Tài liệu Nghiên cứu ứng dụng tin sinh học trong việc phát triển vắcxin và thuốc

  • Số trang: 490 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 103 |
  • Lượt tải: 0
nguyetha

Đã đăng 8489 tài liệu

Mô tả:

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC.04/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG TIN SINH HỌC TRONG VIỆC PHÁT TRIỂN VĂCXIN VÀ THUỐC MÃ SỐ KC.04.18/06-10 Chủ nhiệm đề tài: Cơ quan chủ trì đề tài: PGS.TS. BÙI VĂN LỆ Ban chủ nhiệm Chương trình GS. TS Trần Linh Thước Bộ Khoa học và Công nghệ Văn phòng các Chương trình GS.TSKH. Trần Duy Quý TP Hồ Chí Minh - 2010 MỤC LỤC Mục lục i Danh mục các từ viết tắt ix Danh sách các hình xiii Danh sách các bảng xix BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 1 PHẦN I. MỞ ĐẦU 14 1. Thông tin chung 15 2. Mục tiêu đề tài 15 3. Tổng quan tình hình nghiên cứu ứng dịng Tin sinh học trong việc thiết kế phát triển văcxin 15 3.1. Tình hình dịch cúm trên thế giới 15 3.2. Văcxin phòng bệnh 16 3.2.1 Đặc điểm sinh học của virus H5N1 16 3.2.2. Văcxin phòng bệnh cúm H5N1 17 3.2.3. Văcxin dựa trên epitope cho virus H5N1 19 3.3. Ứng dụng Tin sinh học trong dự đoán epitope 20 3.4. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc 22 4. Tổng quan tình hình nghiên cứu ứng dụng Tin sinh học trong việc thiết kế phát triển thuốc 24 4.1. Độc tố thần kinh nọc rắn 24 4.2. Thụ thể nicotinic acetylcholine và ứng dụng trong y học 25 4.3. Ứng dụng Tin sinh học sàng lọc và phát triển thuốc 27 4.5. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc 28 5. Nội dung nghiên cứu của đề tài 30 5.1. Phần A: Nghiên cứu, ứng dụng Tin sinh học trong việc thiết kế phát triển văcxin 30 i 5.2. Phần B: Nghiên cứu, ứng dụng Tin sinh học trong việc thiết kế phát triển thuốc 31 PHẦN II. NỘI DUNG KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐÃ THỰC HIỆN 33 PHẦN II.A. NGHIÊN CỨU, ỨNG DỤNG TIN SINH HỌC TRONG VIỆC THIẾT KẾ PHÁT TRIỂN VĂCXIN 34 CHƢƠNG 1. NGHIÊN CỨU CÁC CHƢƠNG TRÌNH DỰ ĐOÁN EPITOPE TỪ KHÁNG NGUYÊN VIRUS 35 1.1. Nghiên cứu chƣơng trình dự đoán epitope kháng nguyên virus nhận diện bởi tế bào T 35 1.1.1. Đặt vấn đề 35 1.1.2. Phƣơng pháp HMMs và quy trình dự đoán gián tiếp epitope tế bào T ở dạng peptide gắn MHC 36 1.1.3. Phƣơng pháp ANNs và quy trình dự đoán gián tiếp epitope tế bào T ở dạng peptide gắn MHC 40 1.1.4. Phƣơng pháp SVMs và mô hình dự đoán gián tiếp epitope tế bào T ở dạng peptide gắn MHC 43 1.1.5. Phƣơng pháp kết hợp các thuật toán dự đoán gián tiếp epitope tế bào T ở dạng peptide gắn MHC 1.1.6. Kết luận 45 49 1.2. Nghiên cứu chƣơng trình dự đoán epitope kháng nguyên virus nhận diện bởi tế bào B 1.2.1. Đặt vấn đề 50 50 1.2.2. Phƣơng pháp dự đoán epitope liên tục nhận diện bởi tế bào B dựa trên nguyên tắc thống kê (HMM) 50 1.2.3. Phƣơng pháp dự đoán epitope không liên tục nhận diện bởi tế bào B dựa trên nguyên tắc mô hình hóa cấu trúc peptide tƣơng đồng 54 1.2.4. Kết luận 58 ii CHƢƠNG 2. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU VIRUS CÚM A 59 2.1. Lập mô hình và tạo công cụ thiết lập cơ sở dữ liệu (CSDL) chung cho các virus 59 2.1.1. Đặt vấn đề 59 2.1.2. Vật liệu và phƣơng pháp 59 2.1.3. Kết quả và biện luận 60 2.1.4. Kết luận 62 2.2. Xây dựng cơ sở dữ liệu virus cúm A nhằm phục vụ phát triển văcxin bảo tồn cho virus cúm A 64 2.2.1. Đặt vấn đề 64 2.2.2. Vật liệu và phƣơng pháp 64 2.2.3. Kết quả và biện luận 68 2.2.4. Kết luận 73 CHƢƠNG 3. NGHIÊN CỨU DỰ ĐOÁN EPITOPE VIRUS H5N1 76 3.1. Nghiên cứu dự đoán epitope nhận diện bởi tế bào T từ kháng nguyên của virus H5N1 76 3.1.1. Dự đoán epitope virus H5N1 nhận diện bởi tế bào T bằng phƣơng pháp mạng neuron nhân tạo ANN 76 3.1.2. Dự đoán epitope virus H5N1 nhận diện bởi tế bào T bằng phƣơng pháp máy học vector hỗ trợ SVM 84 3.1.3. Dự đoán epitope virus H5N1 nhận diện bởi tế bào T bằng phƣơng pháp mô hình Markov ẩn HMM 90 3.1.4. Xây dựng quy trình dự đoán epitope virus H5N1 nhận diện bởi tế bào T bằng phƣơng pháp kết hợp HMM- SVM 96 iii 3.1.5. Xây dựng quy trình dự đoán epitope virus H5N1 nhận diện bởi tế bào T bằng phƣơng pháp kết hợp HMM- ANN 99 3.2. Nghiên cứu dự đoán epitope kháng nguyên virus H5N1 nhận diện bởi tế bào B 102 3.2.1. Dự đoán epitope liên tục nhận diện bởi tế bào B bằng phƣơng pháp HMM kết hợp thang tính chất kháng nguyên 102 3.2.2. Dự đoán epitope liên tục và không liên tục nhận diện bởi tế bào B dựa trên thông tin cấu trúc 109 3.2.3. Dự đoán epitope không liên tục nhận diện bởi tế bào B bằng phƣơng pháp mô hình hóa cấu trúc peptid 116 3.2.4. Dự đoán epitope không liên tục nhận diện bởi tế bào B trên kháng nguyên HA của virus H5N1 bằng phƣơng pháp Docking 119 3.3. Tuyển chọn các epitope dự đoán để tiến hành tổng hợp và kiểm chứng thực nghiệm tính năng của epitope 125 CHƢƠNG 4. NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ TỔNG HỢP KHÁNG NGUYÊN VIRUS CÚM H5N1 130 4.1. Nghiên cứu thiết kế và tổng hợp kháng nguyên của virút H5N1 gây đáp ứng miễn dịch tế bào T từ epitope dự đoán 132 4.1.1. Đặt vấn đề 132 4.1.2. Nội dung thực hiện 134 4.1.3. Vật liệu và phƣơng pháp 134 4.1.4. Kết quả và biện luận 142 4.1.5. Kết luận 152 iv 4.2. Nghiên cứu thiết kế và tổng hợp kháng nguyên của virus H5N1 từ epitope liên tục nhận diện bởi tế bào B từ epitope dự đoán 153 4.2.1. Đặt vấn đề 153 4.2.2. Nội dung thực hiện 153 4.2.3. Vật liệu và phƣơng pháp 154 4.2.4. Kết quả và biện luận 158 4.2.5. Kết luận 164 4.3. Nghiên cứu thiết kế và tổng hợp kháng nguyên của virus H5N1 từ epitope không liên tục nhận diện bởi tế bào B từ epitope dự đoán 164 4.3.1. Đặt vấn đề 164 4.3.2. Nội dung thực hiện 165 4.3.3. Vật liệu và phƣơng pháp 165 4.3.3.1. Vật liệu sinh học 165 4.3.4. Kết quả và biện luận 168 4.3.5. Kết luận 175 4.4. Nghiên cứu thiết kế và tổng hợp kháng nguyên phức hợp của virus cúm H5N1 gây đáp ứng miễn dịch do tế bào T và tế bào B từ epitope dự đoán 176 4.4.1. Đặt vấn đề 176 4.4.2. Nội dung thực hiện 177 4.4.3. Vật liệu và phƣơng pháp 177 4.4.4. Kết quả và biện luận 181 4.4.5. Kết luận 186 CHƢƠNG 5. KIỂM CHỨNG KHẢ NĂNG GÂY ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA KHÁNG NGUYÊN VIRUS H5N1 ĐƢỢC THIẾT KẾ 188 5.1. Đặt vấn đề 188 v 5.2. Nội dung thực hiện 193 5.3. Vật liệu và phƣơng pháp 193 5.3.1. Vật liệu sinh học 193 5.3.2. Dụng cụ và hóa chất 194 5.3.3. Phƣơng pháp 194 5.4. Kết quả và biện luận 198 5.4.1. Kiểm chứng khả năng gây đáp ứng miễn dịch từng loại kháng nguyên đƣợc thiết kế 198 5.4.2. Đánh giá epitope tiềm năng và kiểm chứng khả năng gây đáp ứng miễn dịch 202 5.4.3. Kiểm tra hiệu lực bảo vệ của kháng nguyên thiết kế từ các epitope nhận diện bởi tế bào B và epitope tế bào T đƣợc dự đoán 204 5.4.4. Đề xuất kháng nguyên triển vọng cho nghiên cứu phát triển văcxin 207 PHẦN II B. NGHIÊN CỨU, ỨNG DỤNG TIN SINH HỌC TRONG THIẾT KẾ PHÁT TRIỂN THUỐC 208 CHƢƠNG 6. NGHIÊN CỨU, ỨNG DỤNG TIN SINH HỌC TRONG THIẾT KẾ PHÁT TRIỂN THUỐC 209 6.1. Đặt vấn đề 209 6.2. Vật liệu và phƣơng pháp 210 6.2.1. Vật liệu 210 6.2.2. Phƣơng pháp 211 6.3. Kết quả và thảo luận 222 6.3.1. Nghiên cứu thiết kế polypeptid ức chế nọc rắn bằng mô phỏng động học phân tử vi 222 6.3.2. Biểu hiện các đoạn polypeptid bằng con đƣờng tái tổ hợp 234 6.3.3. Kết quả tinh chế các polypeptid tái tổ hợp 240 6.3.4. Kết quả kiểm tra hoạt tính sinh học của các đoạn polypeptid tái tổ hợp 6.4. Kết luận và đề xuất 244 247 6.4.1. Kết luận 247 6.4.2. Kiến nghị 247 PHẦN III. CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƢỢC CỦA ĐỀ TÀI, KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 249 1. Các sản phẩm khoa học công nghệ đã đạt đƣợc 250 1.1. Sản phẩm dạng I 250 1.2. Sản phẩm dang II 251 1.3. Sản phẩm dạng III 254 1.4. Đào tạo sau đại học 254 2. Kết luận 254 3. Kiến nghị 255 TÀI LIỆU THAM KHẢO 256 PHỤ LỤC 265 Phụ lục 1. Các thuật toán dự đoán epitope tế bào T 266 Phụ lục 2.1. Kết quả lập mô hình và tạo công cụ thiết lập cơ sở dữ liệu vius cúm 303 Phụ lục 2.2. Mô hình cơ sở dữ liệu virus cúm A và phƣơng pháp thu nhận dữ liệu 315 Phụ lục 3.1. Kết quả dự đoán epitope tế bào T bằng phƣơng pháp mạng nơron nhân tạo Phụ lục 3.2. Cách thu nhận và xử lý dữ liệu trong bộ luyện trong dự đoán epitope tế bào T bằng phƣơng pháp vii 322 vectơ hỗ trợ SVM 335 Phụ lục 3.3. Phƣơng pháp xây dựng mô hình và kết quả thu nhận dữ liệu trong dự đoán epitope tế bào T bằng phƣơng pháp Mô hình Markov ẩn HMM 337 Phụ lục 3.4. Xây dựng quy trình dự đoán epitope tế bào T bằng phƣơng pháp kết hợp HMM-SVM 343 Phụ lục 3.5. Xây dựng quy trình dự đoán epitope tế bào T bằng phƣơng pháp kết hợp HMM-ANN 355 Phụ lục 3.6. Dự đoán epitope tế bào B bằng phƣơng pháp HMM kết hợp với tính chất kháng nguyên 360 Phụ lục 3.7. Dự đoán epitope liên tục và không liên tục nhận diện bởi tế bào B dựa trên thông tin cấu trúc 374 Phụ lục 3.8. Kết quả dự đoán epitope không liên tục tế bào B bằng phƣơng pháp mô hình hóa tƣơng đồng 382 Phụ lục 3.9. Vật liệu và phƣơng pháp dùng trong phƣơng pháp Docking để dự đoán epitope không liên tục trên phân tử HA nhận diện bởi tế bào B 386 Phụ lục 4. Vật liệu và phƣơng pháp dùng để xây dựng quy trình tạo chủng E. coli tái tổ hợp biểu hiện kháng nguyên H5N1 từ epitope dự đoán 400 Phụ lục 5. Vật liệu và phƣơng pháp dùng trong thử nghiệm đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên virus H5N1 đƣợc thiết kế từ epitope dự đoán viii 421 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AChRP Protein liên kết với acetylcholine ADT AutodockTools Agonist Chất kích thích Amp Ampicilline ANN Mạng nơron nhân tạo (Artificial Neuron Network) Antagonist Chất ức chế APS Ammonium persulfate AR Antigenic Residue AUC Diện tích dƣới đƣờng cong ROC (Area Under Curve) bp cặp base (base pair) CA Carbon anpha CED Conformational Epitope Database CHARMm Chemistry at HARvard Molecular Mechanics Complex) CPE Cytopathic effect CSDL Cơ sở dữ liệu CSDL Cơ sở dữ liệu Dock Protein Chƣơng trình gắn thụ thể và phối tử Docking Quá trình gắn DOPE Discrete Optimized Protein Energy E. coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay ELISPOT Enzyme-linked immunosorbent spot Fab Antigen-binding fragment ix Forcefield Trƣờng lực FPLC Flow Protein Liquid Chromatography Fv Variable fragment GA Genetic Algorithm GST Glutathione-S-transferase HA Hemagglutinin HĐD Hệ điều hành HI Ức chế HA (heamagglutination-inhition) HIU Đơn vị ức chế HA (HA inhibition unit) HLA Kháng nguyên bạch cầu ngƣời (Human Leucocyte Antigen) HMM Mô hình Markov ẩn (Hidden Markov Model) HPLC High Performance Liquid Chromatography IEDB Immune Epitope Database IFN-γ γ –Interferon IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside IVR (Influenza Virus Resource) kDa Kilo Dalton LB Môi trƣờng Luria – Bertani LC50 Lethal Concentration, 50% LD50 Lethal Dose, 50% LOOCV Phƣơng pháp đánh giá chéo (Leave One Out Cross Validation) M1 Matrix protein 1 M2 Matrix protein 2 MCS Multi cloning site MDCK Madin-Darby Canine Kidney MHC Major Histocompatibility Complex x MHC Phức hợp tƣơng tác mô chính (Major Histocompatibility MHCBN Database of MHC Binding and Non-binding peptides MHCPEP Database of MHC-binding Peptides MP Matrix protein NA Neuraminidase nAChR Nicotinic acetylcholine receptor NCBI National Center for Biotechnology Information NLL (Negative-Log Likelihood) NMR Nuclear magnetic resonance NMR Cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) NP Nucleocapsid NS1 Non-structural protein 1 NS1 Non-structural protein 2 OD Mật độ quang (Optical density) PA Polymerase A protein PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PB1 Polymerase B1 protein PB2 Polymerase B2 protein PBS Phosphate buffer saline PBST Phosphate buffer saline tween PCI Phenol-Chloroform-Isoamylalcohol PCR Polymerase chain reaction PDB Protein Data Bank PMSF Phenyl methyl sulfonyl fluoride QM Ma trận số lƣợng (Quantitative Matrix) RDE Receptor Destroying Enzyme RMSD Root-mean-square-deviation ROC Đƣờng ROC (Receiver Operating Characteristic Curve) xi SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate SE Độ nhạy (Sensitivity) SFCs Số đốm tạo thành (Spot-forming count) SNNS Stuttgart Neural Network Simulator SP Độ chuyên biệt (Specificity) SVM Máy véctơ hỗ trợ (Support Vector Machine) SYFPEITHI Database of MHC ligands and peptide motifs TAE Tris-Acetic-EDTA TCID50 Tissue Culture Infectious Dose50 TE Tris-EDTA TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethyldiamine TFA Triflour acetic acid α-BTX α-Bungarotoxin α-Cbtx α-Cobratoxin xii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Chuỗi trạng thái HMM ................................................................. 37 Hình 1.2. Đồ thị ROC so sánh kết quả dự đoán epitope của các phƣơng pháp:Rammensee (sử dụng ma trận điểm của Rammensee), HMM (sử dụng mô hình Makov ẩn), SEQ (sử dụng thuật toán ANN và kiểu mã hóa nhị phân), BL50 SEQ (sử dụng thuật toán ANN và kiểu mã dùng ma trận BLOSUM 50), Comb-I và Comb-II (sử dụng thuật toán ANN cùng kiểu mã kết hợp HMM-nhị phân và HMM-BLOSUM 50) ....................................... 47 Hình 1.3. Đồ thị ROC đánh giá tính chính xác của 3 phƣơng pháp dự đoán epitope ........................................................................................... 54 Hình 1.4. Sơ đồ quy trin ̀ h mô hiǹ h hóa tƣơng đồ ng..................................... 55 Hình 1.5. Sơ đồ quy trin ̀ h dƣ̣ đoán epitope tế bào B không liên tu ̣c dƣ̣a vào phƣơng pháp mô hiǹ h hóa tƣơng đồ ng ........................................... 56 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình thiết kế CSDL Virus cúm A ............................... 61 Hình 2.2. Sơ đồ các thực thể chính của CSDL Virus cúm A ....................... 61 Hình 2.3. Mô hình chi tiết CSDL virút cúm A. (PK: Primary key; FK: Foreign key; U: Unique; NN: Not Null) ................................................ 63 Hình 2.4. Các bƣớc xây dựng CSDL virus cúm A ....................................... 66 Hình 2.5. Các đối tƣợng chính trong CSDL virus cúm A ............................ 66 Hình 2.6. Giao diện trang chủ của CSDL Virus cúm A (IAD) .................... 74 Hình 2.7. Trang chứa công cụ truy vấn thông tin trong CSDL Virus cúm A (IAD) ................................................................................................. 75 Hình 3.1. Sơ đồ tinh lọc và phân loại dữ liệu trình tự protein virus H5N1..78 Hình 3.2. Quy trình xây dựng mô hình dự đoán epitope tế bào T bằng HMM ............................................................................................................. 92 Hình 3.3. Quy trình dự đoán epitope liên tục nhận diện bởi tế bào B xiii bằng thang tính chất kháng nguyên............................................................. 104 Hình 3.4. Quy trình dự đoán epitope liên tục tế bào B bằng HMM và thang tính chất kháng nguyên................................................................. 105 Hình 3.5. Quy trình khảo sát khả năng gắn kết của peptide HA lên kháng thể ..................................................................................................... 121 Hình 4.1.1. Vector pGEX-fljB .................................................................. 135 Hình 4.1.2. Quy trình tạo dòng E. coli biểu hiện kháng nguyên thiết kế từ epitope bảo tồn nhận diện bởi tế bào T ................................................ 141 Hình 4.1.3. Plasmid pGEX-fljB mở vòng bằng hai enzyme cắt giới hạn XhoI và NotI ............................................................................................... 144 Hình 4.1.4. Sàng lọc tế bào E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pGEX-fljB-(hat)3 ....................................................................................... 144 Hình 4.1.5. Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm PCR khuẩn lạc sàng lọc dòng tế bào DH5α mang gen (hat)3. ............................................ 145 Hình 4.1.6. Kết quả so sánh trình tự peptide dung hợp giải trình tự với epitope (H1)3 lý thuyết ......................................................................... 145 Hình 4.1.7. Kết quả so sánh trình tự peptide dung hợp giải trình tự với epitope (H2)3 lý thuyết ......................................................................... 146 Hình 4.1.8. Kết quả so sánh trình tự peptide dung hợp giải trình tự với epitope (H3)3 lý thuyết ........................................................................ 147 Hình 4.1.9. Kết quả so sánh trình tự peptide dung hợp giải trình tự với epitope (N1)3 lý thuyết. ........................................................................ 147 Hình 4.1.10. Kết quả so sánh trình tự peptide dung hợp giải trình tự với epitope (N2)3 lý thuyết ......................................................................... 148 Hình 4.1.11. Kết quả biến nạp gen pG-fljB-(H1)3 vào tế bào E. coli BL21(DE3) .................................................................................................. 149 Hình 4.1.12. Kết quả PCR plasmid tách từ các dòng tế bào E. coli BL21(DE3)/pGEX-fljB-(H1)3. ....................................................... 150 xiv Hình 4.1.13. Phân tích kết quả biểu hiện của protein dung hợp GST-H:1,2-(H1)3 bằng SDS-PAGE ............................................................ 150 Hình 4.1.14. Phân tích kết quả tinh chế protein dung hợp GST-(H1)3-H:1,2 bằng SDS-PAGE. .......................................................... 151 Hình 4.2.1. Quy trình tạo dòng E. coli biểu hiện kháng nguyên thiết kế từ epitope liên tục bảo tồn nhận diện bởi tế bào B .................................... 156 Hình 4.2.2. Sàng lọc tế bào E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pGEX-fljB-HBLT. ........................................................................................ 158 Hình 4.2.3. Sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5α tái tổ hợp mang trình tự mã hóa epitope với cặp mồi pGEX-R/ fljB-F ........................................... 159 Hình 4.2.4. Kết quả so sánh trình tự epitope dòng hóa với trình tự của epitope HBLT lý thuyết ............................................................................. 160 Hình 4.2.5. Kết quả so sánh trình tự epitope dòng hóa với trình tự của epitope NBLT lý thuyết ................................................................................ 160 Hình 4.2.6. Kết quả biến nạp gen pGEX-fljB-hablt vào tế bào E. coli BL21(DE3). ................................................................................................ 161 Hình 4.2.7. Kết quả PCR plasmid tách từ các dòng tế bào E. coli BL21(DE3)/pGEX-fljB-HBLT ......................................................... 162 Hình 4.2.8. Phân tích kết quả biểu hiện của protein dung hợp GST-HBLT-H:1,2 bằng SDS-PAGE ........................................................... 162 Hình 4.2.9. Phân tích kết quả tinh chế protein dung hợp GST-HBLT-H:1,2 bằng SDS-PAGE ............................................................ 163 Hình 4.3.1. Quy trình tạo dòng E. coli biểu hiện kháng nguyên thiết kế từ epitope không liên tục nhận diện bởi tế bào B ...................................... 169 Hình 4.3.2. Sàng lọc tế bào E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pGEX-fljB-(habklt)2. .................................................................................. 170 Hình 4.3.4. Kết quả so sánh trình tự epitope không liên tục nhận diện bởi tế bào B trên plasmid pGEX-fliB-(habklt)2 với trình tự epitope xv (habklt)2 lý thuyết ....................................................................................... 171 Hình 4.3.3. Kết quả PCR khuẩn lạc. ......................................................... 171 Hình 4.3.5. Kết quả biến nạp pGEX-fljB-(habklt)2 vào tế bào E. coli BL21(DE3). ............................................................................................... 172 Hình 4.3.6. Kết quả PCR khuẩn lạc tế bào E. coli BL21(DE3)/pGEX-fljB(habklt)2. ..................................................................................................... 173 Hình 4.3.7. Phân tích kết quả biểu hiện GST-HABKLT)2-H:1,2 bằng SDS-PAGE (A) và lai Western Blot với kháng thể kháng GST (B). ....... 174 Hình 4.3.8. Phân tích kết quả tinh chế protein dung hợp GST-(HABKLT)2-H:1,2 bằng SDS-PAGE. ................................................. 175 Hình 4.4.1. Quy trình tạo dòng E. coli biểu hiện kháng nguyên phức hợp thiết kế từ epitope tế bào T và epitope tế bào B ................................. 180 Hình 4.4.2. Sàng lọc tế bào E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pGEX-fljB-habt. ........................................................................................ 182 Hình 4.4.3. Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm PCR khuẩn lạc..... 182 Hình 4.4.4. Kết quả so sánh trình tự gen habt mã hóa kháng nguyên với trình tự lý thuyết .................................................................................. 183 Hình 4.4.5. Kết quả biến nạp gen pG-fljB-habt vào tế bào E. coli BL21(DE3). ................................................................................................ 184 Hình 4.4.6. Kết quả PCR khuẩn lạc E. coli BL21 (DE3)/pGEX-fljB-habt 184 Hình 4.4.7. Phân tích kết quả biểu hiện của protein dung hợp GST-HABT-H:1,2 bằng SDS-PAGE ........................................................ 185 Hình 4.4.8. Phân tích kết quả tinh chế protein dung hợp GST-HABT-H:1,2 bằng SDS-PAGE. ......................................................... 186 Hình 5.1. Hình ảnh quan sát kết quả thử nghiệm ELISPOT của các epitope bảo tồn nhận diện bởi tế bào T. .............................................. 199 Hình 5.2. Số lƣợng tế bào đơn nhân tiết IFN-γ khi đƣợc ủ với các epitope tế bào T ......................................................................................... 199 xvi Hình 5.3. Kiểm tra sự hiện diện của kháng thể kháng HBLT/NBLT trong kháng huyết thanh chuột bị gây đáp ứng miễn dịch. ................................. 201 Hình 5.4. Kiểm tra sự hiện diện của kháng thể kháng epitope (HBKLT)2 trong kháng huyết thanh chuột bị gây đáp ứng miễn dịch ........................ 202 Hình 6.1. Hệ thống sắc ký HPLC của Shimadzu, Japan .................................. 211 Hình 6.2. Giao diện phần mềm LCsolution ...................................................... 220 Hình 6.3. Mô hình cấu trúc của chuỗi polypeptide đƣợc superimpose với cấu trúc khuôn là 2BG9A và 2QC1B. ......................................................... 224 Hình 6.4. Chuỗi polypeptide đã đƣợc mô hình hóa dạng phiến (A) và dạng liên kết peptide giữa các axit amin (B). ............................................. 225 Hình 6.5. So sánh giá trị DOPE giữa các cấu trúc mô phỏng peptide khác nhau ....................................................................................................................226 Hình 6.6. Mô hình phức hệ polypeptide-độc tố α-Cbtx ................................227 Hình 6.7. Mô hình phức hệ polypeptide-độc tố α-Cbtx “pose1” ................228 Hình 6.8. Các thông số DelPhi charge, DelPhi Radius,… trong Data Table Views ....................................................................................... 229 Hình 6.9. Giá trị điện tích của các acid amin thành phần trong phức hệ protein .......................................................................................... 229 Hình 6.10. Các thông số dữ liệu của quá trình Dynamics (Equilibration) 230 Hình 6.11. Các thông số tọa độ không gian đƣợc ghi lại trong Data Table ...................................................................................................................232 Hình 6.12. So sánh trình tự các chuỗi polypeptide mô hình với trình tự gốc ở ngƣời ..................................................................................................233 Hình 6.13. 05 phức hệ polypeptide-độc tố α-Cbtx đƣợc xây dựng bằng chƣơng trình “Dock Proteins (ZDOCK)” ........................................ 233 Hình 6.14. So sánh mức năng lƣợng của các phức hệ từ chƣơng trình “Standard Dynamics Cascade” ............................................ 235 Hình 6.15. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2%. ...............................236 xvii Hình 6.16. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt pPICZ_peptide_model bằng NcoI và XhoI. .................................................................................................237 Hình 6.17. Các khuẩn lạc đƣợc sàng lọc trên môi trƣờng đĩa thạch LBA ............................................................................................................................. 239 Hình 6.18. Điện di protein tái tổ hợp trên gel TricineSDS PAGE 16 %. ....................................................................................... 239 Hình 6.19. Kiểm tra dạng biểu hiện của polypeptide tái tổ hợp ...................241 Hình 6.20. Sắc ký đồ qui trình tinh chế polypeptide trên HPLC .................242 Hình 6.21. Polypeptide tinh chế bằng cột bán điều chế LC-18 ....................243 Hình 6.22. Polypeptide tinh chế bằng HPLC. ...................................................244 xviii
- Xem thêm -