Tài liệu Nghiên cứu và sử dụng chế phẩm vi sinh vật phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc ở nghệ an

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ------------------------- HOÀNG CÔNG SÁNG Tên ñề tài: NGHIÊN CỨU CHẾ PHẨM VI SINH VẬT PHÒNG TRỪ BỆNH HÉO XANH VI KHUẨN HẠI LẠC Ở NGHỆ AN LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số : 606210 Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Như Kiểu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………….1 LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành bản luận văn này, ngoài nỗ lực của bản thân, tôi còn nhận ñược rất nhiều sự quan tâm giúp ñỡ của thầy cô, ñồng nghiệp, bạn bè và người thân. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Như Kiểu - Viện phó Viện Thổ nhưỡng Nông Hoá, ñã tận tình hướng dẫn tôi về khoa học cũng như suốt quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Ban ðào tạo Sau ðại học Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ khoa học Bộ môn Vi sinh vật Viện Thổ nhưỡng Nông Hoá ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện các nghiên cứu ñể hoàn thành luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn ñến các cán bộ công nhân viên Trung tâm Nghiên cứu Phân bón và Dinh dưỡng cây trồng ñã tạo mọi ñiều kiện cho tôi trong quá trình công tác và thực hiện luận văn này. Tôi chân thành cảm ơn các hộ nông dân tại xã Nghi Long, huyện Nghi Lộc và xã Thọ Hợp, huyện Quỳ Hợp, tỉnh Nghệ An ñã tạo ñiều kiện, giúp ñỡ tôi thực hiện các thí nghiệm ñồng ruộng tại ñây. Hà Nội, ngày 20 tháng 4 năm 2010 Tác giả luận văn Hoàng Công Sáng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………….2 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan, kết quả của luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa từng ñược công bố trong bất cứ công trình nào khác. Các kết quả nghiên cứu là nỗ lực của chính tác giả, các trích dẫn của các tác giả khác và ñồng nghiệp ñều ñược chú thích rõ ràng. Tác giả luận văn Hoàng Công Sáng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………….3 MỤC LỤC Trang TRANG PHỤ BÌA .........................................................................................i LỜI CẢM ƠN...............................................................................................ii LỜI CAM ðOAN ........................................................................................iii MỤC LỤC.................................................................................................... iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT............................................................. vi DANH MỤC CÁC BẢNG..........................................................................vii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ SƠ ðỒ............................................... ix MỞ ðẦU ........................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của ñề tài ............................................................................. 10 2. Mục tiêu của ñề tài...................................................................................... 12 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài ................................................... 12 4. ðối tượng và phạm vi nghiên cứu của ñề tài ............................................. 13 CHƯƠNG I – TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC ............. 14 CỦA ðỀ TÀI................................................................................................... 14 1.1. Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu ...................................................... 14 1.2. Một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan ñến ñề tài...... 15 1.2.1. Kết quả nghiên cứu trên thế giới ..................................................... 15 1.2.2. Kết quả nghiên cứu trong nước ....................................................... 19 CHƯƠNG II – VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ................... 24 NGHIÊN CỨU................................................................................................ 24 2.1. Vật liệu nghiên cứu................................................................................ 24 2.2. Nội dung nghiên cứu.............................................................................. 24 Theo TCVN 5297 - 1995; 5960-95; 10TCN 367-99. ................................ 25 2.3.3. Phương pháp phân lập Ralstonia solanacearum ............................. 25 2.3.4. Phương pháp xác ñịnh ñộc tính của các chủng R.solanacearum ..... 26 2.3.5. Phương pháp xác ñịnh ñộ an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật ñối kháng .................................................................................................. 27 2.3.6. Phương pháp xác ñịnh hoạt tính ñối kháng của các chủng vi sinh vật ñối kháng ñối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum ................................. 28 2.3.7. ðánh giá hoạt tính ñối kháng của các chủng vi khuẩn ñối kháng với R.solanacearum trong ñiều kiện nhà lưới ................................................. 28 2.3.8. Phương pháp bố trí thí nghiệm ñồng ruộng diện hẹp ...................... 29 2.3.9. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh ñối kháng30 2.3.10. Xử lý số liệu .................................................................................. 31 CHƯƠNG III – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................... 32 3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng R. solanasearum từ các mẫu bệnh thu thập ñược và xác ñịnh ñộc tính của chúng..................................................... 32 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………….4 3.1.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn R. solanacearum ......................... 32 3.1.2. ðánh giá ñộc tính của những chủng R. solanacearum phân lập ñược ................................................................................................................. 35 3.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn ñối kháng với R. solanacearum và xác ñịnh hoạt tính ñối kháng ............................................................................... 36 3.2.1. Tuyển chọn vi khuẩn ñối kháng từ nguồn có sẵn............................... 36 3.2.2. Nghiên cứu các ñặc ñiểm sinh học và phân loại các chủng vi khuẩn ñối kháng ......................................................................................................... 31 3.2.3. ðánh giá ñộc tính của các chủng vi khuẩn ñối kháng trên cây trồng ......................................................................................................................... 32 3.2.4. ðánh giá ñộc tính của các chủng vi khuẩn ñối kháng trên chuột bạch ......................................................................................................................... 36 3.3. Nghiên cứu quy trình sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh vật phòng chống bệnh héo xanh cây lạc ........................................................................... 40 3.3.1. Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật ñối kháng bệnh héo xanh cây lạc ............................................................................................... 40 3.3.2. Sản xuất chế phẩm vi sinh vật ñối kháng bệnh héo xanh lạc............ 50 3.3.3. ðánh giá chế phẩm vi sinh vật ñối kháng bệnh héo xanh cây lạc trong nhà lưới, phạm vi hẹp ngoài cánh ñồng và mô hình trình diễn ................ 51 3.3.4. ðánh giá mức ñộ sống sót của các chủng vi sinh vật trong chế phẩm ......................................................................................................................... 60 3.3.5. ðánh giá hiệu quả kinh tế của chế phẩm ngoài ñồng ruộng ............ 62 3.3.6. Quy trình sử dụng chế phẩm vi sinh phòng trừ bệnh héo xanh lạc... 64 CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................... 66 4.1. Kết luận ................................................................................................. 66 4.2. Kiến nghị ............................................................................................... 66 PHỤ LỤC ........................................................................................................ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 74 Tiếng Việt..................................................................................................... 87 Tiếng Anh..................................................................................................... 89 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………….5 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Kí hiệu VK VKðK VSV KB TTC CT ðC NXB ðKVK & N IAA VƯC KTSTTV PG VPGKT Chữ viết tắt Vi khuẩn Vi khuẩn ñối kháng Vi sinh vật Môi trường King B Môi trường TTC Công thức ðối chứng Nhà xuất bản ðối kháng vi khuẩn và nấm Idol Acetic Acid Vòng ức chế vi khuẩn/nấm gây bệnh Kích thích sinh trưởng thực vật Phân giải Vòng phân giải kitin DANH MỤC CÁC BẢNG Nội dung Trang TT 1 Bảng 3.1: ñặc ñiểm sinh học ñiển hình của một số chủng R. 24 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………….6 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 solanacearum thu thập ñược Bảng 3.2: Các chủng R. solanacearum có ñộc tính mạnh với lạc Bảng 3.3: ðặc ñiểm hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn ñối kháng lựa chọn Bảng 3.4: Hoạt lực ñối kháng của các chủng vi khuẩn lựa chọn với vi khuẩn gây bệnh héo xanh lạc Bảng 3.5: ðặc ñiểm sinh học của các chủng vi khuẩn ñối kháng Bảng 3.6: ðánh giá ñộc tính của các chủng vi khuẩn ñối kháng với cây lạc quy mô nhà lưới Bảng 3.7: Tổ hợp các chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh phòng trừ bệnh héo xanh lạc Bảng 3.8: ðánh giá khả năng gây ñộc tính cấp của các chủng vi khuẩn nghiên cứu trên chuột, thí nghiệm sau 24h Bảng 3.9: ðánh giá khả năng gây ñộc bán trường diễn của các chủng vi khuẩn nghiên cứu trên chuột bạch sau 30 ngày Bảng 3.10: Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng ñến sự phát triển của các chủng vi khuẩn Bảng 3.11: Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng ñến hoạt tính ñối kháng của các chủng vi khuẩn Bảng 3.12: Thông số kỹ thuật trong sản xuất sinh khối vi khuẩn (sử dụng sản xuất chế phẩm vi sinh ñối kháng bệnh héo xanh cây lạc) Bảng 3.13: Mật ñộ tế bào của các chủng VKðK trong hai loại môi trường nghiên cứu Bảng 3.14: Mật ñộ của chủng PS1 và BK1 trong thiết bị lên men dung tích 100 lít/mẻ Bảng 3.15: Một số chỉ tiêu chất lượng của chế phẩm vi sinh phòng trừ bệnh héo xanh cây lạc Bảng 3.16: Khả năng hạn chế bệnh héo xanh cây lạc - giống L02 của chế phẩm CP1 (Viện Thổ nhưỡng Nông hoá, vụ hè thu năm 2008) Bảng 3.17: Ảnh hưởng của chế phẩm CP1 ñến sinh trưởng, phát triển và năng suất lạc - giống LO2 ở ñiều kiện nhà lưới (Viện Thổ nhưỡng Nông hoá, vụ hè thu năm 2008) Bảng 3.18: Khả năng hạn chế bệnh héo xanh vi khuẩn của chế phẩm CP1 trên cây lạc - giống MD7 ở ñiều kiện nhà lưới (Viện Thổ nhưỡng Nông hoá, vụ hè thu năm 2008) Bảng 3.19: Ảnh hưởng của chế phẩm CP1 ñến sinh trưởng, phát triển và năng suất lạc - giống MD7 ở ñiều kiện nhà lưới (Viện Thổ nhưỡng Nông hoá, vụ hè thu năm 2008) Bảng 3.20: Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn của chế Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………….7 26 27 31 32 33 34 37 38 41 42 43 44 45 46 52 53 54 55 57 21 22 23 24 25 26 27 phẩm CP1 trên cây lạc - giống L14 tại xã Nghi Long, Nghi Lộc, Nghệ An- vụ xuân năm 2009 Bảng 3.21: Ảnh hưởng của chế phẩm CP1 ñến sinh trưởng, phát triển và năng suất lạc - giống L14 tại xã Nghi Long, Nghi Lộc, Nghệ An- vụ xuân năm 2009 Bảng 3.22: Khả năng hạn chế bệnh héo xanh vi khuẩn của chế phẩm CP1 trên lạc - giống L14 tại xã Thọ Hợp, Quỳ Hợp, Nghệ An- vụ hè thu năm 2009 Bảng 3.23: Ảnh hưởng của chế phẩm CP1 ñến sinh trưởng, phát triển và năng suất lạc - giống L14 tại xã Thọ Hợp, Quỳ Hợp, Nghệ An- vụ hè thu năm 2009 Bảng 3.24: Khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật trong chế phẩm CP1 cho cây lạc sau thời gian bảo quản khác nhau Bảng 3.25: Hoạt lực ñối kháng của các chủng vi sinh vật trong chế phẩm CP1 cho cây lạc sau thời gian bảo quản khác nhau Bảng 3.26: Hiệu quả kinh tế của mô hình bón chế phẩm vi sinh vật ñối kháng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc tại HTX Thọ Sơn - Thọ Hợp, Quỳ Hợp - Nghệ An -Vụ hè thu 2009 Bảng 3.27: Hiệu quả kinh tế của mô hình bón chế phẩm vi sinh vật ñối kháng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc tại xã Nghi Long – Nghi Lộc- Nghệ An - vụ xuân 2009 58 59 60 61 61 62 63 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, BIỂU ðỒ VÀ SƠ ðỒ TT Hình ảnh, biểu ñồ và sơ ñồ Trang 1 Ảnh 3.1: Hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn gây 25 bệnh héo xanh 2 Ảnh 3.2. Hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn ñối 30 kháng 3 Ảnh 3.3. Hình dạng tế bào của một số chủng vi khuẩn ñối kháng 30 ở ñộ phóng ñại 1.000 lần Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………….8 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Ảnh 3.4. Hoạt lực ñối kháng của các chủng vi khuẩn kháng R. solanacearum Ảnh 3.5: ðánh giá hoạt lực ñối kháng vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh lạc Ảnh 3.6. Nuôi cấy các chủng vi khuẩn tuyển chọn trên cùng môi trường dinh dưỡng Ảnh 3.7: ðánh giá tính ñộc của hỗn hợp các chủng vi khuẩn ñối kháng trong chế phẩm CP1 trên cây lạc Ảnh 3.8. Ảnh hưởng của hỗn hợp các chủng vi khuẩn ñối kháng trong chế phẩm CP1 với bệnh héo xanh lạc - giống MD7 Ảnh 3.9. Lô chuột thí nghiệm sau 30 ngày xử lý Ảnh 3.10. Hình ảnh mẫu gan chuột ở công thức thí nghiệm SƠ ðỒ 3.1: QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VSV ðỐI KHÁNG BỆNH HÉO XANH CÂY LẠC Ảnh 3.11. Chế phẩm vi sinh ñối kháng bệnh héo lạc Ảnh 3.12. Ảnh hưởng của chế phẩm VSV ñối kháng với bệnh héo xanh lạc- giống L02 Ảnh 3.13: ðánh giá chế phẩm vi sinh ñối kháng diện hẹp ngoài ñồng ñối với cây lạc Ảnh 3.14: Mô hình ñánh giá chế phẩm vi sinh ñối kháng bệnh héo xanh lạc vụ hè thu năm 2009 tại tại HTX Thọ Sơn - Thọ Hợp, Quỳ Hợp - Nghệ An -Vụ hè thu 2009 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………….9 31 34 35 35 36 39 39 47 51 53 56 59 MỞ ðẦU 1. Tính cấp thiết của ñề tài Lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị dinh dưỡng cao và ý nghĩa kinh tế lớn. Hiện nay lạc ñược trồng phổ biến ở hơn 100 quốc gia trên thế giới với tổng diện tích 24,671 triệu ha, năng suất bình quân ñạt 14 tạ/ha, cho tổng sản lượng là 34 triệu tấn/năm. Ở nhiều nước trên thế giới lạc là mặt hàng ñem lại kim ngạch xuất khẩu cao (ở Xênêgan giá trị từ lạc chiếm ½ tổng thu nhập, 80% giá trị xuất khẩu và con số này ở Nigiêria là 60%. Ở nước ta lạc là sản phẩm quan trọng ñể xuất khẩu và sản xuất dầu ăn (hiện nay nước ta còn phải nhập khẩu) [1], [11]. Năng suất lạc của nước ta so với một số nước trên thế giới còn thấp, năng suất lạc ở Mỹ là 2,99 tấn/ha, Trung Quốc là 2,94 tấn/ha trong khi ñó ở Việt Nam là 1,44 tấn/ha năm 1999 [Nguồn: Production Estimates and Crop Assessment Division, FAS, USDA]. Một trong những nguyên nhân dẫn ñến năng suất lạc của nước ta thấp là do các loại sâu bệnh phá hại. Các loại ñối tượng sâu bệnh hại luôn là cản trở lớn cho hoạt ñộng sản xuất nông nghiệp, chúng không chỉ làm giảm năng suất mà còn ảnh hưởng xấu ñến chất lượng nông sản, làm tăng chi phí sản xuất do các hoạt ñộng phòng trừ chúng. Trong ñó bệnh héo xanh vi khuẩn là một trong những bệnh hại nghiêm trọng làm giảm năng suất lạc. Cùng với hàng loạt các tiến bộ khoa học kỹ thuật ñược áp dụng trong sản xuất, ñặc biệt là các cuộc cách mạng về giống và phân bón, sản xuất nông nghiệp nước ta trong những năm gần ñây ñã phát triển vượt bậc, vươn lên trở thành một trong những nước xuất khẩu hàng ñầu thế giới về lúa gạo, cà phê, ñiều v.v… Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………….10 Tuy vậy, vấn ñề ñặt ra cho sản xuất nông nghiệp của nước ta là ñi ñôi với việc tăng năng suất, vấn ñề chất lượng sản phẩm và vệ sinh an toàn thực phẩm ñang trở nên cấp bách ñược cả xã hội quan tâm. Việc áp dụng biện pháp hóa học trong bảo vệ thực vật ñã gây ra hàng loạt vấn ñề về sức khỏe, về môi trường sinh thái, về ña dạng quần thể sinh vật và cân bằng sinh học tự nhiên [19], [20]. Bệnh héo xanh vi khuẩn (Bacterial wilt disease) hại lạc và nhiều loại cây trồng khác rất phổ biến ở châu Mỹ, châu Phi, châu Úc. Bệnh gây hại nghiêm trọng và là một trở ngại lớn cho sản xuất lạc ở nước ta, Trung Quốc, Inñônêxia, Malayxia, Uganña…Ở nước ta và các nước ðông Nam Á, thiệt hại về năng suất do bệnh gây ra trong khoảng 5 - 80%, trung bình hàng năm từ 10 - 40% [23]. Việc sử dụng các biện pháp phòng trừ bệnh này bằng thuốc hóa học chưa ñem lại hiệu quả mong muốn. Hơn nữa nó còn ảnh hưởng nghiêm trọng ñến các quần thể sinh vật sống trong ñất, ñể lại một lượng tồn dư trong ñất, nước và các sản phẩm nông sản, ảnh hưởng xấu ñến môi trường sinh thái và sức khỏe con người. Theo Trần Thị Lệ Hà và Nguyễn Hữu Thành những loại thuốc có chứa hoạt chất Dimethoat, Fenvalerate, Cypermethrin có thời gian tồn tại trong ñất và trong sản phẩm từ 7 - 10 ngày [6]. Các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước những năm qua ñã chỉ ra rằng một số vi sinh vật có hoạt tính ñối kháng ñối với một số vi khuẩn gây bệnh, kết quả này ñã mở ra khả năng ứng dụng tính ñối kháng trong phòng một số bệnh cho cây trồng [7], [9], [10], [18], [26]. Do vậy việc sử dụng các loại thuốc trừ sâu có nguồn gốc sinh học, trong ñó các loại chế phẩm ñược sản xuất từ các vi sinh vật ñối kháng có nhiều ưu ñiểm như thời gian cách ly ngắn, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………….11 an toàn cho người sử dụng và thân thiện với môi trường ñang ngày càng ñược quan tâm nghiên cứu và phát triển [16]. Trong thời gian qua, các nhà khoa học ñã ñi sâu nghiên cứu ñặc tính ñối kháng của các chủng vi sinh vật trong phòng trừ bệnh héo xanh trên cà chua, ớt, khoai tây ..v…v…và ñạt nhiều kết quả khả quan. Từ khả năng có thể ứng dụng ñặc tính ñối kháng của các vi sinh vật trong phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn nên chúng tôi tiến hành ñề tài “Nghiên cứu và sử dụng chế phẩm vi sinh vật phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc ở Nghệ An”. 2. Mục tiêu của ñề tài Sản xuất ñược chế phẩm vi sinh vật ñối kháng bệnh héo xanh vi khuẩn trên cây lạc. Các chủng vi sinh vật ñuợc ứng dụng ñể sản xuất chế phẩm phải có ñộ an toàn sinh học cao. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài - Ý nghĩa khoa học: Tuyển chọn ñược những chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum có ñộc tính cao ở những ñịa ñiểm tiến hành thu mẫu và nghiên cứu. ðây là các chủng vi khuẩn có ý nghĩa khoa học cho việc nghiên cứu tiếp theo. Tuyển chọn ñược các chủng vi sinh vật có hoạt tính ñối kháng mạnh với bệnh héo xanh trên cây lạc ñể làm vật liệu khởi ñầu nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học phòng trừ một số bệnh phổ biến trong sản xuất lạc nói riêng và sản xuất nông nghiệp nói chung. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………….12 - Ý nghĩa thực tiễn: Phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc có hiệu quả, góp phần giảm thiểu sử dụng thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học trong phòng trừ bệnh héo xanh trên cây lạc, nâng cao năng suất và chất lượng lạc, góp phần làm trong sạch môi trường ở vùng nghiên cứu. 4. ðối tượng và phạm vi nghiên cứu của ñề tài ðối tượng nghiên cứu: bệnh héo xanh vi khuẩn trên các giống lạc ñang trồng phổ biến tại Nghệ An. Thu thập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật ñối kháng từ nguồn gen vi sinh vật có sẵn tại Phòng vi sinh Viện Thổ nhưỡng Nông hóa, từ các mẫu ñất, cây họ cà và vùng rễ cây trồng tại nơi nghiên cứu. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………….13 CHƯƠNG I – TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ðỀ TÀI 1.1. Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu Trong tự nhiên các sinh vật chịu tác ñộng ñồng thời của nhiều yếu tố, về cơ bản là yếu tố vô sinh và yếu tố hữu sinh trong quá trình sinh sống của mình. Yếu tố hữu sinh gồm các cơ thể sống như thực vật, ñộng vật, vi sinh vật và tất cả các mối quan hệ giữa các sinh vật với nhau. Các sinh vật ñều trực tiếp hay gián tiếp ảnh hưởng ñến nhau. Các loài sinh vật luôn luôn tồn tại trong các dạng quan hệ, về cơ bản ñều thuộc năm dạng quan hệ: cạnh tranh, cộng sinh, ký sinh, kìm hãm và vật ăn thịt - con mồi [20]. Quan hệ hãm sinh là kiểu quan hệ mà một sinh vật kìm hãm sự phát triển của một sinh vật khác bằng cách tiết vào môi trường các chất ñộc cho loài khác. Chẳng hạn, một số loài nấm có khả năng tiết ra chất kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn. Khá nhiều loài thực vật cũng có khả năng này, rễ của chúng tiết ra chất gọi là Phytoxit có tác dụng kìm hãm sự phát triển của các loài thực vật khác, ñặc tính này cũng ñã ñược ứng dụng trong thực tế, như việc sử dụng các chất tiết của nấm ñể làm thuốc kháng sinh Penicilin; chế phẩm Bt trong phòng trừ sâu bệnh hại cây nông nghiệp… ðất trồng không chỉ thuần túy là tập hợp của các nguyên tố hóa học, mà ẩn chứa bên trong nó là một thế giới sống vô cùng phong phú và phức tạp. ðất là nơi trú ngụ và sinh sống của hàng triệu loài vi sinh vật khác nhau và ở ñó luôn luôn xẩy ra các phản ứng lý, hóa và sinh học. Thông qua các phản ứng ñó và các hoạt ñộng sống của vi sinh vật ñất trồng mới có ñiều kiện ñể phục hồi và cân bằng thông qua các qui luật của tự nhiên. ðất trồng cũng là Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………….14 nơi tồn tại của nhiều loại vi sinh vật gây bệnh hại cây trồng. ðể phát triển nền nông nghiệp bền vững các nhà khoa học trên thế giới và trong nước ñã và ñang rất quan tâm ñến các giải pháp tổng hợp vừa có tác dụng cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng, vừa có tác dụng cải tạo, bồi bổ ñất cũng như giảm thiểu sự gây hại của các ñối tượng sâu bệnh hại. Một số nghiên cứu của các tác giả ñã chỉ ra nhiều vi sinh vật có khả năng ña hoạt tính sinh học, trong ñó có những vi sinh vật vừa có khả năng tạo nguồn dinh dưỡng cho cây, sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật ñồng thời cũng có khả năng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh vùng rễ cây trồng [21], [31], [33], [34], [35], [36], [37]. Một số nghiên cứu khác cũng ñã chứng minh chế phẩm vi sinh vật làm phân bón nhưng lại có tác dụng hạn chế bệnh do vi khuẩn hoặc nấm gây nên [26], [29], [30], [38], [39]. Các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước ñã mở ra một hướng mới trong công tác phòng trừ bệnh hại, ñó là sử dụng các dạng chế phẩm ñược sản xuất từ các vi sinh vật có hoạt tính ñối kháng. 1.2. Một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan ñến ñề tài 1.2.1. Kết quả nghiên cứu trên thế giới Từ lâu, các nhà khoa học trên thế giới ñã có nhiều công trình nghiên cứu về các loại chế phẩm mang bản chất sinh học ñể phòng trừ nhiều loại sâu bệnh hại cây trồng và ñã ñạt ñược nhiều thành tựu quan trọng, góp phần không nhỏ trong việc nâng cao năng suất cây trồng, giảm tác hại của thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học. Các loại chế phẩm ñược sản xuất từ các loại vi sinh vật khác nhau cũng ñã ñược sản xuất. Ở Mỹ, ñã ứng dụng nấm bạch cương Beauveria globulifera ñể trừ bọ xít hại lúa mì, nấm ñược sản xuất với khối lượng lớn, phát cho các trang trại (Coppel et al…, 1977; Weiser, 1966) [28]. Ngoài ra tiềm năng ñối Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………….15 kháng của các vi sinh vật với nhau cũng ñược các nhà khoa học sử dụng trong công tác bảo vệ thực vật. Người ta ñã thử nghiệm sử dụng nấm Trichoderma ñể trừ bệnh cho cà chua, dưa chuột, ớt, cải tím, rau diếp…Ở Ấn ðộ, nấm T.viride có thể ức chế sự phát triển của bệnh R.solani gây ra trên khoai tây, hiệu lực ức chế tối ña lên ñến 83,4 % (Sing et al, 1991). Năm 1978, Cuppels và cs ñã kết luận rằng, nhiều chủng vi khuẩn có khả năng sản sinh bacteriocin và một số chủng sinh bacteriocin không ñộc có khả năng giảm bệnh héo xanh của cà chua. Bệnh héo xanh do R.solanacearum là một trong 5 bệnh cây trồng thuộc ñối tượng quan tâm nhất của chương trình phòng trừ tổng hợp của FAO (Lê Như Kiểu, 2004). Nó là loại bệnh chịu sự kiểm soát chặt chẽ của kiểm dịch quốc tế, nhất là ở các nước thuộc cộng ñồng Châu Âu. Năm 1892, Halsted là người khởi ñầu nghiên cứu bệnh héo xanh cà chua. Càng về sau này càng có nhiều công trình nghiên cứu về các ñặc ñiểm sinh lý, sinh hoá, di truyền, sinh học phân tử và phân tích genome của vi khuẩn R.solanacearum. Năm 1896, E.F. Smith ñã nghiên cứu bệnh héo xanh do vi khuẩn ở khoai tây, cà chua và cà tím, năm 1909 ông lại phát hiện thấy bệnh này ở thuốc lá. Kelman ñã công bố rằng chính polysacarit ngoại bào tạo ra bởi R.solanacearum là chất gây nên bệnh héo xanh. Cook và Sequeira ñã tách thành công những gen phức tạp ñiều khiển quá trình sinh tổng hợp Exopolisacarits EPS. R.solanacearum tạo ra ít nhất 3 polygalacturonaza ngoại bào. Một endo-PG của pI 9.2 (PehA) ñã ñược tạo ra một lượng lớn khi R.solanacearum phát triển trên môi trường giàu dinh dưỡng, nó thể hiện vai trò chính trong sự phát triển bệnh. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………….16 Năm 1986, Aspiras R.B và Cruz A. R cho rằng Bacillus polymyxa và P. fluorescens có khả năng giảm bệnh héo xanh cà chua ở ñiều kiện nhà kính. Năm 1990, Tanaka và cs ñã phát hiện ñược các thực khuẩn thể không ñộc có vai trò tiềm tàng trong phòng trừ sinh học ñối với R.solanacearum. Năm 1993, Hsu ñã cho rằng cải tạo ñất bằng một hỗn hợp theo công thức ammonium sulphat, bột xương, bột hải ly, cua, glixerin, sỉ silic và valin ñã làm tăng tần xuất tạo khuẩn lạc của các chủng P.fluorescens ở ñầu rễ, chính vì vậy ñã làm tăng khả năng phòng chống bệnh héo xanh cho cây trồng ở các thực nghiệm trong chậu. Năm 1993, Elphinstone và Aley ñã chỉ ra một loài khác là P.cepacia ñược phân lập từ rễ ngô có khả năng ñối kháng với vi khuẩn gây bệnh héo xanh trong phòng thí nghiệm và trong chậu. Trigalet, Frey và Demery ñã ñưa ra một bức tranh toàn cảnh gồm các công trình nghiên cứu của nhiều tác giả về biện pháp phòng trừ sinh học bệnh héo xanh do R.solanacearum như sau: Khi sử dụng các biện pháp phòng trừ sinh học ñều cho thấy mức ñộ giảm quần thể R.solanacearum một cách hiệu quả, mặc dù hầu hết các kết quả ñều ở phạm vi phòng thí nghiệm, nhà kính và quy mô ñồng ruộng nhỏ. Các chất giống như kháng sinh sinh ra bởi Pseudomonas cepacia và Pseudomonas glumae, cần ñược nghiên cứu kỹ hơn ñể ñánh giá vai trò tiềm tàng của chúng trong việc phòng chống R.solanacearum ở trên ñồng ruộng . Tanaka ñã phát hiện ñược các thực khuẩn thể không ñộc có vai trò tiềm tàng trong phòng trừ sinh học bệnh héo xanh. Wall ñã phát hiện thấy tần suất thực khuẩn thể không ñộc cao hơn ở những ruộng không có cây bị nhiễm bệnh, khi so với những ruộng bị nhiễm kề cạnh. Vi khuẩn ñối kháng với Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………….17 R.solanacearum có thể ñược phân lập từ nhiều nguồn khác nhau, chẳng hạn từ những vùng ñất và rễ cây họ cà, ớt và hành không có mầm bệnh. Trong hầu hết các trường hợp thì các thực nghiệm trên ñồng ruộng vẫn còn nhiều hạn chế, có thể do sự xâm nhiễm của các nhân tố phòng trừ sinh học vào trong rễ cây còn quá yếu, hoặc do sự phụ thuộc quá nhiều vào các ñiều kiện tự nhiên. Một số tác giả ñã phát hiện ñược một số chủng vi sinh vật có khả năng ñối kháng với R.solanacearum thể hiện ở bảng sau. Các chủng vi sinh vật ñối kháng với R.solanacearum Chủng vi sinh vật Pseudomonas fluorescens Pseudomonas glumae Pseudomonas cepacia Bacillus sp. Erwinia sp. Các thể ñột biến của R. solanacearum không ñộc Tác giả nghiên cứu Kempe và Sequeira (1983) Ciampi-Panno và cs (1989) Gallardo và cs (1989) Anuratha và Gnanamanickam (1990) Wakimoto (1987) Furaya và cs (1991) Aoki và cs (1991) Fucikovsky và cs (1989) Anuratha và Gnanamanickam (1990) Fucikovsky và cs (1989) Kempe và Sequeira (1983) Chen và Echandi (1984) Tanaka (1985) Trigalet và Trigalet-Demery (1990) Hara và Ono (1991) B. F. Hu ñã phân lập ñược 2 chủng vi khuẩn ñối kháng Pseudomonas sp. (P751) và Bacillus cereus (B752) từ lá thông. Chúng có khả năng ức chế sinh trưởng và phát triển của 9 loài nấm và côn trùng, 2 chủng này an toàn ñối Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………….18 với người, thực vật và ñộng vật, ức chế bệnh và tăng năng suất cây trồng như lúa, lúa mì, thuốc lá, trà, rau và cỏ.... Ciampi-Panno ñã tách ñược chủng P.fluorescens BC8 có thể ức chế mạnh vi khuẩn gây bệnh héo xanh ở khoai tây, ñặc biệt khi hạt ñược bao bọc một lớp vỏ vi khuẩn P.fluorescens BC8. Dường như vi khuẩn này có thể xâm nhập ñược vào cây chủ qua hệ thống rễ, song hiệu qủa kháng bệnh chưa cao, thực tế sự nhiễm bệnh ở củ vẫn xảy ra. Thực tế, trên thế giới nhiều dạng chế phẩm vi sinh vật tổng hợp khác như E.2001, Super life, Phytobacter…[40], [41], [42], [43] ñã ñược nghiên cứu sản xuất và trở thành sản phẩm thương mại. Chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu (Effective microorganisms - EM (do giáo sư Teruo Higa Nhật Bản nghiên cứu), ñây là chế phẩm trộn lẫn một nhóm các loài vi sinh vật có ích trong ñó vi khuẩn axit lactic, một số nấm men, một số xạ khuẩn, vi khuẩn quang hợp,…Nó tác dụng: cải tạo lý hóa tính và ñặc tính sinh học của ñất, làm giảm mầm mống sâu bệnh trong ñất, làm tăng hiệu quả của phân bón hữu cơ [2], [22]. Những thành tựu nghiên cứu về các dạng chế phẩm vi sinh vật ñối kháng trên thế giới ñã ñược ứng dụng và ñem lại nhiều lợi ích quan trọng trong phòng trừ một số loại sâu bệnh hại cây trồng, cũng như góp phần bảo vệ sức khỏe cho con người và môi trường sinh thái. 1.2.2. Kết quả nghiên cứu trong nước Trong những năm qua, ở nước ta có nhiều nghiên cứu, ứng dụng các dạng chế phẩm có nguồn gốc là các vi sinh vật cũng ñã có nhiều thành tựu ñáng kể, góp phần không nhỏ trong phòng trừ sâu bệnh hại. Trường ðại học Sư phạm I - Hà Nội ñã nghiên cứu chủng xạ khuẩn Streptomyces V6 có khả năng sinh kháng sinh chống nấm và vi khuẩn R. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………….19 solanacearum. Viện Công nghệ Sinh học cũng ñã sản xuất các chế phẩm Bt và một số chế phẩm sinh học khác có nguồn gốc từ vi khuẩn, xạ khuẩn và vi nấm v.v... Các chế phẩm này ñã có tác dụng trong phòng chống một số sâu, bệnh hại cây trồng [8], [14]. Nấm Trichoderma và một số xạ khuẩn cũng có tác dụng trừ bệnh hại cây trồng như bệnh héo rũ lạc, bệnh khô vằn ngô, lúa (Nguồn: khoa học ñại chúng phục vụ Nông nghiệp và Nông thôn). Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam (cũ) ñã nghiên cứu tạo chế phẩm phân bón vi sinh trên cơ sở một tập hợp ña chủng vi sinh vật, trong ñó có vi khuẩn ñối kháng, sản phẩm ñược sử dụng trong trồng trọt vừa có tác dụng kích thích sinh trưởng của cây, vừa có khả năng ức chế một số bệnh thực vật gây ra bởi vi khuẩn hoặc nấm [26], [27], [38]. Các kết quả nghiên cứu trong thời gian gần ñây ở nước ta ñã cho những kết quả nhất ñịnh về ñặc tính ñối kháng của các chủng vi sinh vật. ðã xác ñịnh ñược 3 chủng Burkholderia có khả năng kháng nấm Fusarium gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn, nhiều chủng Bacillus và Pseudomonas có khả năng ñối kháng vi khuẩn héo xanh ở cả cà chua, khoai tây và lạc, trong ñó một số chủng Bacillus còn có thể ức chế cả nấm Fusarium gây bệnh lở cổ rễ cây trồng cạn [26]. Các nghiên cứu khác cũng cho thấy khi sử dụng chế phẩm có chứa tổ hợp vi khuẩn ñối kháng Azotobacter và Bacillus trên cây cà chua tỷ lệ chết do bệnh héo xanh chỉ còn 2% so với 70 - 80% khi không dùng chế phẩm và tỷ lệ này là 0% ñối với tổ hợp vi sinh vật Enterobacter, Burkholderia, Bacillus, Azotobacter [26]. Trên lạc cũng cho kết quả tương tự, làm giảm tỷ lệ chết do bệnh héo xanh vi khuẩn từ 70 - 80% xuống còn 2% và 0% [26]. Trên khoai tây tỷ lệ này là 5% xuống còn 3,3%. ðối với cây lâm nghiệp và công nghiệp các tổ hợp vi sinh vật trên có tác dụng ngăn chặn bệnh lở cổ rễ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………….20