Tài liệu Nghiên cứu vai trò của một số gốc axit amin đối với tính chất của β galactosidase từ bacillus subtilis vtcc dvn 12 01 phân lập ở việt nam bằng kỹ thuật ep rca và đột biến điểm định hướng

  • Số trang: 168 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 585 |
  • Lượt tải: 0
dangvantuan

Tham gia: 02/08/2015

Mô tả:

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ THẢO NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ GỐC AXIT AMIN ĐỐI VỚI TÍNH CHẤT CỦA -GALACTOSIDASE TỪ Bacillus subtilis VTCC-DVN-12-01 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT ep-RCA VÀ ĐỘT BIẾN ĐIỂM ĐỊNH HƯỚNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2017 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nguyễn Thị Thảo NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ GỐC AXIT AMIN ĐỐI VỚI TÍNH CHẤT CỦA -GALACTOSIDASE TỪ Bacillus subtilis VTCC-DVN12-01 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT ep-RCA VÀ ĐỘT BIẾN ĐIỂM ĐỊNH HƯỚNG Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Quyền Đình Thi Viện Công nghệ sinh học Hà Nội, 2017 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới cố PGS. TS Quyền Đình Thi, nguyên Trưởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, nguyên Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, biên tập bản thảo bài báo và tạo mọi điều kiện hóa chất, thiết bị cũng như kinh phí để hoàn thành Luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Vũ Văn Hạnh, Trưởng phòng Các chất chức năng sinh học, Viện Công nghệ sinh học đã sửa các bản thảo bài báo và cho tôi sử dụng số liệu trong khuôn khổ đề tài “Nâng cao hoạt tính xúc tác của enzyme tái tổ hợp β-galactosidase bằng kỹ thuật sao chép lỗi DNA vòng và đột biến điểm trực tiếp” thuộc đề tài Nghiên cứu cơ bản 2011-2012 của Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia do TS làm chủ nhiệm. Tôi xin cảm ơn GS. TS Trương Nam Hải, nguyên Trưởng phòng Kỹ thuật di truyền, nguyên Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ hướng dẫn phân tích cấu trúc enzyme. Tôi xin cảm ơn TS. Đỗ Thị Tuyên, phụ trách phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học đã giúp tôi hoàn thành các thủ tục để bảo vệ Luận án ở các cấp. Tôi cũng xin cảm ơn tập thể Phòng CNSH Enzyme, đã tạo điều kiện về thời gian, chia sẻ chuyên môn và giúp đỡ tận tình trong suốt quá trình thực hiện Luận án. Tôi xin cảm ơn Phòng quản lý tổng hợp, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, các cán bộ tại cơ sở đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất, máy móc và giúp đỡ tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu. Cuối cùng tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã giúp đỡ, tạo điều kiện và động viên tôi trong suốt thời gian học tập. Hà Nội, ngày 20 tháng 08 năm 2017 Tác giả Nguyễn Thị Thảo i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: 1. Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; 2. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; 3. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày 20 tháng 08 năm 2017 Tác giả Nguyễn Thị Thảo ii CÁC TỪ VIẾT TẮT bp BOD BSA cfu COD CS DNA ep-RCA Gal Glc GHF GOS IPTG kb kDa M PCR oNP oNPG pNPG/pNP-gal pNP-fuc rpm SDS-PAGE SOC TIM TLC TE TBE TEMED v/v w/v WT Base pair (cặp bazơ) Biochemical oxygen demand (Nhu cầu oxy sinh hóa) Bovine serum albumin (Albumin huyết thanh bò) Colony forming unit (Đơn vị xác định số lượng tế bào riêng rẽ của vi khuẩn hoặc nấm) Chemical oxygen demand (Nhu cầu oxy hóa học) Cộng sự Deoxyribonucleic acid (Axit deoxyribonucleic) Error prone rolling circle amplification (Sao chép vòng tạo lỗi) Galactose (đường galactozơ) Glucose (đường glucozơ) Glycoside hydrolase family (Họ các enzym thủy phân liên kết glycozit) Galactose-oligossacharide Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside Kilo base (Đơn vị đo kích thước của phân tử ADN) Kilo Dalton (Đơn vị đo khối lượng của phân tử protein) Marker (Thang chuẩn) Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Ortho-Nitrophenyl Ortho-Nitrophenyl--D-galactopyranoside para-Nitrophenyl--D-galactopyranoside para-Nitrophenyl--D-fucopyranoside Round per minute (Vòng/phút) Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (Điện di gel polyacrylamit có bổ sung sodium dodecyl sulfate) Super optimal broth (Môi trường giàu dinh dưỡng cho vi khuẩn) Triose-phosphate isomerase Thin-layer chromatography (Sắc ký bản mỏng) Tris EDTA Tris boric acid EDTA N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamine Volume/volume (Thể tích/thể tích) Weight/volume (Trọng lượng/thể tích) Wild type (Dạng ban đầu) iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... i LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................. ii CÁC TỪ VIẾT TẮT........................................................................................................ iii MỤC LỤC ....................................................................................................................... iv DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................ vii DANH MỤC BẢNG ....................................................................................................... ix DANH MỤC PHỤ LỤC .................................................................................................. xi MỞ ĐẦU.......................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................................................4 1.1 Thông tin chung về -galactosidase ............................................................. 4 1.1.1 Định nghĩa ..................................................................................................... 4 1.1.2 Nguồn gốc và phân loại .................................................................................. 4 1.1.3 Cấu trúc ......................................................................................................... 8 1.1.4 Cơ chế phản ứng .......................................................................................... 15 1.2 Ứng dụng ................................................................................................. 18 1.2.1 Trong công nghiệp chế biến sữa ................................................................... 19 1.2.2 Trong xử lý whey ......................................................................................... 20 1.2.3 Trong y dược................................................................................................ 23 1.2.4 Một số ứng dụng khác .................................................................................. 24 1.3 Tình hình nghiên cứu β-galactosidase trong và ngoài nước ........................ 25 1.3.1 Các hướng nghiên cứu trên thế giới .............................................................. 25 1.3.2 Các nghiên cứu trong nước........................................................................... 31 1.3.3 Hướng nghiên cứu của đề tài ........................................................................ 32 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 35 2.1 Vật liệu và hóa chất .................................................................................. 35 2.1.1 Vật liệu ........................................................................................................ 35 2.1.2 Hóa chất và dung dịch .................................................................................. 36 2.1.3 Thiết bị thí nghiệm ....................................................................................... 38 2.2 Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 38 iv 2.2.1 Tạo đột biến ngẫu nhiên trên gen lacA.......................................................... 38 2.2.2 Xây dựng thư viện các dòng mang gen lacA đột biến ................................... 41 2.2.3 Tạo đột biến điểm và đột biến điểm suy biến ............................................... 42 2.2.4 Xây dựng và phân tích cấu trúc enzyme ....................................................... 43 2.2.5 Sàng lọc hoạt tính -galactosidase từ các dòng mang gen lacA đột biến ....... 43 2.2.6 Tách DNA plasmid ...................................................................................... 44 2.2.7 Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn ............................................................... 45 2.2.8 Điện di agarose ............................................................................................ 45 2.2.9 Xác định trình tự DNA ................................................................................. 45 2.2.10 Biểu hiện và tinh sạch LacA tái tổ hợp ......................................................... 45 2.2.11 Điện di SDS-PAGE ...................................................................................... 46 2.2.12 Xác định hàm lượng protein ......................................................................... 47 2.2.13 Xác định hoạt tính thủy phân của -galactosidase ......................................... 48 2.2.14 Xác định khả năng chuyển hóa glycoside của -galactosidase ...................... 49 2.2.15 Đặc điểm của LacA tự nhiên và đột biến ...................................................... 50 2.2.16 Xử lý số liệu ................................................................................................. 52 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...................................................................................................... 53 3.1 Tạo đột biến ngẫu nhiên............................................................................ 54 3.1.1 Tạo đột biến ngẫu nhiên trên gen lacA.......................................................... 54 3.1.2 Tạo thư viện các dòng mang gen lacA đột biến và sàng lọc hoạt tính ............ 57 3.1.3 Phân tích trình tự các dòng đột biến.............................................................. 59 3.1.4 Xác định điểm đột biến làm thay đổi hoạt tính LacA .................................... 60 3.2 Tạo đột biến điểm suy biến........................................................................ 66 3.2.1 Xác định vùng liên kết cơ chất của LacA ...................................................... 67 3.2.2 Tạo thư viện đột biến điểm suy biến ............................................................. 68 3.2.3 Sàng lọc hoạt tính và chọn dòng ................................................................... 69 3.2.4 Phân tích trình tự các dòng đột biến.............................................................. 69 3.2.5 Tinh sạch và xác định hoạt tính riêng của LacA đột biến điểm suy biến .............. 72 3.3 Đánh giá tính chất lý hóa của các LacA đột biến ........................................ 77 3.3.1 Nhiệt độ hoạt động tối ưu ............................................................................. 78 3.3.2 pH hoạt động tối ưu...................................................................................... 79 3.3.3 Ảnh hưởng của pH đến độ bền LacA tự nhiên và đột biến ............................ 80 v 3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền LacA tự nhiên và đột biến .................... 81 3.3.5 Động học của LacA tự nhiên và đột biến ...................................................... 85 3.3.6 Ảnh hưởng của đột biến đến khả năng tạo oligosaccharide ........................... 86 3.4 Phân tích sự ảnh hưởng của các đột biến đến cấu trúc của LacA ............... 88 3.4.1 Ảnh hưởng của vị trí Ala301 đến cấu trúc của LacA..................................... 88 3.4.2 Ảnh hưởng của vị trí Phe361 đến cấu trúc của LacA .................................... 91 3.4.3 Ảnh hưởng của vị trí Leu373 đến cấu trúc của LacA .................................... 93 CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN ............................................................................................................................. 97 4.1 Tạo đột biến ngẫu nhiên trên gen lacA ...................................................... 97 4.2 Đánh giá ảnh hưởng của các vị trí đột biến tìm được trên LacA................. 98 4.2.1 Ảnh hưởng của axit amin Ala301 ................................................................. 99 4.2.2 Ảnh hưởng của các axit amin dự đoán liên kết với cơ chất ......................... 103 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................................................ 112 CÁC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .......................................................... 113 THESIS ABSTRACT ................................................................................................... 114 TÀI LỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 121 PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 1 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. 10 Cấu trúc -galactosidase của E. coli thuộc họ GHF-2. ................................................................ Hình 1.2. 10 Cấu trúc của -galactosidase từ K. lactis. ................................................................................................ Hình 1.3. 11 So sánh cấu trúc -galactosidase từ người với một số vi sinh vật khác ................................ Hình 1.4. 12 Cấu trúc của -galactosidase từ B. circulans ATCC 31382. ................................................................ Hình 1.5. Cấu trúc không gian 3 chiều và vùng trung tâm hoạt động của LacA. ................................ 14 Hình 1.6. 16 Động học phản ứng thủy phân lactose của -galactosidase................................................................. Hình 1.7. Động học phản ứng thủy phân lactose của -galactosidase với hai axit glutamic 17 trong trung tâm hoạt động. ................................................................................................................................ Hình 1.8. Sự tổng hợp oligosaccharide.................................................................................................22 Hình 1.9. Sơ đồ so sánh phương pháp error prone-RCA với các phương pháp đột biến ngẫu nhiên khác. ................................................................................................................................ 33 Hình 2.1. Cơ chế tạo đột biến ngẫu nhiên bằng sao chép lỗi vòng DNA................................................................. 40 Hình 2.2. Các bước trong quá trình tạo đột biến định hướng. ................................................................ 42 Hình 2.3. Đường chuẩn hàm lượng albumin huyết thanh bò theo Bradford................................. 48 Hình 2.4. 49 Sự thủy phân của oNPG bởi -galactosidase................................................................................................. Hình 2.5. Đồ thị Lineawever-Burk. ................................................................................................................................ 51 Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm plasmid pELacA sau phản ứng ep-RCA. ................................................................ 55 Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid pELacA từ các dòng trong thư viện đột biến ngẫu nhiên bằng BamHI và NotI ................................................................................................ 57 Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm PCR khuôn pELacA với các cặp mồi đột biến. ................................ 60 Hình 3.4A. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Glu62 trên LacA ................................ 61 Hình 3.4B. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Arg77 trên LacA................................ 61 Hình 3.4C. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Ala191 trên LacA ................................ 62 Hình 3.4D. 62 Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin A301 trên LacA ................................ Hình 3.4E. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Phe361 trên LacA................................ 62 Hình 3.4F. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Ala429 trên LacA ................................ 63 Hình 3.4G. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Ala524 trên LacA ................................ 63 Hình 3.5. SDS-PAGE protein tổng số của các dòng đột biến điểm biểu hiện LacA. ................................ 64 Hình 3.6. SDS-PAGE LacA tinh sạch từ các dòng đột biến điểm................................................................. 64 Hình 3.7. Kết quả dự đoán các vị trí axit amin tương tác với cơ chất theo chương trình 67 SWISS-MODEL................................................................................................................................. Hình 3.8. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại khuôn pElacA với các cặp mồi đột biến................................. 68 vii Hình 3.9. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Ala301 trên LacA-WT và các LacA đột biến................................................................................................................................. 70 Hình 3.10. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Leu373 trên LacA-WT 72 và các LacA đột biến................................................................................................................................. Hình 3.11. SDS-PAGE protein tổng số của một số dòng đột biến điểm biểu hiện LacA. ................................ 73 Hình 3.12. SDS-PAGE LacA tinh sạch từ một số dòng đột biến điểm................................................................. 74 Hình 3.13. Nhiệt độ hoạt động tối ưu của LacA-WT và các LacA đột biến. ................................................................ 78 Hình 3.14. pH hoạt động tối ưu của LacA-WT và các LacA đột biến. ................................................................ 79 Hình 3.15. Ảnh hưởng pH đến độ bền LacA-WT và các LacA đột biến ở pH 4. ................................ 81 Hình 3.16. 82 Độ bền của LacA-WT và các LacA đột biến ở 45 và 50C. ................................................................ Hình 3.17. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính LacA và các đột biến. ................................ 85 Hình 3.18A. Sắc ký bản mỏng sản phẩm chuyển hóa của LacA-WT và các LacA đột biến tại vị trí 301. ................................................................................................................................................................ 87 Hình 3.18B. Sắc ký bản mỏng sản phẩm chuyển hóa của LacA-WT và các LacA đột biến tại 88 vị trí Phe361 và Leu373. ................................................................................................................................ Hình 3.19. Một phần cấu trúc bậc hai của LacA-WT và LacA đột biến ở vị trí Ala301................................. 89 Hình 3.20. Mối tương tác với cơ chất trong vùng xúc tác của LacA-WT và các đột biến tại 90 Ala301................................................................................................................................................................. Hình 3.21. Một phần cấu trúc bậc hai của LacA-WT và LacA đột biến Phe361Tyr................................. 91 Hình 3.22. Kết quả phân tích cấu trúc 3D của LacA-WT và LacA-361Tyr. ................................................................ 92 Hình 3.23. Kết quả phân tích mối tương tác với cơ chất trong vùng trung tâm LacA-WT và LacA-361Tyr. ................................................................................................................................ 92 Hình 3.24. Một phần cấu trúc bậc hai của LacA-WT và LacA đột biến tại Leu373................................. 94 Hình 3.25. Kết quả phân tích mối tương tác với cơ chất trong vùng trung tâm LacA-WT và LacA đột biến tại Leu373................................................................................................................................. 95 Hình 4.1. Sự phân bố của các đột biến nucleotide trên gen lacA................................................................. 97 Hình 4.2. 100 Trình tự một phần của -galactosidase thuộc họ 42 từ các loài khác nhau. ................................ viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. 6 Nguồn -galactosidase từ vi sinh vật................................................................................................ Bảng 1.2. 15 Độ tương đồng về trình tự axit amin của LacA với một số -galactosidase khác................................ Bảng 1.3. 15 Các vị trí axit amin của LacA được dự đoán liên kết với cơ chất ................................................................ Bảng 1.4. Tính chất của một số -galactosidase từ vi sinh vật ................................................................19 Bảng 1.5. β-Galactosidase hoạt động ở nhiệt độ thấp và độ bền nhiệt................................................................ 25 Bảng 2.1. Các cặp mồi tạo đột biến điểm ............................................................................................................................ 35 Bảng 2.2. Các cặp mồi đột biến điểm suy biến................................................................................................ 36 Bảng 2.3. Các hóa chất thí nghiệm chính ............................................................................................................................ 36 Bảng 2.4. Thành phần các loại đệm và dung dịch................................................................................................ 37 Bảng 2.5. Các thiết bị thí nghiệm................................................................................................................................ 38 Bảng 2.6. Thành phần gel cô và gel tách ............................................................................................................................. 47 Bảng 2.7. Quan hệ giữ 1/V và 1/[S] ................................................................................................ 51 Bảng 3.1. 55 Ảnh hưởng của nồng độ MnCl2 đến khả năng khuếch đại DNA trong phản ứng RCA ............................. Bảng 3.2. Tần suất đột biến nucleotide trên gen lacA ở các nồng độ MnCl2 khác nhau ................................ 56 Bảng 3.3. Các dạng đột biến nucleotide trong phản ứng RCA ở nồng độ 1,5 mM MnCl2................................ 56 Bảng 3.4. Sàng lọc hoạt tính LacA của các dòng có khả năng mang gen lacA đột biến................................ 58 Bảng 3.5. 59 Hoạt tính LacA còn lại của một số dòng LacA đột biến sau khi ủ ở 50C ................................ Bảng 3.6. Các axit amin đột biến của LacA từ một số dòng có hoạt tính thay đổi so với dòng ban đầu ................................................................................................................................................................ 59 Bảng 3.7 Các bước tinh sạch LacA-WT và các LacA đột biến ngẫu nhiên từ E. coli JM109(DE3) ................................................................................................................................ 65 Bảng 3.8. Hoạt tính của LacA ban đầu và LacA đột biến................................................................................................ 66 Bảng 3.9. Sàng lọc hoạt tính các dòng đột biến ................................................................................................ 69 Bảng 3.10. 71 Đột biến thay thế axit amin khác nhau tại một số vị trí trên LacA................................................................. Bảng 3.11. Tinh sạch LacA-WT và các LacA đột biến điểm suy biến từ E. coli JM109(DE3)................................ 75 Bảng 3.12. Hoạt tính đặc hiệu của LacA ban đầu và LacA đột biến với cơ chất oNPG................................ 77 Bảng 3.13. Độ bền pH của LacA-WT và các LacA đột biến............................................................................................. 80 Bảng 3.14. Thời gian bán hủy của LacA-WT và các LacA đột biến ................................................................ 84 Bảng 3.15. Các thông số động học của LacA-WT và đột biến với cơ chất oNPG................................86 Bảng 3.16. Sự thay đổi số lượng liên kết với cơ chất và ion kim loại của các axit amin trong vùng trung tâm xúc tác của LacA đột biến tại vị trí Ala301 ................................................................ 89 Bảng 3.17. So sánh sự tương tác của các axit amin được dự đoán liên kết với cơ chất ở LacA 90 ix đột biến tại Ala301 ................................................................................................................................ Bảng 3.18. So sánh sự tương tác của các axit amin được dự đoán liên kết với cơ chất khi Tyr thay thế cho Phe ở vị trí 361 ................................................................................................................................ 93 Bảng 3.19. Sự thay đổi số lượng liên kết với cơ chất và ion kim loại của các axit amin trong 93 vùng trung tâm xúc tác của LacA đột biến tại vị trí Phe361................................................................ Bảng 3.20. Sự thay đổi số lượng liên kết với cơ chất và ion kim loại của các axit amin trong vùng trung tâm xúc tác của LacA đột biến tại vị trí 373................................................................ 94 Bảng 3.21. So sánh sự tương tác của các axit amin được dự đoán liên kết với cơ chất khi Tyr 95 thay thế cho Phe ở vị trí 373 ................................................................................................................................ x DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục 1. Trình tự nucleotide thay đổi tại vị trí 120 trên gen lacA của một số dòng đột biến ................................ 1 Phụ lục 2. Trình tự nucleotide thay đổi tại vị trí W331 trên gen lacA của một số dòng đột biến ................................ 1 Phụ lục 3. Trình tự nucleotide thay đổi tại vị trí 361 trên gen lacA ................................................................ 2 Phụ lục 4. Trình tự nucleotide thay đổi tại vị trí 371, 373 và 374 của một số dòng đột biến................................ 2 Phụ lục 5. 3 Hoạt tính đặc hiệu của LacA ban đầu và LacA đột biến với cơ chất oNPG................................ Phụ lục 6. 3 Nhiệt độ hoạt động tối ưu của LacA-WT và các LacA đột biến ................................................................ Phụ lục 7. pH hoạt động tối ưu của LacA-WT và các LacA đột biến ................................................................ 4 Phụ lục 8. Độ bền pH của LacA-WT ................................................................................................................................ 5 Phụ lục 9. Độ bền pH của LacA đột biến A301E................................................................................................ 6 Phụ lục 10. Độ bền pH của LacA đột biến A301Y ................................................................................................ 7 Phụ lục 11. Độ bền pH của LacA đột biến A301V ................................................................................................ 8 Phụ lục 12. Độ bền pH của LacA đột biến F361Y................................................................................................ 9 Phụ lục 13. Độ bền pH của LacA đột biến L373C ................................................................................................ 10 Phụ lục 14. Độ bền pH của LacA đột biến L373M................................................................................................ 11 Phụ lục 15. 12 Độ bền nhiệt của LacA-WT và các LacA đột biến ở 30 và 40C ................................................................ Phụ lục 16. Độ bền nhiệt của LacA-WT ở các nồng độ cơ chất khác nhau ................................................................ 14 Phụ lục 17. 15 Độ bền nhiệt của LacA-301E ở các nồng độ cơ chất khác nhau ................................................................ Phụ lục 18. Độ bền nhiệt của LacA-301V ở các nồng độ cơ chất khác nhau................................................................ 16 Phụ lục 19. Độ bền nhiệt của LacA-301Y ở các nồng độ cơ chất khác nhau................................................................ 17 Phụ lục 20. Độ bền nhiệt của LacA đột biến Y361F ở các nồng độ cơ chất khác nhau ................................ 18 Phụ lục 21. Độ bền nhiệt của LacA đột biến L373C ở các nồng độ cơ chất khác nhau ................................ 20 Phụ lục 22. Độ bền nhiệt của LacA đột biến L373M ở các nồng độ cơ chất khác nhau ................................ 21 Phụ lục 23. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính của LacA-WT và biến thể ................................ 22 xi 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề -Galactosidase (hay còn gọi là lactase), thuộc nhóm các enzyme chuyển hóa saccharide, cắt các gốc -D-galactose từ đầu không khử của các -galactoside galactoside của các poly- và oligosaccharide hoặc các sản phẩm chuyển hóa bậc hai. Enzyme này phổ biến trong tự nhiên và được tìm thấy ở vi sinh vật, thực vật, động vật và người. Trong đó, -galactosidase được sinh tổng hợp chủ yếu từ vi sinh vật như nấm men, nấm mốc và vi khuẩn và đây cũng là nguồn enzyme có giá trị thương mại hơn so với từ thực vật và động vật vì dễ thao tác, tốc độ sinh trưởng nhanh và năng suất tổng hợp cao. -Galactosidase được ứng dụng nhiều trong y dược, môi trường, công nghệ sinh học và đặc biệt là công nghiệp chế biến sữa. Với 75% dân số trên thế giới thiếu hụt enzyme lactase để phân giải lactose của sữa, nên đây được xem là một ứng dụng quan trọng của -galactosidase trong ngành công nghiệp này. Ngoài ra galactosidase còn được bổ sung vào quá trình lên men bơ sữa để tránh sự kết tinh của lactose ở nhiệt độ thấp và tăng độ ngọt cho sản phẩm. Đặc biệt gần đây, galactosidase đã được khai thác mạnh vào việc sản xuất thực phẩm chức năng là tổng hợp galacto-oligosaccharide (GOS) nhờ hoạt tính chuyển gốc glycosyl trong quá trình thủy phân lactose trong sữa để tạo thành các oligosaccharide. GOS được sử dụng như nguồn thức ăn không tiêu hóa (prebiotic) để kích thích hệ vi khuẩn hữu ích đã hiện diện trong đường ruột. Để đáp ứng nhu cầu trong ngành công nghiệp này, -galactosidase từ rất nhiều nguồn vi sinh vật đã được nghiên cứu khai thác. Trong số này -galactosidase từ B. subtilis cũng rất được chú ý bởi khả năng hoạt động tối ưu trong khoảng pH 6-7, bền ở nhiệt độ 30-40C rất thích hợp cho ứng dụng thủy phân lactose trong sữa cũng như trong các sản phẩm chế biến khác từ sữa. Đây cũng là một enzyme có tiềm năng để ứng dụng trong một số lĩnh vực khác và B. subtilis cũng đã được biết là một chủng an toàn được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm. 2 Bên cạnh đó, để chủ động hơn trong việc ứng dụng cũng như lĩnh vực ứng dụng, ngoài việc sàng lọc và tuyển chọn vi sinh vật sinh tổng hợp các enzyme mới có hiệu suất xúc tác cao và tính chất như mong đợi, sự phát triển của công nghệ DNA cũng cho phép chúng ta có thể chủ động hơn trong việc cải biến protein/enzyme để nâng cao hiệu suất xúc tác cũng như phát triển các tính chất mới của enzyme. Phương pháp tạo đột biến ngẫu nhiên trong in vitro hoặc in vivo cùng với việc lựa chọn di truyền và phương pháp sàng lọc nhanh, là những công cụ mạnh để phát triển enzyme với những đặc tính mới so với ban đầu. Từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu vai trò của một số gốc axit amin đối với tính chất của β-galactosidase từ Bacillus subtilis VTCC-DVN-12-01 phân lập ở Việt Nam bằng kỹ thuật ep-RCA và đột biến điểm định hướng”. 2. Mục đích nghiên cứu - Xác định vai trò của một số axit amin quan trọng của -galactosidase (LacA) từ B. subtilis VTCC-DVN-12-01. - Tìm được LacA đột biến có tính chất mới so với enzyme ban đầu. 3. Nội dung nghiên cứu - Tạo đột biến ngẫu nhiên gen (lacA) mã hóa -galactosidase từ B. subtilis VTCC DVN-12-01 bằng phương pháp ep-RCA (error prone rolling circle amplification, sao chép lỗi DNA vòng) và sàng lọc các dòng mang gen lacA đột biến có hoạt tính tăng hoặc có các tính chất mới như nhiệt độ hoạt động, độ bền nhiệt độ so với LacA ban đầu. - Sử dụng chương trình dự đoán cấu trúc protein/enzyme, kết hợp với so sánh trình tự axit amin với các -galactosidase trong cùng họ đã được xác định cấu trúc để dự đoán một số axit amin quan trọng tham gia trực tiếp trong quá trình thủy phân cơ chất của LacA để từ đó tạo đột biến điểm định hướng nhằm tạo ra các LacA có các tính chất mới so với enzyme ban đầu. 3 4. Những đóng góp mới của luận án (i) Xây dựng được thư viện đột biến ngẫu nhiên gen lacA mã hóa betagalactosidase của B. subtilis VTCC-DVN-12-01 bằng phương pháp ep-RCA với tần suất đột biến đạt 2,7 đột biến/kb. (ii) Xác định được 6 vị trí axit amin quyết định đến hoạt tính của LacA gồm Arg120, Asn158, Trp331, Glu371, Lys372 và His374. (iii) Xác định được một số thay đổi axit amin ở vị trí Ala301, Phe361 làm tăng độ bền LacA và một số thay đổi tại vị trí Leu373 làm tăng nhiệt độ hoạt động của LacA. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Về khoa học: Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp dẫn liệu khoa học về phương pháp tạo đột biến ngẫu nhiên trên gen bằng phương pháp lỗi DNA vòng, đột biến điểm suy biến. Kết quả cũng cung cấp thông tin về vai trò quan trọng của một số axit amin của -galactosidase từ B. subtilis VTCC DVN-12-01 ảnh hưởng đến hoạt tính và tính chất của enzyme. Về ý nghĩa thực tiễn: Những kết quả thu được có thể áp dụng để cải biến các β-galactosidase khác trong cùng họ enzyme thủy phân liên kết glycoside GHF-42 (Glycoside Hydrolase Family 42) nhằm thay đổi hoạt tính cũng như phát triển các tính chất mới của enzyme. 4 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Thông tin chung về -galactosidase 1.1.1 Định nghĩa -Galactosidase (-D-galactohydrolase, E.C.3.2.1.23), thuộc nhóm các enzyme chuyển hóa saccharide trong họ các enzyme thủy phân, cắt các gốc -D-galactose từ đầu không khử của các -galactoside (CAZy, http://www.cazy.org/). Ngoài ra, β-galactosidase còn được gọi là enzyme tiêu hóa lactose hay lactase có mặt trong ruột non ở hầu hết động vật có vú giúp thủy phân lactose (Järvelä et al., 2009). 1.1.2 Nguồn gốc và phân loại 1.1.2.1 Nguồn gốc -Galactosidase phân bố rộng rãi ở vi sinh vật, thực vật, động vật và người. Ở thực vật enzyme này có thể ở dạng hòa tan hoặc bám vào thành tế bào ở một số mô, chúng phân giải các cơ chất như glycoprotein, glycolipid, flavonoid và alkaloid. -Galactosidase đầu tiên ở thực vật được tìm thấy là ở những cây họ hoa hồng như mơ, đào, táo (Wallenfels and Malhotra, 1961). Gần đây, người ta cũng tìm thấy enzyme này ở một số hệ thực vật khác và các gen mã hóa tương tự nhau hoặc có độ tương đồng cao. Một số nghiên cứu về các quá trình sinh học đã cho thấy βgalactosidase tham gia vào sự sinh trưởng của tế bào (Dopico et al., 1990; Gomez et al., 1995), quá trình chín của quả (Ali et al., 1995; Carey et al., 1995) và huy động khả năng dự trữ, nảy mầm của hạt (Buckeridge and Reid, 1994; Alcântara et al., 1999; Kim et al., 2003). Chúng cũng liên quan đến việc giải phóng năng lượng dự trữ trong quá trình sinh trưởng nhanh, giải phóng galactose tự do trong chu trình chuyển hóa bình thường của galactolipid, glycoprotein và trong việc tạo thành của tế bào (Smith and Gross, 2000). 5 Ở động vật, người ta tìm thấy β-galactosidase ở ruột cá rô phi (Taniguchi and Takano, 2004), ở động vật có vú như dê (Gaur et al., 2000) và người. Chúng có nhiều ở thành ruột non của hầu hết động vật có vú và người, đặc biệt là ở trẻ em hàm lượng enzyme cao hơn vì chức năng chính là phân giải lactose. Ở vi sinh vật, β-galactosidase được tìm thấy ở nấm men, nấm mốc và vi khuẩn. Nguồn enzyme từ vi khuẩn có giá trị thương mại hơn so với từ thực vật và động vật vì dễ thao tác, tốc độ sinh trưởng nhanh và năng suất tổng hợp cao. Một lượng lớn các loài vi sinh vật đã được biết đến như một nguồn cung cấp β-galactosidase thương mại tiềm năng (Bảng 1.1) (Panesar et al., 2010). β-Galactosidase có thể được tổng hợp ở nhiều loại vi khuẩn khác nhau, nhưng trong đó Streptococcus thermophilus và Bacillus stearothermophilus được coi như nguồn enzyme tiềm năng. Ở nấm mốc β-galactosidase thường hoạt động tối ưu trong khoảng pH từ 2,5 đến 5,4. Do đó, chúng rất thích hợp cho công nghệ sản xuất các sản phẩm sữa lên men. Nhiệt độ tối ưu cho các enzyme này rất cao và có thể được ứng dụng trong điều kiện sản xuất ở nhiệt độ lên tới 50C. Một số nguồn enzyme từ nấm mốc như Asperilus niger và Asperilus oryae đã được sử dụng trong công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa. Đặc biệt enzyme từ Crytococcuss laurentii và Sterigmatomyces elviae có hoạt tính chuyển gốc galactosyl cao do vậy được ứng dụng để sản xuất galacto-oligosaccaride từ lactose (Panesar et al., 2010). Nấm men được coi là một trong những nguồn tổng hơp -galactosidase quan trọng trong ngành công nghiệp. Với pH tối ưu trung tính, đây là điều kiện rất thích hợp cho quá trình thủy phân lactose trong sữa và được chấp nhận rộng rãi vì tính an toàn khi sử dụng trong công nghiệp thực phẩm. Nhiều công trình nghiên cứu sản xuất -galactosidase từ các chủng nấm men khác nhau được thực hiện vì tiềm năng ứng dụng cao của nó. Các sản phẩm thương mại -galactosidase từ nguồn nấm men như Maxilact (Hà Lan), Lactase (Ý) được tách chiết từ Kluyveromyces lactis và Lactozym (Đan Mạch) từ Kluyveromyces fragilis (Roy and Gupta, 2003). 6 Bảng 1.1. Nguồn -galactosidase từ vi sinh vật Nguồn: (Panesar et al., 2010) Nguồn Vi sinh vật Alicyclobacillus acidocaldarius, Arthrobacter sp. Bacillus acidocaldarius, B. circulans, B. coagulans, B. subtilis, B. megaterum, B. stearothermophilus Bacteriodes polypragmatus Bifidobacterium bifidum, B. infantis Clostridium acetobutylicum, C. thermosulfurogens Corynebacterium murisepticum Enterobacter agglomerans, E. cloaceae, Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L. delbrueckii, L. helviticus, L. kefiranofaciens, L. lactis, L. sporogenes, L. themophilus, Leuconostoc citrovorum Pediococcus acidilacti, P. pento Propioionibacterium shermanii Pseudomonas fluorescens, Pseudoalteromonas haloplanktis Streptococcus cremoris, S. lactis, S. thermophius Sulfolobus solfatarius Thermoanaerobacter sp. Thermus rubus, T. aquaticus Trichoderma reesei, Vibrio cholera, Xanthomonas campestris Alternaria alternate, A. palmi Aspergillus foelidis, A. fonsecaeus, A. fonsecaeus, A. carbonarius, A. oryzae Auerobasidium pullulans, Curvularia inaequalis Fusarium monilliforme, F. oxysporum Nấm mốc Mucor meihei, M. pusillus Neurospora crassa Penicillum canescens, P. chrysogenum, P. expansum Saccharopolyspora rectivergula, Scopulariapsis sp. Streptomyces violaceus Bullera singularis Nấm men Candida pseudotropicalis Saccharomyces anamensis, S. lactis, S. fragilis Kluyveromyces bulgaricus, K. fragilis, K. lactis, K. marxianus 7 1.1.2.2 Phân loại Theo Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử Quốc tế (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology - NC-IUBMB), enzyme được phân lớp (EC – Enzyme Classification) dựa vào phản ứng hóa học và đặc hiệu cơ chất của enzyme. Theo tiêu chí này, β-galactosidase thuộc phân lớp EC 3.2.1.23: - Lớp: enzyme thủy phân (3), - Phân lớp: glycosylase (2), - Dưới phân lớp: glycosidase - hydrolysing O-glycosyl (1), - Enzyme: -glycoside (23). Tuy nhiên, hệ thống EC không sử dụng cấu trúc hoặc thông tin tiến hóa và ít sử dụng cho phân loại enzyme khi cơ chất phù hợp chưa biết. Do đó Henrissat đã đưa ra một hệ thống phân loại dựa vào trình tự axit amin, tính kỵ nước và cơ chế phản ứng (Henrissat, 1991). Theo tiêu chí này, β-galactosidase hiện nay được chia thành 4 họ thủy phân glycoside (GHF, Glycoside Hydrolase Family) là 1, 2, 35 và 42 dựa vào sự tương đồng về chức năng. Tuy nhiên, hiện nay trên hệ thống CAZy (Carbohydrate-active Enzymes), ngoài 4 họ trên, β-galactosidase còn có thêm nhóm mới trong họ GHF-59 là β-galactosidase từ Clostridium cellulolyticum. Mặc dù vậy, sự phân nhóm này cũng chưa rõ ràng vì enzyme này có thể thủy phân nhiều cơ chất khác nhau như cellobiose, cellotriose, cellotetraose, p-nitrophenyl-beta- glucopyranoside, lactose và o-nitrophenyl-beta-galactopyranoside, trong đó hiệu suất xúc tác Kcat/Km với cơ chất cellodextrin cao hơn 2-4 lần so với lactose và Kcat/Km với cellodextrin và cũng cao hơn cellobiose, cellotriose, cellotetraose nên được đề nghị cellodextrin glucohydrolase (EC 3.2.1.74), họ GHF-1 (Liu et al., 2010). GHF-42 đã được công nhận là một nhóm khác biệt vào 1993. Dựa vào trình tự, các enzyme GHF-42 có một cấu trúc trung tâm Triose phosphate isomerase (TIM) (α/β)8 và axit amino đóng vai trò chất cho proton và ái nhân nằm trên các chuỗi β số 4 và 7 của trung tâm TIM nên những enzyme này thuộc dưới họ 4/7 (Jenkins et al.,
- Xem thêm -