm 10 phút, chế độ lắc 200 vòng/phút. 10 - Sau đó, sử dụng dung dịch axit triclor acetic 1% để kiểm tra protein trong dịch chiết màng. Mẫu chứng âm là nƣớc cất, mẫu chứng dƣơng là dung dịch pepton 1%. Phản ứng dƣơng cho kết tủa đục. - So sánh với mẫu đối chứng âm (nƣớc cất) ta thu đƣợc màng dẻo dai, mềm, mỏng, có thể hút nƣớc và dịch mô. 2.3.2.3. Phương pháp dựng đường chuẩn của thuốc Diclofenac natri - Nguyên lý: Sử dụng máy UV- 2450 đo quang phổ hấp thụ của thuốc diclofenac với các nồng độ khác nhau ở bƣớc sóng 283 nm [4]. - Thực hiện: Bƣớc 1: Chuẩn bị mẫu chuẩn diclofenac với các nồng độ tƣơng ứng trong dung môi Methanol. Trong đó, mẫu trắng là methanol. Bƣớc 2: Đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn bị theo dãy trên tại bƣớc đã lựa chọn với mẫu trắng và xây dựng đƣờng chuẩn biểu diễn mối tƣơng quan giữa độ hấp thụ và nồng độ diclofenac natri. Bƣớc 3: Dùng máy đo quang phổ từ ngoại UV- 2450 để đo mật độ quang phổ (OD) của các dung dịch đã pha nhƣ trên ở hấp thụ cực đại (λ max). Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc diclofenac natri để xây dựng đƣờng chuẩn của thuốc. Phƣơng trình tuyến tính biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ diclofenac natri và độ hấp thụ. Phƣơng trình biểu diễn giữa nồng độ và độ hấp thụ có dạng: y= ax + b với R2 là hệ số tƣơng quan Trong đó: y: độ hấp thụ của dung dịch tại λ max x: nồng độ của dung dịch Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau. 11 2.3.2.4. Xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng BC, tính hiệu suất Tiến hành thử nghiệm trên 4 mẫu MTC. - Mẫu 1: Dùng màng cellulose vi khuẩn với độ dày 0,5cm. - Mẫu 2: Dùng màng cellulose vi khuẩn với độ dày 0,5cm, ép loại nƣớc 50%. - Mẫu 3: Dùng màng cellulose vi khuẩn với độ dày 1cm. - Mẫu 4: Dùng màng cellulose vi khuẩn với độ dày 1cm, ép loại nƣớc 50%. Chuẩn bị trƣớc 12 bình tam giác chứa 25mg thuốc diclofenac cùng 100ml dung dịch Methanol khuấy tan. Cho 12 màng vào 12 bình trên, rồi cho vào máy lắc 150 vòng/ phút. Sau các quãng thời gian 30 phút, 1giờ, 1,5 giờ, 2 giờ rút mẫu đo quang phổ bằng máy UV – 2450. Thu đƣợc giá trị OD thay vào phƣơng trình đƣờng chuẩn ta nhận đƣợc nồng độ diclofenac (C%) có trong dung dịch. (1) C%: nồng độ phần trăm khối lƣợng, thể tích chỉ số mg chất tan có trong 100ml dung dịch. mct: khối lƣợng chất tan trong dung dịch (mg). mdd hay Vdd: thể tích của dung dịch (ml). Khối lƣợng diclofenac hấp thụ là: mht = mtr - ms (2) mht : khối lƣợng diclofenac đƣợc hấp thụ vào màng BC (mg). mtr: khối lƣợng diclofenac trong dung dịch ban đầu (mg). ms: khối lƣợng diclofenac còn lại trong 100ml dung dịch diclofenac 25% (mg) Tỷ lệ % diclofenac hấp thụ vào màng cellulose vi khuẩn: (3) 12